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CN116103342A - 基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法 - Google Patents

基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法 Download PDF

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CN116103342A
CN116103342A CN202211612527.0A CN202211612527A CN116103342A CN 116103342 A CN116103342 A CN 116103342A CN 202211612527 A CN202211612527 A CN 202211612527A CN 116103342 A CN116103342 A CN 116103342A
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cas9
sheep
crispr
tracing
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邓守龙
许雪玲
李岩
连正兴
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China Agricultural University
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China Agricultural University
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Abstract

本发明公开了基于CRISPR‑Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法，具体是CRISPR‑Cas9介导的羊Rosa26基因敲除和定点插入Cas9‑T2A‑EGFP基因的方法，用来对合成靶DNA进行编辑。本发明还提供由合成靶DNA介导的谱系示踪载体。该载体包含40种整合条码和合成靶DNA及相应的三个独立转录sgRNA。该合成靶DNA嵌入在表达红色荧光蛋白tdTomato的PB转座子载体上。此系统能够产生大量的可遗传修复结果，并可通过整合条形码对这些序列进行区分。该谱系示踪载体体系可直接转染目标细胞，随着发育对目标细胞进行追踪，提供反刍动物发育的综合分子细胞图谱，应用前景广阔。

Description

基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的 谱系示踪方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法。
背景技术
细胞是所有生物体的基本单位，动物细胞在胚胎发育开始就不断的迁移分化。示踪细胞的状态对了解细胞起源与命运、组织器官发育与再生过程及机体生理疾病发生机制具有重要意义。细胞谱系示踪技术能对特定单个细胞及后代细胞的分化和发育活动进行追踪，该技术已应用于干细胞治疗、基因功能研究、器官移植和新药研发等领域。CRISPR-Cas9系统可实现高效的基因编辑，包括定点插入、敲除及突变。CRISPR-Cas9系统切割DNA后会产生indel，不同indel突变序列会随细胞分裂传递给子代，形成谱系示踪的条形码，结合单细胞测序技术可高效的进行细胞谱系示踪。近几年研究将人工合成的外源DNA条形码转入细胞，在应用CRISPR-Cas9对靶点进行编辑，靶点切割后基因组修复结果不同，产生印记。理论上相同来源细胞会携带它们祖细胞的共同印记，对条形码进行分析，可构建不同细胞的谱系发育树。由此可见，细胞谱系示踪技术具有巨大的发展潜力和应用价值。
在追踪细胞及其后代是如何随时间变化的过程中，正确推断细胞间的谱系联系是目前反刍动物细胞谱系示踪技术的主要瓶颈。众所周知，单细胞测序技术的出现大大促进了发育生物学、癌症生物学等多个领域的发展。将单细胞测序技术与遗传示踪技术结合，通过多个细胞分裂访问后代中积累的自然遗传标记，然后通过共享标记推断它们的谱系关系，能够提高发育轨迹推断的准确性，提供了一种系统的方法来追踪细胞的起源。
