CN116121196B - 一种调控car-t细胞的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控CAR‑T细胞的方法与应用。本发明通过酪氨酸激酶抑制剂调控CAR‑T细胞，从而缓解和治疗CAR‑T细胞在用于治疗后可能产生的免疫相关毒性。本发明的调控方法能够调控多种CAR‑T细胞免疫毒性相关细胞因子的的表达，对相关毒性进行早期干预，降低严重毒性的发病率和死亡率，从而提高CAR‑T细胞的安全性。本发明所使用的调控方法中的达沙替尼是已批准用于临床治疗的抗肿瘤药物，在多种癌症治疗中均可作为应用，可以实现老药新用，具有重大经济价值。

Description

一种调控CAR-T细胞的方法与应用

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种调控CAR-T细胞的方法与应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)是一种通过对T细胞进行基因改造从而实现对肿瘤细胞靶向杀伤的免疫治疗技术，在癌症治疗中显示出巨大前景，特别是在血液恶性肿瘤中取得显著疗效，完全缓解率可达70％-90％。CAR-T细胞在血液肿瘤治疗中的成功，鼓舞研究人员将其用于实体瘤治疗。越来越多针对实体瘤的CAR-T细胞疗法的相继开展且取得一定效果。目前，FDA已批准6个靶向CD19或BCMA的CAR-T细胞产品用于治疗B细胞淋巴瘤。CAR-T正在改变恶性肿瘤的治疗方式，引领肿瘤治疗进入细胞治疗时代。

由于CAR-T细胞作为活药物的性质，细胞预计将长期持续存在，疗效可能持续数十年，但是这也可能与严重免疫相关毒性有关从而成为CAR-T临床应用的挑战。CAR-T治疗常见的免疫相关毒性包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)和免疫效应细胞相关的神经毒性综合征(immune effector cell-associated neurotoxicitysyndrome，ICANS)，根据临床CAR-T使用发现，CRS和ICANS的发生率分别为57％-93％和在20％-70％。此外，CAR-T免疫相关毒性的发生主要与CAR-T细胞输注后的急性细胞因子产生有关。研究发现CRS的特点为急性全身炎症、循环细胞因子水平升高以及继发性器官功能障碍，涉及多种细胞因子间相互作用的复杂网络。CAR-T免疫相关毒性可通过IL-6受体拮抗剂或皮质类固醇等方法实现控制和治疗，但是严重者也可能会危及生命。此外，皮质类固醇的使用会对CAR-T细胞活性造成不可逆的永久伤害，从而影响长期治疗效果。因此，研究能精确控制CAR-T细胞免疫相关毒性的策略至关重要。

研究人员通过优化CAR的结构来实现更特异和更安全地靶向肿瘤细胞从而降低免疫相关毒性的发生，如引入自杀基因HSV-TK或iCasp9等，构建双抗原特异性CAR、抑制性嵌合抗原受体(inhibitory chimeric antigen receptors，iCAR)、SynNotch CAR、小分子开关调控的CAR)。但是，以上方法均需要复杂的基因工程改造并且不能直接控制细胞因子的产生。

因此，如何能通过药物直接调控CAR-T细胞中细胞因子的表达，同时不影响CAR-T细胞的持久性，使其更精确可控成为提高其临床应用安全性的关键。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种调控CAR-T细胞的方法与应用，能够调控CAR-T细胞中多种细胞因子的的表达，从而缓解和治疗CAR-T细胞在用于治疗后可能产生的免疫相关毒性，包括细胞因子释放综合征(CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合症(ICANS)，增加CAR-T细胞的安全性。

本发明的第一个方面，提供一种调控CAR-T细胞的方法，所述方法为使用酪氨酸激酶抑制剂处理CAR-T细胞20～28h。

在本发明的一些的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂包括达沙替尼和/或其衍生物。

在本发明的一些的实施方式中，所述衍生物包括达沙替尼药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、多晶型物、异构体或前药。

