CN116121175A - 一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法与应用，其包括：制备单细胞悬液；样本管中加入细胞裂解液和磁珠，细胞裂解液由如下终浓度的组分组成：100‑1000mM KCl、10‑200mMpH7.0‑9.0的Tris‑HCl、质量百分比浓度为0.05‑0.5％的NP‑40、1‑5URNA酶抑制剂；吸取单个细胞加入至样本管中，室温下涡旋；4℃下离心；将样本管放在预冷磁力架上，待磁珠吸附到样本管壁上后，吸取样本管中上清液即为细胞质及其内容物，原样本管中剩余物即为匹配的细胞核。本发明可对同一个单细胞进行高效的核质分离，同时回收配对的细胞核与细胞质，并保证各自的生物活性，为不同应用奠定基础。

Description

一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法与应用。

背景技术

细胞核是细胞遗传与代谢的调控中心，是细胞内遗传信息的储存、复制和转录的主要场所。细胞核借双层多孔的核膜与细胞质分隔，其完整地保存遗传物质，核基因组在细胞核内转录为各种类型RNA，部分前体RNA通过核孔进入细胞质，并在细胞质中翻译，表达出相应的蛋白。

细胞质是细胞质膜包围的除细胞核区外的物质总称。细胞质包括基质、细胞器和包含物。细胞质基质为各种细胞器维持其正常结构提供所需要的离子环境，为各类细胞器完成其功能活动供给所需的一切底物，同时也是进行某些生化活动的场所。细胞器是分布于细胞质内、具有一定形态、在细胞生理活动中起重要作用的结构，包括线粒体、内质网、高尔基体、液泡(溶酶体、囊泡)中心粒等。

细胞核通过核基因组等控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动，因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的重要方法。此外由于细胞质中也存在DNA遗传物质，以及细胞质和细胞核里的RNA和蛋白质在定位和功能等方面可能存在差异，为排除相互干扰，在某些情况下也需要去除细胞核的纯化细胞质。随着技术的发展，很多研究需在微量甚至单细胞水平开展，如在细胞工程中的核移植实验，就是将分离得到细胞核，然后与另外的细胞质或细胞核进行融合，构建杂交细胞。此外，细胞作为构成个体的基本单位，其功能与形态存在着广泛的异质性。得益于高通量测序技术与细胞分离技术的迅猛发展，对单个细胞进行单一组学的测序目前已较为成熟。根据建库方法的不同，现有的技术已实现在单细胞水平上对全基因组、转录组、表观遗传组以及蛋白质组学等进行独立分析和研究。但随着基础研究的不断深入，单一的组学测序技术已经难以完全满足科学研究的需要。因此，可以同时检测单个细胞中两个以及两个以上的组学信息的单细胞多组学技术近年来备受关注。有些研究人员将样本一分为二，用单细胞RNA-seq处理一半样本，用单细胞ATAC-seq处理另一半样本，从而同时获得转录组和表观基因组信息。然后，据此推断哪些类型的细胞在两个数据集中相互对应。然而，这种方法在很大程度上依赖于转录起始位点、启动子位置和基因表达水平之间关系的假设，以及有关不同类型细胞的表观遗传学特征的先验信息。此外，处理两份样本的不同流程之间的差异也可能会影响细胞状态和结果。同一单细胞多组学技术，对同一个单细胞进行有效的细胞核与细胞质的分离，可弥补单一组学技术无法在多维度解析单细胞多态性的缺陷，极大提高样本利用率的同时，也能对细胞的多态性进行更加全面地探索。目前，已有数十种单细胞多组学测序方案问世并在多个领域进行了成功的应用。因此，将细胞核与细胞质分离的核质分离技术是生物医学研究中的重要方法。

