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CN116083601A - 用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法 - Google Patents

用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法 Download PDF

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CN116083601A
CN116083601A CN202211740501.4A CN202211740501A CN116083601A CN 116083601 A CN116083601 A CN 116083601A CN 202211740501 A CN202211740501 A CN 202211740501A CN 116083601 A CN116083601 A CN 116083601A
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窦艳玲
黄河
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Chongqing Medical University
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体的说是用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，S1：通过翻正反射消失(LORR)检测咪达唑仑或甲苯磺酸瑞马唑仑使小鼠达到麻醉水平的药物剂量，并记录翻正反射消失的维持时间；S2：检测肝脏组织肝药酶CYP450总活力和血浆非特异性酯酶总活力；S3：通过WheelRunning(跑轮实验)记录咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠活动/休息节律的影响；S4：通过RT‑qPCR法检测咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠核心时钟基因表达量的影响；以探究甲苯磺酸瑞马唑仑相关的时间药理学。

Description

用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说是用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法。
背景技术
每年全球会开展约两亿例全麻手术，虽然这是社会医疗的显著进步和改善，但患者术后麻醉药物相关的并发症也是一个无法忽略的问题，其中，有大量研究报导了苯二氮类药物咪达唑仑相关的术后并发症，比如术后认知功能障碍、术后苏醒延迟；这种术后并发症的发生，除了与药物本身有关系之外，与药物的使用剂量、使用时间和使用方式等都息息相关；2005年有研究报导，在不同时间使用同等剂量的咪达唑仑会导致维持时间不同；所以，除了药物本身，药物在体内代谢速率的时间性也是我们必须重视的问题，即药物的时间药理学。
时间药理学即依据生物学上的时间特性，研究药物作用的时间规律，包括药理效应、药物代谢动力学和机体敏感度等依时间不同而发生变化的规律，从而来选择合适的用药时机，以达到最小剂量、最佳疗效、最小毒性的治疗目的，从而提高患者的用药效果；这种药物的时间性主要是受到体内生物节律的影响，生物钟也称生物节律，是一种广泛存在于地表生物体内的内在机制。