在本发明的一些实施方式中，所述异构体包括构造异构体、立体异构体、旋光异构体、区域异构体、几何异构体。

在本发明的一些的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂的处理CAR-T细胞时在体系中的终浓度为0.1～3μM。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂的处理CAR-T细胞时在体系中的终浓度为1μM。

在本发明的一些具体的实施方式中，所述CAR-T细胞的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的一些的实施方式中，所述CAR-T细胞的具体构建方法来源于现有公开专利文本：CN112940137A：一种PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞及其制备方法和应用。

在本发明的一些的实施方式中，所述嵌合抗原受体(CAR)包括抗原结合结构域、跨膜结构域，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。

在本发明的一些的实施方式中，所述抗原结合结构域为靶向肿瘤抗原的抗原结合片段为靶向MUC1的scFv。

在本发明的一些的实施方式中，所述跨膜结构域来源于CD8和CD28。

在本发明的一些的实施方式中，所述共刺激结构域为共刺激分子的细胞内结构域。

在本发明的一些的实施方式中，所述共刺激分子为4-1BB。

在本发明的一些的实施方式中，所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。

本发明的第二个方面，提供达沙替尼和/或其衍生物作为唯一活性成分在制备抑制CAR-T细胞释放细胞因子的制剂中的应用。

本发明发现，所述达沙替尼和/或其衍生物能够应用于制备抑制CAR-T细胞释放细胞因子的制剂，从而治疗CAR-T细胞在用于治疗后可能产生的免疫相关毒性。

在本发明的一些的实施方式中，所述免疫相关毒性包括细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)和免疫效应细胞相关的神经毒性综合征(immuneeffector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)。

在本发明的一些的实施方式中，所述细胞因子包括IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、4-1BB。

在本发明的一些的实施方式中，所述制剂中还包括药学上可接受的辅料。

在本发明的一些的实施方式中，所述药学上可接受的辅剂包括稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂、等渗调节剂、螯合剂。

在本发明的一些的实施方式中，所述制剂为注射剂，给药方式包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、鞘内注射。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种调控CAR-T细胞的方法，能直接下调多种CAR-T免疫毒性相关细胞因子的的表达，通过本方法可以对CAR-T细胞免疫相关毒性进行早期干预，降低严重毒性的发病率和死亡率，从而提高CAR-T细胞的安全性。

2.本发明实施例中所使用的调控物质为达沙替尼，其为已批准用于临床治疗的抗肿瘤药物，在多种癌症治疗中均可作为应用；本发明进一步发现了其在调控CAR-T细胞治疗过程中的出现的免疫毒性的相关症状，可以实现老药新用，具有重大经济价值。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为流式细胞术检测T细胞转染为CAR-T细胞的阳性率，其中的A图为实施例1中培养激活得到的T细胞，B图为实施例1中制备得到的CAR-T细胞；

图2为不同浓度的达沙替尼对CAR-T细胞的细胞活率和增殖的影响情况，其中的A图为CAR-T细胞的细胞存活率，B图为CAR-T细胞的活细胞数量；

图3为不同达沙替尼浓度对CAR-T细胞中细胞因子表达的影响情况，其中的A图为CAR-T细胞中的IL-6的mRNA相对表达量，B图为CAR-T细胞中的IL-10的mRNA相对表达量，C图为CAR-T细胞中的IFN-γ的mRNA相对表达量，D图为CAR-T细胞中的TNF-α的mRNA相对表达量；

图4为不同达沙替尼浓度对CAR-T细胞中的T细胞标志物4-1BB的mRNA相对表达量的影响情况。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1CAR-T细胞的制备

本发明实施例中使用的CAR-T细胞为一种靶向MUC1的CAR-T细胞，其具体制备方法可参考中国专利文献CN112940137A(一种PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞及其制备方法和应用)具体操作步骤如下：

1、慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CAR 5E5的构建

CAR结构由抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和信号传导结构域串联而成，在本实施例中CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，其中抗原结合结构域为靶向肿瘤抗原的抗原结合片段，具体为靶向MUC1的scFv，跨膜结构域来源于CD8和CD28，共刺激结构域为共刺激分子的细胞内结构域4-1BB，细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。

