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CN116068100A - 一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法 - Google Patents

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CN116068100A
CN116068100A CN202211485704.3A CN202211485704A CN116068100A CN 116068100 A CN116068100 A CN 116068100A CN 202211485704 A CN202211485704 A CN 202211485704A CN 116068100 A CN116068100 A CN 116068100A
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hepes
piperazine ethanesulfonic
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CN202211485704.3A
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柴晓晖
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Shanghai Yannuo Pharmaceutical Technology Co ltd
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Shanghai Yannuo Pharmaceutical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及涉及缓冲剂检测领域，具体涉及一种测定4‑羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，采用亲水相互作用色谱(HILIC)联合蒸发光散射检测器，色谱柱采用Hilic柱；所述亲水相互作用色谱采用的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A浓度为0.13％三乙胺‑0.04％甲酸缓冲液；所述流动相B为乙腈；所述流动相A和流动相B体积比为1:9～7:3。本发明提供的检测方法，实现了HEPES的检测，该方法操作简便，高效，专属性强，为其他相关辅料的检测提供了参考价值。

Description

一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法
技术领域
本发明涉及缓冲剂检测领域，具体涉及一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法。
背景技术
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是一种氢离子缓冲剂，其在pH6.8～8.2范围内具有较好的缓冲能力，且其本身不受温度，浓度和离子组成等影响而能长期保持良好的稳定性，加之无细胞毒性，是Good’s缓冲液的一员，已被广泛应用到细胞培养基，体外诊断试剂，药物研发等领域。随着脂质体技术的越发成熟，脂质体作为药物包封的重要媒介，实现了药物递送靶向性和低毒性的双重功效，提高了治疗效果。而实现这一目的的，将药物包封到空白脂质体中是关键步骤之一，而使用HEPES缓冲液进行淋洗、过柱，最终使得药物的pH维持恒定且具有特定浓度的HEPES缓冲液，又是实现这一关键步骤的核心操作。因此准确测定药物中HEPES的含量对于药物的质量控制必不可少,但是目前对于HEPES的检测鲜有报道。
HILIC虽然已经被广泛地使用在亲水化合物的含量分析中，但是其保留机理一直存在争议。其中最被接受的机理模型是基于分析物在流动相和HILIC固定相上的“富水层”之间的分配。HILIC固定相为裸硅胶或者键合了亲水性基团，它可以结合流动相中的水形成一层“富水层”，分析物可以进入这个“富水层”而被保留，同时不同化合物由于在“富水层”和流动相中分配系数不同而实现分离，而这个“富水层”的存在也是HILIC区别于正相的重要特点。这个“水膜”的厚度由很多因素决定，包括固定相的组成、温度以及流动相的离子强度等，因此可以通过改变这些参数来改变化合物在HILIC柱上的保留和选择性。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种测定HEPES的检测方法，研究了不同因素对HEPES含量测定的影响。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：采用HILIC色谱联合ELSD法，色谱柱采用Hilic柱(250x4.6mm，5μm)
在本发明中，流动相A为0.13％三乙胺-0.04％甲酸缓冲液(测得pH范围至4～5)；流动相B为乙腈；流动相A和流动相B体积比为1:9～7:3，优选为4:6。
HEPES是一种极性和两性离子缓冲液，在很宽的pH值范围内带电，因此选择了一种高效的方法开发策略使用XBridge HILIC色谱柱联合蒸发光散射检测器来筛选HEPES的选择性及保留性。使用该方法可产生不同的洗脱顺序或最佳的保留性，这一特性有利于开发对溶液中HEPES的分离方法；当使用极性固定相，并且流动相的乙腈浓度高于40％时，HEPES将会得到很好的保留。
