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CN116103412A - 鉴定奶牛胚胎种用价值的方法 - Google Patents

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CN116103412A CN202310205437.8A CN202310205437A CN116103412A CN 116103412 A CN116103412 A CN 116103412A CN 202310205437 A CN202310205437 A CN 202310205437A CN 116103412 A CN116103412 A CN 116103412A
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Abstract

本发明公开了鉴定奶牛胚胎种用价值的方法。该方法包括对离体的待测奶牛胚胎细胞进行基因组选择，得到待测奶牛胚胎的基因组育种值，根据基因组育种值鉴定奶牛胚胎种用价值。本发明开发了奶牛种用胚胎植入前遗传性能快速检测评估新技术，结合胚胎显微操作取样技术和基因组选择技术，对胚胎进行早期准确基因组检测和遗传评估。本发明首次将全基因组选择技术应用于奶牛胚胎早期检测，由原来的犊牛出生后检测转变为胚胎植入前预测后备牛的性状，筛选高品质胚胎，通过胚胎移植技术快速扩繁高产奶牛，构建高产奶牛育种核心群和筛选优秀种子母牛，提高奶牛定向和定性制种能力，培育优秀种牛，提高选择准确性，缩短育种周期，加快遗传进展，降低育种成本。

Description

鉴定奶牛胚胎种用价值的方法
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，涉及鉴定奶牛胚胎种用价值的方法，具体涉及利用基因组选择技术早期鉴定奶牛胚胎种用价值的方法。
背景技术
在传统的奶牛育种中，优秀种公牛需要经过后裔测定进行选择，其选择准确性高，但选择周期长(5～6年)、育种成本高、效率较低。优秀母牛个体通常基于系谱与产奶、体型等性状表型数据选择，准确性较差。基因组选择(Genomic selection，GS)是最新一代的育种技术，大幅度缩短了世代间隔，育种效率远远超过传统育种方法。目前，基因组选择主要应用于青年公牛、核心群母牛的早期选择。
胚胎生产和胚胎移植是奶牛良种快速扩繁的重要技术，目前已广泛应用于奶牛育种和奶牛养殖中。具有高育种价值的优秀胚胎可进一步加速优秀基因的扩繁，提高奶牛群体的生产水平，但如何鉴定胚胎的种用价值仍是目前未解决的技术难题，通常基于胚胎供体(母牛、公牛)的系谱信息(父亲、母亲、祖亲的生产性能或育种值)或供体母牛的产奶表现进行评价，准确性低，极大地影响了遗传进展和种群质量。鉴于此，有必要提供一种早期鉴定奶牛胚胎种用价值的方法，在胚胎移植前，即犊牛出生前，利用基因组选择技术鉴定并选择优秀胚胎进行移植，从而快速扩繁其携带的优秀遗传物质，进一步缩短育种周期，提高奶牛定向和定性制种能力，培育优秀种牛，加快群体遗传进展。由此，本发明提出一种早期准确鉴定奶牛胚胎种用价值的方法，包括体内胚、体外胚和克隆胚。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何早期准确鉴定奶牛胚胎(包括体内胚、体外胚和/或克隆胚)种用价值、提高奶牛的定向和定性制种能力、缩短奶牛育种周期和/或加快群体遗传进展。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了早期鉴定奶牛胚胎(包括体内胚、体外胚和/或克隆胚)种用价值的方法，所述方法可包括对离体的待测奶牛胚胎进行基因组选择，得到待测奶牛胚胎的基因组育种值，根据所述基因组育种值鉴定奶牛胚胎种用价值。
所述基因组选择在胚胎植入前进行。
所述待测奶牛胚胎包括体内胚、体外胚和/或克隆胚。
进一步地，所述鉴定奶牛胚胎种用价值可为奶牛种用胚胎植入前遗传性能的评估。
进一步地，所述遗传性能的评估包括评估下述至少任一性状的遗传价值：
F1)产奶性状；
F2)健康性状；
F3)体型性状。
进一步地，所述产奶性状的指标可为产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和/或乳蛋白率。
进一步地，所述健康性状的指标可为体细胞评分(奶牛乳房炎的指示性指标)。
进一步地，所述体型性状的指标可为体型总分、泌乳系统评分和/或肢蹄评分。
上述方法中，所述基因组选择的方法可包括如下步骤：
A1)从待测奶牛胚胎中利用显微操作技术获取少量胚胎细胞，提取所述少量胚胎细胞的微量基因组DNA；
A2)扩增所述微量基因组DNA并进行基因组DNA质量检测，获得质检后的基因组DNA；