生物节律不仅参与调控机体许多重要的生理过程，如血压、体温、激素分泌等；同时也参与调控机体许多病理过程，如肿瘤、心血管疾病、糖尿病等；因此，维持体内生物节律的稳定具有非常重要的意义，但外界很多因素会影响体内的生物节律，比如光线、氧气含量、药物等；其中就有研究报导，作为临床麻醉常用的镇静药物咪达唑仑，不仅显著降低小鼠时钟中枢SCN中核心时钟基因Per2的表达量，而且在不同时间点注射咪达唑仑还会导致小鼠活动/休息的相位显著前移或者后移，咪达唑仑对机体生物节律的这种具有时间差异性的严重干扰，可能是其术后其认知功能障碍并发症发生的重要原因，那么对于同种类新药的开发就变得更加期待，最近一种新型的苯二氮类药物已经上市—甲苯磺酸瑞马唑仑，甲苯磺酸瑞马唑仑是在咪达唑仑的分子结构体系上直接引入丙酸甲酯侧链，从而产生的一种较新型高效的苯二氮类药物，临床实验结果显示，与咪达唑仑相比，甲苯磺酸瑞马唑仑药物具有更持久的中枢镇静治疗作用和相对更有效的中枢镇静状态恢复，并且甲苯磺酸瑞马唑仑在体内迅速被非特异性酯酶代谢，不经过肝肾，其代谢物唑仑丙酸没有活性，这些性质使甲苯磺酸瑞马唑仑成为替代丙泊酚和咪达唑仑的潜在候选药物；但甲苯磺酸瑞马唑仑相关的时间药理学研究仍是空白，同时，甲苯磺酸瑞马唑仑是否对机体生物节律产生显著影响也值得我们去进一步研究，甲苯磺酸瑞马唑仑和咪达唑仑之间的影响差异也需要进一步探究。
为此，本发明提供用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，解决背景技术中所提出的至少一个技术问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，该方法如下所示：
S1：通过翻正反射消失(LORR)检测咪达唑仑或甲苯磺酸瑞马唑仑使小鼠达到麻醉水平的药物剂量，并记录翻正反射消失的维持时间；
S2：检测肝脏组织肝药酶CYP450总活力和血浆非特异性酯酶总活力；
S3：通过Wheel Running(跑轮实验)记录咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠活动/休息节律的影响；
S4：通过RT-qPCR法检测咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠核心时钟基因表达量的影响。
优选的，所述S1具体步骤如下所示：
A1：采用完全随机法将C57BL/6J小鼠分为6组，每组数量为7只，甲苯磺酸瑞马唑仑：每瓶规格为36mg中加入9mL 0.9％浓度生理盐水，配成4mg/mL，用于小鼠腹腔注射，咪达唑仑为5mg/mL规格液体，可直接注射；
A2：小鼠饲养环境为08：00(ZT0)开灯，20：00(ZT12)关灯，ZT表示由实验室控制的灯光表示方法，ZT0-12为开灯时间，ZT12-24为关灯时间，在以下六个时间点ZT0(08：00)，ZT4(12：00)，ZT8(16：00)，ZT12(20：00)，ZT16(24：00)，ZT20(04：00)分别探究各药物浓度下小鼠翻正反射消失的比例；
A3：对小鼠进行药物腹腔注射后，把小鼠放在单独的笼子里，观察并翻动小鼠，若在一分钟之内没有恢复四脚着地的状态，则被认为是翻正反射消失，并记录每组有效麻醉小鼠个数，若翻正反射比例为100％则认为该剂量为有效剂量，同时，记录麻醉维持时间即为翻正反射恢复的时间。
优选的，所述S2中血浆非特异性酯酶总活力检测的具体步骤如下所示：
B1：将10只C57BL/6J小鼠随机分为ZT0、ZT8两组，对小鼠进行眼球采血，血液收集于抗凝管内，在4℃下通过低温离心机离心，5000rpm，离心5min，分离出血浆，同时将血浆稀释500倍；
B2：取0.304g NaH2PO4和0.695g K2HPO4于100mL蒸馏水中，在稀释5倍获得10mMPB，然后再将18.62mg于100μL乙醇溶解成1mol/L后加入10mM PB稀释2000倍，获得0.5mMα-醋酸萘酯底物液，在PCR96孔板中加入180μLα-醋酸萘酯底物液和20μL稀释血浆，在30℃生化酶培养箱中孵育30min；
B3：加入20μL显色底物，显色底物为5％SDS+0.25％固蓝B盐，600nm检测吸光度；
B4：取14.4mgα-萘酚于100μL乙醇溶解成1mol/L后，再用10mM PB稀释5000倍至200μM/L，再倍比稀释成不同浓度，然后在已知浓度标准α-醋酸萘酚中加入200μL不同浓度的稀释的α-萘酚；
B5：绘制标准曲线，计算样本酶活性。
优选的，所述S2中肝脏组织肝药酶CYP450检测的具体步骤如下所示：
C1：采用颈椎脱臼法处死小鼠，立即剪开小鼠的胸腹腔，暴露小鼠心脏，用4.5号针头刺入小鼠左心室，在静脉窦处剪一小开口，打开恒速泵注器，持续均匀泵入PBS溶液，待小鼠肝脏颜色完全变浅后可停止灌注；