哺乳动物早期胚胎发育是通过多个层次的细胞命运决定，是生命体最重要的分子事件。研究早期胚胎谱系建立过程、不同胚层和组织前体细胞的命运决定及其发生与发展的调控机制，不仅能预防早期发育相关疾病、指导细胞分化与转分化，还能够为应用大动物进行人器官重建与组织再生提供参考。谱系示踪技术可以提供动物发育的综合分子细胞图谱。特别是近五六年发展迅速，愈来愈多的谱系示踪技术开发和试验研究成果见诸于国际学术刊物，成为国际生物学术界的重要研讨内容。但目前为止，细胞谱系示踪多以模式动物线虫、斑马鱼和小鼠为主，高等哺乳动物未见报道。大动物如羊不仅是重要的经济动物，在某些器官结构、大小以及生理代谢方面与人更加接近，是比较理想的器官重建与生物医药模型。因此，亟需开发反刍动物早期胚胎发育的谱系示踪技术，观察器官组织形成的命运图。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法。
本发明构思如下，利用CRISPR-Cas9技术，以羊Rosa26基因为靶点，定点插入Cas9-T2A-EGFP，利用启动子CMV使其在早期胚胎中过表达。同时，利用PB转座子将在红色荧光蛋白tdTomato的3'UTR中形成串联阵列的三个Cas9靶点引入基因组中。编辑后的靶点经过多轮细胞分裂积累，然后通过在tdTomato的3'UTR与三个Cas9靶点中间的40种8碱基对整合条码对这些序列进行区分，可用于研究羊胚胎发育的谱系，重建不同细胞的谱系层次结构。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于反刍动物谱系示踪的载体体系，其是由40种用于反刍动物谱系示踪的载体组成，其中每种载体携带有不同的整合条形码intBC；
所述用于反刍动物谱系示踪的载体是将谱系示踪载体插入到表达红色荧光蛋白的PB转座子载体上构建得到的；
所述谱系示踪载体包括整合条形码intBC、合成靶DNA序列以及靶向所述合成靶DNA序列的三个独立转录的sgRNA。
用于扩增40种整合条形码intBC序列的引物见表1：
表1 40种intBC引物
Figure BDA0003999709520000021
Figure BDA0003999709520000031
Figure BDA0003999709520000041
进一步地，所述谱系示踪载体包括如下结构：整合条形码intBC-合成靶DNA序列-bGH poly(A)-三个独立转录的sgRNA。
所述合成靶DNA序列包含三个位点ade2、bam3和white B，分别记为位点1～位点3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述三个独立转录的sgRNA分别靶向位点1～位点3，其中靶向位点1的sgRNA受mU6启动子控制，靶向位点2的sgRNA受hU6启动子控制，靶向位点3的sgRNA受bU6启动子控制。
进一步地，所述谱系示踪载体的结构中，合成靶DNA序列-bGH poly(A)-三个独立转录的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步地，所述用于反刍动物谱系示踪的载体包括如下结构：EF1α启动子-tdTomato-整合条形码intBC-合成靶DNA序列-bGH poly(A)-三个独立转录的sgRNA。
第二方面，本发明提供所述载体体系在反刍动物谱系示踪中的应用。
第三方面，本发明提供一套羊早期胚胎发育谱系示踪系统，包括基于CRISPR-Cas9技术的羊Rosa26基因编辑载体和所述用于反刍动物谱系示踪的载体体系。
所述基因编辑载体包括CRISPR-Cas9打靶载体和基因同源重组载体。
其中，所述CRISPR-Cas9打靶载体含有编码sgRNA序列(sgRNA1、sgRNA2)的DNA片段。
优选地，骨架载体为PX458。
优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
所述基因同源重组载体包含Donor DNA，以及用于将所述Donor DNA通过同源末端修复定点插入羊Rosa26基因的元件序列。
优选地，所述Donor DNA为Cas9-T2A-EGFP。
进一步地，所述基因同源重组载体包括如下结构：左同源臂-CMV启动子-Cas9-T2A-EGFP-bGH poly(A)-右同源臂。
优选地，所述左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
第四方面，本发明提供所述系统在羊早期胚胎发育谱系示踪中的应用。