A3)使用奶牛全基因组芯片对所述质检后的基因组DNA进行胚胎基因组检测，获得基因组芯片基因型数据，对所述基因组芯片基因型数据进行质量控制获得质控后的基因组芯片基因型数据；
A4)利用质控后的基因组芯片基因型数据进行基因组育种值估计。
所述质检后的基因组DNA可为质检后的足够量的基因组DNA。
本文所述少量胚胎细胞可为1～10个细胞。
所述1～10个胚胎细胞可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个胚胎细胞。
所述待测奶牛胚胎可为桑椹胚阶段的奶牛胚胎，包括体内胚、体外胚和/或克隆胚。
上述方法中，A2)中所述基因组DNA质量检测的方法可包括对扩增后的基因组DNA进行浓度、纯度和/或长度的检测，并进行基因组DNA完整性的检测。
上述方法中，所述基因组DNA完整性的检测可包括如下步骤：
B1)挑选位于奶牛不同染色体上的基因设计引物，所述基因包括SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因；
B2)以所述扩增后的基因组DNA为模板，利用B1)中的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
B3)利用所述扩增产物判断所述扩增后的基因组DNA的完整性。
进一步地，所述SESN2基因(Gene ID:509863)和RPL11基因(Gene ID:512745)为奶牛2号染色体上的功能基因；所述DDIT3基因(Gene ID:777788)与GAPDH基因(Gene ID:281181)为奶牛5号染色体上的功能基因；所述DGAT1基因(GeneID:282609)为奶牛14号染色体上的功能基因。
进一步地，B1)中所述引物可包括SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因的PCR扩增引物。
进一步地，所述PCR扩增引物可包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.10所示的引物组合物，其中：
SESN2基因引物F：5’-GAAGTCCCGTTTCATCATGC-3’(SEQ ID No.1)；
SESN2基因引物R：5’-TATCCGCTTGTCTGGCTTCT-3’(SEQ ID No.2)；
RPL11基因引物F：5’-CGGGTTAACTGTCCTTCATCC-3’(SEQ ID No.3)；
RPL11基因引物R：5’-AAGTGTAGGGTAACGGAAGGC-3’(SEQ ID No.4)；
DDIT3基因引物F：5’-TCCGGGTCCAACACTAAGTC-3’(SEQ ID No.5)；
DDIT3基因引物R：5’-GACGGGGTGTCTTTCTCGTA-3’(SEQ ID No.6)；
GAPDH基因引物F：5’-CAATGCTGAAACCTCCACGC-3’(SEQ ID No.7)；
GAPDH基因引物R：5’-AGCACTGCGGGAGAGTAGTA-3’(SEQ ID No.8)；
DGAT1基因引物F：5’-TGTGAAACCAAGTAAGATCGGC-3’(SEQ ID No.9)；
DGAT1基因引物R：5’-CAGGCTGACACCCAACGC-3’(SEQ ID No.10)。
进一步地，B2)中所述PCR扩增的反应条件可为：95℃反应5min；95℃反应30sec，58℃反应30sec，72℃反应40sec，共反应35个循环；72℃反应10min；4℃保存。
进一步地，B2)中所述PCR扩增的反应体系可为：正向引物F(10pmol/μL)1.25μL、反向引物R(10pmol/μL)1.25μL、2×Taq Master Mix 12.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O8μL。
上述方法中，A2)中所述扩增所述微量基因组DNA的时间可为4～8小时，优选地，A2)中所述扩增所述微量基因组DNA的时间可为4小时。
进一步地，A2)中所述扩增所述微量基因组DNA的反应条件可为：30℃扩增微量基因组DNA 4小时。
进一步地，A2)中所述扩增所述微量基因组DNA的反应体系(40μL)为：REPLI-g scReaction Bufffer 29μL、REPLI-g sc DNA Polymerase 2μL、H2O 9μL。
上述方法中，A3)中对所述基因组芯片基因型数据进行质量控制的方法可包括剔除SNP位点检出率低于90％、最小等位基因频率低于0.01的SNP位点。
进一步地，所述质量控制可使用plink软件对所述基因组芯片基因型数据进行质量控制，对个体检出率低于90％的胚胎可重新进行DNA提取及基因组芯片检测。
上述方法中，A4)中所述基因组育种值估计的方法包括如下步骤：
