CN116096355A - 用于治疗角膜神经损伤或损失的高分子量透明质酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗人或非人动物受试者的眼睛的角膜中的神经损伤或损失(角膜神经损伤或损失)的方法，包括将包含高分子量透明质酸(HMWHA)的流体局部施用到眼睛的眼表面，其中所述透明质酸具有至少2.5m³/kg的特性粘度。

Description

用于治疗角膜神经损伤或损失的高分子量透明质酸

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年7月24日提交的美国临时申请序列号63/056,081和2020年6月12日提交的美国临时申请序列号63/038,361的权益，每个临时申请的全部内容通过引用整体并入本文，包括任何图、表、核酸序列、氨基酸序列或附图。

背景技术

角膜是神经密集支配的表面组织，已使用组织化学和体内共聚焦显微镜(IVCM)进行了研究(见Guthoff RF等人，“Epithelial Innervation of Human Cornea–A Three-Dimensional Study Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy”，Cornea,2005,24(5):608-613，尤其是其中的图2的示意图)。除了感官功能外，角膜神经还通过释放营养因子，如P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子(NT-3)，而有助于眨眼反射、泪液产生和眼表面功能完整性的维持(Shaheen,BS等人,“Corneal nerves in health anddisease,”Survey of Ophthalmology,2014,第59卷,第263-285页；Marfurt CF等人，“Anatomy of the human corneal innervation,”Exp Eye Res,2010；4:478-492；You L等人,“Neurotrophic factors in the human cornea,”Invest Ophthalmol Vis Sci,2000年3月；41(3):692-702)。

不同细胞类型之间的细胞-细胞相互作用在维持神经功能和完整性方面起重要作用，这些相互作用对于修复受损组织以恢复正常健康状态是必要的。因此，这些细胞-细胞相互作用的调节被认为是神经组织中的潜在再生策略，目的是重建功能性上皮和基质微环境，包括在神经损伤后恢复与周围细胞的角膜神经相互作用。关于起源有大量的科学文献(Kowtharapu BS和Stachs O,Corneal Cells:Fine-tuning Nerve Regeneration,CurrentEye Research,2020,45(3):291-302)。

由于机械或化学创伤、炎症、屈光手术、感染和其它致病因素引起的角膜神经功能障碍可以导致角膜疾病。例如，由于角膜神经在角膜上皮的稳态中起重要作用，神经营养性角膜病变(NK)可以在神经损伤或损失后该稳态受到干扰时产生(Eguchi H等人,“CornealNerve Fiber Structure,Its Role in Corneal Function,and Its Changes in CornealDiseases,”Biomed Res Int.,2017,2017:3242649；Mastropasqua L等人,“Understandingthe Pathogenesis of Neurotrophic Keratitis:The Role of Corneal Nerves,J.Cell.Physiol.,232:717–724,2017)。

使用IVCM诊断角膜神经损伤或损失已经取得了进展，这允许体内角膜基底下神经丛的直接可视化，以及评估角膜神经在不同疾病阶段或在治疗前后的再生情况，例如激光原位角膜磨削术(LASIK)(Choi EY等人,“Langerhans cells prevent sub-basal nervedamage and upregulate neurotrophic factors in dry eye disease”,PLoS One,2017；12(4):e0176153；Tuisku,IS等人,“Alterations in corneal sensitivity and nervemorphology in patients with primary Sjogren’s syndrome,”Experimental EyeResearch,2008,第86卷,第879–885页；Alhatem A等人,“In vivo confocal microscopyin dry eye disease and related conditions,”Seminars in Ophthalmology,2012,第27卷,第138–148页；Patel DV和C.N.McGhee,“Quantitative analysis of in vivoconfocal microscopy images:a review,”Survey of Ophthalmology,2013,第58卷,第466–475页；Cruzat A.等人,“In vivo confocal microscopy of corneal nerves inhealth and disease,”The Ocular Surface,第15卷,第15–47页,2017)。然而，旨在恢复损伤或损失的神经的治疗策略是有限且昂贵的(John T等人,“Corneal Nerve Regenerationafter Self-Retained Cryopreserved Amniotic Membrane in Dry Eye Disease,”JOphthalmol.,2017；2017:6404918)。

发明内容

本发明涉及一种用于治疗人或非人动物受试者的眼睛的角膜中的神经损伤或损失(角膜神经损伤或损失)的方法，包括将包含高分子量透明质酸(HMWHA)的流体局部施用到眼睛的眼表面，其中所述透明质酸具有至少2.5m³/kg(2.5m³/kg或更大)的特性粘度。可以使用本发明的方法治疗的角膜神经损伤或损失是抑制或损害正常角膜神经翻转、定向、生长、功能或前述两种或多种的任意组合的任何一种神经损伤。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本将在请求和支付必要费用后由专利商标局提供。

图1：与对照润滑剂滴眼液相比，用高分子量透明质酸滴眼液(Comfort

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液)治疗的患者在8周时总神经纤维长度更大。

图2A和2B：来自个体基底下神经丛(SNP)(图2A)和自动检测的用于定量的神经纤维(图2B)的单张图像。

图3：来自对照组和研究组的受试者的典型SNP图像，以及用于在基线和治疗8周后表征SNP的检测到的神经纤维的示意图。

图4：用高分子量透明质酸(COMFORT

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液)处理的组的患者和对照组的患者在基线和8周的角膜神经纤维长度。图4对应于图1，其中包括单独的患者数据点。

具体实施方式

在HYLAN M研究中，即高分子量透明质酸滴眼液(COMFORT

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液,i.com medical GmbH，德国慕尼黑)在严重干眼中的性能研究中，共聚焦显微术是可选的诊断方法，该诊断方法由那些在基线随访和8周随访时具有所需仪器和实验的研究者进行，以分析基底下上皮神经丛。在基线时和在8周治疗后，收集来自16名患者的图像。所述图像来自对照组的8名患者(他们继续使用在他们被纳入HYLAN M研究之前一直使用的对照润滑剂滴眼液)以及眼睛润滑剂滴眼液已经被COMFORT

滴眼液取代的8名患者。

令发明人惊讶的是，发现用Comfort Shield滴眼液治疗的患者中总神经纤维长度出现了统计学上显著的增长(p＝0.031)(见实施例1和图1)。这种神经营养活性是高分子量透明质酸(HMWHA)的意想不到的效果，与许多与干眼病无关的眼部情况密切相关。关于HYLAN M研究的进一步细节和HMWHA流体(例如COMFORT

滴眼液)对总神经纤维长度的作用和对基底下神经丛的营养作用，被提供在以下文章中：van Setten等人，“TheHYLAN M Study:Efficacy of 0.15％ High Molecular Weight Hyaluronan Fluid inthe Treatment of Severe Dry Eye Disease in a Multicenter Randomized Trial,”JClin Med.,2020年11月2日；9(11):3536；和van Setten等人,“High Molecular WeightHyaluronan Promotes Corneal Nerve Growth in Severe Dry Eyes,”J Clin Med.,202011月24日；9(12):3799中,它们各自通过引用全部并入本文。

本发明涉及一种用于治疗人或非人动物受试者的眼睛的角膜中的神经损伤或损失(角膜神经损伤或损失)的方法，包括向眼睛的眼表面局部施用包含HMWHA的流体，其中所述透明质酸具有至少2.5m³/kg的特性粘度。在不受作用机制的理论的限制的情况下，向眼表面提供HMWHA被认为支持和促进了在角膜神经损伤之后有助于轴突外生长和神经再生的功能性上皮和基质微环境的恢复。

透明质酸(HA)是碳水化合物-糖胺聚糖，具体地，其可以在活生物体中发现。内源性HA的生物学功能包括液体结缔组织(例如关节滑液和眼玻璃体液)的弹粘性的维持(Necas J等人,“Hyaluronic acid(hyaluronan):a review”,Veterinarni Medicina,2008,53(8):397-411；Stern R等人,“Hyaluronan fragments:An information-richsystem”,European Journal of Cell Biology,2006,85:699-715)。尽管人们对HA的多种信号传导涉及的具体机制仍知之甚少，但已知HA可以调节随HA大小而变化的多方面的生物效应(Cyphert JM等人,“Size Matters:Molecular Weight Specificity of HyaluronanEffects in Cell Biology,”International Journal of Cell Biology,2015,Epub 2015年9月10日,563818)。

自20世纪70年代以来，透明质酸钠和其它粘弹剂已被用于眼内外科手术中，且自20世纪80年代以来，被用于治疗干眼症(Higashide T和K Sugiyama,“Use ofviscoelastic substance in ophthalmic surgery-focus on sodium hyaluronate,”Clinical Ophthalmology,2008,2(1):21-30；Polack FM和MT McNiece,“The treatmentof dry eyes with Na hyaluronate(Healon)-preliminary report,1982,1(2):133-136)；然而，迄今为止，对于透明质酸在上皮细胞中的生物学功能的关注很少(Müller-Lierheim WGK,“