其是通过将SEQ ID NO：1所示序列克隆到慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-Puro(购自上海林渊生物科技有限公司)的EcoRI和MluI酶切位点之间，构建的重组慢病毒表达载体(命名为pLVX-EF1α-CAR 5E5)，然后用无内毒素质粒大提试剂盒(Endo-free Plasmid MaxiKit，购自Omega)进行质粒提取。同时对慢病毒包装的辅助载体质粒(pSPAX2和pMD2.G)进行大量提取。用紫外分光光度计检测提取的质粒的浓度和纯度，然后置于-20℃冰箱中保存，用于后续的慢病毒包装。

2、慢病毒包装与纯化

取冻存的HEK293T细胞(购自ATCC)复苏，用DMEM完全培养基(DMEM培养基(Gibco)+10％FBS)传代培养。将HEK293T细胞以3×10⁶/mL密度接种至10层细胞工厂，加入DMEM完全培养基体积为1L，过夜培养后细胞能达到80-90％的融合度，进行质粒转染。

准备1个T75培养瓶(A瓶)，加入慢病毒表达质粒pLVX-EF1α-CAR 5E5(840μg)、慢病毒包装质粒pSPAX2(840μg)和慢病毒包膜质粒pMD2.G(420μg)，加入无血清DMEM补至60mL。再准备1个T75培养瓶(B瓶)，加入1mg/mL的PEI MAX40K(polysciences)5.25mL，加入无血清DMEM补至60mL。分别将A、B瓶液体混匀，静置5min。将B液加入A液中，充分混匀，静置20min，形成DNA-PEI复合物。

将DNA-PEI复合物加入1L含5％FBS的DMEM培养基中，充分混匀，替换掉10层细胞工厂中培养液。在转染后的48h收集培养上清液约1L，放入2～8℃冰箱中保存。同时向10层细胞工厂中加入1L新鲜的含5％FBS的DMEM培养基，24h后收集培养上清液约1L，放入2～8℃冰箱中保存，重复该过程一次。将3次收集的约3L培养上清液混合，使用囊式滤器(Sartorius)去掉细胞和细胞碎片。

将澄清过滤的慢病毒上清通过切向流过滤系统(仕必纯KR2I)浓缩到200～300mL。经过0.45μm滤膜过滤后，进行层析纯化。将纯化的慢病毒经过0.22μm滤器(Sartorius)除菌过滤，分装，-80℃冰箱保存。

3、CAR-T细胞制备

取肿瘤患者或者健康志愿者外周血50mL，肝素抗凝，离心分离后获得的血清，经56℃灭活备用。

沉淀细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶液(购自GE)的离心管中，以密度梯度离心法分离得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，生理盐水洗涤2次，计数备用。

用淋巴细胞培养基KBM 581无血清细胞培养基(Corning)重悬PBMC，调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，接种至T75细胞培养瓶，加入抗人CD3单抗(OKT-3)激活PBMC，同时补加500IU/mL的重组人白细胞介素2(rhIL-2)，5～10％血浆，在37℃、5％CO₂培养箱培养，得到激活的T细胞。

取激活过夜的T细胞，加入纯化的慢病毒(MOI＝5)，离心感染，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

慢病毒感染24h后离心换液，重悬于KBM581培养基中，加入5～10％血浆和500IU/mL rhIL-2继续扩增。

PBMC经刺激培养过夜后，计数，离心，然后用含有重组人白细胞介素2(rhIL-2)的淋巴细胞培养基KBM 581无血清细胞培养基重悬，使T淋巴细胞密度达到2～5×10⁶/mL，将T淋巴细胞等分至6孔板中，加入纯化的慢病毒液(MOI＝5)和聚凝胺(polybrene，终浓度6μg/mL)。离心感染，700g，1.5h，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。

慢病毒感染24h后离心换液，重悬于KBM581培养基中，加入5～10％血浆和500IU/mL rhIL-2，于37℃、5％CO₂培养箱继续扩增培养，适时换液并将细胞逐步转移到更大体积的培养瓶或培养袋中。

