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CN116121131B - 一株长双歧杆菌长亚种lf03及其在制备抗抑郁药物中的应用 - Google Patents

一株长双歧杆菌长亚种lf03及其在制备抗抑郁药物中的应用 Download PDF

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CN116121131B CN202211665992.0A CN202211665992A CN116121131B CN 116121131 B CN116121131 B CN 116121131B CN 202211665992 A CN202211665992 A CN 202211665992A CN 116121131 B CN116121131 B CN 116121131B
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Abstract

本发明公开了一株长双歧杆菌长亚种LF03及其在制备抗抑郁药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的一株长双歧杆菌长亚种LF03，保藏编号为CGMCCNo.23315。长双歧杆菌长亚种LF03在体内失眠模型中能显著增加斑马鱼的运动距离、狂躁时间、活跃时间，和显著减少静止时间，以及显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性，具备应用于体内预防或治疗抑郁症的潜能。本发明所述的长双歧杆菌长亚种LF03在制备治疗和/或预防抑郁症药物方面有巨大的潜在应用前景。

Description

一株长双歧杆菌长亚种LF03及其在制备抗抑郁药物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体地说是涉及一株长双歧杆菌长亚种LF03及其在制备抗抑郁药物中的应用。
背景技术
抑郁症是一种精神类疾病，其特征是持续抑郁、悲观、频繁失眠、精神痛苦，严重时还会出现身体症状。目前，治疗抑郁症主要运用抗抑郁药。然而，抗抑郁药物对于30-40％的患者的治疗效果较差，且大多数药物设计干扰大脑中神经递质的活性，会导致头痛、恶心、呕吐、腹泻等副作用。
因此，寻找一种疗效可靠、毒副作用小的治疗抑郁症的手段成为主要研究方向。与传统药物治疗相比，具有抗抑郁功效的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点，而被广泛关注。
一个成年人的肠道含有1013–1014个微生物，至少是人体细胞数量的10倍。总之，肠道微生物含有约300万个基因，是人类基因组中发现的基因数量的150倍。饮食、感染、疾病状况和其他因素会影响肠道微生物的组成，而异常微生物群会改变行为、免疫力和内分泌功能。肠道包含超过1亿个神经元，是神经、微生物和免疫细胞的聚集地。肠道菌群通过对神经形成、突触可塑性、神经递质信号传导、神经发育等核心神经系统过程的影响，调节中枢神经系统和外周神经功能，和神经炎症。另外，肠道微生物异常与自闭症谱系障碍、抑郁症和帕金森氏症有关。细菌是正常大脑发育和成人大脑功能所必需的。先前动物和临床研究的证据支持肠道微生物群在情绪调节中的关键作用，并且当将该菌群从重度抑郁症患者移植到正常小鼠中时，可引起小鼠出现抑郁行为。
当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄等国，而国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。
基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株长双歧杆菌长亚种LF03，及其在制备抗抑郁药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株长双歧杆菌长亚种LF03，所述长双歧杆菌长亚种LF03，于2021年08月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23315，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacteriumlongumsubsp.longum。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种工程菌株，以上述长双歧杆菌长亚种LF03为出发菌株构建而得。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护长双歧杆菌长亚种LF03在制备抗抑郁药物中的应用。
优选地，所述长双歧杆菌长亚种LF03在利血平诱导的斑马鱼抑郁模型中，可显著增加斑马鱼的运动距离、狂躁时间、活跃时间，显著降低静止时间，表现出良好的抗抑郁益生功效。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护长双歧杆菌长亚种LF03在制备抑制单胺氧化酶活性药物中的应用。
优选地，所述长双歧杆菌长亚种LF03能显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种治疗和/或预防抑郁症的药物，包括上述长双歧杆菌长亚种LF03或上述工程菌株。
优选地，所述药物剂型为菌悬液、粉剂或片剂。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种抑制单胺氧化酶活性的药物，包括上述长双歧杆菌长亚种LF03或上述工程菌株。