优选的，所述流动相A的pH可调节为4.1～4.5，再优选的，pH可调节为4.3。
由于流动相中使用了甲酸，氢离子浓度的变化也意味着总离子浓度的变化，在pH＝4～5的范围内，随着pH值的增加，HEPES的保留时间也在发生变化，而当pH调节为4.3，HEPES的保留时间达到最优。
优选地，本申请所用甲酸用来调整流动相的水溶液部分的pH值。
具体的，稀释剂为流动相A和流动相B体积比为1:9～9:1，优选为4:6。
流动相中的流动相A和流动相B,在比例为4:6时，HILIC的吸附或离子交换机制成为Hilic柱上的主要保留机制。使得Hilic柱能够对HEPES进行更好地捕获。
具体的，柱温为10～40℃，优选为25℃。
柱温在10～40℃温度范围内，Hilic柱对于HEPES具有很好的捕获能力，但是并不是根据温度的变化而线性变化，其原因在于保留机制在吸附或离子交换机制之间随着温度的变化而变化，当温度选择为25℃时，吸附或离子交换机制发挥的作用最强，能够很好地捕获HEPES。
具体的，样品盘温度为10～30℃，优选为25℃。
具体的，进样体积为1～30ul,优选为10ul。
具体的，流速为0.1～2.0ml/min，优选为1.0ml/min。
具体的，ELSD检测器型号为Waters2424或AllChrom 6100。
具体的，气体压力为30～50psi,优选为40psi(适用于waters 2424)；或1.4～1.8L/min，优选为1.6L/min(适用于AllChrom 6100)。
具体的，增益值为40～60，优选为50(适用于waters 2424)；或0.5～1.5，优选为1(适用于AllChrom 6100)。
具体的，漂移管温度为50～120℃，优选为80℃(适用于waters2424或AllChrom6100)。
本发明有益效果是：
本发明提供的检测方法，实现了HEPES的检测，该方法操作简便，高效，专属性强，为其他相关辅料的检测提供了参考价值。
附图说明
图1为实施例1专属性考察中HEPES对照品溶液的色谱图。
图2为实施例3准确度考察中HEPES对照品(浓度125％)溶液的色谱图。
图3为实施例5耐用性考察中HEPES对照品(流速0.9ml/min)溶液的色谱图。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明进行详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
专属性考察：专属性是确定待测物在该方法中能被分离，且测定中不会受到空白溶液及其它杂质的干扰；如有干扰说明干扰的程度。
色谱条件如表1所示：
表1
Figure BDA0003962178140000031
溶液配制：
空白溶液(同稀释剂)：三乙胺-甲酸缓冲液:ACN＝40:60(v/v)。
对照品贮备液：精确称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)对照品约10mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀。
对照品溶液(STD)：精密移取4.0mL对照品贮备液，置20mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀。
结果：空白溶液和其它杂质对HEPES的检测无干扰；HEPES峰的拖尾因子为0.96，HEPES峰的理论塔板数为24652。专属性满足接受标准。
实施例2
线性考察：该方法线性响应是在限度的50％至限度的150％以内的相对浓度之间进行检查，结果显示响应值(峰面积)的对数与给定的范围内样品中被分析物的浓度的对数成正比。
色谱条件同实施例1。
对照品贮备液：同实施例1。
各线性溶液按表2配制：
表2
Figure BDA0003962178140000041
结果见图2：Y＝1.6633X+7.9196，相关系数r为0.999，表明HEPES在50％～150％(0.050mg/mL～0.150mg/mL)范围内线性关系良好。
实施例3
准确度考察：准确度是测定该方法在测定HEPES含量时测定结果与真实值的差异，从而确认是否该方法可以获得准确的测试结果。
色谱条件同实施例1。
对照品贮备液：同实施例1。
供试品溶液：精确称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)约10mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀，作为供试品贮备液；精密移取上述供试品贮备液4.0mL，置20mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，得供试品溶液。
准确度溶液1(75％)：分别精密移取1.5mL供试品贮备液和对照品贮备液，置同一20mL量瓶中，用稀释剂定容，混匀。平行制备3份。
准确度溶液2(100％)：分别精密移取2.0mL供试品贮备液和对照品贮备液，置同一20mL量瓶中，用稀释剂定容，混匀。平行制备3份。
准确度溶液3(125％)：分别精密移取2.5mL供试品贮备液和对照品贮备液，置同一20mL量瓶中，用稀释剂定容，混匀。平行制备3份。
结果如表3所示，平均回收率为99.8％(RSD＝2.4％，n＝9)，可满足日常检测需求。
表3准确度结果表
Figure BDA0003962178140000051