第五方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法，所述方法包括：将所述羊早期胚胎发育谱系示踪系统显微注射入羊原核胚胎，产生大量可遗传indels，将40种整合条形码与可诱导的CRISPR-Cas9的indels相结合，利用单细胞转录测序技术，以示踪不同细胞的发育进程。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统结合，改良构建了一套用于反刍动物的谱系示踪载体体系。该载体体系包含8碱基对静态的整合条形码intBC和260个碱基对的合成靶DNA(3个CRISPR/Cas切割位点)。该合成DNA序列嵌入在表达红色荧光蛋白的PB转座子载体上。另外一个基于Rosa26安全位点同源重组高效表达EGFP-Cas9的载体，用来编辑合成靶DNA。此系统能够产生大量的可遗传修复结果和目标位点，能够在反刍动物系统中大规模应用，高分辨率记录谱系和其他信息，揭示具有连续表型谱系的细胞群，有助于了解早期胚胎到器官形成期的分子机制，以期为应用反刍动物进行人器官重建与组织再生提供参考。
本发明通过显微注射的方式将同源重组载体和打靶载体共注射羊原核胚，利用Gibson Assembly方法构建的供体载体中CMV启动子可以使Cas9-T2A-EGFP实现在羊胚胎中稳定表达，进而对合成靶DNA进行持续编辑，在整个示踪过程种不断产生多样性。
本发明构建的谱系示载体体系可以直接转染目标细胞，随着发育对目标细胞进行追踪，可通过整合条形码在数千个单个细胞中同时进行谱系追踪和单细胞水平转录组分析，提供了一种系统的方法来追踪新型细胞的起源或在不同条件下对已知的细胞类型进行鉴定，且对细胞表型影响最小，同时，不涉及基因编辑系统自身的改造和优化，具有操作简便、成本低等优势，有极大的应用价值和市场空间。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中羊Rosa26位点两个打靶载体图谱。
图2为本发明较佳实施例中羊Rosa26基因CRISPR-Cas9基因编辑打靶及同源修复模板示意图，图中所示序列为羊Rosa26基因相应打靶位点(两个sgRNA)；LHA和RHA分别代表左同源臂和右同源臂，长度分别为1017bp和1004bp，方框内为待整合的Cas9基因和外源绿色荧光标记基因EGFP。
图3为本发明较佳实施例中同源重组载体中LHA(扩增后1069bp)、RHA(扩增后1060bp)以及Cas9-T2A-EGFP(6128bp)载体片段PCR扩增电泳图。
图4为本发明较佳实施例中反刍动物谱系示踪载体的结构示意图。
图5为本发明较佳实施例中反刍动物谱系示踪的原理示意图。
图6为本发明较佳实施例中同源重组载体酶切电泳图，得到片段大小为8153bp。
图7为本发明较佳实施例中谱系示踪载体酶切电泳图，得到片段大小为6072bp。
图8为本发明较佳实施例中sgRNA1、sgRNA2、PB酶mRNA、Cas9 mRNA体外转录电泳图。
图9为本发明较佳实施例中同源重组序列、CRISPR-Cas9系统的载体、谱系示踪的载体显微注射图。
图10为本发明较佳实施例中羊胚胎发育至E18.5、E19.5时期的荧光检测图。
图11为本发明较佳实施例中胚胎样本检测intBC数量的统计图。
具体实施方式
本发明旨在提供一套基于反刍动物Rosa26位点同源重组高效表达EGFP-Cas9的载体，对合成靶DNA进行编辑的谱系示踪显微注射体系，从而获得可用于谱系示踪反刍动物器官发育的早期胚胎，该胚胎表达绿色和红色荧光，产生多种indels。
本发明为今后羊的Rosa26位点进行有效编辑提供了gRNA位点，所获得的表达indels胚胎可准确追踪大量细胞来源，避免荧光遗传示踪技术不稳定性造成的可靠性降低，为今后器官发育和异种移植的研究提供了重要动物素材，具有临床应用价值。
作为优选，所述基因编辑为CRISPR-Cas9介导的通过同源修复实现的基因编辑。
本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供基于CRISPR-Cas9技术特异靶向羊Rosa26基因的两个sgRNA。
基于CRISPR-Cas9技术特异靶向羊Rosa26基因的sgRNA1、sgRNA2，sgRNA1、sgRNA2作用位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
第二方面，本发明提供含有上述sgRNA1、sgRNA2的CRISPR-Cas9打靶载体。
优选地，骨架载体为PX458。
第三方面，本发明提供一种不含任何真核筛选标记的生物安全性更高的供体载体，该载体含有CMV启动子，目的基因Cas9-T2A-EGFP，转录终止信号为bGH poly(A)signal，用于Rosa26打靶位点同源重组的左、右同源臂序列。
所述目的基因表达盒结构为：CMV-Cas9-T2A-EGFP-bGH poly(A)。
所述元件序列包括用于羊Rosa26基因打靶位点同源重组的左、右同源臂，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