目前核质分离的方法主要包括：1)在组织层面的核质分离，是将不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化，细胞质留在离心的上清液中。该方法无法对单细胞进行有效的核质分离。2)利用显微注射进行的核质分离，是利用显微注射系统，在镜下将单个细胞的细胞核抽出，从而达到单细胞核质分离的目的。但该技术需要利用显微注射系统实现，对设备和人员操作要求极高，且难以实现批量的单细胞核质分离需求。3)利用酶消化的核质分离，是根据细胞膜和核膜裂解的难易程度用不同强度的裂解液裂解细胞，达到细胞质和细胞核物质分离的效果。该方法在裂解细胞膜后，难以实现细胞核与细胞质的分离和同步回收。

在进行核质分离以用于单细胞多组学测序分析方面，代表性的是美国10XGenomics公司的Chromium Single Cell MultiomeATAC+Gene Expression Reagent Kits。为同时获得同一细胞的转录组和表观组，该方法首先利用一个细胞核分离试剂盒，将3-50mg的组织在裂解液进行研磨捣碎，裂解液裂解细胞膜后，释放出细胞核，从而得到单细胞核悬液。之后利用Tn5转座酶对细胞核悬液进行核DNA转座，Tn5转座酶优先切割开放染色质区域中的核DNA形成DNA片段，之后加入预制的凝胶珠Gel Bead形成液滴，该Gel Bead已预先修饰了特异性条形码、唯一分子标识符的poly(dT)序列和带有特异性条形码的Spacer序列，poly(dT)序列用于捕获具有poly(dA)尾的mRNA，进而用于转录组文库的构建；Spacer序列能够将条形码添加到转座的DNA片段上进而用于染色质开放性ATAC文库构建。对得到的两种文库进行测序后通过数据处理，从而实现了同时对同一细胞的转录组和表观组进行分析的目的。该方案进行了核质分离并进行单细胞双组学测序，但本质上，该方案在裂解细胞(组织)后，仅回收了细胞核，之后的转录组文库构建，是对细胞核内的mRNA进行捕获建库，而细胞核中的mRNA含量较少，且包含大量新生转录的未成熟mRNA，因此在分析基因表达时，可能与绝大部分成熟mRNA主要富集的细胞质进行的转录组表达情况有所差异，因此是单细胞核多组学方案。且该方案无法回收匹配的细胞质，丢弃的细胞质中存在的细胞器以及其他细胞内含物也无法获取和回收。

因此，目前微量甚至单细胞水平的核质分离技术仍需要探索和完善。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法与应用。为了分离同一单细胞的细胞核与细胞质，保持其生物活性并进行有效回收，从而精准的匹配细胞核内与细胞质中的信息，本发明利用优化的细胞膜裂解液对单细胞进行单独裂解，实现有效裂解细胞膜的同时最大程度保证细胞核完整性，之后在单细胞裂解物中加入磁珠特异性吸附细胞核，通过磁力架实现对细胞核的固定，吸取上清即为细胞质内容物，留下吸附在磁珠上的即为对应的完整细胞核。通过本发明技术方案可对同一个单细胞进行高效的核质分离，同时回收配对的细胞核与细胞质，并保证各自的生物活性，为后续的不同应用奠定基础，如用于同一单细胞的多组学建库测序、细胞核移植、细胞内酶活性等生化检测、进一步的细胞器或细胞内容物分离等应用。

本发明的具体技术方案如下：

本发明第一方面提供一种分离单细胞中细胞核与细胞质的细胞裂解液，其由如下终浓度的组分组成：100-1000mM KCl、10-200mM pH7.0-9.0的Tris-HCl、质量百分比浓度为0.05-0.5％的NP-40、1-5U RNA酶抑制剂。

本发明第二方面提供一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法，包括如下步骤：

1)制备单细胞悬液；

2)样本管中加入所述细胞裂解液以及磁珠；

3)从步骤1)的单细胞悬液中吸取单个细胞加入至步骤2)样本管中，室温下涡旋，以破碎细胞膜，释放细胞质和细胞核；

4)将步骤3)涡旋后的样本管在4℃下离心，使细胞核沉于管底；

5)将步骤4)离心后的样本管放在预冷的磁力架上，待磁珠吸附到样本管壁上后，吸取样本管中上清液转移至一个新的样本管中，即为细胞质及其内容物，原样本管中剩余物即为匹配的细胞核。