C1)将基于表型数据和系谱信息的常规育种值可靠性大于等于0.3的奶牛个体组成的群体作为计算参考群，通过逆回归迭代方程计算逆回归育种值；
C2)对所述质控后的基因组芯片基因型数据进行缺失基因型填充，对填充后基因型数据进行质量控制，得到填充质控后的芯片基因型数据；
C3)根据所述填充质控后的芯片基因型数据计算待测胚胎间的基因组亲缘关系，构建基因组关系矩阵；
C4)以C1)中所述逆回归育种值作为反应变量，基于单性状动物模型GBLUP方法计算待测胚胎的各性状基因组育种值(DGV)，数学模型如下：y＝μ+Zg+e
其中：y代表产奶性状、健康性状和体型性状的逆回归育种值；μ代表总体均值；Z代表基因组亲缘关系矩阵；g代表个体随机加性遗传效应向量；e代表随机残差效应向量；
C5)基于所述基因组育种值，根据基因组性能指数公式计算获得待测胚胎的基因组性能指数；
C6)根据待测胚胎的基因组育种值和/或基因组性能指数进行排名，由排名大小来进行奶牛胚胎种用价值鉴定。
上述方法中，C5)中所述基因组性能指数(GCPI)公式可如下所示：
Figure BDA0004110730830000041
其中，GEBVFat、GEBVProt、GEBVSCS、GEBVType、GEBVMS、GEBVF&L分别是乳脂量、乳蛋白量、体细胞评分、体型总分、泌乳系统、肢蹄评分性状的基因组育种值。
进一步地，C2)中所述质量控制的方法可为剔除SNP位点检出率低于90％、最小等位基因频率低于0.01的SNP位点。
本文所述检出率可为某个SNP位点被成功检测到的样本与所有样本的比值；最小等位基因频率可为在给定群体中不常见等位基因的发生频率。
进一步地，C3)中所述构建基因组关系矩阵(G阵)的计算过程为：
Figure BDA0004110730830000042
其中，M为n×m的矩阵，即n个个体，m个SNP。pk为第i个SNP的最小等位基因频率。P为n×m的矩阵，第k列元素为2pk。
上述方法中，C4)中所述产奶性状的指标可为产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和/或乳蛋白率，所述健康性状的指标可为体细胞评分，所述体型性状的指标可为体型总分、肢蹄评分和/或泌乳系统评分。
进一步地，所述产奶量为牛只自产犊后第一天开始到第305个泌乳日的总产奶量，单位为千克。乳脂率或乳蛋白率为牛只从产犊后第一天到本次测定日时的乳脂或乳蛋白总产量/总产奶量×100，单位为率(％)。乳脂量或乳蛋白量为产奶量×乳脂率或乳蛋白率/100，单位为千克。
进一步地，所述体细胞评分由体细胞数取对数转换而来，计算公式为log2(体细胞数/100)+3，其分值为0～9分，体细胞数越高对应的分值越大，是奶牛乳房健康的指示性指标。体细胞数指泌乳牛测定日牛奶中体细胞的数量，包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞和乳腺组织脱落的上皮细胞等，单位为千个/ml。
进一步地，所述体型总分包含体躯容量、尻部、肢蹄、泌乳系统和乳用特征；所述泌乳系统包含乳房形态、前乳房和后乳房；所述肢蹄评分包含蹄角度、蹄踵深度、骨质地、后肢侧视、后肢后视。奶牛体型性状通过专业的奶牛体型鉴定员评定，采用9分制评分方法，首先在奶牛第一胎产犊后的30～180天以内，由体型鉴定员按照标准对多个部位进行评分，之后通过系数加权进行整合。
上述方法中，A3)中所述全基因组芯片包含大量分子遗传标记，所述分子遗传标记为覆盖奶牛全基因组的高密度单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism，SNP)。
进一步地，所述分子遗传标记的信息可如下：覆盖奶牛全基因组的遗传标记，一般为单核苷酸多态性位点，常用商业化全基因组芯片包括GeneSeek 150K、GeneSeek100K、博瑞迪140K，分别包含139,376、95,256、139,097个SNP位点。
在本发明的一个实施方案中，所述全基因组芯片为博瑞迪140K全基因组芯片(货号PHR0105_Bt140K)。
本发明还提供了本文中任一所述方法的下述任一种应用：
D1)在早期鉴定奶牛胚胎种用价值中的应用；
D2)在构建奶牛育种核心群和筛选种子母牛中的应用；
D3)在提高奶牛定向和定性制种能力中的应用；
D4)在种牛自主培育和群体遗传改良中的应用；
D5)在缩短奶牛育种选择周期中的应用；
D6)在降低奶牛育种成本中的应用。
本发明研究开发了一种早期鉴定奶牛胚胎种用价值的方法，即奶牛胚胎植入前遗传性能(种用价值)快速检测评估新技术。结合胚胎显微操作取样技术和基因组选择技术，对胚胎进行桑椹胚早期基因组检测和遗传评估，筛选高品质优秀胚胎作为种用进行胚胎移植，获得优秀后备牛。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