所述基因同源重组载体包括如下结构：左同源臂-CMV启动子-Cas9-T2A-EGFP-bGHpoly(A)-右同源臂。
优选地，可采用Gibson Assembly法构建供体载体，通过无缝连接，克服了在序列长度大、连接片段多的情况下，采用传统的酶切连接法无合适酶切位点可用的弊端。
第四方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9技术开发的羊Rosa26基因编辑载体，包括上述CRISPR-Cas9打靶载体和基因同源重组载体。
其中，所述基因同源重组载体包含目的基因Cas9-T2A-EGFP，以及用于将所述目的基因通过同源末端修复定点插入羊Rosa26基因的元件序列(同源重组DNA片段)。
本发明的另一个目的是提供构建所述谱系追踪反刍动物器官发育形成模型的方法。
本发明提供一套用于反刍动物的谱系示踪载体，所述该载体体系包含8碱基对静态的整合条形码intBC和260个碱基对的合成靶DNA(3个CRISPR/Cas切割位点)以及三个独立的sgRNA。
本发明中，所述的整合条形码intBC由8个碱基对组成，共有40种类型。
所述谱系示踪载体包括如下结构：intBC(1～40)-260个碱基对的合成靶基因-bGHpoly(A)-三个独立转录的sgRNA。
所述的260个碱基对的合成靶基因为whiteB(位点3)-bri1-bam3(位点2)-whiteL-ade2(位点1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明中，所述的三个独立转录sgRNA均由独立的启动子控制，位点1(ade2)受mU6启动子控制，位点2(bam3)受hU6启动子控制，位点3(white B)受bU6启动子控制。
本发明中，所述的谱系示踪载体插入到表达红色荧光蛋白的PB转座子载体上，并由CRISPR-Cas9系统对合成靶基因进行敲除。
所述载体结构包含如下：EF1α-tdTomato-intBC-white B(位点3)-bril-bam3(位点2)-white L-ade2(位点1)-bGH poly(A)-mU6-ade2 sgRNA-hU6-bam3 sgRNA-bU6-wihiteB sgRNA。
本发明中，所述谱系示踪载体通过PB转座子以多拷贝形式传递。
本发明所构建的谱系示踪载体由上述构建的基于Rosa26位点同源重组高效表达EGFP-Cas9的载体用于对合成靶基因进行编辑。
本发明提供的反刍动物谱系示踪载体技术，包括将所述羊Rosa26基因编辑载体和谱系示踪载体导入羊原核胚胎中。
本发明将所述的靶向羊Rosa26基因的sgRNA1、sgRNA2，所述的CRISPR-Cas9打靶载体、所述的羊Rosa26基因编辑载体，所述的谱系示踪载体体系，所述的反刍动物谱系示踪载体技术应用于示踪早期胚胎到器官形成期细胞的发育进程。
本发明提供CRISPR-Cas9介导的羊Rosa26基因敲除和定点整合Cas9-T2A-EGFP基因的方法，用于对合成靶基因DNA进行编辑，将所述的CRISPR-Cas9打靶载体、基因同源重组载体和所述的谱系示踪载体体系显微注射转入羊原核胚胎，产生大量可遗传indels，将40种整合条形码与可诱导的CRISPR-Cas9的indels相结合，利用单细胞转录测序，以示踪不同细胞发育进程。
本发明中，所述注射方法包括采用显微注射将外源片段导入动物早期胚胎。
本发明中，在所述显微注射溶液中，同源重组DNA片段浓度为10ng/ul；40个谱系示踪载体片段的浓度均为10ng/ul；PB转座酶mRNA的浓度为100ng/ul，Cas9 mRNA的浓度为100ng/ul；sgRNA1、sgRNA2的浓度为100ng/ul。
具体地，本发明所述的用于反刍哺乳动物的谱系示踪方法包括如下步骤：
(1)质粒的制备：制备两个待导入的Cas9/sgRNA质粒、同源重组DNA片段和40个谱系示踪载体；
(2)PB转座酶、cas9酶、sgRNA1、sgRNA2的体外转录；
(3)对供体羊和受体羊进行同期发情，对供体羊进行超速排卵和人工授精；
(4)从供体羊输卵管冲取原核期胚胎；
(5)待导入的DNA模板和RNA按比例混合均匀，显微注射原核期胚胎；
(6)采用手术法处理受体羊，每只受体羊输卵管移植胚胎2-4枚。
作为本发明的优选实施方案，上述步骤(5)中，将10ng/ul同源重组DNA片段与100ng/ul sgRNA1、100ng/ul sgRNA2和40个10ng/ul谱系示踪DNA模板以及100ng/ul PB转座酶mRNA，100ng/ul Cas9 mRNA混合均匀，进行显微注射。
本发明中，所述动物为哺乳动物。
作为本发明的一种实施方式，所述动物胚胎为湖羊早期胚胎。
