CN116064757A - 一种提高TaqMan探针特异性的探针设计方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高TaqMan探针特异性的设计方法。具体地，本发明通过在TaqMan探针核苷酸多态位点邻近的位置引入错配碱基，从而设计出一种较高特异性的TaqMan探针，能够降低在SNP分型检测过程中的交叉反应问题。具有在SNP分型检测中应用的前景。

Description

一种提高TaqMan探针特异性的探针设计方法

技术领域

本发明涉及基因多态性检测领域。具体地说，本发明涉及一种提高TaqMan探针特异性的探针设计方法。

背景技术

核苷酸多态性(Nucleotide Polymorphism)，是指在基因组水平上由核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。核苷酸多态性位点的存在往往会使基因发生变化，尤其是单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)从而会导致某些疾病的产生，如各种遗传病、恶性肿瘤等。近年来随着分子生物学的迅猛发展，越来越多的疾病相关基因被发现。因此，检测突变基因对于疾病的诊断和风险预测有着举足轻重的意义，越来越多的突变基因检测技术应运而生。目前对于基因突变检测的方法主要有DNA测序法、突变扩增阻碍系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)和实时荧光定量PCR(Real TimeQuantitative PCR,qPCR)法等。

如今常用的DNA测序法有一代测序和二代测序。一代测序即Sanger测序法是检测基因SNP位点最多最可靠的方法，也是医学上的金标准，但这种方法操作繁琐、成本较高，因此不适于对大量临床样本进行检测。二代测序通量高，对基因的覆盖面大，测序深度大，但对于已知突变位点的检测成本相对较高，需要专门的试剂、仪器和人员进行实验和分析数据，较复杂。

上世纪90年代，qPCR技术由美国ABI公司推出，是一种在PCR扩增过程中，以荧光化学物质检测每个循环后产物总量的方法。运用qPCR的方法进行核苷酸多态性检测，是在PCR反应时，加入一对5’端带有不同荧光标记的TaqMan探针来识别不同的等位基因，通过荧光信号的组合区分不同的基因型。这种方法对已知特定突变位点检测不仅高效快捷，也能区分不同基因型，是一种较理想的方法。但在实际操作过程中，由于突变型与野生型模板仅存在一个碱基的差异，很容易产生交叉反应的问题，从而对检测结果有一定干扰。

目前为止，有研究表明在引物上引入错配碱基，往往能够提高PCR反应的特异性，但对于TaqMan探针而言，并没有引入错配碱基的先例。因此，急需开发一种方法，提高这种TaqMan探针的特异性。

发明内容

本发明的目的就是提供一种提高TaqMan探针特异性的探针设计方法。

在本发明的第一方面，提供了一种检测核苷酸多态性的TaqMan探针，所述探针特异性结合多态位点所在的靶序列，并且所述探针在距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处存在错配碱基。

在另一优选例中，所述的错配碱基与靶序列对应位置碱基形成选自下组的错配：A/G、A/C、A/A、T/G、T/C、T/T、G/G、C/C、或其组合。

在另一优选例中，所述的探针与靶序列之间存在至少1个(优选1-5个，更优选1-3个，更优选1-2个)碱基错配。

在另一优选例中，所述的错配碱基位于距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处，优选1-3个碱基处，更优选1-2个碱基处，更优选1个碱基处。

在另一优选例中，所述的探针用于检测单核苷酸多态性(SNP)。

在本发明的第二方面，提供了一种检测核苷酸多态性的TaqMan探针组合，所述探针组合包括探针A和探针B，其中探针A特异性结合野生基因型靶序列，探针B特异性结合突变基因型靶序列，并且

所述探针A和/或探针B是如本发明第一方面所述的探针。

在另一优选例中，所述的错配碱基与靶序列对应位置碱基形成选自下组的错配：A/G、A/C、A/A、T/G、T/C、T/T、G/G、C/C、或其组合。

在另一优选例中，所述的野生基因型靶序列和突变基因型靶序列具有至少1个差异碱基，优选地具有1个差异碱基。

在另一优选例中，所述的探针A与突变基因型靶序列之间存在至少2个(优选2-5个，更优选2-3个)碱基错配，和/或所述的探针B与野生基因型靶序列之间存在至少2个(优选2-5个，更优选2-3个)碱基错配。

在另一优选例中，所述的错配碱基位于距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处，优选1-3个碱基处，更优选1-2个碱基处，更优选1个碱基处。

在另一优选例中，所述的探针结合于靶序列的模板链、或编码链。

在另一优选例中，所述的探针A和探针B的5'端分别连接有不同的荧光基团。

在另一优选例中，所述的探针组合用于检测单核苷酸多态性(SNP)。

在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的探针、或如本发明第二方面所述的探针组合的用途，用于制备检测核苷酸多态性的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂或试剂盒中进一步包括引物。

在另一优选例中，所述的试剂或试剂盒用于qPCR检测。

在另一优选例中，所述的试剂或试剂盒用于检测单核苷酸多态性(SNP)。

在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的探针、或如本发明第二方面所述的探针组合的制备方法，包括步骤：

(i)针对检测的野生型位点和突变型位点分别设计探针A和探针B；

(ii)在所述探针A和/或探针B上距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处引入错配碱基。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了本发明的技术原理图。