现有技术中，将全基因组选择技术应用于奶牛胚胎早期检测存在的技术难点包括：早期胚胎少量活细胞显微操作取样技术、少量胚胎细胞的微量基因组DNA提取及基因组检测、基因组芯片数据质控等技术环节均未得到有效解决，从而难以在胚胎移植前进行种用价值鉴定。本发明首次优化建立了奶牛胚胎桑椹胚阶段显微操作获取少量细胞、少量细胞的微量基因组DNA提取与扩增、芯片数据质控及基因组评估技术流程，可以获得少量胚胎活细胞、足量且完整的基因组DNA、基因组芯片数据检出率不低于90％、芯片数据填充准确性不低于96％、主要性状平均遗传评估准确性不低于60％，而本发明相较于常规系谱指数的选择准确性提高了20％～30％(张沅，家畜育种学(第二版)，2018，中国农业出版社，第89页表4-8表明当性状遗传力为0.10、0.25、0.50时，采用常规系谱指数的选择准确性分别为23％、35％、50％。公维嘉，中国荷斯坦牛群体遗传分析的研究，中国农业大学博士学位论文，2010：我国荷斯坦奶牛的产奶、健康、体型性状的遗传力为0.09～0.50)。
其次，将全基因组选择技术应用于奶牛胚胎早期检测，可实现早期选择具有高育种价值的优秀胚胎，通过胚胎移植获得优秀后备牛，由原来的犊牛出生后检测转变为胚胎植入前预测后备牛的性状，相较于常规的犊牛出生后检测缩短育种周期12个月(母牛妊娠期9个月，犊牛出生后采集牛毛或血液样本进行基因组检测和评估时间3个月)，进一步缩短了育种周期，加快了遗传进展。另外，应用奶牛胚胎早期检测，筛选高品质优秀胚胎进行移植，淘汰遗传性能差的胚胎，节约了胚胎移植费用及其母牛妊娠、犊牛饲养所需费用，从而降低育种成本。由此，通过移植高品质优秀胚胎，可实现快速扩繁高产优秀奶牛，构建高产奶牛育种核心群，筛选优秀种子母牛，提高奶牛定向和定性制种能力，培育优秀种牛，进一步缩短奶牛育种世代间隔，加快遗传进展，降低育种成本。
附图说明
图1为奶牛胚胎显微操作获取1～10个胚胎细胞。
图2为4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果。
图3为4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA扩增的完整性(SESN2基因)。
图4为4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA扩增的完整性(RPL11基因)。
图5为4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA扩增的完整性(DDIT3基因)。
图6为4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA扩增的完整性(GAPDH基因)。
图7为4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA扩增的完整性(DGAT1基因)。
图8为扩增时间为4h的胚胎基因组芯片基因型数据结果。
图9为扩增时间为6h的胚胎基因组芯片基因型数据结果。
图10为扩增时间为8h的胚胎基因组芯片基因型数据结果。
图11为24枚待测胚胎基因组DNA的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果。
图12为24枚待测胚胎基因组DNA扩增的完整性(SESN2基因)。
图13为24枚待测胚胎基因组DNA扩增的完整性(RPL11基因)。
图14为24枚待测胚胎基因组DNA扩增的完整性(DDIT3基因)。
图15为24枚待测胚胎基因组DNA扩增的完整性(GAPDH基因)。
图16为24枚待测胚胎基因组DNA扩增的完整性(DGAT1基因)。
图17为24枚待测胚胎的基因组芯片基因型数据质量控制结果。
图18为鉴定奶牛胚胎种用价值的技术流程。
图19为24枚待测胚胎的基因组评估结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的IVC溶液为体外胚胎发育培养液，购自IVF Bioscience公司，货号71005。
下述实施例中的holding液为ICP bio公司产品，货号MPHM-500。
下述实施例中的桑椹胚阶段的奶牛胚胎来源于内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司。
实施例1、奶牛早期胚胎少量细胞的获得
本实施例从33枚奶牛胚胎中通过显微操作技术收集奶牛胚胎细胞，每枚奶牛胚胎取1～10个胚胎细胞，具体步骤如下：
1、将从牧场取回桑椹胚阶段的33枚奶牛胚胎，用IVC溶液洗掉holding液，将桑椹胚放入IVC溶液中进行培养。
2、在60mm皿底做滴，分为两行，第一行做三个滴，每个滴均为50μL的7％PVP(配方参见表1)；第二行做三个滴，每个滴均为100μL的HM(配方参见表2)，加6mL矿物油直至将液滴盖住。