本发明中，构建的谱系示踪载体体系可以直接转染目标细胞，随着发育对目标细胞进行追踪。
优选地，动物细胞来源于哺乳动物绵羊。
在本发明中，构建基于CRISPR条形码的谱系示踪体系，相较传统的谱系示踪方法，将CRISPR条形码与遗传操作相结合，可以实现高分辨率的谱系追踪。
本发明利用CRISPR-Cas9系统和PB转座子(PiggyBac转座子)系统结合，构建了一套用于反刍动物的谱系示踪载体体系。本发明提供基于CRISPR-Cas9编辑技术介导的羊Rosa26基因敲除和定点插入Cas9-T2A-EGFP基因的方法，用来对合成靶DNA进行编辑。本发明还提供了由合成靶DNA介导的谱系示踪载体。该载体包含40种8碱基对静态的整合条码(Integration Barcode，IntBC)和260个碱基对的合成靶DNA(3个CRISPR-Cas9切割位点)及相应的三个独立转录sgRNA。该合成靶DNA序列嵌入在表达红色荧光蛋白tdTomato的PB转座子载体上。通过此系统能够产生大量的可遗传修复结果，并可通过整合条形码对这些序列进行区分。同时构建的谱系载体体系可以直接转染目标细胞，随着发育对目标细胞进行追踪，可提供反刍动物发育的综合分子细胞图谱，应用前景广阔。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1CRISPR-Cas9打靶载体的构建
打靶位点位于羊Rosa26基因中，其中，sgRNA1、sgRNA2序列中识别该靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。根据上述靶点序列，设计相应的引物序列(表2)，由北京擎科生物公司合成，纯化方式为HPLC。
表2羊Rosa26基因打靶序列引物
核苷酸名称 序列(5’-3’)
Ovis aries-Rosa26-sgRNA1-F caccgGGTGGAGTGAAATGAAGTCC
Ovis aries-Rosa26-sgRNA1-R aaacGGACTTCATTTCACTCCACCc
Ovis aries-Rosa26-sgRNA2-F caccgTGTGGGAAGATAAAGAAATT
Ovis aries-Rosa26-sgRNA2-R aaacAATTTCTTTATCTTCCCACACc
Olio核酸序列的形成：将引物稀释成100μM，磷酸化退火，体系：Ovis aries-ROSA26-sgRNA1-F(100μM)1μl，Ovis aries-Rosa26-sgRNA1-R(100μM)1μl，10×T4ligation buffer 1μl，T4PNK 1μl，ddH2O 6μl，总体积10μl；Ovis aries-Rosa26-sgRNA2-F(100μM)1μl，Ovis aries-Rosa26-sgRNA2-R(100μM)1μl，10×T4 ligation buffer 1μl，T4PNK 1μl，ddH2O 6μl，总体积10μl。反应程序如下：37℃30min；95℃5min，PCR仪内每分钟降5-25℃。反应结束后250倍稀释，载体PX458用BbsI内切酶进行酶切。16℃连接过夜。连接反应结束后，使用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基。37℃30min，70℃30min。之后保存到-20℃，可保存至少一周。
该步骤所得产物可直接用于转化大肠杆菌，推荐使用DH5α感受态细胞。采取热击的方法：取2μl PlasmidSafe后的质粒，加入到50μl感受态细胞中，冰上10min，热击42℃30s，立即置于冰上2min，加入100μl LB培养基，37℃培养1h。使用含有Amp的LB平板。37℃过夜。第二天观察，对照板应无克隆，而含sgRNA插入的平板中长有克隆。挑取单克隆摇菌12h，菌液送北京擎科生物公司进行测序。验证质粒构建正确后，小提质粒，进行后续实验。打靶载体图谱如图1所示。
实施例2同源重组载体的构建
如图2所示，要将Cas9-T2A-EGFP定点插入Rosa26靶点，需利用同源末端修复(Homology directed repair，HDR)的方式将带同源臂的基因座插入靶位点。由于供体载体的构建需要将三个长片段克隆到一个目的载体中，加上酶切位点的不确定性，难以保证每个片段都能合适的拼接，因此采用基于同源重组的Gibson Assembly，其能够将更多个长片段高效无缝的拼接在一起，不受酶切位点的限制。
供体载体的结构如图2所示，需要将上游同源臂5-LHA、Cas9-T2A-EGFP、下游同源臂3-RHA一并连入骨架载体pUC57-Amp中，其中上、下游同源臂从羊基因组上克隆，Cas9-T2A-EGFP克隆自实验室保存的载体PX458，每个片段根据Gibson Assembly引物设计原则设计引物，引物序列如表3所示。