进一步地，步骤2)中细胞裂解液的体积为2-5μL。

进一步地，步骤3)中涡旋的时间为30秒-2分钟。

进一步地，步骤4)中离心的转速为800-2000g，时间为30秒-2分钟。

本发明第三方面提供所述分离方法获得的细胞质及其内容物和/或细胞核。

本发明第四方面提供所述细胞质及其内容物在转录组文库构建、蛋白检测、代谢物检测、细胞质生化检测、细胞器和其他内容物分离或功能测定、蛋白印记分析或RNA剪切分析等中的应用。

本发明第五方面提供所述细胞核在细胞核内基因组文库构建、表观基因组文库构建、细胞核内转录组文库构建、蛋白检测、代谢物检测、细胞核移植或细胞核相关功能检测中的应用。

本发明第六方面提供所述细胞质及其内容物和细胞核在构建同一单细胞多组学文库中的应用。

进一步地，所述多组学文库选自转录组、基因组、甲基化、染色质可及性、蛋白组、代谢组、表观组学等中的两种以上。

本发明第七方面提供一种同一单细胞多组学分析的方法，包括：采用所述分离方法分离细胞质及其内容物和细胞核；基于分离的细胞质及其内容物和细胞核构建多组学文库；对得到的多组学文库进行测序；对得到的测序数据进行生物信息学分析。

本发明的有益效果为：

1)本发明可实现同一单细胞的核质分离，同步回收细胞质和匹配的细胞核，实现对同一单细胞细胞核和细胞质信息的准确匹配，而非预测推断的匹配关系，为后续独立分析细胞核与细胞质内的信息并进行关联分析提供了金标准；

2)本发明分离的细胞核与细胞质的内含物仍具有生物活性，可用于后续多种检测与分析，如细胞质及其内容物可用于后续转录组建库、蛋白组检测、代谢物检测、细胞内酶活性等生化检测、细胞器和其他内容物分离或功能测定、蛋白印记分析、RNA剪切等；匹配的细胞核可用于细胞核内基因组、表观基因组或细胞核内转录组建库、蛋白检测、代谢物检测，细胞核移植以及细胞核相关功能检测等；

3)本发明分离的细胞质可进一步提取其中的细胞器或其他内含物进行功能检测，从而实现细胞器或其他内含物与细胞核的准确匹配信息分析；

4)本发明的细胞裂解液将传统细胞裂解液中使用的MgCl₂和NaCl用KCl替换，调整Tris-HCl的PH值，以及降低NP-40的工作浓度，可更高效的裂解细胞膜，同时最大程度保证细胞核完整性以及细胞内涵物的生物活性；并且本发明分离方法操作简便，一般性的分子生物实验室即可开展，相比利用显微注射系统进行细胞核的抽取，在操作难度和样本通量方面得到了大大的提升和本质上的改进。

附图说明

图1DAPI染色后细胞核吸附在磁珠上。

图2分离单细胞的细胞质用于转录组建库的片段大小检测。

图3分离同一单细胞的细胞核用于DNA甲基化建库的片段大小检测。

图4实施例的实验流程图。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

本发明提供同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法，包括如下步骤：

1)利用酶消化等常规方法对组织/培养细胞等来源进行解离，制备成单细胞悬液；

2)按以下表1配方配制细胞裂解液：

表1

在一个具体的实施方案中，细胞裂解液配方如下表2：

表2

3)根据需求量准备样本管，每管加入表2所示细胞裂解液和适量的磁珠，备用；

4)从步骤1)的单细胞悬液中吸取单个细胞加入至步骤3)样本管中，室温下涡旋1分钟，以破碎细胞膜，释放细胞质和细胞核；

5)将样本管在4℃下以1500g离心1分钟，将细胞核沉于管底；

6)将样本管放在预冷的磁力架上1分钟或直到磁珠吸附到管壁上；

7)小心吸取样本管中上清液转移到一个新的样本管中，即为细胞质及其内容物，可用于后续转录组建库、细胞质生化检测、细胞器和其他内容物分离或功能测定、蛋白印记分析、RNA剪切等；