3、将胚胎放入第二行任意的液滴里，用显微操作仪进行显微操作，用内径为20μm的注射针(injection)进行破透明带，透明带击破后，吸取出1～10个胚胎细胞(图1)，获得胚胎细胞样品用于后期胚胎少量细胞的微量基因组DNA提取与扩增，对所获得的胚胎基因组DNA进行基因组检测以及基因组遗传评估，选择高品质优秀胚胎作为种用。
表1、7％ PVP配方
组成 配比
PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 7g
Medium 199(1×) 93mL
表2、HM配方
组成 配比
PS(磷脂酰丝氨酸) 40μL
FBS(胎牛血清) 1mL
Medium 199(1×) 9mL
实施例2、奶牛胚胎少量细胞的微量基因组DNA提取
分别提取实施例1中获得的33枚奶牛胚胎少量细胞的基因组DNA，具体步骤如下：
1、将显微操作获取的每个奶牛胚胎的1～10个胚胎细胞放入加有4μL PBS的200μL离心管中。
2、根据表3配置细胞裂解缓冲液，将3μL细胞裂解缓冲液加入步骤1所述的200μL离心管中，轻弹离心管混匀，7000rmp离心1min；将离心管放置于PCR扩增仪(型号：BIO-RADT100)65℃孵育10min，以裂解胚胎细胞，释放基因组DNA；加入3μL Stop Solution终止细胞裂解反应，轻弹离心管混匀，7000rmp离心1min后放于冰上，停止细胞裂解，分别收获33枚奶牛胚胎的微量基因组DNA。
表3、细胞裂解缓冲液体系
Figure BDA0004110730830000081
实施例3、奶牛胚胎少量细胞的微量基因组DNA扩增方法优化
1、为获得足够量的符合基因组遗传评估要求的胚胎基因组DNA，对实施例2获得的微量基因组DNA进行扩增。根据表4配置反应体系，将40μL DNA扩增体系加入实施例2步骤2所述的200μL离心管(即含有微量基因组DNA的离心管)中，轻弹离心管混匀，7000rmp离心1min；将离心管放置于PCR扩增仪(型号：BIO-RAD T100)，30℃扩增微量基因组DNA 4～8小时；之后继续在PCR扩增仪(型号：BIO-RAD T100)65℃孵育3min，使REPLI-g sc DNAPolymerase酶失活，扩增后的基因组DNA于4℃或-20℃保存。
表4、胚胎基因组DNA扩增反应体系
Figure BDA0004110730830000091
在上述步骤中，考虑到扩增时间会影响胚胎基因组DNA的基因组检出率，本发明优化了步骤1中的微量基因组DNA的扩增时间。选取实施例1中33枚奶牛胚胎中的9枚具有相同供体母牛及供体公牛的胚胎，将9枚胚胎的微量基因组DNA的扩增时间设置3个不同梯度，分别为4h、6h、8h，每个时间参数含3枚胚胎，即3个生物学重复。
2、进一步比较分析4h、6h、8h三个扩增时间参数对所获得的胚胎基因组DNA浓度、纯度、长度的影响。
利用核酸分析仪(型号：NanoDrop 2000)测定9枚胚胎基因组DNA的浓度、纯度。4h、6h、8h三个扩增时间的胚胎基因组DNA质检结果如表5所示，9枚胚胎的DNA浓度均在193.6ng/uL～217.9ng/uL，DNA纯度A260/A280均在1.7～2.0，结果表明4h、6h、8h三个扩增时间的胚胎基因组DNA浓度、纯度均达到全基因组芯片检测要求。
利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测9枚胚胎基因组DNA的长度。4h、6h、8h三个扩增时间的胚胎基因组DNA的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，结果表明4h、6h、8h三个扩增时间所获得的胚胎基因组DNA长度均为2kb～10kb弥散条带，均符合胚胎基因组DNA扩增结果。
表5、4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组DNA质检结果
Figure BDA0004110730830000092
Figure BDA0004110730830000101