表3供体载体各片段扩增引物
引物名称 序列(5’-3’)
LHA-F1 tcgagctcggtacctcgcgaatgcatGGACGGAGCCATTGCTCCTG
LHA-R1 aagttatgtaacgggtacctctagacttcgtcctctaaatcttata
Cas9-T2A-EGFP-F tctagaggtacccgttacataactta
Cas9-T2A-EGFP-R ttcctgcggccgctccccag
RHA-F3 gcatgctggggagcggccgcaggaaccaacacctgggactgatttt
RHA-R3 caagcttgcatgcaggcctctgcagTCGACctggaagggtaaggactatc
LHA的扩增体系为：高保真DNA聚合酶Phanta MAX Super-Fidelity DNAPolymerase(P505，vazyme)1μl，2×Phanta Max buffer 25μl，dNTP mix(各10mM)1μl，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，羊基因组模板2μl，加ddH2O至50μl。扩增条件为：98℃预变性3min；98℃10s，52℃15s，72℃15s，34个循环；循环结束后72℃5min，4℃保存。Cas9-T2A-EGFP的扩增体系为：高保真DNA聚合酶Phanta MAX Super-Fidelity DNA Polymerase(P505，vazyme)1μl，2×Phanta Max buffer 25μl，dNTP mix(各10mM)1μl，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，羊基因组模板2μl，加ddH2O至50μl。扩增条件为：98℃预变性3min；98℃10s，
60℃15s，72℃60s，33个循环；循环结束后72℃5min，4℃保存。RHA的扩增体系为：高保真DNA聚合酶Phanta MAX Super-Fidelity DNA Polymerase(P505，vazyme)1μl，2×Phanta Max buffer 25μl，dNTP mix(各10mM)1μl，正向引物(10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，羊基因组模板2μl，加ddH2O至50μl。扩增条件为：98℃预变性3min；98℃10s，56℃15s，72℃15s，34个循环；循环结束后72℃5min，4℃保存。扩增结果如图3所示。
PCR产物纯化：(1)取100μl PCR产物，加入5倍体积的溶液BB，混匀后加入离心柱中，10000g离心1min，弃去流出液。(2)加入650μl溶液WB，10000g离心1min，弃去流出液。(3)10000g离心2min，彻底取出残留的WB。(4)将离心柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入50μl的ddH2O，室温静置1min，10000g离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存。
左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，Cas9-T2A-EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
各纯化片段采用全式金pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(CU101-1)，按照说明书进行无缝拼接。无缝克隆的体系为：2×Basic Assembli Mix5μl，Cas9-T2A-EGFP 0.25pmol，LHA 0.125pmol，RHA0.125pmol，酶切PUC57片段0.125pmol，补水至10μl，50℃反应30min。
实施例3谱系示踪载体的构建
为记录反刍动物细胞发育轨迹和谱系，利用CRISPR-Cas9编辑技术改良了一套基于PB转座子的谱系示踪报告系统(40个谱系示踪质粒)。将以PB载体为骨架的谱系示踪质粒显微注射羊原核胚胎，PB转座子整合到基因组时，胚胎可以检测到明显的红色荧光tdTomato(谱系示踪载体的结构如图4所示。谱系示踪载体由两部分组成，第一部分的目标位点由整合条形码intBC和三个用于Cas9敲除的切割位点组成，此序列插入到红色荧光tdTomato的3’UTR中。第二部分为编码三个独立转录的sgRNA，分别由不同的启动子mU6、hU6和bU6控制，以允许记录多个不同的信号)，具体构建方法如下：