Neuesüber

”AktuelleKontaktologie,2015年4月,17-19)。

本发明中所用的高分子量透明质酸或“HMWHA”是指具有至少2.5m³/kg(2.5m³/kg或更大)的特性粘度的透明质酸，所述特性粘度由欧洲药典9.0第3584页“SodiumHyaluronate”的方法所确定。简单来说，通过线性最小二乘回归分析来计算特性粘度[η]，即使用Martin方程：Log₁₀(n_r-1/c)＝log₁₀[η]+κ[η]c。在一些实施方式中，高分子量透明质酸具有至少2.9m³/kg(2.9m³/kg或更大)的特性粘度。

在一些实施方式中，透明质酸具有<0.2％w/v的浓度。在一些实施方式中，透明质酸具有0.1至0.19％w/v的浓度。在一些实施方式中，透明质酸具有0.15％w/v的浓度。

在一些实施方式中，流体具有：a)6.8-7.6的pH；b)240-330mosmol/kg的渗透浓度；c)7.6-10.5g/1的NaCl浓度；和/或d)1.0-1.4mmol/1的磷酸盐浓度。

在一些实施方式中，流体是透明且无色的溶液，不含可见杂质。设想流体是无菌的。

在一些实施方式中，根据本发明的流体是Comfort

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液。

在一些实施方式中，HA具有由Mark-Houwink方程计算的至少3百万道尔顿的分子量。在一些实施方式中，HA的由Mark-Houwink方程计算的分子量在3百万至4百万道尔顿的范围内。

在一些实施方式中，高分子量HA是透明质酸。在一些实施方式中，高分子量HA是交联的。在一些实施方式中，高分子量HA是非交联的。在一些实施方式中，高分子量HA是线性的。在一些实施方式中，高分子量HA是非线性的(例如，支化的)。在一些实施方式中，高分子量HA是透明质酸的衍生物，例如酯衍生物、酰胺衍生物或硫酸化衍生物，或前述两种或更多种的组合。

可以通过任何局部给药方法将流体施用于受试者的一只或两只眼睛的眼表面。例如，流体可以以一滴或多滴从用于分配滴眼液滴的装置(例如滴眼器)被施用。流体可以被自施用或由第三方施用。作为单剂或多剂给药至眼表面的剂量将根据多种因素而变化，包括患者状况和特性、症状程度、并发治疗、治疗频率和预期效果。例如，可以施用一滴或多滴(例如，每滴约30微升)。

虽然每天1-3次施用1-3滴在一些情况下可能是足够的，但是对于大多数情况的角膜神经损伤或损失，可能需要更频繁的局部给药，例如每天4、5、6、7、8、9、10次或更多次1-3滴。在一些实施方式中，每天一次或多次施用3滴或更多滴。

在一些实施方式中，当角膜神经再生时，施用频率和/或每剂用量可随着时间减少。例如，在一些情况下，在四周之后，施用的量可以减少和/或每天施用的频率可以减少，或者施用的频率可以减少到每日一半。然而，虽然受试者通常以“根据需要”的频率和持续时间用眼药水，但感觉丧失可能是由于角膜神经损伤或损失造成的，这使得受试者对自己需要的频率和持续时间的自我评估不可靠。因此，不应仅仅因为没有不适就停止给药，以避免过早停止治疗。

使用HMWHA流体和本发明的方法治疗的角膜神经损伤或损失可以是抑制或损害正常角膜神经翻转、生长、功能或前述两种或更多种的任何组合的任何类型的神经损伤，并且可能涉及对神经结构(架构和/或连续性)以及在一些情况下对周围组织的任何程度的损伤。神经损伤可以是任何类型或阶段的损伤，如神经失用症、轴突断伤或神经断伤(SeddonHJ,“A Classification of Nerve Injuries”,British Medical Journal,1942,2(4260):237–9)。例如，神经损伤或损失可包括以下特征中的一个或多个：减少的神经纤维长度、减少的神经纤维弯曲度、减少的神经纤维密度、以及完全的或部分的神经纤维分离。

HMWHA流体以一定的用量和持续时间局部施用到眼睛的眼表面，与在没有HMWHA流体的情况下发生的角膜神经净损失相比，足以减少来自角膜神经损伤或损失的角膜神经净损失。因此，局部施用足够的HMWHA流体，以减少否则在没有HMWHA流体治疗的情况下发生的角膜神经的净损失。

治疗方法可包括在局部施用HMWHA流体之前鉴别受试者患有角膜神经损伤或损失的步骤。优选地，在患有神经损伤或损失的眼睛上使用体内共焦显微镜(IVCM)来识别受试者(Alhatem A等人,“In vivo confocal microscopy in dry eye disease and relatedconditions,”Seminars in Ophthalmology,2012,第27卷,第138–148页；Patel DV和C.N.McGhee,“Quantitative analysis of in vivo confocal microscopy images:areview,”Survey of Ophthalmology,2013,第58卷,第466–475页；Cruzat A.等,“In vivoconfocal microscopy of corneal nerves in health and disease,”The OcularSurface,第15卷,第15–47页,2017)。

可选地，在治疗期间和/或之后使用IVCM监测受试者一次或多次，并且可以将共焦显微图像与先前图像进行比较，以评估角膜神经愈合和生长的状态和进展。

可选地，该方法包括在施用HMWHA流体之前鉴别受试者患有角膜神经损伤或损失的一个或多个标志或症状的步骤。角膜神经损伤或损失的标志的例子包括但不限于：角膜神经支配或感觉的减少、支配角膜的神经纤维或束的数量的减少、支配角膜的神经元的死亡、神经递质释放的减少或损失、神经生长因子释放的减少或损失、异常流泪反射、异常眨眼反射、异常神经形态、异常神经芽的出现、异常曲折度、增加的珠状神经形成、神经纤维束变薄、神经纤维束增厚、次级角膜神经螺纹长度缩短、角膜神经的密度减小、角膜神经的长度减小、角膜神经的支化减少、复发性角膜侵蚀、角膜的上皮伤口愈合延迟以及降低的流泪率。角膜神经损伤或损失的症状的实施例包括但不限于：异常泪液产生或干燥、异常眨眼、难以聚焦或聚焦能力损失、视敏度降低或损失、角膜敏感度降低或损失。

在一些实施方式中，角膜神经损伤或损失由疾病、创伤(化学、机械等)、先天性缺陷或者医疗程序引起。

在一些实施方式中，角膜神经损伤或损失包括由病毒感染、药疹、长期使用隐形眼镜、手术、糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)或多发性硬化症引起的角膜神经支配损伤。

在一些实施方式中，受试者在给药时眼睛患有神经营养性角膜病变(轻度、中度或重度NK)，并且HMWHA流体减轻NK的一种或多种标志或症状。在一些实施方式中，NK在给药时是轻度NK(也称为阶段1)或中度NK(也称为阶段2)，并且HMWHA流体防止或延迟NK进展到重度NK的状态(也称为阶段3)。在一些实施方式中，NK是重度NK。

在一些实施方式中，受试者在给药时不患有NK，HMWHA流体防止或延迟NK的发作。

在一些实施方式中，受试者患有眼表面疾病或病症(轻度、中度或重度)。在其它实施方式中，受试者不患有眼表面疾病或病症。眼表面疾病或病症的实例及其发病机制可在以下文章中找到：Belmonte C,“Pain,Dryness,and Itch Sensations in Eye SurfaceDisorders are Defined By A Balance Between Inflammation and Sensor NerveInjury,”Cornea,2019,38 Suppl 1:S11-S24，其整体通过引用并入本文。在一些实施方式中，受试者患有干眼病(轻度、中度或重度)。在其它实施方式中，受试者不患有干眼病。在一些实施方式中，受试者患有泪膜缺陷。在其它实施方式中，受试者不患有泪膜缺陷。

在一些实施方式中，受试者患有泪液容量不足。在一些实施方式中，受试者不患有泪液容量不足；然而，受试者患有眼表面异常(地形异常)，包括角膜或正常泪膜(具有正常表面张力和粘度的泪膜)未覆盖的眼表面的其他地方的隆起，导致在眼表面产生摩擦区域(van Setten,Epitheliopathy of the bleb(EoB)-identifying attrition:A new modelfor failure of glaucoma surgery,New Frontiers in Ophthalmology,2018:4(3):1-4)。

糖尿病是已知的引起人类角膜中的结构和功能变化的常见代谢疾病，其中糖尿病的眼部并发症(包括角膜神经损伤和损失)经常发生。在一些实施方式中，用本发明的方法治疗的受试者具有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)。

在一些实施方式中，受试者患有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)，并且患有糖尿病性周围神经病变。