3、进一步比较分析4h、6h、8h三个扩增时间参数对所获得的胚胎基因组DNA完整性的影响。挑选位于奶牛不同染色体上的5个功能基因，包括2号染色体上的SESN2基因(GeneID:509863)与持家基因RPL11(Gene ID:512745)、5号染色体上的DDIT3基因(Gene ID:777788)与持家基因GAPDH(Gene ID:281181)、14号染色体上的DGAT1基因(Gene ID:282609)，利用primer3.0(http://primer3.wi.mit.edu/)分别设计5个基因的PCR扩增引物。以4h、6h、8h三个扩增时间所获得的胚胎基因组DNA为模板，分别以各基因的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，比较PCR扩增产物长度是否与目的片段长度相同，以此判断4h、6h、8h三个扩增时间所获得的胚胎基因组DNA完整性。4h、6h、8h三个扩增时间所获得的胚胎基因组DNA完整性的结果如图3～图7所示，结果表明4h、6h、8h三个扩增时间所获得胚胎基因组DNA的SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因扩增产物长度均符合目的条带长度，对挑选的5个基因均完整扩增，结果表明4h、6h、8h三个扩增时间获得的胚胎基因组DNA完整性好。
5个基因PCR扩增的引物序列、产物长度、退火温度见表6，PCR反应体系和PCR反应条件见表7和表8。
表6、5个基因PCR扩增引物序列、产物长度、退火温度
Figure BDA0004110730830000102
表7、PCR反应体系
Figure BDA0004110730830000103
Figure BDA0004110730830000111
表8、PCR反应条件
Figure BDA0004110730830000112
4、将步骤1所述的4h、6h、8h三个扩增时间参数获得的胚胎基因组DNA使用博瑞迪140K全基因组芯片(货号PHR0105_Bt140K)进行胚胎基因组检测，获得每枚胚胎的基因组芯片基因型数据。
5、使用plink软件对4h、6h、8h三个扩增时间所获得的胚胎基因组芯片基因型数据检出率进行分析。4h、6h、8h三个扩增时间的胚胎基因组芯片的检出率如图8～图10、表9所示。扩增时间为4小时，胚胎细胞的芯片数据个体检出率为0.929～0.975；扩增时间为6小时，胚胎细胞的芯片数据个体检出率为0.864～0.913；扩增时间为8小时，胚胎细胞的芯片数据个体检出率为0.865～0.910。结果表明微量基因组DNA扩增时间为4小时胚胎细胞的芯片数据的个体检出率明显高于6小时和8小时，更符合基因组遗传评估的要求。
表9、4h、6h、8h三个扩增时间胚胎基因组芯片数据个体检出率
胚胎编号 扩增时间 个体检出率
4-1 4小时 0.975
4-2 4小时 0.929
4-3 4小时 0.956
6-1 6小时 0.913
6-2 6小时 0.894
6-3 6小时 0.864
8-1 8小时 0.865
8-2 8小时 0.910
8-3 8小时 0.906
本实施例中基于基因组遗传评估的奶牛胚胎少量细胞的微量基因组DNA扩增方法优化为本发明首次创新完成，通过上述比较分析4h、6h、8h三个扩增时间对所获得的胚胎基因组DNA浓度、纯度、完整性及基因组芯片检出率的影响，结果发现扩增时间为4小时的胚胎基因组DNA芯片检出率显著高于6小时和8小时，同时浓度和纯度符合基因组芯片检测要求，所获得的胚胎基因组DNA完整性好。
实施例4、待测胚胎少量细胞的微量基因组DNA扩增及基因组DNA质量检测
1、基于实施例3所优化的奶牛胚胎微量基因组DNA扩增时间参数为4小时，对33枚奶牛胚胎中的剩余24枚待测胚胎的微量基因组DNA进行扩增，其它步骤同实施例3的步骤1所述，得到扩增后的基因组DNA，并进一步对扩增后的基因组DNA进行质量检测。
2、检测24枚待测胚胎所获得的基因组DNA(即步骤1中获得的扩增后的基因组DNA)浓度、纯度、长度，具体步骤同实施例3的步骤2所述，质检结果见表10，DNA浓度为102.1ng/uL～252.6ng/uL，DNA纯度A260/A280为1.7～2.0，结果表明24枚待测胚胎的基因组DNA浓度、纯度均符合全基因组芯片检测要求。24枚待测胚胎基因组DNA的1.0％琼脂糖凝胶电泳结果如图11所示，基因组DNA长度为2kb～10kb弥散条带，符合胚胎基因组DNA扩增结果。
3、检测24枚待测胚胎所获得的基因组DNA的完整性，步骤同实施例3中的步骤3，最终获得质检后的基因组DNA。24枚待测胚胎所获得的胚胎基因组DNA完整性的结果如图12～图16所示，结果表明：24枚待测胚胎所获得胚胎基因组DNA的SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因扩增产物长度均符合目的条带长度，对挑选的5个基因均完整扩增，结果表明24枚待测胚胎获得的胚胎基因组DNA完整性好。
表10、24枚待测胚胎的基因组DNA质检结果
Figure BDA0004110730830000121
Figure BDA0004110730830000131
实施例5、24枚待测胚胎基因组芯片基因型数据的获得和质量控制
1、将24枚待测胚胎的基因组DNA(即实施例4中获得的质检后的基因组DNA)使用博瑞迪140K全基因组芯片(货号PHR0105_Bt140K)进行胚胎基因组检测，获得每枚胚胎的基因组芯片基因型数据。