优选地，所述药物剂型为菌悬液、粉剂或片剂。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株长双歧杆菌长亚种LF03，并提供了长双歧杆菌长亚种LF03在制备抗抑郁药物中的应用，长双歧杆菌长亚种LF03是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在利血平诱导的斑马鱼抑郁模型中可显著增加斑马鱼的运动距离、狂躁时间、活跃时间，显著降低静止时间；同时能显著抑制斑马鱼体内单胺氧化酶的活性，具备应用于预防或治疗抑郁症的潜能，此为利用长双歧杆菌长亚种LF03开发预防或治疗抑郁症的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03在MRS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03对利血平诱导斑马鱼抑郁模型的运动轨迹的影响；
图3附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03对利血平诱导斑马鱼抑郁模型的运动距离的影响；
图4附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03对利血平诱导斑马鱼抑郁模型的狂躁时间的影响；
图5附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03对利血平诱导斑马鱼抑郁模型的活跃时间的影响；
图6附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03对利血平诱导斑马鱼抑郁模型的静止时间的影响；
图7附图为本发明长双歧杆菌长亚种LF03对斑马鱼体内单胺氧化酶活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1长双歧杆菌长亚种LF03分离、鉴定及保藏
(1)分离：
1)将长寿老人粪便(约0.1g)溶解于装有1mL无菌生理盐水的1.5mL离心管中，用1mL无菌枪头充分吹打混匀，备用。
2)在6个无菌1.5mL离心管中各加入900uL的无菌生理盐水。
3)从第1个装有10-1样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第2个离心管(10-2)，稀释到10-2；
4)从第2个装有10-2样品稀释液的离心管中，吸取100uL的液体加入第3个离心管(10-3)，稀释到10-3；
5)重复上个步骤，一直稀释到10-4、10-5、10-6、10-7。
6)从装有10-4样品稀释液的离心管中吸取100uL的样品稀释液涂布在分别接种于BS固体培养基、MRS固体培养基中上，将100uL的菌液摊平涂干，注意涂布的手法要温和，动作快速，必须在酒精灯火焰附近操作。涂布完成后，在培养皿侧面做好标记，包括姓名、样品编号、培养基名称、培养时间、稀释梯度、培养条件(厌氧/好氧)等信息。
7)重复上个步骤，完成10-5、10-6、10-7稀释梯度的稀释涂布。
8)涂布完成后，将培养皿分别放在37℃、厌氧养条件下进行培养，48h后可进行观察记录。
9)用接种环挑取平板上的单菌落划线至BS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，分离得到纯菌落。
10)将平板上的纯菌落接种于BS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。
(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16SrDNA通用引物27F和1492R扩增16SrDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。
其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16SrDNA鉴定，其中菌株LF03被鉴定为长双歧杆菌长亚种，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
TACCATGCAAGTCGACGGGATCCATCAGGCTTTGCTTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATACACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCAGTTGATCGCATGGTCTTCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGGTCGTAGAGATACGGCTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTATGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACGCGGCGACGCGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGATGGAGCCGTC；SEQ ID NO.3。
菌株LF03单菌落接种到BS固体培养基上，在37℃厌氧下生长良好，菌落乳白色、呈球形、边缘整齐，表面光滑(参见附图1)。菌株LF03已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年08月30日，分类命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacteriumlongum subsp.longum，保藏编号为CGMCC No.23315。
实施例2长双歧杆菌长亚种LF03菌悬液(菌体)的制备