在一些实施方式中，受试者患有糖尿病性角膜神经病变，HMWHA流体逆转糖尿病性角膜神经病变。

在一些实施方式中，受试者患有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)，但尚未患有糖尿病性周围神经病变。

在一些实施方式中，受试者患有已知的与可以导致NK的眼表面损伤共病的遗传疾病(如Riley-Day综合征(家族性自主神经异常)、Goldenhar-Gorlin综合征、Mobius综合征和家族性角膜感觉减退)。

在一些实施方式中，受试者患有已知的与可以导致NK的眼表面损伤共病的全身性疾病(诸如糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)、麻风病、维生素A缺乏症、淀粉样变性和多发性硬化症)。

在一些实施方式中，受试者患有已知导致眼表面损伤(其可以导致NK)的中枢神经系统(CNS)疾病(如肿瘤、动脉瘤、中风、中枢神经系统退行性疾病(诸如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)和神经外科手术后疾病(诸如听神经瘤、三叉神经痛或三叉神经的其他外科损伤))。

在一些实施方式中，受试者患有已知导致眼表面损伤(其可以导致NK)的眼病(诸如疱疹后感染(单纯疱疹和带状疱疹)、具有与角膜神经炎相关的神经损伤的其它感染、化学或物理烧伤、局部麻醉剂的滥用、药物毒性(诸如trimolol、倍他洛尔、双氯芬酸钠、30％磺胺醋酰)、慢性眼表面损伤或炎症、眼部手术(诸如白内障手术、青光眼手术、激光原位角膜磨削术(LASIK)和屈光性角膜切削术(PRK)、穿透性角膜移植术(PK)、深板层角膜移植术(DALK)、圆锥角膜胶原交联术、用于视网膜脱离的玻璃体切除术、治疗糖尿病性视网膜病变的光凝术、术后或激光治疗)、佩戴隐形眼镜、眼眶肿瘤或角膜营养不良(晶格或颗粒)。

在一些实施方式中，该方法还包括在局部施用HMWHA流体之前、期间或之后施用一种或多种额外的治疗，所述治疗选自：重组人神经生长因子(cenegermin)、基质金属蛋白酶抑制剂、富含生长因子的血浆(PRGF)、治疗性隐形眼镜、暂时性睑缘缝合术(给予HMWHA流体后部分地或完全地)、羊膜移植、穿透角膜移植术、角膜移植、cenegermin联合角膜移植、或直接或间接角膜神经再生。可选地，如果所述额外的治疗涉及施用活性剂，则其可以在HMWHA流体中或在单独施用的制剂中施用。

在一些实施方式中，HMWHA流体作为滴剂或作为洗剂(例如，灌洗)被直接施用到眼表面。

在一些实施方式中，施用1至3滴，每天1至3次。

在一些实施方式中，施用1至3滴，每天4、5、6、7、8、9或10次或更多次。

在一些实施方式中，每天一次或多次施用3滴或更多滴。

在一些实施方式中，HMWHA流体通过局部施用于眼表面或眼睛的其他部分的递送剂(流体递送剂)(例如，涂有和/或将流体分泌到眼表面的颗粒)间接施用到眼表面。

在一些实施方式中，透明质酸具有2.6m³/kg至2.9m³/kg或更大范围内的特性粘度。

在一些实施方式中，透明质酸具有至少3百万道尔顿的分子量。在一些实施方式中，透明质酸的分子量在3百万道尔顿至4百万道尔顿的范围内。

在一些实施方式中，HMWHA流体包含浓度<0.2％w/v的HMWHA。在一些实施方式中，HMWHA流体包含浓度为0.1至0.19％w/v的HMWHA。在一些实施方式中，HMWHA流体包含浓度为约0.15％w/v的HMWHA。

在一些实施方式中，HMWHA流体具有以下组成/特性，其对应于Comfort

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液的那些组成/特性：

a)6.8-7.6的pH；

b)240-330mOsmol/kg的渗透浓度；

c)7.6-10.5g/1的NaCl浓度；和/或

d)1.0-1.4mmol/1的磷酸盐浓度。

在一些实施方式中，HMWHA流体是透明且无色的溶液，不含可见杂质。

在一些实施方式中，HMWHA流体是无菌的。

在一些实施方式中，HMWHA流体是Comfort

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液。

在一些实施方式中，HMWHA流体不包含其它生物活性剂(例如，不含疏水活性成分)。在其它实施方式中，HMWHA流体进一步包含生物活性剂(例如，疏水活性成分)。如本文所用，术语“生物活性剂”是指，当以影响组织的有效量施用时，对人类或非人动物受试者具有影响的任何物质。生物活性剂可以是任何种类的物质，例如药物分子或生物分子(例如，多肽、碳水化合物、糖蛋白、免疫球蛋白，核酸)，可以是天然产物或人工生产的，并且可以通过药理学、免疫或代谢等任何机制起作用。生物活性剂类的实施例包括改变眼睛的压力的物质(例如，酶抑制剂)和抗血管生成剂。生物活性剂的一些具体实施例包括类固醇(例如皮质类固醇)、抗生素、免疫抑制剂、免疫调节剂、他克莫司、纤溶酶激活剂、抗纤溶酶和环孢菌素A。在一些实施方式中，生物活性剂是：治疗或预防眼睛感染的类固醇或抗生素；青光眼药物如前列腺素类似物、β阻滞剂、α激动剂或碳酸酐酶抑制剂；眼部过敏缓解剂，诸如组胺拮抗剂或非甾体抗炎药；或散瞳剂。不幸的是，在一些情况下，包含在流体中的一种或多种生物活性剂可能会刺激或损害眼睛(例如，环孢菌素A)。有利地，通过其流变性质和其它性质，流体中的高分子量HA可以减轻和/或保护眼睛免受流体内的一种或多种生物活性剂的刺激和/或损害作用(即，如果在没有高分子量HA的情况下施用，生物活性剂将更加刺激或损伤眼睛)。

在一些实施方式中，HMWHA流体不包含类固醇、抗生素或免疫调节剂。在一些实施方式中，流体不包含其它生物活性剂(例如，不含疏水性活性成分)。

在一些实施方式中，HMWHA流体包含防腐剂和/或洗涤剂，优选不会对眼睛造成损害或刺激的。在其它实施方式中，HMWHA流体不包含防腐剂或洗涤剂(即，流体是不含防腐剂和不含洗涤剂的)。在一些情况下，可能需要在流体内包括一种或多种防腐剂或洗涤剂。通常，这种防腐剂和洗涤剂刺激或损害眼睛。有利地，通过其流变性质和其它性质，流体可减轻和/或保护眼睛免受流体内的防腐剂或洗涤剂的刺激和/或损害作用。因此，在一些实施方式中，流体进一步包含刺激或损害眼睛的防腐剂或洗涤剂(即，如果在没有高分子量HA的情况下施用，防腐剂或洗涤剂将更加刺激或损伤眼睛)。

在一些实施方式中，HMWHA流体包括环孢菌素A、西他氯铵、泰洛沙泊或前述两种或多种的组合。

在一些实施方式中，在向受试者施用包含生物活性剂的另一组合物之前、期间和/或之后向受试者施用HMWHA流体。在一些情况下，可能需要在另一组合物内包括一种或多种防腐剂或洗涤剂。如上所述，通常这种防腐剂和洗涤剂会刺激或损害眼睛，并且一些生物活性剂本身可能会刺激或损害眼睛。有利地，通过其流变性质和其它性质，流体可以减轻和/或保护眼睛免受另一组合物内的生物活性剂、防腐剂和/或洗涤剂的刺激和/或损害作用。因此，如果在没有流体的情况下施用，另一组合物内的生物活性剂、防腐剂和/或洗涤剂将更加刺激或损伤眼睛。

在一些实施方式中，另一组合物包括抗生素、免疫抑制剂或免疫调节剂中的一种或多种。

在一些实施方式中，另一组合物包括环孢菌素A、西他氯铵、泰洛沙泊或前述的两种或多种的组合。

施用于受试者的另一组合物可呈任何形式并通过任何途径施用(例如，局部或全身)。在一些实施方式中，将另一组合物施用于眼睛，例如局部或通过注射施用。在一些实施方式中，将另一组合物局部施用于眼表面。

在一些实施方式中，包含在HMWHA流体或其它组合物中的防腐剂或洗涤剂是化学防腐剂或氧化防腐剂。

在一些实施方式中，包含在HMWHA流体或其它组合物中的防腐剂或洗涤剂通过破坏微生物细胞膜的脂质结构而杀死易感微生物细胞，从而增加微生物细胞膜渗透性。

在一些实施方式中，包含在HMWHA流体或其它组合物中的防腐剂或洗涤剂通常对角膜组织(例如角膜上皮、内皮、基质和例如膜的界面)造成损伤，但HMWHA流体可改善或保护免受该损伤。