2、使用plink软件对24枚待测胚胎的基因组芯片基因型数据进行质量控制，获得质控后的基因组芯片基因型数据。质量控制方法为：剔除SNP位点检出率低于90％、最小等位基因频率低于0.01的SNP位点。对芯片数据个体检出率低于90％的胚胎可重新进行DNA提取及芯片检测。质量控制结果如图17所示。
实施例6、24枚待测胚胎的基因组遗传评估
基于发明人前期构建的大规模中国荷斯坦牛基因组选择参考群体(张琪，整合GWAS先验信息的奶牛基因组遗传评估研究，中国农业大学硕士学位论文，2022)的基因组芯片数据和逆回归育种值数据，利用质控后的基因组芯片基因型数据，对24枚待测胚胎进行基因组育种值估计，具体方法如下：
1、基于中国荷斯坦牛基因组参考群群体，筛选常规育种值(EBV)可靠性大于等于0.3的个体作为计算参考群(共17,940头)，通过逆回归迭代方程计算逆回归育种值(DRP)。
2、基于17,940头参考群体，使用Beagle5.0软件对24枚待测胚胎基因组芯片基因型数据(即质控后的基因组芯片基因型数据)进行缺失基因型填充，之后以实施例5步骤2所述方法对填充后基因型数据进行质控，得到填充质控后的芯片基因型数据。
3、基于填充质控后的芯片基因型数据(包括参考群及待测胚胎)，计算24枚待测胚胎间的基因组亲缘关系，构建基因组关系矩阵(G阵)，计算过程为：
Figure BDA0004110730830000141
其中，M为n×m的矩阵，即n个个体，m个SNP。pk为第i个SNP的最小等位基因频率。P为n×m的矩阵，第k列元素为2pk。
4、以参考群体个体的逆回归育种值作为反应变量，基于单性状动物模型GBLUP方法，使用DMU软件计算24枚待测胚胎的各性状直接基因组育种值(DGV)，数学模型如下：
y＝u+Zg+e
其中，y：产奶性状(产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)、健康性状(体细胞评分)和体型性状(体型总分、肢蹄评分或泌乳系统评分)的逆回归育种值；μ：总体均值；Z：基因组亲缘关系矩阵；g：个体随机加性遗传效应向量；e：随机残差效应向量。
5、基于直接基因组育种值，根据中国奶牛基因组性能指数(GCPI)公式，获得24枚待测胚胎的GCPI。GCPI公式如下：
Figure BDA0004110730830000142
其中，GEBVFat、GEBVProt、GEBVSCS、GEBVType、GEBVMS、GEBVF&L分别是乳脂量、乳蛋白量、体细胞评分、体型总分、泌乳系统、肢蹄评分性状的基因组育种值。
6、根据24枚待测胚胎各性状的基因组育种值和/或GCPI数值，从大到小进行排名，鉴定24枚待测胚胎的种用价值，选择高品质优秀胚胎作为种用。通过移植高品质优秀胚胎，可实现快速扩繁高产优秀奶牛，构建高产奶牛育种核心群，筛选优秀种子母牛，提高了奶牛定向和定性制种能力，培育优秀种牛，进一步缩短奶牛育种世代间隔，加快遗传进展，降低育种成本。
本发明建立了早期鉴定奶牛胚胎种用价值的完整技术流程(如图18所示)，24枚待测胚胎的基因组评估结果如图19所示。结果表明本发明建立了奶牛胚胎桑椹胚阶段显微操作获取1～10个细胞、少量胚胎细胞的微量基因组DNA提取与扩增、基因组芯片数据质控及基因组评估技术流程，能够获得1～10个桑椹胚活细胞、足量且完整的基因组DNA、基因组芯片数据检出率不低于90％、芯片数据填充准确性不低于96％、主要性状的平均基因组评估准确性不低于60％。
本发明相较于常规系谱指数的选择准确性，提高了20％～30％(张沅，家畜育种学(第二版)，2018，中国农业出版社，第89页表4-8表明当性状遗传力为0.10、0.25、0.50时，采用常规系谱指数的选择准确性分别为23％、35％、50％。公维嘉，中国荷斯坦牛群体遗传分析的研究，中国农业大学博士学位论文，2010：产奶、健康、体型性状的遗传力为0.09～0.50)。
将全基因组选择技术应用于奶牛胚胎早期检测，可实现早期选择具有高育种价值的优秀胚胎，通过胚胎移植获得优秀后备牛，由原来的犊牛出生后检测转变为胚胎植入前预测后备牛的性状，相较于常规的犊牛出生后检测缩短育种周期12个月(母牛妊娠期9个月，犊牛出生后采集牛毛或血液样本进行基因组检测和评估时间3个月)，进一步缩短了育种周期，加快了遗传进展。另外，应用奶牛胚胎早期检测，筛选高品质优秀胚胎进行移植，淘汰遗传性能差的胚胎，节约了胚胎移植费用以及母牛妊娠、犊牛饲养所需费用，从而降低了育种成本。通过移植高品质优秀胚胎，可实现快速扩繁高产优秀奶牛，构建奶牛育种核心群，筛选种子母牛，提高了奶牛定向和定性制种能力，培育优秀种牛，进一步缩短了奶牛育种世代间隔，加快了遗传进展，降低了育种成本。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.鉴定奶牛胚胎种用价值的方法，其特征在于，所述方法包括对离体的待测奶牛胚胎进行基因组选择，得到待测奶牛胚胎的基因组育种值，根据所述基因组育种值鉴定奶牛胚胎种用价值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组选择的方法包括如下步骤：