(1)谱系示踪序列whiteB(位点3)-bri1-bam3(位点2)-whiteL-ade2(位点1)-bGHpoly(A)signal-mU6-ade2 sgRNA-hU6-bam3 sgRNA-bU6-whiteB sgRNA由通用生物公司合成，合成序列大小2132bp，结构示意图如图4所示，编码上述序列的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
(2)用限制性内切酶AscI和NotI酶切原PB载体质粒pPL149-PB-EF1a-tdTomato-Puro，回收得到6316bp。
(3)将步骤(2)回收得到的pPL149-PB-EF1a-tdTomato-Puro片段和步骤(1)合成的谱系示踪序列进行连接，连接体系：T4 Buffer 2μl，酶切得到的PB载体片段0.02pmol，谱系示踪序列0.06pmol，T4 DNA Ligase 1μl，补水至20μl，16℃过夜连接，得到无整合条形码的谱系示踪载体。
(4)连接40个整合条形码片段：intBC引物由北京擎科生物公司合成，具体序列见表1。40个intBC连接体系：T4 Buffer 1μl，IntBC1～40-F 2.5μl，IntBC1～40-R 2.5μl，补水至10μl；95℃，5分钟，结束后稀释50倍，备用。
(5)无整合条形码的谱系示踪载体酶切：10×NEBuffer 5ul，无整合条形码的谱系示踪质粒3ug，SpeI 2ul，NotI 2ul，补水至50ul，回收酶切后片段8462bp。
(6)构建40个带有整合条形码的谱系示踪载体：利用T4 DNA Ligase将酶切后无整合条形码的谱系示踪载体片段8462bp与步骤(4)的40个intBC片段分别进行连接，得到40个带有整合条形码intBC的谱系示踪质粒。
反刍动物谱系示踪的原理示意图见图5。每个细胞包含多个基因组、intBC可区分的目标整合位点。sgRNA将Cas9引导至切割位点以产生插入或缺失突变，利用Cas9在修复双链断裂时生成插入或缺失，这些断裂在下一代细胞中遗传，通过追踪不同的intBC进行区分，记录反刍动物早期胚胎的谱系信息。
实施例4同源重组质粒和40个带有整合条形码谱系示踪载体的酶切
将实施例2的绵羊Rosa26同源重组质粒进行酶切，具体酶切体系如下：10×NEBuffer 10μl，质粒20ug，NsiI 5μl，SalI 5μl，补水至100μl，酶切后片段8153bp，酶切电泳结果见图6所示。
将实施例3的40个带有整合条形码的谱系示踪质粒进行酶切，具体酶切体系如下：10×NEBuffer 5μl，质粒3ug，PspXI 2μl，EcoRI 2μl，补水至50μl，酶切后片段6072bp，酶切电泳结果如图7所示。
酶切产物纯化：配制合适浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离DNA片段。当DNA片段分离后，将凝胶置于紫外灯下，快速切下含目的DNA片段的凝胶，回收纯化DNA，操作如下：(1)在紫外灯下分离目的凝胶片段，置于干净EP管中，称其质量。胶块体积换算公式:100μl＝l00mg。(2)向EP管内加入3倍体积的Buffer GDP，震荡混合后放入50℃水浴锅中使胶块充分溶解，时间为7-10min。(3)取出平衡柱HiPure DNA Column和收集管Collection Tube，并按要求正确安置好。将(2)中溶液转入HiPure DNA Column管内，而后12000rpm离心1min，重复离心一次。(4)吸取150ul Buffer GDP加入到HiPure DNA Column中，静止1min，离心条件同上。(5)吸取已添加过无水乙醇Buffer DW2500μl加入HiPure DNA Column，离心条件同上，弃滤液，重复离心一次。(6)继续离心2min，条件不变。(7)取一新的Collection Tube，将HiPure DNA Column安放好，并向HiPure DNA Column中加入Rnase-free ddH2O 25μl，室温条件下静置2min。(8)12000rpm离心1min收集DNA，-20℃保存。
实施例5CRISPR-Cas9打靶载体和谱系示踪载体体系的体外转录
将实施例1构建得到的2个打靶载体、PB酶载体，cas9载体进行体外转录，体外转录的步骤参见试剂盒说明书，具体转录情况见图8。体外转录引物序列见表4：
表4体外转录引物序列
Figure BDA0003999709520000121
Figure BDA0003999709520000131