在一些实施方式中，HMWHA流体或其他组合物中包含的防腐剂或洗涤剂选自以下组中：季铵盐防腐剂(例如，苯扎氯铵(BAK)或西他氯铵)、氯丁醇、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、聚季铵盐-1(例如，Polyquad^TM防腐剂)、稳定氧化剂(例如，稳定氧氯络合物)(例如，Purite^TM防腐剂))、离子缓冲防腐剂(例如，sofZia^TM防腐剂)、聚六亚甲基双胍(PHMB)、过硼酸钠(例如，GenAqua^TM防腐剂)、tylopaxol和山梨酸盐。

在一些实施方式中，HMWHA流体至少基本上不含粘蛋白；或换句话说，具有<0.3％w/v的粘蛋白浓度。

在一些实施方式中，HMWHA流体进一步包括糖胺聚糖(GAG)(即，除了高分子量HA之外还包括一个或多个GAG)、电解质(例如氯化钠)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液)、或前述两种或更多种的组合。

HMWHA流体可以与绷带隐形眼镜结合使用。因此，该方法还可以进一步包括在施用流体之前、期间和/或之后将绷带隐形眼镜施加到眼睛。例如，可以在施加绷带隐形眼镜之前、施加隐形眼镜之后施用流体，和/或在将绷带隐形眼镜施加到眼睛之前将流体放置在绷带隐形眼镜上。流体的使用允许绷带隐形眼镜在眼表面上施加压力，同时最小化眼表面处的摩擦。有利地，流体和绷带隐形眼镜可在眼科手术(例如青光眼手术)后不久安全地使用。

本发明的另一方面涉及可用于实施本文所述的本发明的方法的试剂盒，即治疗角膜神经损伤或损失的试剂盒。所述试剂盒包括本文所述的HMWHA流体和一个或多个绷带隐形眼镜。绷带隐形眼镜可与同一容器内的流体一起包装(绷带隐形眼镜与流体接触)，或者绷带隐形眼镜可与包装在单独的容器中的流体分离。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)制成。

试剂盒可包括与眼表面或眼睛的其它部分接触的递送剂(单独地或与流体相关联)。例如，试剂盒可包括涂覆有流体和/或将流体释放到眼表面上的颗粒(例如，微粒或纳米颗粒)。

可选地，试剂盒可以包括用于分配滴眼液的装置(例如，滴眼器)，该装置在试剂盒的外包装被访问(例如，打开)之前可以作为或可以不作为试剂盒中HMWHA流体的容器，即，滴眼液分配装置可以用于容纳由未访问(未打开)的试剂盒提供的流体，或者可以是空的，用于在试剂盒被访问之后接收该流体。可选的是，试剂盒可以包括标签或带有印刷的或数字的试剂盒使用说明(例如，用于执行本发明的方法)的包装插页。

试剂盒可以包括被分隔以接收一个或多个容器(例如小瓶、管等)的包装材料，所述容器中的每一个包括待在本文描述的方法中使用的单独元件中的一个。仅示例地，用于包装药物产品的包装材料包括美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252。药物包装材料的实施例包括但不限于罩板包装、瓶、管、泵、袋、小瓶、不透光密封的容器、注射器、瓶子，以及适用于所选择的制剂和预期给药和治疗模式的任何包装材料。

试剂盒可包括一个或多个附加容器，每个附加容器具有从商业和用户角度需要的用于本文所述组合物的各种材料的一种或多种。这些材料的非限制性实施例包括但不限于：缓冲剂、稀释剂、载体、包装、容器、小瓶和/或列出供使用的内容物和/或说明的管标签，以及具有供使用的说明的包装插页。

标签可以在容器上或与容器相关联。当形成标签的字母、数字或其他字符被附接、模制或蚀刻到容器本身中时，标签可以在容器上；当它存在于也保持容器的储存器或载体内时，标签可以与容器相关联，例如，作为包装插页。标签可用于指示内含物将用于特定的治疗应用。标签还可指示内含物的使用方向，例如在本文所述的方法中。

在试剂盒的一些实施方式中，HMWHA流体可以存在于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置可包含一个或多个含有本文所公开的组合物的单位剂型。该包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可附有用于施用的说明。

HMWHA流体制备

如上所述，流体的透明质酸具有至少2.5m³/kg的特性粘度，以及优选地<0.2％w/v的浓度。在一些实施方式中，透明质酸具有至少2.9m³/kg的特性粘度。

粘弹性被定义为同时具有粘性和弹性的流体的特性。零剪切粘度被确定为在剪切速率消失时的稳态剪切平台粘度。对于高粘性的制剂，优选用可控应力流变仪进行测量。

通过Mark-Houwink方程给出分子量和特性粘度[η](m³/kg)之间的关系：

[η]＝k·(M_rm)^a

其中M_rm是MD_a中的分子量；系数k＝1.3327·10^-4；a＝0.6691；其中k和a的值已被发现最具预测性。

HMWHA流体可以如下生产：对装灌管线进行灭菌；将纯净水或注射用水(WFI)加入到不锈钢混合槽中；在混合的同时加入盐；缓慢加入HA并混合，直到获得均匀溶液/流体；如果需要，通过添加NaOH或HCl调节pH值，同时继续混合过程；将溶液通过1μm孔径滤筒转移到无菌保持槽；以及通过无菌过滤将溶液无菌地填充到无菌初级包装(单剂或小瓶)中。在单剂的情况下，这可以通过吹灌密封(BFS)工艺来完成。

优选地，HMWHA流体至少基本上不含粘蛋白或换句话说具有<0.3％w/v的粘蛋白浓度。这意味着流动行为或性质基本上是由透明质酸达到或调整的，而不是由自然存在于受试者泪液中的并主要负责其流动行为的粘蛋白来达到或调整的。

如果添加增加粘度的物质，优选在接近最终步骤或在最终步骤过程中或作为最终步骤添加它们。进行混合以达到均匀的混合物。作为替代或补充，优选地首先提供纯净水或注射用水作为基础，然后可选地，首先向纯净水或注射用水添加电解质、缓冲剂和不增加粘度的物质。

在专题著作欧洲药典9.0第3583页(Sodium Hyaluronate)中进一步描述了HA，其全部内容通过引用并入本文。

在一个实施方式中，本发明的方法和试剂盒中使用的流体具有表1中列出的特征：

表1

特性	规格	测试方法
			外观	无色透明溶液，不含可见杂质	欧洲药典
pH值	6.8-7.6	欧洲药典
			渗透浓度	240-330mosmol/kg	欧洲药典
HA浓度	0.10-0.19％w/v	欧洲药典
			NaCl浓度	7.6-10.5g/l	欧洲药典
无菌性	无菌	欧洲药典
			磷酸盐浓度	1.0-1.4mmol/l	欧洲药典

示例性实施方式

实施方式1：一种用于治疗人或非人动物受试者的眼睛角膜的神经损伤或损失(角膜神经损伤或损失)的方法，包括将包含高分子量透明质酸(HMWHA)的流体局部施用到眼睛的眼表面，其中所述透明质酸具有至少2.5m³/kg的特性粘度。

实施方式2：根据实施方式1所述的方法，其中神经损伤或损失包括以下特征中的一个或多个：减少的神经纤维长度、减少的神经纤维曲度、减少的神经纤维密度和神经纤维分离(完全的或部分的)。

实施方式3：根据实施方式1或2所述的方法，其中与在没有HMWHA流体的情况下发生的角膜神经的净损失相比，HMWHA流体减小了来自角膜神经损伤或损失的角膜神经净损失。

实施方式4：根据前述实施方式中任一项所述的方法，进一步包括在所述施用HMWHA流体之前鉴别受试者患有角膜神经损伤或损失。

实施方式5：根据实施方式4所述的方法，其中所述鉴别包括在受试者的眼睛上执行体内共焦显微术(IVCM)。

实施方式6：根据实施方式1至3中任一项所述的方法，进一步包括：在所述施用HMWHA流体之前，鉴别受试者患有角膜神经损伤或损失的标志或症状。

实施方式7：根据实施方式6的方法，其中角膜神经损伤或损失的标志为以下中的一种或多种：角膜神经支配或感觉的减少、支配角膜的神经纤维或束的数量的减少、支配角膜的神经元的死亡、神经递质释放的减少或损失、神经生长因子释放的减少或损失、异常流泪反射、异常眨眼反射、异常神经形态、异常神经芽的出现、异常曲度、增加的珠状神经形成、神经纤维束的变薄、神经纤维束的增厚、次级角膜神经螺纹长度缩短、角膜神经的密度减小、角膜神经的长度减小、角膜神经的支化减少、复发性角膜侵蚀、角膜的上皮伤口愈合延迟或降低的流泪率。