C2：取肝脏组织于PBS溶液中漂洗残留血液和毛发，滤纸吸干，称重肝组织；
C3：称重400mg肝组织，加2mL蔗糖溶液，冰浴研磨，然后在4℃于15000g离心30min，取上清1mL，加入PB 4mL稀释5倍，混匀，再冰浴下充CO，1-2气泡/秒，通气2min获得饱和CO的匀浆液；
C4：取饱和CO的匀浆液1.5mL放入含15mgNa2S2O4的离心管中，盖上盖子，放置5min左右；
C5：分别测量含/不含连二亚硫酸钠的CO匀浆液在450nm和490nm的吸光度值。
优选的，所述S2中肝脏组织的蛋白检测步骤如下所示：
D1：将已知浓度蛋白按0、1、2、4、6、8、16μL加到96孔板中，加蒸馏水补足到20μL，同时将1μL肝脏组织内的蛋白样品加入到96孔板中，蒸馏水补足到20μL；
D2：取NaH2PO427.6 g于蒸馏水中，稀释溶解后计量至水满1000mL，获得A液，取Na2HPO453.6 g加适量蒸馏水搅拌溶解，加水计量至每桶1000mL，获得B液，然后将A液和B液按照50：1比例混合得到BCA工作液；
D3：各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30分钟；
D4：用酶标仪测定A562波长的吸光度，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
优选的，所述S3中Wheel Running(跑轮实验)步骤如下所示：
E1：采用完全随机法将C57BL/6J小鼠分为6组，每组7只，6组为CT0生理盐水对照组、CT8生理盐水对照组、CT0咪达唑仑给药组、CT8咪达唑仑给药组、CT0甲苯磺酸瑞马唑仑给药组和CT8甲苯磺酸瑞马唑仑给药组，CT0为动物活动与休息的交界处，活动结束后0h，CT8为动物活动结束后8h的时间点；
E2：先将C57BL/6J小鼠于光暗条件下同步化饲养一周以上，在转移到恒暗条件后，每一只动物被单独关在一个装有跑轮的笼子里，以便连续记录动物活动/休息节律，使动物在恒暗的条件下自由活动一周，以便在给药前建立一个稳定的节律；
E3：分别在CT0和CT8(对小鼠进行甲苯磺酸瑞马唑仑50mg/kg或咪达唑仑70mg/kg腹腔注射，放回笼中，继续监测记录小鼠跑轮的活动/休息节律。
优选的，所述S4中过RT-qPCR法检测的检测步骤如下所示：
F1：采用完全随机法将C57BL/6J小鼠分为6组，每组4只，6组分为ZT0对照组、ZT0咪达唑仑给药组、ZT0甲苯磺酸瑞马唑仑给药组、ZT8对照组、ZT8咪达唑仑给药组、ZT8甲苯磺酸瑞马唑仑给药组，对照组注射等体积生理盐水，给药组注射50mg/kg甲苯磺酸瑞马唑仑或70mg/kg咪达唑仑，给药2h后进行取材，其中ZT0为动物活动与休息的交界处，ZT8为动物活动8h后；
F2：于ZT0和ZT8采用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开小鼠胸腔，暴露心脏，用4.5号针头均匀刺入小鼠心尖部，在静脉窦处剪一小开口，打开恒速泵注器，持续均匀泵入PBS溶液，待小鼠肝脏颜色完全浅后可停止灌注，剪下小鼠脑部，剪开头部皮肤切除整个脑颅盖骨，完全暴露其脑组织，倒置小鼠头部，使脑组织随惯性与颅底完全分离，用弯头尖镊和小号组织剪分离下丘脑组织于无RNA酶的EP管中，作好标记，迅速放入液氮中冷冻，后将所有样品保存于-80℃冰箱；
F3：下丘脑组织RNA提取；
F4：下丘脑组织RNA反转录；
F5：通过PCR检测样品组织中基因的表达量。
优选的，所述F3下丘脑组织RNA提取步骤如下所示：
G1：在下丘脑组织中加入Trizol后匀浆(<50mg/mL)，15000g、4℃离心5min，转移上清至新的EP管中，在室温条件下放置至少5min以保证使核蛋白复合物彻底解离；
G2：按照每1mL的Trizol液中加入0.2mL的量加入氯仿，盖上EP管的盖子，在手中用力地震荡约15秒，室温4℃放置约2-3min，然后取一支新的EP管，按每1mL的Trizol加0.5mL的异丙醇量加入异丙醇，做好标记，4℃备用；