在慢病毒感染后第3天，通过流式细胞术检测T细胞转染为CAR-T细胞的阳性率，结果如图1所示，本实施例制得的CAR-T细胞的阳性率约为85.9％。

实施例2达沙替尼调控CAR-T细胞的基因表达

1.达沙替尼处理CAR-T细胞

取实施例1制备的CAR-T细胞，4℃下12000g离心10min，弃上清，用KBM581培养基重悬，并将细胞密度调整为1×10⁶个细胞/mL。将2mLCAR-T细胞悬液接种到12孔板中，得到2×10⁶个细胞/孔。将12个孔分为4组，每组3个孔，其中一组加入二甲基亚砜(DSMO)作为对照组，另外3组分别加入等体积的不同浓度的达沙替尼，使体系中的达沙替尼终浓度分别为1μM、5μM、10μM)，置于37℃、5％ CO₂培养箱培养。24h后从各组中分别取10mL的溶液进行细胞计数并计算细胞存活率。

本实施例中的细胞存活率计算公式为细胞存活率＝活细胞数/细胞总数×100％。

结果如图2所示，DMSO处理组的CAR-T细胞的细胞存活率为96.20％±0.44％，1μM、5μM和10μM的达沙替尼处理组的CAR-T细胞的细胞存活率分别为97.7％±0.40％、95.23％±0.15％和85.10±2.56％，1μM和5μM的达沙替尼对CAR-T细胞的存活率没有显著影响，而10μM的达沙替尼显著降低CAR-T细胞的细胞活率；此外，在活细胞数统计图中，1μM的达沙替尼的对CAR-T细胞的活细胞数也无显著影响，而在5μM和10μM的达沙替尼处理下，CAR-T的活细胞数发生显著降低，分别仅为对照组的57.84％±5.29％和40.17±2.34％。以上结果说明1μM的达沙替尼对CAR-T细胞无细胞毒性且不影响其增殖。

2.提取细胞总RNA

(1)分别取上述各组中的CAR-T细胞悬液，在4℃下500g离心5min，弃上清，加入0.5mL总RNA提取试剂(TRIzol reagent，购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司)重悬细胞沉淀，充分混匀。

(2)加入0.1mL氯仿，剧烈振荡15s，静置3min。在4℃下12000g离心10min。

(3)将最上层液体转移至一新的1.5mL离心管中，加入1mL异丙醇，-20℃冰箱静置20min以上。

(4)在4℃下12000g离心10min，去掉上清液，并向离心管中加入1mL 70％乙醇清洗沉淀。在4℃下7500g离心10min，去掉上清，重复此步骤一次。

(6)将保留有沉淀的离心管放入超净台中干燥，用1mL的ddH₂O重悬沉淀，并用超微量核酸分析仪检测抽提RNA浓度。

3.cDNA合成

使用cDNA合成试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Thermo))将上述步骤中提取的总RNA反转录成cDNA，步骤如下：

(1)在一新的RNase-free PCR管中，配制表1所示反应体系：

表1

名称	用量
		上述步骤中提取得到的总RNA	1μg
10×反应缓冲液(含MgCl2)	1μL
		脱氧核糖核酸酶I(EN0521)	1μL
无核酸酶纯水	10μL

(2)涡旋混匀，瞬时离心后在37℃环境下孵育30min；

(3)向混合液中加入1μL 50mM的EDTA，涡旋混匀，瞬时离心后65℃孵育10min。

(4)在无菌PCR管中配制表2所示反应体系：

表2

名称	体积(μL)
		RNA	10
Oligo(dT)18(来自cDNA合成试剂盒)	1
		无核酸酶纯水	1

(5)将管中液体涡旋混匀，瞬时离心，65℃孵育5min后即刻置于冰上冷却；

(6)向管中加入如表3所示组分：

表3

名称	体积(μL)
		5×反应缓冲液	4
RiboLock RNase inhibitor(20U/μL)	1
		10mM脱氧核糖核苷三磷酸混合物	2
RevertAid M-MuLVRT(200U/μL)	1
		总体积	20