实施方式8：根据实施方式6的方法，其中角膜神经损伤或损失的症状是以下中的一项或多项：异常泪液产生或干燥、异常眨眼、难以聚焦或聚焦能力损失、视敏度降低或损失、或者角膜敏感度降低或损失。

实施方式9：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中角膜神经损伤或损失由疾病、创伤、先天性缺陷或医疗程序引起。

实施方式10：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中角膜神经损伤或损失包括由病毒感染、药疹、长期使用隐形眼镜、手术、糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)或多发性硬化症引起的角膜神经支配损伤。

实施方式11：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中受试者在给药时在眼睛患有神经营养性角膜病变(轻度、中度或重度NK)，并且HMWHA流体减轻NK的一种或多种标志或症状。

实施方式12：根据实施方式11所述的方法，其中NK在给药时是轻度NK(也称为阶段1)或中度NK(也称为阶段2)，并且HMWHA流体防止或延迟NK进展到重度NK的状态(也称为阶段3)。

实施方式13：根据实施方式11的方法，其中NK是重度NK。

实施方式14：根据实施方式1至10中任一项所述的方法，其中受试者在施用时不患有神经营养性角膜病变(轻度、中度或重度NK)，并且HMWHA流体防止或延迟NK的发作。

实施方式15：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中受试者患有眼表面疾病(轻度、中度或严重)。

实施方式16：根据实施方式1至14中任一项所述的方法，其中受试者不患有眼表面疾病。

实施方式17：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中受试者患有泪膜缺陷。

实施方式18：根据实施方式1至16中任一项所述的方法，其中受试者不患有泪膜缺陷。

实施方式19：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中受试者患有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)，并且患有糖尿病周围神经病变。

实施方式20：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中受试者患有糖尿病性角膜神经病变，其中HMWHA流体逆转糖尿病性角膜神经病变。

实施方式21：根据实施方式1至18中任一项所述的方法，其中受试者患有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)，但尚未患有糖尿病性周围神经病变。

实施方式22：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中受试者患有已知的可以导致眼表面损伤(其可导致NK)的眼病(诸如疱疹后感染(单纯疱疹和带状疱疹)、具有与角膜神经炎相关的神经损伤的其他感染、化学或物理烧伤、局部麻醉剂的滥用、药物毒性(诸如trimolol、倍他洛尔、双氯芬酸钠、30％磺胺醋酰)、慢性眼表面损伤或炎症、眼部手术(诸如白内障手术、青光眼手术、激光原位角膜磨削术(LASIK)和屈光性角膜切削术(PRK)、穿透性角膜移植术(PK)、深板层角膜移植术(DALK)、圆锥角膜胶原交联术、用于视网膜脱离的玻璃体切除术、治疗糖尿病性视网膜病变的光凝术、术后或激光治疗)、佩戴隐形眼镜、眼眶肿瘤或角膜营养不良(晶格或颗粒)。

实施方式23：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在局部施用HMWHA流体之前、期间或之后施用一种或多种额外的治疗，所述治疗选自：重组人神经生长因子(cenegermin)、基质金属蛋白酶抑制剂、富含生长因子的血浆(PRGF)、治疗性隐形眼镜、暂时性睑缘缝合术(在给予HMWHA流体后部分地或完全地)、羊膜移植、穿透角膜移植术、角膜移植、cenegermin联合角膜移植、或直接或间接角膜神经再生。

实施方式24：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体作为滴剂或作为洗剂(例如，灌洗)被直接施用到眼表面。

实施方式25：根据实施方式1至23中任一项所述的方法，HMWHA流体通过局部施用于眼表面或眼睛的其他部分的递送剂(流体递送剂)(例如，涂有和/或将流体分泌到眼表面的颗粒)间接施用至眼表面。

实施方式26：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中透明质酸具有2.6m³/kg至2.9m³/kg或更大范围内的特性粘度。

实施方式27：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体进一步包括防腐剂。

实施方式28：根据实施方式1至26中任一项所述的方法，其中HMWHA流体不进一步包含防腐剂(即，所述流体是不含防腐剂的)。

实施方式29：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体进一步包含额外的糖胺聚糖(GAG)、电解质(例如，氯化钠)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液)、或前述两种或更多种的组合。

实施方式30：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中透明质酸具有至少3百万道尔顿的分子量。

实施方式31：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中透明质酸的分子量在3百万道尔顿至4百万道尔顿的范围内。

实施方式32：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体包含浓度＜0.2％w/v的HMWHA。

实施方式33：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体包含浓度为0.1至0.19％w/v的HMWHA。

实施方式34：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体包含浓度为约0.15％w/v的HMWHA。

实施方式35：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体具有：

a)6.8-7.6的pH；

b)240-330mOsmol/kg的渗透浓度；

c)7.6-10.5g/1的NaCl浓度；和/或

d)1.0-1.4mmol/1的磷酸盐浓度。

实施方式36：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体是透明且无色的溶液，不含可见杂质。

实施方式37：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体是无菌的。

实施方式38：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体是Comfort

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液。

实施方式39：根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中HMWHA流体不包含其它生物活性剂(例如，不含疏水活性成分)。

实施方式40：根据实施方式1至38中任一项所述的方法，其中HMWHA流体还包含生物活性剂(例如，疏水性活性成分)。

定义

除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“这个”和类似术语应被解释为涵盖单数和复数。因此，例如，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则提及“一个细胞”或“一个化合物”应被解释为涵盖单个细胞或单个化合物以及多个细胞和多个化合物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。缩写词“例如(e.g.)”源自拉丁语“exempligratia”，并且在本文中用于指示非限制性实施例。因此，缩写词“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。此外，在说明书和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括”、“具有”或其变体的情况下，这样的术语旨在以类似于术语“包含”的方式为包容性的。过渡术语/短语(以及其任何语法变体)“包含”、“基本由...组成”以及“由...组成”可以互换使用。

本发明的施用流体的上下文中的术语“有效量”是指获得期望结果所需的流体量，例如与在没有HMWHA流体的情况下发生的角膜神经净损失相比，减少来自角膜神经损伤或损失的角膜神经净损失所需的量。

当用作组合物的改性剂时，术语“分离的”意味着所述组合物是通过人为干预制备的或从其天然存在的体内环境分离出来的。通常，如此分离的组合物基本上不含它们通常实质上与之相结合的一种或多种材料，例如一种或多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。“基本上纯的”分子可以与一个或多个其它分子结合。因此，术语“基本上纯的”不排除组合物的组合。基本纯度可以达到分子质量的约60％或更多。纯度也可以是约70％或80％或更多，并且可以更大，例如90％或更多。纯度可以通过任何合适的方法来确定，包括例如UV光谱法、色谱法(例如，HPLC、气相)、凝胶电泳(例如，银或考马斯染色)和序列分析(用于核酸和肽)。

如本文所用，术语“透明质酸”(HA)是指自然界中发现的由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸的二糖重复组成的糖胺聚糖，也称为透明质烷(例如，由二糖[-D-葡糖醛酸-b1,3-N-乙酰-D-葡萄糖胺-b1,4-]n的重复单元组成的直链糖胺聚糖聚合物)，还指具有化学修饰的透明质酸的衍生物，如透明质酸的酯、酰胺衍生物、烷基胺衍生物、低分子量和高分子量形式的透明质酸，以及交联形式(如透明质酸凝胶)。因此，二糖链可以是线性或非线性的。透明质酸可以通过连接交联剂如硫醇、甲基丙烯酸酯、十六烷基酰胺和酪胺来交联。透明质酸也可以直接与甲醛和二乙烯基砜交联。透明质酸凝胶的例子包括但不限于透明质酸凝胶A、透明质酸凝胶B和透明质酸凝胶G-F 20(Hargittai M和I Hargittai，“More Conversationswith Hyaluronan Scientists,”摘自Hyaluronan-From Basic Science to ClinicalApplications,Balazs EA主编,卷3,2011,PubMatrix,Edgewater,NJ；Cowman MK等，Carbohydrate Polymers 2000,41:229-235；Takigami S等，Carbohydrate Polymers,1993,22:153-160；Balazs EA等，“Hyaluronan,its cross-linked derivative–Hylan—and their medical applications”,in Cellulosics Utilization:Research andRewards in Cellulosics,Proceedings of Nisshinbo International Conference onCellulosics Utilization in the Near Future(Eds Inagaki,H and Phillips GO),Elsevier Applied Science(1989),NY,第233-241页；Koehler L等,Scientific Reports,2017,7,article no.1210；以及Pavan M等，Carbohydr Polym，2013，97(2):321-326；它们各自通过引用整体并入本文)。