G3：加入氯仿后溶液会分成三层，只需小心均匀地吸取上层溶液的水相到含异丙醇的EP管中，注意吸取过程中不要吸到中间层的蛋白，4℃放置10min，15000g，4℃离心10min，再将上清液倒掉，加量为1mL 75％乙醇，简短振荡，10000g，4℃离心5min，再倒掉乙醇；
G4：开盖将RNA沉淀量取出，晾干乙醇，然后在加入适当体积DEPC水重悬，核酸仪测其浓度和纯度。
优选的，所述F4下丘脑组织RNA反转录的步骤如下所示：
H1：混合4*DN MasterMix与gDNARemover：440μL4*DN MasterMix加入8.8μLgDNARemover，颠倒混匀；
H2：RNA变性：取1μg RNA，补加无核酸酶水至12μL，65℃，5min，立即置冰上冷却；
H3：去除基因组DNA：加入4μL已添加gDNARemover的4*DN Master Mix，轻轻混匀，37℃孵育5min；
H4：逆转录：加入4μL 5*RT MasterMix II，轻轻混匀后进行以下反应：37℃15min、50℃5min、98℃5min、4℃Hold，加入180μL H2O，-20℃保存备用。
所述RT-PCR目的基因mRNA相对定量：以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达量，其中引物序列见下表：
引物序列
本发明的有益效果如下：
1.本发明所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，通过翻正反射消失(LORR)检测咪达唑仑或甲苯磺酸瑞马唑仑使小鼠达到麻醉水平的药物剂量，并记录翻正反射消失的维持时间，检测肝脏组织肝药酶CYP450总活力和血浆非特异性酯酶总活力；通过Wheel Running(跑轮实验)记录咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠活动/休息节律的影响。通过RT-qPCR法检测咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠核心时钟基因表达量的影响，得到咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑均具有时间药效学现象，其原因是肝药酶CYP450活力和血浆非特异性酯酶活力具有节律性；咪达唑仑使动物活动/休息节律相位提前，并且对大多数核心节律基因表达有一定的影响，甲苯磺酸瑞马唑仑不影响生物节律，并且不影响大部分核心节律基因的表达。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1是咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑在六个时间点使C57BL/6J小鼠达到翻正反射消失的比例图；
图2是六个时间点咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑的起效剂量图；
图3是咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑在六个时间点的维持时间图；
图4是ZT0和ZT8中肝脏CYP450酶活力的展示图；
图5是ZT0和ZT8中非特异性酯酶总活力的展示图；
图6是CT0和CT8中咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑的活动/休息节律周期结果图；
图7是CT0和CT8咪达唑仑的活动/休息节律相位结果图；
图8是CT0和CT8甲苯磺酸瑞马唑仑的活动/休息节律相位结果；
图9是ZT0、ZT8咪达唑仑组及对照组对C57BL/6J小鼠的下丘脑组织节律基因mRNA表达情况的影响；
图10是ZT0、ZT8甲苯磺酸瑞马唑仑唑仑组及对照组对C57BL/6J小鼠的下丘脑组织节律基因mRNA表达情况的影响；
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明实施例所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其S1中分别在ZT0(08：00)、ZT4(12：00)、ZT8(16：00)、ZT12(20：00)、ZT16(24：00)、ZT20(04：00)这6个时间点验证咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑唑仑各剂量达到翻正反射消失的小鼠比例。