将长双歧杆菌长亚种LF03活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养24h后，4℃，6000r/min离心10min，得到菌体沉淀；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为调整细胞浓度为1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL得到菌悬液(菌体)。
实施例3长双歧杆菌长亚种LF03对斑马鱼抑郁模型的影响
利血平购自Sigma公司；盐酸氯吉林购自MedChemExpress公司。
挑选发育至3dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于96孔细胞培养板中。实验设置正常组、模型组、阳性对照组、菌株干预组(1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03)，每组设置20个复孔，每孔1条鱼。正常组和模型组均加入PBS，阳性对照组加入盐酸氯吉林溶液(5μmol/L)，1×104CFU/mL干预组加入1×104CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03，1×105CFU/mL干预组加入1×105CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03，1×106CFU/mL干预组加入1×106CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03，每孔200μL，28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育48h后弃上述溶液，正常组加入PBS，模型组、阳性对照组、菌株干预组(1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03)均加入利血平溶液(2mg/L)，每孔200μL，28℃孵育48h后，将96孔细胞培养板置于斑马鱼行为分析系统(EthoVisionXT10.4，诺达思信息技术有限责任公司)中进行轨迹跟踪，关闭光源使斑马鱼适应环境5min，随后开启行为轨迹分析软件，采集斑马鱼在黑暗环境下5min内的行为轨迹。统计斑马鱼的运动距离；同时根据斑马鱼的游动速率将斑马鱼划分为3种运动状态：静止(<4mm/s)、活跃(4-20mm/s)、狂躁(>20mm/s)，并统计斑马鱼的狂躁时间、活跃时间、静止时间。
采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SEM数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：####p<0.001，与模型组相比：&&&&p<0.001；用单因素方差分析,与模型组相比：*P<0.05，***P<0.005，****P<0.001。
结果见附图2-6；由附图2和附图3可知，红色的区域为斑马鱼运动的路径所覆盖的区域；与正常组相比，模型组斑马鱼的运动轨迹减少，表明模型组斑马鱼的活跃程度降低；同时，与正常组(75.88±2.08cm)相比，模型组斑马鱼的运动距离(37.37±1.79cm)显著缩短(p<0.001)，表明本次斑马鱼抑郁模型建立成功。
与模型组相比，阳性对照组(盐酸氯吉林)斑马鱼的运动轨迹增加，表明盐酸氯吉林在利血平诱导的斑马鱼抑郁模型中，可提高斑马鱼的活跃程度；同时阳性对照组斑马鱼的运动距离为68.18±2.62cm，与模型组(37.37±1.79cm)相比差异性显著(P<0.001)。因此，盐酸氯吉林具有抗抑郁的作用，与临床结果一致。与模型组相比，长双歧杆菌长亚种LF03组斑马鱼的运动轨迹增加，表明长双歧杆菌长亚种LF03在利血平诱导的斑马鱼抑郁模型中，可提高斑马鱼的活跃程度；同时长双歧杆菌长亚种LF03浓度为1×105CFU/mL和1×106CFU/mL时，斑马鱼的运动距离分别为53.09±3.02cm、60.66±1.85cm，与模型组(37.37±1.79cm)相比较均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明长双歧杆菌长亚种LF03在体内抑郁模型中均能显著增加斑马鱼的运动距离，表现出缓解抑郁的作用。
由附图4、附图5和附图6可知，与正常组(狂躁时间：21.28±0.76s、活跃时间：63.43±1.91s、静止时间：215.28±1.88s)相比，模型组斑马鱼的狂躁时间(6.51±0.40s)、活跃时间(35.63±1.60s)均显著减少(p<0.001)，静止时间(257.87±1.65s)显著增加(p<0.001)，表明本次斑马鱼抑郁模型建立成功。
与模型组(狂躁时间：6.51±0.40s、活跃时间：35.63±1.60s、静止时间：257.87±1.65s)相比，阳性对照组斑马鱼的狂躁时间(18.16±0.76s)、活跃时间(58.15±3.83s)均显著增加(p<0.001)，静止时间(223.69±3.96s)显著减少(p<0.005)，表明盐酸氯吉林具有抗抑郁的作用，与临床结果一致。与模型组(狂躁时间：6.51±0.40s、活跃时间：35.63±1.60s、静止时间：257.87±1.65s)相比，1×105CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03和1×106CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03组斑马鱼的狂躁时间(1×105CFU/mL组：13.14±0.55s、1×106CFU/mL组：15.28±0.72s)、活跃时间(1×105CFU/mL组：45.17±3.10s、1×106CFU/mL组：52.02±3.27s)均显著增加(p<0.05)，静止时间(1×105CFU/mL组：241.69±3.11s、1×106CFU/mL组：232.70±3.09s)均显著减少(p<0.005)。