(7)混合均匀，瞬时离心。将管中反应液42℃孵育60min，70℃孵育5min，即完成cDNA的合成。

4.实时荧光定量PCR检测细胞因子的相对表达量

使用qPCR试剂盒TBPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus，购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TAKARA))，按照说明书操作检测4组CAR-T细胞中的细胞因子(IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、4-1BB)的相对表达量，步骤如下：

(1)qPCR引物设计与合成：

IL-6的检测引物为IL6-F/R，上游引物IL6-F序列如SEQ ID NO：3所示；下游引物IL6-R的序列如SEQ ID NO：4所示。

IL-10的检测引物为IL10-F/R，上游引物IL10-F序列如SEQ ID NO：5所示；下游引物IL10-R的序列如SEQ ID NO：6所示。

IFN-γ的检测引物为IFN-γ-F/R，上游引物IFN-γ-F序列如SEQ ID NO：7所示；下游引物IFN-γ-R的序列如SEQ ID NO：8所示。

TNF-α的检测引物为TNF-α-F/R，上游引物TNF-α-F序列如SEQ ID NO：9所示；下游引物TNF-α-R的序列如SEQ ID NO：10所示。

4-1BB的检测引物为4-1BB-F/R，上游引物4-1BB-F序列如SEQ ID NO：11所示；下游引物4-1BB-R的序列如SEQ ID NO：12所示。

(2)配制反应如表4所示体系：

表4

(3)混匀，瞬时离心。

(4)按照下述PCR反应程序进行扩增：

95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火32s，读板，共40次循环。

(5)qPCR反应结束后，导出各个样品的Ct值，采用2^-△△Ct分析不同浓度达沙替尼处理CAR-T细胞的细胞因子的相对表达量。

结果如图3所示，其中终浓度为1μM、5μM和10μM的达沙替尼均能显著降低CAR-T细胞的IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α的mRNA水平的表达，特别是低浓度的达沙替尼(1μM)对IL-6的下调最有效，而CAR-T临床中CRS的发生与IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等高度相关且常用托珠单抗(Tocilizumab，IL-6受体单克隆抗体)阻断IL-6/IL-6R来治疗CRS。此外，还通过qPCR检测了活化的T细胞标志物4-1BB的表达，结果如图4所示，1μM和5μM的达沙替尼均能显著下调4-1BB的mRNA水平的表达，且1μM的抑制作用更强，说明1μM的达沙替尼还能有效抑制CAR-T细胞的激活。

综上所述，1μM的达沙替尼不仅能显著下调CAR-T细胞中多种与免疫毒性发生相关的细胞因子(与IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α)的表达，还能显著下调T细胞标志物4-1BB的表达，抑制CAR-T细胞的激活，并且对1μM的达沙替尼对CAR-T细胞没有细胞毒性，因此，可以使用低浓度的达沙替尼来治疗CAR-T细胞治疗中出现的免疫相关毒性。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (5)

1.一种调控CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法为使用酪氨酸激酶抑制剂处理CAR-T细胞20~28h，所述调控CAR-T细胞是指抑制CAR-T细胞中细胞因子和CAR-T细胞激活标志物的表达，所述细胞因子包括IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α，所述CAR-T细胞激活标志物是4-1BB；所述酪氨酸激酶抑制剂为达沙替尼；所述CAR-T细胞为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞；

所述酪氨酸激酶抑制剂处理CAR-T细胞时在体系中的终浓度为1 μM；

所述CAR-T细胞的CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述方法为非疾病治疗方法。

2.达沙替尼作为唯一活性成分在制备抑制CAR-T细胞释放细胞因子和CAR-T细胞激活标志物的制剂中的应用；所述细胞因子包括IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α，所述CAR-T细胞激活标志物是4-1BB；所述CAR-T细胞为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞；所述CAR-T细胞的CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂中还包括药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、包衣材料、溶剂、pH调节剂、抗菌剂、等渗调节剂、螯合剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为注射剂，给药方式包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、鞘内注射。