将能够达到100％小鼠产生翻正反射消失现象的药物使用剂量作为该麻醉药物的有效剂量。如图1和图2中黑色线条所示，根据结果可以看出，咪达唑仑在不同时间点的麻醉有效剂量不同，在ZT12时最高，为70mg/kg；在ZT0、4、8三个时间点均较低，为50mg/kg；根据以上结果可确定在六个时间点均能产生麻醉效果的咪达唑仑的有效剂量为70mg/kg，为了后续实验的可操作性和可重复性，故选择此剂量作为后续的实验剂量；
同时，如图1和图2中灰色线条所示，根据甲苯磺酸瑞马唑仑的结果可以看出，甲苯磺酸瑞马唑仑在不同时间点的麻醉有效剂量也不同，在ZT0较高，为50mg/kg，在ZT16时最低，为20mg/kg；根据以上实验结果确定在六个时间点均有效的药物剂量为50mg/kg，为了实验的可操作性和可重复性，故选择此剂量作为后续的实验剂量。
如图3中黑色柱体所示，研究者分别在ZT0(08：00)，ZT4(12：00)，ZT8(16：00)，ZT12(20：00)，ZT16(24：00)，ZT20(04：00)这6个时间点对小鼠腹腔注射70mg/kg的咪达唑仑，记录麻醉维持时间，发现咪达唑仑的麻醉维持时间在ZT0时为881.44±21.71min，ZT4时为777.22±32.71min，ZT8时为659.11±41.25min，ZT12为680.22±18.01min，ZT16为599.56±53.76min，ZT20时为585.37±54.05min，其中麻醉维持时间最长的为ZT0，因为ZT0与除ZT4之外的四个时间点比较差异均较大(p＜0.001)，其中ZT0与ZT8的维持时间差异也比较明显(p＜0.001)；
同样如图3灰色柱体所示，分别在ZT0(08：00)，ZT4(12：00)，ZT8(16：00)，ZT12(20：00)，ZT16(24：00)，ZT20(04：00)这6个时间点对小鼠腹腔注射剂量为50mg/kg的甲苯磺酸瑞马唑仑，分别记录麻醉维持时间，结果显示甲苯磺酸瑞马唑仑的麻醉维持时间在ZT0时为15.83±1.70min，ZT4时为22.96±3.76min，ZT8时为54.94±5.40min，ZT12为26.59±3.44min，ZT16为34.41±5.03min，ZT20时为19.95±2.85min，其中差异最大的为ZT0和ZT8(p＜0.001)。
通过以上结果为了在后续实验中将咪达唑仑与甲苯磺酸瑞马唑仑的研究结果做比较，后续实验统一选择了ZT0和ZT8这两个时间点作为差异时间点。
如图4所示，通过测定肝脏CYP450酶活力来反应咪达唑仑的代谢情况，根据图4研究结果所示，本研究将同步化后的小鼠在ZT0和ZT8两个时间点分别取肝脏测定CYP450酶活力，结果显示肝脏ZT0时CYP450酶活力为16.99±5.32nmol/g protein，ZT8时CYP450酶活力为28.77±6.71nmol/gprotein。ZT0的CYP450酶活力显著低于ZT8，差异具有统计学意义，说明咪达唑仑在ZT0时麻醉维持时间显著长于ZT8可能是因为ZT0时其代谢酶CYP450的酶活力显著低于ZT8，导致咪达唑仑在ZT0时的代谢速率显著降低，从而麻醉维持时间显著延长。
如图5所示，通过测定酯酶活力反应甲苯磺酸瑞马唑仑的代谢情况，根据图5结果所示，ZT0时酯酶总活力为5075.62±296.29U/L，ZT8时酯酶总活力为3936.33±129.73U/L，酯酶活力在ZT0时显著高于ZT8，说明甲苯磺酸瑞马唑仑在ZT0时麻醉维持时间显著短于ZT8可能是因为ZT0时其代谢酯酶的酶活力显著高于ZT8，导致甲苯磺酸瑞马唑仑在ZT0时的代谢速率显著增高，从而麻醉维持时间显著缩短。