8)原样本管中剩余物即为匹配的细胞核，可用于细胞核内基因组、表观基因组或细胞核内转录组建库、细胞核移植以及细胞核相关功能检测等。

图4为实施例的实验流程图。

在一个具体的实施方案中，所述单个细胞为单个卵裂球。通过对单个卵裂球进行上述方法的核质分离，之后通过DAPI染色，可在镜下观察到完整的细胞核吸附于磁珠上(图1)。同时对分离的细胞质进行转录组建库，通过检测文库片段大小，可检测到300bp左右的目标片段峰(图2)，表明分离的细胞质中mRNA得到了有效保留，可用于进行转录组测序；同时对分离的细胞核进行DNA甲基化建库，可检测到约400bp的目标DNA片段信号峰(图3)，表明同步分离的细胞核保留了完整的染色质并可用于表观遗传等相关分析。以上结果表明，本发明分离方法具有很好的分离效率。

经申请人实验验证，采用表1所示配方范围的细胞裂解液进行同一单细胞中细胞核与细胞质的分离，通过DAPI染色，均可在镜下观察到完整的细胞核吸附于磁珠上，保证了细胞核完整性，在此不再赘述。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种分离单细胞中细胞核与细胞质的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液由如下终浓度的组分组成：100-1000mM KCl、10-200mM pH7.0-9.0的Tris-HCl、质量百分比浓度为0.05-0.5％的NP-40、1-5U RNA酶抑制剂。

2.一种同一单细胞中细胞核与细胞质的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备单细胞悬液；

2)样本管中加入权利要求1所述细胞裂解液以及磁珠；

3)从步骤1)的单细胞悬液中吸取单个细胞加入至步骤2)样本管中，室温下涡旋，以破碎细胞膜，释放细胞质和细胞核；

4)将步骤3)涡旋后的样本管在4℃下离心，使细胞核沉于管底；

5)将步骤4)离心后的样本管放在预冷的磁力架上，待磁珠吸附到样本管壁上后，吸取样本管中上清液转移至一个新的样本管中，即为细胞质及其内容物，原样本管中剩余物即为匹配的细胞核。

3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤2)中细胞裂解液的体积为2-5μL。

4.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤3)中涡旋的时间为30秒-2分钟；

步骤4)中离心的转速为800-2000g，时间为30秒-2分钟。

5.权利要求2-4任一项所述分离方法获得的细胞质及其内容物和/或细胞核。

6.权利要求5所述细胞质及其内容物在转录组文库构建、蛋白检测、代谢物检测、细胞质生化检测、细胞器和其他内容物分离或功能测定、蛋白印记分析或RNA剪切分析中的应用。

7.权利要求5所述细胞核在细胞核内基因组文库构建、表观基因组文库构建、细胞核内转录组文库构建、蛋白检测、代谢物检测、细胞核移植或细胞核相关功能检测中的应用。

8.权利要求5所述细胞质及其内容物和细胞核在构建同一单细胞多组学文库中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多组学文库选自转录组、基因组、甲基化、染色质可及性、蛋白组、代谢组、表观组学等中的两种以上。

10.一种同一单细胞多组学分析的方法，其特征在于，包括：采用权利要求2-4任一项所述分离方法分离细胞质及其内容物和细胞核；基于分离的细胞质及其内容物和细胞核构建多组学文库；对得到的多组学文库进行测序；对得到的测序数据进行生物信息学分析。

Images