术语“透明质酸”或HA包括HA本身和其药学上可接受的盐。HA可以配制成药学上可接受的盐形式。可以通用常规技术制备HA的药学上可接受的盐。

本发明的透明质酸上下文中的术语“高分子量”或“HMW”是指具有至少2.5m³/kg(2.5m³/kg或更大)的特性粘度的透明质酸，特性粘度由欧洲药典9.0中第3584页“SodiumHyaluronate”的方法所确定(其全文通过引用并入本文)。简单来说，通过线性最小二乘回归分析来计算特性粘度[η]，即使用Martin方程：Log₁₀(n_r-1/c)＝log₁₀[η]+κ[η]c。在一些实施方式中，高分子量透明质酸具有至少2.9m³/kg的特性粘度。

术语“神经损伤或损失”(在角膜中)和“角膜神经损伤或损失”在本文中可互换使用，是指抑制或损害正常角膜神经翻转、定向、生长、功能或前述两种或更多种的任何组合的任意类型的神经损伤，并且可以涉及对神经结构(架构和/或连续性)以及在一些情况下周围组织的任何程度的损伤。神经损伤可以是任何类型或阶段的损伤，例如神经失用症、轴突断伤或神经断伤(Seddon HJ,“A Classification of Nerve Injuries”,BritishMedical Journal,1942,2(4260):237–9)。例如，神经损伤或损失可包括以下特征中的一个或多个：减少的神经纤维长度、减少的神经纤维曲度、减少的神经纤维密度、以及完全的或部分的神经纤维分离。神经损伤或损失可以是减少神经元功能(神经营养损伤)的任何类型的影响和/或导致神经元功能完全不存在(神经麻痹损伤)(例如在神经分离中的情况)的类型的影响的结果。

术语“神经营养性角膜病变”或“NK”是指由角膜神经支配受损引起的退行性角膜疾病，其特征是角膜感觉减少或缺失，可能导致上皮角膜病变、上皮缺损、基质溃疡，并最终导致角膜穿孔。改变正常角膜神经支配的眼部或全身疾病可以导致NK。潜在的病原学状况包括：感染，如疱疹性角膜炎(带状和单纯)；局部麻醉剂滥用；化学和物理烧伤；滥用隐形眼镜(长期佩戴隐形眼镜)；局部药物毒性；眼睛或附属器的辐射；长期使用含苯扎氯铵(BAK)的局部药物；角膜手术，如激光原位角膜磨削术(LASIK)、屈光性角膜切削术(PRK)、角膜移植手术(特别是穿透性角膜移植术(PK)和深板层角膜移植术(DALK))以及圆锥角膜眼的胶原交联术；非角膜眼部手术，如用于视网膜脱离的玻璃体切除术和治疗糖尿病性视网膜病变的光凝术，用于增生性糖尿病性视网膜病变的间接激光；以及非眼部病因，如神经外科手术或损伤第五脑神经的创伤、中风、动脉瘤、多发性硬化症、颅内肿块、糖尿病、麻风病、维生素A缺乏、药物(嗜睡药和抗精神病药)和三叉神经先天性发育不全。

如本文所用，术语“眼表面”是指角膜和结膜及其部分，包括覆盖上眼睑和下眼睑的结膜。HMWHA流体可以局部施用至眼表面的一个或多个部分，包括例如整个眼表面。

“药学上可接受的盐”包括酸和碱加成盐。本文中描述的HA或任何一种其它化合物的药学上可接受的盐旨在涵盖任何和所有的药学上合适的盐形式。优选的本文所述的药学上可接受的盐是药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。

药学上可接受的酸加成盐是指保持游离碱的生物学有效性和性质的那些盐，其不是生物学的或其它方式不希望的，并且其用无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸等形成。还包括用有机酸形成的盐，有机酸例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等，还包括例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。示例性盐因此包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸酯、氯苯甲酸酯、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸酯、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、乙酸苯酯、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还考虑到氨基酸盐，如精氨酸盐、葡糖酸盐和半乳糖醛酸酯(参见，例如，Berge S.M.等,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Science,66:1-19(1997)，其全文通过引用并入本文)。碱性化合物的酸加成盐可以通过根据技术人员熟悉的方法和技术将游离碱形式与足够量的所需酸接触来制备。

药学上可接受的碱加成盐是指保持游离酸的生物有效性和性质的那些盐，所述游离酸不是生物学或其它方面不希望的。这些盐是通过向游离酸中添加无机碱或有机碱而制备的。药学上可接受的碱加成盐可由金属或胺形成，例如碱和碱土金属或有机胺。由无机碱衍生的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。由有机碱衍生的盐包括但不限于：伯胺盐、仲胺盐和叔胺盐；包含天然存在的取代胺的取代胺；环胺和碱离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因，N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、乙烯二苯胺、N-甲基葡糖胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。参见Berge等人，同上。在一些实施方式中，药学上可接受的盐是钠盐(参见欧洲药典9.0第3583页“Sodium Hyaluronate”，其通过引用并入本文)。

如本文所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”指代人或非人动物。受试者还指例如灵长类动物(例如，人类)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者是鸟或鱼。因此，所述方法可以在医学环境和兽医环境中进行。非人类动物受试者可以是例如患有眼睛或非眼睛疾病的宠物或动物模型。

术语“局部给药”在本文中以其常规意义使用，以意指局部递送至所需解剖学部位，例如眼表面。包含高分子量透明质酸的流体可以通过允许有效量的流体和眼表面接触的任何方式直接或间接地施加到眼表面。例如，流体可以直接施加到眼表面，诸如经由滴眼液或灌洗，或经由与眼表面或眼睛的其它部分接触的递送剂(例如，流体递送剂)间接施加。递送剂的实施例是涂覆有流体和/或将流体释放到眼表面上的颗粒(例如，微粒或纳米颗粒)。此类颗粒可由各种材料如天然或合成聚合物组成。在一些实施方式中，递送剂本身可以作为滴剂施用。

术语“治疗”包括减轻医学病症、改善医学病症、抑制或预防医学病症的进展、逆转或消除医学病症(例如角膜神经损伤或损失)或与该病症相关的一种或多种症状或并发症，以及减轻、改善或根除该病症的一种或多种病因。

本发明仅由说明书和附图中的实施方式示例性地描述，并且不限于此，而是包括专家在考虑和/或结合其特定知识的情况下可以从本申请的完整文件中获得的所有变型、改进、替换和组合。

本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过引用整体(包括所有附图和表)并入本文，到它们与本说明书的明确教导没有不一致的程度上。

以下是示出用于实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有百分比均按重量计，并且所有溶剂混合物比例均按体积计。

实施例1-高分子量透明质酸滴眼液促进角膜神经生长

A.背景技术

HYLAN M研究是一项正在进行的针对严重干眼症患者(根据ODISSEY主要标准)的随机临床研究。在HYLAN M研究中，患者被随机分为两组，一组使用之前确定的最有效的个体患者治疗，另一组改用高分子量透明质酸滴眼液(COMFORT 

无防腐剂透明质酸钠滴眼液(i.com medical GmbH，德国慕尼黑))，其与本文中的表1的实施方式相对应。

这些患者已经接受了他们的眼科医生所能提供的最好的治疗。所有患者在纳入本研究时都在接受“稳定”治疗，即在纳入本研究之前，他们的治疗在一段规定的时间内没有改变。患者被随机分为两组，一组患者继续使用目前的干眼综合征疗法，第二组患者使用上述流体滴剂(COMFORT 

滴眼液)代替泪液替代品进行治疗。

研究目标包括:(1)比较使用COMFORT 

滴眼液治疗的干眼和用泪液替代滴眼液(在严重干眼症中，在出现在研究者之前，患者用其治疗(＝当前疗法))治疗的干眼的客观和主观症状；(2)观察滴眼液的客观性能、患者主观接受度及不良事件。对每个患者，检查双眼，并对基线检查时角膜荧光素染色评分较高的眼进行评估。

在HYLAN M研究中，共聚焦显微术是要在基线随访和8周随访时执行的可选的诊断方法，用于分析基底下上皮神经丛。关于HYLAN M研究的细节如下。

关于HYLAN M研究的进一步细节可见

W.G.K.“The HYLANM Study.Study design and first results”Aktkontaktol，2017年1月，第13期，第27号(3页)，其通过引用整体并入本文。

B.角膜共聚焦显微术的总体介绍

海德堡视网膜断层扫描仪(HRT)是一种共聚焦激光扫描系统，用于采集和分析眼睛后部和前部的二维或三维图像。海德堡视网膜断层扫描仪的最重要的常规临床应用是视神经头的青光眼损伤的检测和通过青光眼模块进行青光眼进展的随访。该仪器能够定量描述视神经头形态和时间相关变化。