如图6-8所示，在恒暗环境下记录咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对活动/休息节律的影响，根据图6和图7数据显示，本研究分别在CT0和CT8两个时间点分别对小鼠腹腔注射咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑，对照组则分别在CT0和CT8两个时间点在小鼠身上注射同等体积的生理盐水，根据结果显示，相比于对照组，在CT0给予咪达唑仑对相位无显著影响，在CT8给予咪达唑仑使相位明显提前；在CT0和CT8两个时间点给予咪达唑仑均不会改变小鼠活动/休息节律的周期；同时图6和图8数据显示，相比于对照组，在CT0和CT8两个时间点分别给予甲苯磺酸瑞马唑仑不会改变小鼠活动/休息节律的周期和相位，说明甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠的活动/休息节律没有显著影响。
图9和图10所示，本研究分别在ZT0和ZT8分别腹腔注射70mg/kg咪达唑仑和50mg/kg甲苯磺酸瑞马唑仑，给药两小时后对取材下丘脑组织，并检测核心时钟基因的表达量；如图9结果显示，相比于对照组，ZT0注射咪达唑仑对下丘脑组织核心时钟基因Cry2显著增加，而对其余节律基因无显著影响；在ZT8注射咪达唑仑使核心时钟基因Per1、Per2和Cry1的表达量显著降低，使核心时钟基因Cry2的表达量显著增加；同时，如图10结果显示，相比于对照组，ZT0时注射甲苯磺酸瑞马唑仑，下丘脑组织中核心时钟基因Per1的表达量显著升高；ZT8注射甲苯磺酸瑞马唑仑则对核心时钟基因的表达量无显著影响；表1显示咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑影响节律基因的对比。
表1
综上所述：咪达唑仑在70mg/kg剂量、甲苯磺酸瑞马唑仑在50mg/kg剂量时可以在任意时间点达到100％小鼠翻正反射消失，其中咪达唑仑麻醉维持时间ZT0最长，ZT8较短；甲苯磺酸瑞马唑仑麻醉维持时间差异最大的为ZT0和ZT8，ZT0最短，ZT8最长，非特异性酯酶活力在ZT0比ZT8高，肝药酶CYP450活力在ZT0比ZT8低(p＜0.001)；在CT8给予咪达唑仑使活动/休息节律相位提前，在CT0和CT8给予甲苯磺酸瑞马唑仑不改变小鼠活动休息节律的周期和相位；咪达唑仑在ZT0上调下丘脑组织节律基因Cry2的表达，在ZT8下调下丘脑组织的Per1、Per2、Cry1的表达，在ZT8上调Cry2基因的表达；甲苯磺酸瑞马唑仑在ZT0上调下丘脑组织节律基因Per1的表达，对其余节律基因表达不具有影响。
咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑均具有时间药效学现象，其原因是肝药酶CYP450活力和血浆非特异性酯酶活力具有节律性；咪达唑仑使动物活动/休息节律相位提前，并且对大多数核心节律基因表达有一定的影响，甲苯磺酸瑞马唑仑不影响生物节律，并且不影响大部分核心节律基因的表达。
上述前、后、左、右、上、下均以说明书附图中的图1为基准，按照人物观察视角为标准，装置面对观察者的一面定义为前，观察者左侧定义为左，依次类推。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：该方法如下所示：
S1：通过翻正反射消失(LORR)检测咪达唑仑或甲苯磺酸瑞马唑仑使小鼠达到麻醉水平的药物剂量，并记录翻正反射消失的维持时间；
S2：检测肝脏组织肝药酶CYP450总活力和血浆非特异性酯酶总活力；
S3：通过WheelRunning(跑轮实验)记录咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠活动/休息节律的影响；
S4：通过RT-qPCR法检测咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对小鼠核心时钟基因表达量的影响。
2.根据权利要求1所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述S1具体步骤如下所示：
A1：采用完全随机法将C57BL/6J小鼠分为6组，每组数量为7只，甲苯磺酸瑞马唑仑：每瓶规格为36mg中加入9mL0.9％浓度生理盐水，配成4mg/mL，用于小鼠腹腔注射，咪达唑仑为5mg/mL规格液体，可直接注射；