Figure BDA0003962178140000061
75％水平的回收率分别为：101.4％，104.6％，96.4％，平均回收率为100.8％；100％水平的回收率分别为：100.9％，99.5％，99.1％，平均回收率为99.8％；125％水平的回收率分别为：98.3％，100.4％，97.7％，平均回收率为98.8％；9份样品的总平均回收率为99.8％，RSD为2.4％。准确度满足接受标准。
实施例4
重复性考察：精密度指在规定的测试条件下同一个均匀供试品，经多次测定所得到的结果之间的接近度。在相同条件下由同一分析人员测定所得的结果之间的接近度称为重复性，平行测定6份同一浓度供试品溶液，计算含量的RSD值，得到重复性。
色谱条件同实施例1。
供试品溶液：精确称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)供试品约10mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀；精密移取上述溶液4.0mL，置20mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀。平行制备6份。
结果如表4所示，HEPES含量的RSD为2.7％，说明方法的重复性良好。
表4重复性结果表
Figure BDA0003962178140000062
Figure BDA0003962178140000071
6份供试品溶液中HEPES含量的RSD为2.7％，重复性满足接受标准
实施例5
耐用性考察：耐用性是检验方法参数很小变化(诸如样品放置时间、流速、柱温、漂移管温度、载气压力的变化等)而保持不受影响的能力，对此进行研究，证明方法的可靠性。
色谱条件，除对流速进行改变外，其余同实施例1。
供试品溶液：精确称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)供试品约10mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀；精密移取上述溶液4.0mL，置20mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀。
结果如表5所示，流速进行微小的调整，对HEPES的含量检测基本无影响。
表5改变流速结果表
Figure BDA0003962178140000072
实施例6
稳定性考察：
色谱条件同实施例1。
供试品溶液：精确称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)供试品约10mg，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀；精密移取上述溶液4.0mL，置20mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀。
对照品溶液同实施例1。
供试品溶液和对照品溶液分别于不同的时间点(如：0h，4h和8h)取样进行检测。
结果如表6所示，供试品溶液和对照品溶液中HEPES含量的RSD分别为1.9％，0.7％(n＝3),说明供试品溶液和对照品溶液在8h内基本稳定。
表6稳定性结果表
Figure BDA0003962178140000081
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，采用亲水相互作用色谱(HILIC)联合蒸发光散射检测器，色谱柱采用Hilic柱；所述亲水相互作用色谱采用的流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为浓度0.13％三乙胺-0.04％甲酸缓冲液；所述流动相B为乙腈；所述流动相A和流动相B体积比为1:9～7:3。
2.根据权利要求2所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，所述流动相A的pH设置为4.1～4.5。
3.根据权利要求1所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，所述Hilic柱的柱温为10～40℃。
4.根据权利要求1所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，样品盘温度为10～30℃。
5.根据权利要求2所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，进样体积为1～30ul，流速为0.1～2.0ml/min。
6.根据权利要求1所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，蒸发光散射检测器型号为Waters2424或AllChrom 6100。
7.根据权利要求6所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，Waters2424蒸发光散射检测器气体压力为30～50psi,增益值为40～60。
8.根据权利要求6所述的一种测定4-羟乙基哌嗪乙磺酸的检测方法，其特征在于，AllChrom 6100蒸发光散射检测器气体流速为1.4～1.8L/min，增益值为0.5～1.5。
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