随着Rostock角膜模块(RCM)的加入，HRT被转换为允许获取不同角膜层(包括角膜神经丛)以及角膜缘和结膜的二维和三维图像的共聚焦角膜显微镜。

为了获取角膜图像，激光束聚焦在角膜上，并通过振荡镜周期性偏转，使得角膜的二维扇区被顺序扫描。每个点处的反射光的数量由光敏检测器测量。在HRT的共聚焦光学系统中，光只有在从环绕预设焦平面的狭窄区域反射或散射时才能到达探测器。在焦平面外反射或散射的光被高度抑制。因此，二维共焦图像可以被看作是通过角膜的enface光学切面。焦平面可以手动移动通过整个角膜。因此，可以获得以下不同角膜层的图像。

测量焦平面的实际位置，并将其与每个采集的图像一起存储。

海德堡视网膜断层扫描仪/Rostock角膜模块中的激光源是一个波长为670微米的二极管激光器。二维图像由384×384个图像元素(像素)组成。使用“400FOV”场透镜，它覆盖0.4mm×0.4mm的角膜区域，或者使用“300FOV”场透镜，它覆盖0.3mm×0.3mm的角膜区域。

该设备由具有医疗保健背景并具有眼科成像和诊断设备操作经验的专业用户(如医生、眼科摄影师或验光师)操作。

C.角膜神经丛评估

RCM测量遵循临床常规。将局部麻醉药和人工泪液施用于受试者的双眼，受试者在设备的头枕和颏托中。操作人员将粘性人工泪液施加到HRT-RCM患者界面的前凹部分，并在HRT-RCM设备与患者眼睛之间安装“Tomocap”作为接触元件。然后，操作者将小心地向前移动HRT-RCM，直到“Tomocap”与患者角膜之间产生轻柔接触。将焦平面调整到基底下神经丛层，并在靠近每个角膜中心的不同位置收集基底下神经丛的图像，特别侧重感兴趣的区域。基底下神经丛图像应是均匀光照的、无伪影并具有最大的信噪比。

D.HYLAN M研究内的数据收集

在基线检查和8周随访时，收集每名患者双眼的角膜中央区域的基底下神经丛图像10张。图像存储在HRT+RCM设备的单图像模式下，并输出到阅读中心进行评估。

E.数据分析和结果

收集16名患者在基线和治疗8周后的图像。这16名患者包括继续使用在被纳入HYLAN M研究之前一直使用的对照润滑剂滴眼液的8名对照组患者以及其眼睛润滑剂滴眼液已经被COMFORT 

滴眼液取代的8名患者。

令发明人惊讶的是，与对照组相比，发现用Comfort 

滴眼液治疗8周的患者的总神经纤维长度出现了统计学显著的(p＝0.031)的生长(51％生长)，如图1所示。这种神经营养活性是意想不到的效果。

实施例2-HYLANM研究的详细分析

如实施例1所述，患有严重干眼病(DED)的患者被随机分成两个平行组。对照组继续使用被纳入之前他们正在使用的疗法。在真实组中(COMFORT 

滴眼液组；在本文中也称为HMWHA组)，在被纳入之前每个患者使用的单个润滑剂滴眼液被含有0.15％HMWHA的滴眼液代替(Comfort 

滴眼液，i.com medical GmbH，德国慕尼黑)。对干眼的伴随治疗(如环孢菌素滴眼液)在两个组中保持不变。

在基线随访期间记录人口统计数据和医疗历史。在基线随访、第4周和第8周随访访问时，分别评估与DED相关联的症状和标志(参见表2)。

表2.诊断测试计划,圆括号内为可选测试

缩写：眼表面疾病指数(OSDI)、最佳矫正视力(BCVA)、角膜荧光素染色(CFS)、泪膜破裂时间(TBUT)、眼内压(IOP)和眼睑刷上皮病变(LWE)。

Korb,D.R.等，Prevalence of lid wiper epitheliopathy in subjects withdry eye signs and symptoms.Cornea 2010,29,377–383。

Yamaguchi,M.等，Marx line:Fluorescein staining line on the inner lidas indicator of meibomian gland function.Am.J.Ophthalmol.2006,141,669–675.

建议研究中心在基线和第8周随访时选择性地拍摄CSLM图像，并将其提供给蒙面阅读中心进行评估。11个研究中心中有4个参加了这项可选测试。这四个研究中心提供了他们所有的符合方案的患者的CSLM图像；因此，在整个HYLAN M研究中使用的电子随机化也适用于可选的共聚焦显微术研究。这四个研究中心的CSLM图像的评估结果是本报告的主题。纳入HYLAN M研究的所有符合方案的84例患者的其他诊断测试的结果，如眼表面疾病指数(OSDI)、滴的频率、最佳矫正视力(BCVA)、角膜荧光素染色(CFS)、泪膜破裂时间(TBUT)、泪液分泌试验1、泪液渗透浓度、眼内压(IOP)、眼睑刷上皮病变(LWE)和Yamaguchi评分，此前均已被报道(van Setten等人，“The HYLAN M Study:Efficacy of 0.15％ HighMolecular Weight Hyaluronan Fluid in the Treatment of Severe Dry Eye Diseasein a Multicenter Randomized Trial”,J.Clin.Med.2020,9,3536)。

患有任何潜在病因的DED的18岁以上的患者符合纳入条件。纳入之前，患者必须接受稳定、不变的干眼治疗至少2个月(如果同时使用环孢菌素治疗，则为3个月)。如果患者参加了任何其他临床试验、患有干眼病以外的眼部疾病、在研究纳入前不到三个月做过眼部手术、正在使用泪点栓、或具有由Karpecki所确定的伪装症状(Karpecki,“Why dry eyetrials often fail:From disease variability to confounding underlyingconditions,there are countless reasons why new dry eye drugs have come upshort in FDA testing,”Rev.Optom.2013,150,50–56)，则被排除。伪装症状为结膜松弛症、复发性角膜糜烂、上皮基底膜营养不良、粘液钓鱼综合征、眼睑松弛综合征、巨乳头性结膜炎、萨尔斯曼氏结节变性和眼红斑痤疮。

作为用于重度干眼的纳入标准，选择了根据Baudouin等的主要标准(Baudouin,C.等.ODISSEY European Consensus Group Members.Diagnosing the severity of dryeye:A clear and practical algorithm.Br.J.Ophthalmol.2014,98,1168–1176)。使用眼表面疾病指数(OSDI)问卷对干眼症状进行评估，OSDI得分达到33分或更高才可纳入(Schiffman,R.M.等.Reliability and validity of the Ocular Surface DiseaseIndex.Arch.Ophthalmol.2000,118,615–621)。角膜荧光素染色(CFS)被选为干眼标志(Bron,A.J.等.Grading of corneal and conjunctival staining in the context ofother dry eye tests.Cornea 2003,22,640–650)。为了纳入，患者必须至少有一只眼患有牛津3级或以上的CFS，但没有融合的CFS。染色评分较高的眼睛被定义为研究眼睛。

如先前所述，海德堡视网膜断层扫描仪(HRT 3)与Rostock角膜模块(HeidelbergEngineering GmbH，德国海德堡)联合用于角膜基底下神经丛(SNP)的体内评估(Ziegler,D.等，Early detection of nerve fiber loss by corneal confocal microscopy andskin biopsy in recently diagnosed type 2diabetes.Diabetes 2014,63,2454–2463；Stachs,O.等，In Vivo Confocal Scanning Laser Microscopy.In High ResolutionImaging in Microscopy and Ophthalmology:New Frontiers in Biomedical Optics；Bille,J.F.,Ed.；Springer:Cham,Switzerland,2019；第263–284页)。双眼均用局部麻醉剂麻醉，并用人工泪液覆盖。为了防止眼睛运动，患者被要求用未经检查的眼睛盯着聚光灯。

在靠近顶点、距离次级螺纹超过0.5mm的角膜中心区域拍摄5张不重叠的图像(参见图2A和经阅读中心处理后的图2B为图像示例)。

图像处理和定量图像分析由阅读中心使用Mathematica(11.3版本，WolframResearch Inc.，美国伊利诺伊州Champaign)进行，如前所述(Winter,K.等，LocalVariability of Parameters for Characterization of the Corneal Subbasal NervePlexus.Curr.Eye Res.2016,41,186–198)。计算以下SNP参数：角膜神经纤维长度(CNFL)，定义为每单位面积上所有神经纤维的总长度(mm/mm²)；角膜神经纤维密度(CNFD)，定义为每单位面积上神经纤维的数量(n/mm²)；角膜神经分支密度(CNBD)，定义为每单位面积上分支点的数量(n/mm²)；平均加权角膜神经纤维曲度(CNFTo)，反映神经纤维方向的可变性，定义为绝对神经纤维曲度/神经纤维长度(μm^-1)；角膜神经连接点(CNCP)，定义为穿过区域边界的神经纤维数量(连接/mm²)；角膜神经单纤维平均长度(CNSFL)，定义为神经纤维的平均长度(μm)；平均加权角膜神经纤维厚度(CNFTh)，作为垂直于神经纤维路线的平均厚度(μm)来测量。