A2：小鼠饲养环境为08：00(ZT0)开灯，20：00(ZT12)关灯，ZT表示由实验室控制的灯光表示方法，ZT0-12为开灯时间，ZT12-24为关灯时间，在以下六个时间点ZT0(08：00)，ZT4(12：00)，ZT8(16：00)，ZT12(20：00)，ZT16(24：00)，ZT20(04：00)分别探究各药物浓度下小鼠翻正反射消失的比例；
A3：对小鼠进行药物腹腔注射后，把小鼠放在单独的笼子里，观察并翻动小鼠，若在一分钟之内没有恢复四脚着地的状态，则被认为是翻正反射消失，并记录每组有效麻醉小鼠个数，若翻正反射比例为100％则认为该剂量为有效剂量，同时，记录麻醉维持时间即为翻正反射恢复的时间。
3.根据权利要求2所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述S2中血浆非特异性酯酶总活力检测的具体步骤如下所示：
B1：将10只C57BL/6J小鼠随机分为ZT0、ZT8两组，对小鼠进行眼球采血，血液收集于抗凝管内，在4℃下通过低温离心机离心，5000rpm，离心5min，分离出血浆，同时将血浆稀释500倍；
B2：取0.304gNaH2PO4和0.695gK2HPO4于100mL蒸馏水中，在稀释5倍获得10mMPB，然后再将18.62mg于100μL乙醇溶解成1mol/L后加入10mMPB稀释2000倍，获得0.5mMα-醋酸萘酯底物液，在PCR96孔板中加入180μLα-醋酸萘酯底物液和20μL稀释血浆，在30℃生化酶培养箱中孵育30min；
B3：加入20μL显色底物，显色底物为5％SDS+0.25％固蓝B盐，600nm检测吸光度；
B4：取14.4mgα-萘酚于100μL乙醇溶解成1mol/L后，再用10mMPB稀释5000倍至200μM/L，再倍比稀释成不同浓度，然后在已知浓度标准α-醋酸萘酚中加入200μL不同浓度的稀释的α-萘酚；
B5：绘制标准曲线，计算样本酶活性。
4.根据权利要求3所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述S2中肝脏组织肝药酶CYP450检测的具体步骤如下所示：
C1：采用颈椎脱臼法处死小鼠，立即剪开小鼠的胸腹腔，暴露小鼠心脏，用4.5号针头刺入小鼠左心室，在静脉窦处剪一小开口，打开恒速泵注器，持续均匀泵入PBS溶液，待小鼠肝脏颜色完全变浅后可停止灌注；
C2：取肝脏组织于PBS溶液中漂洗残留血液和毛发，滤纸吸干，称重肝组织；
C3：称重400mg肝组织，加2mL蔗糖溶液，冰浴研磨，然后在4℃于15000g离心30min，取上清1mL，加入PB4mL稀释5倍，混匀，再冰浴下充CO，1-2气泡/秒，通气2min获得饱和CO的匀浆液；
C4：取饱和CO的匀浆液1.5mL放入含15mgNa2S2O4的离心管中，盖上盖子，放置5min左右；
C5：分别测量含/不含连二亚硫酸钠的CO匀浆液在450nm和490nm的吸光度值。
5.根据权利要求4所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述S2中肝脏组织的蛋白检测步骤如下所示：
D1：将已知浓度蛋白按0、1、2、4、6、8、16μL加到96孔板中，加蒸馏水补足到20μL，同时将1μL肝脏组织内的蛋白样品加入到96孔板中，蒸馏水补足到20μL；
D2：取NaH2PO427.6g于蒸馏水中，稀释溶解后计量至水满1000mL，获得A液，取Na2HPO453.6g加适量蒸馏水搅拌溶解，加水计量至每桶1000mL，获得B液，然后将A液和B液按照50：1比例混合得到BCA工作液；
D3：各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置20-30分钟；
D4：用酶标仪测定A562波长的吸光度，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
6.根据权利要求5所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述S3中WheelRunning(跑轮实验)步骤如下所示：