实施例6反刍动物显微注射CRISPR-Cas9载体体系和谱系示踪体系
将实施例5转录得到的2个sgRNA、PB酶mRNA、Cas9酶mRNA，以及绵羊Rosa26同源重组DNA片段、40个谱系示踪片段共同注射湖羊原核胚胎。具体操作方法如下：
(1)供体绵羊子宫角输精18小时后，采用手术法将子宫暴露于窗口表面，从输卵管冲取出原核期胚胎并记录两侧卵巢黄体的发育情况。
(2)挑选透明带清晰、胞质均匀于原核可见的受精卵进行原核显微注射，将注射的体外转录获得的Cas9 mRNA、PB mRNA、sgRNA1、sgRNA2稀释到100ng/μl，绵羊Rosa26同源重组DNA片段稀释到10ng/μl，40个谱系示踪片段稀释到10ng/μl，进行显微注射，显微注射情况如图9所示。
(3)采用手术法处理受体羊，每只受体输卵管移植胚胎2-4枚，羊群术后需要再小圈内观察1天，圈内保持清洁防止刀口感染，保证术后恢复。
实施例7不同胚胎时期谱系示踪结果检测
待实施例6的胚胎发育至E18.5、E19.5，取出胚胎，经荧光显微镜拍照，可见明显的荧光，具体情况如图10所示；检测样本intBC的表达情况，单个样本中可检测到多达39种intBC，具体结果见图11，检测结果表明成功在羊原核胚胎导入CRISPR-Cas9打靶体系和谱系示踪载体体系。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于反刍动物谱系示踪的载体体系，其特征在于，其是由40种用于反刍动物谱系示踪的载体组成，其中每种载体携带有不同的整合条形码intBC；
所述用于反刍动物谱系示踪的载体是将谱系示踪载体插入到表达红色荧光蛋白的PB转座子载体上构建得到的；
所述谱系示踪载体包括整合条形码intBC、合成靶DNA序列以及靶向所述合成靶DNA序列的三个独立转录的sgRNA。
2.根据权利要求1所述的载体体系，其特征在于，所述谱系示踪载体包括如下结构：整合条形码intBC-合成靶DNA序列-bGH poly(A)-三个独立转录的sgRNA。
3.根据权利要求2所述的载体体系，其特征在于，所述合成靶DNA序列包含三个位点ade2、bam3和white B，分别记为位点1～位点3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述三个独立转录的sgRNA分别靶向位点1～位点3，其中靶向位点1的sgRNA受mU6启动子控制，靶向位点2的sgRNA受hU6启动子控制，靶向位点3的sgRNA受bU6启动子控制。
4.根据权利要求2所述的载体体系，其特征在于，所述谱系示踪载体的结构中，合成靶DNA序列-bGH poly(A)-三个独立转录的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
5.根据权利要求3或4所述的载体体系，其特征在于，所述用于反刍动物谱系示踪的载体包括如下结构：EF1α启动子-tdTomato-整合条形码intBC-合成靶DNA序列-bGH poly(A)-三个独立转录的sgRNA。
6.权利要求1-5任一项所述载体体系在反刍动物谱系示踪中的应用。
7.羊早期胚胎发育谱系示踪系统，其特征在于，包括基于CRISPR-Cas9技术的羊Rosa26基因编辑载体和权利要求1-5任一项所述载体体系；
所述基因编辑载体包括CRISPR-Cas9打靶载体和基因同源重组载体；
其中，所述CRISPR-Cas9打靶载体含有编码sgRNA序列的DNA片段；
优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；
所述基因同源重组载体包含Donor DNA，以及用于将所述Donor DNA通过同源末端修复定点插入羊Rosa26基因的元件序列；
优选地，所述Donor DNA为Cas9-T2A-EGFP。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述基因同源重组载体包括如下结构：左同源臂-CMV启动子-Cas9-T2A-EGFP-bGH poly(A)-右同源臂；
优选地，所述左、右同源臂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
9.权利要求7或8所述系统在羊早期胚胎发育谱系示踪中的应用。
10.基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求7或8所述系统显微注射入羊原核胚胎，结合单细胞转录测序技术，以示踪不同细胞的发育进程。
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