使用IBM SPSS Statistics(版本22，IBM Corp，美国纽约州阿蒙克市)进行统计分析。计算描述性统计量，并生成箱形图。采用夏皮罗-威尔克检验来检查数据的正态分布。分别采用Wilcoxon符号秩检验和曼-惠特尼U检验进行分组比较。显著性水平确定为p<0.05。

表3包含了具有SNP的CSLM评估的患者的社会人口特征。

表3.根据治疗组(n＝16)的社会人口特征

分析了在基线随访结束时和第8周随访结束时拍摄的8名对照组患者和8名HMWHA组患者的5张CSLM图像(见图3中的示例)。

我们发现基线和8周随访的CNFL有统计学上显著的差异；与对照组(p＝0.294)相反，HMWHA组CNFL有显著性差异(p＝0.030)。HMWHA和对照的CNFL在基线时类似(p＝0.793)，并且在8周后显示出显著差异(p＝0.031)。可能由于患者人数较少，我们没有发现其他SNP参数(CNFD、CNBD、CNFTo、CNCP、CNSFL、CNFTh)有显著差异。此外，患有严重干眼的患者的SNP一般不发达，SNP附近存在大量异物组织，使图像分析变得复杂。图4总结了HMWHA组和对照组在基线和8周随访时的CNFL结果。图4对应于实施例1中的图1，包含了所示的单个患者数据点。

关于HYLAN M研究和COMFORT 

滴眼液对总神经纤维长度的效果和基底下神经丛的营养效应的进一步细节被提供在van Setten等的“The HYLAN M Study:Efficacy of 0.15％ High Molecular Weight Hyaluronan Fluid in the Treatment ofSevere Dry Eye Disease in a Multicenter Randomized Trial,J Clin Med.,2020年11月2日；9(11):3536”和van Setten等的“High Molecular Weight Hyaluronan PromotesCorneal Nerve Growth in Severe Dry Eyes,J Clin Med.,2020年11月24日；9(12):3799”中，它们各自通过引用整体并入本文。

应该理解的是，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且根据其进行的各种修改或变化将被建议给本领域的技术人员，并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方式的任何元素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他元素或限制(单独或以任何组合)或任何其他发明或其实施方式相结合，并且所有这些组合都是在本发明的预期范围内，而不是对其进行限制。

Claims (40)

1.一种用于治疗人或非人动物受试者的眼睛的角膜的神经损伤或损失(角膜神经损伤或损失)的方法，包括将包含高分子量透明质酸(HMWHA)的流体局部施用到眼睛的眼表面，其中所述透明质酸具有至少2.5m³/kg的特性粘度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中神经损伤或损失包括以下特征中的一个或多个：减少的神经纤维长度、减少的神经纤维曲度、减少的神经纤维密度和神经纤维分离(完全的或部分的)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中与在没有HMWHA流体的情况下发生的角膜神经的净损失相比，HMWHA流体减小了来自角膜神经损伤或损失的角膜神经净损失。

4.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在所述施用HMWHA流体之前鉴别受试者患有角膜神经损伤或损失。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述鉴别包括在受试者的眼睛上执行体内共焦显微术(IVCM)。

6.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：在所述施用HMWHA流体之前，鉴别受试者患有角膜神经损伤或损失的标志或症状。

7.根据权利要求6所述的方法，其中角膜神经损伤或损失的标志为以下中的一种或多种：角膜神经支配或感觉的减少、支配角膜的神经纤维或束的数量的减少、支配角膜的神经元的死亡、神经递质释放的减少或损失、神经生长因子释放的减少或损失、异常流泪反射、异常眨眼反射、异常神经形态、异常神经芽的出现、异常曲度、增加的珠状神经形成、神经纤维束的变薄、神经纤维束的增厚、次级角膜神经螺纹长度缩短、角膜神经的密度减小、角膜神经的长度减小、角膜神经的支化减少、复发性角膜侵蚀、角膜的延迟的上皮伤口愈合或降低的流泪率。

8.根据权利要求6所述的方法，其中角膜神经损伤或损失的症状是以下中的一项或多项：异常泪液产生或干燥、异常眨眼、难以聚焦或聚焦能力损失、视敏度降低或损失、或者角膜敏感度降低或损失。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中角膜神经损伤或损失由疾病、创伤、先天性缺陷或医疗程序引起。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中角膜神经损伤或损失包括由病毒感染、药疹、长期使用隐形眼镜、手术、糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)或多发性硬化症引起的角膜神经支配的损伤。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者在给药时眼睛患有神经营养性角膜病变(轻度、中度或重度NK)，并且HMWHA流体减轻NK的一种或多种标志或症状。

12.根据权利要求11所述的方法，其中NK在给药时是轻度NK(也称为阶段1)或中度NK(也称为阶段2)，并且HMWHA流体防止或延迟NK进展到重度NK的状态(也称为阶段3)。

13.根据权利要求11所述的方法，其中NK是重度NK。

14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中受试者在施用时不患有神经营养性角膜病变(轻度、中度或重度NK)，并且HMWHA流体防止或延迟NK的发作。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者患有眼表面疾病(轻度、中度或严重)。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者不患有眼表面疾病。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者患有泪膜缺陷。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者不患有泪膜缺陷。

19.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者患有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)，并且患有糖尿病性周围神经病变。

20.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者患有糖尿病性角膜神经病变，并且其中HMWHA流体逆转糖尿病性角膜神经病变。

21.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者患有糖尿病(1型、2型或妊娠糖尿病)，但尚未患有糖尿病性周围神经病变。

22.根据权利要求1或2所述的方法，其中受试者患有已知的可以导致眼表面损伤(其可导致NK)的眼病(诸如疱疹后感染(单纯疱疹和带状疱疹)、具有与角膜神经炎相关的神经损伤的其他感染、化学或物理烧伤、局部麻醉剂的滥用、药物毒性(诸如trimolol、倍他洛尔、双氯芬酸钠、30％磺胺醋酰)、慢性眼表面损伤或炎症、眼部手术(诸如白内障手术、青光眼手术、激光原位角膜磨削术(LASIK)和屈光性角膜切削术(PRK)、穿透性角膜移植术(PK)、深板层角膜移植术(DALK)、圆锥角膜胶原交联术、用于视网膜脱离的玻璃体切除术、治疗糖尿病性视网膜病变的光凝术、术后或激光治疗)、佩戴隐形眼镜、眼眶肿瘤或角膜营养不良(晶格或颗粒)。

23.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括在局部施用HMWHA流体之前、期间或之后施用一种或多种额外的治疗，所述治疗选自：重组人神经生长因子(cenegermin)、基质金属蛋白酶抑制剂、富含生长因子的血浆(PRGF)、治疗性隐形眼镜、暂时性睑缘缝合术(在给予HMWHA流体后部分地或完全地)、羊膜移植、穿透角膜移植术、角膜移植、cenegermin联合角膜移植、或直接或间接角膜神经再生。

24.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体作为滴剂或作为洗剂(例如，灌洗)被直接施用到眼表面。

25.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体通过局部施用于眼表面或眼睛的其他部分的递送剂(流体递送剂)(例如，涂有和/或将流体分泌到眼表面的颗粒)间接施用至眼表面。

26.根据权利要求1或2所述的方法，其中透明质酸具有2.6m³/kg至2.9m³/kg或更大范围内的特性粘度。

27.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体进一步包括防腐剂。

28.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体不进一步包含防腐剂(即，所述流体是不含防腐剂的)。

29.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体进一步包含额外的糖胺聚糖(GAG)、电解质(例如，氯化钠)、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液)，或前述两种或更多种的组合。

30.根据权利要求1或2所述的方法，其中透明质酸具有至少3百万道尔顿的分子量。

31.根据权利要求1或2所述的方法，其中透明质酸的分子量在3百万道尔顿至4百万道尔顿的范围内。

32.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体包含浓度＜0.2％w/v的HMWHA。

33.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体包含浓度为0.1至0.19％w/v的HMWHA。

34.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体包含浓度为约0.15％w/v的HMWHA。

35.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体具有：

a)6.8-7.6的pH；

b)240-330mOsmol/kg的渗透浓度；

c)7.6-10.5g/1的NaCl浓度；和/或

d)1.0-1.4mmol/1的磷酸盐浓度。

36.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体是透明且无色的溶液，不含可见杂质。

37.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体是无菌的。

38.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体是COMFORT

无防腐剂的透明质酸钠滴眼液。

39.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体不包含其它生物活性剂(例如，不含疏水活性成分)。

40.根据权利要求1或2所述的方法，其中HMWHA流体进一步包含生物活性剂(例如，疏水性活性成分)。

Images