E1：采用完全随机法将C57BL/6J小鼠分为6组，每组7只，6组为CT0生理盐水对照组、CT8生理盐水对照组、CT0咪达唑仑给药组、CT8咪达唑仑给药组、CT0甲苯磺酸瑞马唑仑给药组和CT8甲苯磺酸瑞马唑仑给药组，CT0为动物活动与休息的交界处，活动结束后0h，CT8为动物活动结束后8h的时间点；
E2：先将C57BL/6J小鼠于光暗条件下同步化饲养一周以上，在转移到恒暗条件后，每一只动物被单独关在一个装有跑轮的笼子里，以便连续记录动物活动/休息节律，使动物在恒暗的条件下自由活动一周，以便在给药前建立一个稳定的节律；
E3：分别在CT0和CT8(对小鼠进行甲苯磺酸瑞马唑仑50mg/kg或咪达唑仑70mg/kg腹腔注射，放回笼中，继续监测记录小鼠跑轮的活动/休息节律。
7.根据权利要求6所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述S4中过RT-qPCR法检测的检测步骤如下所示：
F1：采用完全随机法将C57BL/6J小鼠分为6组，每组4只，6组分为ZT0对照组、ZT0咪达唑仑给药组、ZT0甲苯磺酸瑞马唑仑给药组、ZT8对照组、ZT8咪达唑仑给药组、ZT8甲苯磺酸瑞马唑仑给药组，对照组注射等体积生理盐水，给药组注射50mg/kg甲苯磺酸瑞马唑仑或70mg/kg咪达唑仑，给药2h后进行取材，其中ZT0为动物活动与休息的交界处，ZT8为动物活动8h后；
F2：于ZT0和ZT8采用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开小鼠胸腔，暴露心脏，用4.5号针头均匀刺入小鼠心尖部，在静脉窦处剪一小开口，打开恒速泵注器，持续均匀泵入PBS溶液，待小鼠肝脏颜色完全浅后可停止灌注，剪下小鼠脑部，剪开头部皮肤切除整个脑颅盖骨，完全暴露其脑组织，倒置小鼠头部，使脑组织随惯性与颅底完全分离，用弯头尖镊和小号组织剪分离下丘脑组织于无RNA酶的EP管中，作好标记，迅速放入液氮中冷冻，后将所有样品保存于-80℃冰箱；
F3：下丘脑组织RNA提取；
F4：下丘脑组织RNA反转录；
F5：通过PCR检测样品组织中基因的表达量。
8.根据权利要求7所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述F3下丘脑组织RNA提取步骤如下所示：
G1：在下丘脑组织中加入Trizol后匀浆(<50mg/mL)，15000g、4℃离心5min，转移上清至新的EP管中，在室温条件下放置至少5min以保证使核蛋白复合物彻底解离；
G2：按照每1mL的Trizol液中加入0.2mL的量加入氯仿，盖上EP管的盖子，在手中用力地震荡约15秒，室温4℃放置约2-3min，然后取一支新的EP管，按每1mL的Trizol加0.5mL的异丙醇量加入异丙醇，做好标记，4℃备用；
G3：加入氯仿后溶液会分成三层，只需小心均匀地吸取上层溶液的水相到含异丙醇的EP管中，注意吸取过程中不要吸到中间层的蛋白，4℃放置10min，15000g，4℃离心10min，再将上清液倒掉，加量为1mL75％乙醇，简短振荡，10000g，4℃离心5min，再倒掉乙醇；
G4：开盖将RNA沉淀量取出，晾干乙醇，然后在加入适当体积DEPC水重悬，核酸仪测其浓度和纯度。
9.根据权利要求8所述的用于比较咪达唑仑和甲苯磺酸瑞马唑仑对生物节律的方法，其特征在于：所述F4下丘脑组织RNA反转录的步骤如下所示：
H1：混合4*DNMasterMix与gDNARemover：440μL4*DNMasterMix加入8.8μLgDNARemover，颠倒混匀；
H2：RNA变性：取1μgRNA，补加无核酸酶水至12μL，65℃，5min，立即置冰上冷却；
H3：去除基因组DNA：加入4μL已添加gDNARemover的4*DNMaster Mix，轻轻混匀，37℃孵育5min；
H4：逆转录：加入4μL5*RTMasterMixII，轻轻混匀后进行以下反应：37℃15min、50℃5min、98℃5min、4℃Hold，加入180μLH2O，-20℃保存备用。
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