A1)从待测奶牛胚胎中利用显微操作技术获取少量胚胎细胞，提取所述少量胚胎细胞的微量基因组DNA；
A2)扩增所述微量基因组DNA并进行基因组DNA质量检测，获得质检后的基因组DNA；
A3)使用奶牛全基因组芯片对所述质检后的基因组DNA进行胚胎基因组检测，获得基因组芯片基因型数据，对所述基因组芯片基因型数据进行质量控制获得质控后的基因组芯片基因型数据；
A4)利用质控后的基因组芯片基因型数据进行基因组育种值估计。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，A2)中所述基因组DNA质量检测的方法包括对扩增后的基因组DNA进行浓度、纯度和/或长度的检测，并进行基因组DNA完整性的检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA完整性的检测包括如下步骤：
B1)挑选位于奶牛不同染色体上的基因设计引物，所述基因包括SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因；
B2)以所述扩增后的基因组DNA为模板，利用B1)中的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
B3)利用所述扩增产物判断所述扩增后的基因组DNA的完整性。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于，A2)中所述扩增所述微量基因组DNA的时间为4～8小时，优选地，A2)中所述扩增所述微量基因组DNA的时间为4小时。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于，A3)中对所述基因组芯片基因型数据进行质量控制的方法包括剔除SNP位点检出率低于90％、最小等位基因频率低于0.01的SNP位点。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于，A4)中所述基因组育种值估计的方法包括如下步骤：
C1)将基于表型数据和系谱信息的常规育种值可靠性大于等于0.3的奶牛个体组成的群体作为计算参考群，通过逆回归迭代方程计算逆回归育种值；
C2)对所述质控后的基因组芯片基因型数据进行缺失基因型填充，对填充后基因型数据进行质量控制，得到填充质控后的芯片基因型数据；
C3)根据所述填充质控后的芯片基因型数据计算待测胚胎间的基因组亲缘关系，构建基因组关系矩阵；
C4)以C1)中所述逆回归育种值作为反应变量，基于单性状动物模型GBLUP方法计算待测胚胎的各性状基因组育种值，数学模型如下：y＝μ+Zg+e
其中：y代表产奶性状、健康性状和体型性状的逆回归育种值；μ代表总体均值；Z代表基因组亲缘关系矩阵；g代表个体随机加性遗传效应向量；e代表随机残差效应向量；
C5)基于所述基因组育种值，根据基因组性能指数公式计算获得待测胚胎的基因组性能指数；
C6)根据待测胚胎的基因组育种值和/或基因组性能指数进行排名，由排名大小来进行奶牛胚胎种用价值鉴定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，C5)中所述基因组性能指数公式如下所示：
Figure FDA0004110730820000021
其中，GEBVFat、GEBVProt、GEBVSCS、GEBVType、GEBVMS、GEBVF&L分别是乳脂量、乳蛋白量、体细胞评分、体型总分、泌乳系统、肢蹄评分性状的基因组育种值。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，C4)中所述产奶性状的指标为产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和/或乳蛋白率，所述健康性状的指标为体细胞评分，所述体型性状的指标为体型总分、肢蹄评分和/或泌乳系统评分。
10.权利要求1-9中任一所述方法的下述任一种应用：
D1)在早期鉴定奶牛胚胎种用价值中的应用；
D2)在构建奶牛育种核心群和筛选种子母牛群中的应用；
D3)在提高奶牛定向和定性制种能力中的应用；
D4)在种牛自主培育和群体遗传改良中的应用；
D5)在缩短奶牛育种选择周期中的应用；
D6)在降低奶牛育种成本中的应用。
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