因此，上述结果表明长双歧杆菌长亚种LF03在体内抑郁模型中均能显著增加斑马鱼的狂躁时间、活跃时间，和显著减少静止时间，表现出缓解抑郁的作用。
实施例4长双歧杆菌长亚种LF03对斑马鱼体内单胺氧化酶活性的影响
盐酸氯吉林购自MedChemExpress公司；单胺氧化酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。
将野生型AB系斑马鱼(5dpf)置于于六孔板中。实验设置正常组、阳性对照组(盐酸氯吉林)、菌株干预组(1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03)，每组设置6个复孔，每孔30条鱼。正常组每孔加入5mLPBS；阳性对照组每孔加入5mL5μmol/L盐酸氯吉林溶液；1×104CFU/mL干预组加入1×104CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03，1×105CFU/mL干预组加入1×105CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03，1×106CFU/mL干预组加入1×106CFU/mL长双歧杆菌长亚种LF03，每孔5mL，28℃孵育，24h后更换新溶液；孵育72h后收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管20条斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入100μL的冷PBS，用S-18KS手持微量电动组织匀浆器将斑马鱼匀浆破碎，直至无明显组织碎块，12000×g，4℃离心10min，收集上清液于离心管中，使单胺氧化酶测定试剂盒检测上清液中单胺氧化酶活性。
采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SD数据表示，用T-检验分析，与正常组相比：####p<0.001；用单因素方差分析,与正常组相比：****P<0.001(参见附图7)。
由附图7可知，盐酸氯吉林组斑马鱼体内单胺氧化酶活性为0.14±0.01U/min/mL，与正常组(0.50±0.02U/min/mL)相比差异性显著(P<0.001)，表明本次斑马鱼体内单胺氧化酶活性的检测实验有效。
长双歧杆菌长亚种LF03浓度为1×105CFU/mL和1×106CFU/mL时，斑马鱼体内单胺氧化酶活性分别为0.31±0.02U/min/mL和0.23±0.02U/min/mL，与正常组(0.50±0.02U/min/mL)相比差异性显著(P<0.001)。
人体内有许多游离的有生物活性的单胺类物质，如儿茶酚胺肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等。这些单胺是对人体有特殊作用的物质。这些物质作为神经元突触的递质，平时储存在细胞中，神经冲动则释放到神经突触间隙中，与受体结合，起到冲动传导的作用。而突触间隙中的单胺类则被单胺氧化酶氧化脱氨而分解消除。所以单胺氧化酶起着调节神经细胞内及突触间隙单胺浓度的作用。单胺氧化酶抑制剂的作用则是抑制单胺氧化酶，使5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺等神经递质的降解减少，使其在脑组织中含量增多。因为脑内单胺浓度的降低可以致使人患上抑郁症，因此单胺氧化酶抑制剂可以起到治疗抑郁症的作用。
上述结果表明，本发明长双歧杆菌长亚种LF03对斑马鱼体内单胺氧化酶抑制作用，具有预防或治疗抑郁症的潜能。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一株长双歧杆菌长亚种LF03，其特征在于，所述长双歧杆菌长亚种LF03，于2021年08月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23315，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp. longum。
2.权利要求1所述长双歧杆菌长亚种LF03在制备抗抑郁药物中的应用。
3.一种治疗和/或预防抑郁症的药物，其特征在于，包括权利要求1所述长双歧杆菌长亚种LF03。
4.根据权利要求3所述的治疗和/或预防抑郁症的药物，其特征在于，所述药物剂型为菌悬液、粉剂或片剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mindful of probiotics for psychiatric comorbidities in IBS;Katrina Ray;Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology;20170524;第1页 *
ProbioticBifidobacterium longumNCC3001 Reduces DepressionScores and Alters Brain Activity: A Pilot Study in Patients WithIrritable Bowel Syndrome;Maria Ines Pinto-Sanchez;Gastroenterology;20170831;第448–459页 *

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