图2显示了本发明实施例中对G等位基因TaqMan探针未引入突变碱基的扩增结果示意图。

图3显示了本发明实施例中对G等位基因TaqMan探针的SNP位点左侧第1位引入错配碱基的扩增结果示意图。

图4显示了本发明实施例中对G等位基因TaqMan探针的SNP位点左侧第2位引入错配碱基的扩增结果示意图。

图5显示了本发明实施例中对G等位基因TaqMan探针的SNP位点右侧第1位引入错配碱基的扩增结果示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种提高TaqMan探针特异性的设计方法，通过在TaqMan探针SNP位点邻近的位置引入错配碱基，从而设计出一种较高特异性的TaqMan探针，能够降低在SNP分型检测过程中的交叉反应问题。在此基础上，完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“核苷酸多态性(Nucleotide Polymorphism)”是指在基因组水平上由核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。本发明所称的核苷酸多态性包括一个或多个碱基发生的碱基替换、插入、缺失造成的序列多态性。本发明提供了用于检测核苷酸多态性的方法，该方法使用本发明的探针或探针组合，通过qPCR方式进行检测以识别核苷酸多态性。本发明的探针或探针组合能够用于检测任意的核苷酸多态性。在优选的实施方式中，本发明的探针或探针组合用于检测单核苷酸多态性。在另外的实施方式中，本发明的探针或探针组合也能够用于检测一个或多个碱基发生的碱基替换、插入、缺失产生的序列多态性。

如本文所用，术语“单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)”，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，也有利于对其进行基因分型。通常地，在自然群体中往往有一种占多数的等位基因，称为野生型基因。与之相对的是突变型基因。

如本文所用，术语“交叉反应”、“非特异性反应”和“非特异性结合”可互换使用，均是指探针的非特异性反应，即探针与其靶序列同源性高的其他序列发生的非特异性结合。典型地，本发明所要克服的交叉反应是指PCR过程中探针A与探针B的模板、或探针B与探针A的模板之间发生的非特异性结合。

如本文所用，术语“错配碱基”是指DNA双螺旋结构中腺嘌呤(A)与胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)配对，或胸腺嘧啶(T)与胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)配对、或一对腺嘌呤(A)、一对胸腺嘧啶(T)、一对胞嘧啶(C)、或一对鸟嘌呤(G)配对。

探针

如本文所用，术语“探针”是指一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。本发明的探针中，核苷酸多态位点优选地位于探针的中间位置。

本发明旨在克服探针与非目的模板间发生的非特异性结合。这种结合系由碱基错配造成的。不同碱基错配的发生概率不同，因此，优选地将错配碱基引入到容易发生错配的探针中。例如，本发明发现，G-T碱基对更容易发生错配。因此，在本发明的优选实施方式中，针对在SNP位点形成G-T错配的探针引入错配碱基。当然，本领域技术人员应当理解，对于本发明的探针组合，可以在两条探针中均引入错配碱基，从而提高其特异性。

典型地，图2示出了对G等位基因TaqMan探针未引入突变碱基的扩增结果。其中，可以观察到检测G等位基因的探针(G探针)较容易在突变位点处形成G-T碱基错配，而检测A等位基因的探针(A探针)几乎不会发生A-C碱基错配。在该情况下，在一种实施方式中，可以只在G探针中引入错配碱基提高其特异性，而A探针不引入错配碱基。在另一种实施方式中，可以在G探针和A探针中均引入错配提高其特异性。

检测方法

qPCR技术是一种在PCR扩增过程中，以荧光化学物质检测每个循环后产物总量的方法。运用qPCR的方法进行核苷酸多态位点分型，是在PCR反应时，加入一对5’端带有不同荧光标记的TaqMan探针来识别不同的等位基因，通过荧光信号的组合区分不同的基因型。

本发明的检测方法利用了特殊设计的探针，在探针与模板退火过程中，本发明的探针如果与非特异模板结合，会因存在至少2个错配碱基大大降低结合效率，从而提高TaqMan探针结合的特异性和检测效率。

具体TaqMan探针设计方案及具体检测步骤如下：

(1)核苷酸多态位点位于探针的中间位置，每条探针的5’端带有不同荧光标记基团，3’端带有荧光淬灭基团，并在探针核苷酸多态位点的左侧或/和右侧1-5个碱基之间引入错配碱基；

(2)根据检测核苷酸多态位点所在区域设计一对普通PCR引物；

(3)将普通PCR引物组与上述TaqMan设计方法设计的两条不同等位基因的TaqMan探针按一定比例混合；

(4)配置反应体系，在荧光定量PCR仪进行扩增并实时收集荧光信号。

本发明的主要优点包括：

(1)检测速度快：整个PCR反应在荧光定量PCR仪上进行，反应结束后通过荧光信号数据即可判读结果；

(2)可区分基因型：PCR反应结束后，通过不同荧光组合可区分样本不同基因类型，野生型、杂合和纯合突变；

(3)特异性高：通过在TaqMan探针核酸多态位点邻近位置引入错配碱基提高探针的特异性，在探针与模板退火过程中，如果与非特异模板结合会因存在至少2个错配碱基大大降低结合效率，从而提高TaqMan探针结合的特异性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

本发明以rs2274223位点为例，由于该位点是A/G突变类型，在实际检测过程中，检测G等位基因的探针(灰色荧光标记)会发生非特异性结合(如图2所示)，因此本实施例在该探针上通过引入错配碱基来提高其特异性。

利用本发明对rs2274223位点基因型分别为AA、AG和GG的3个DNA样本进行检测。主要包括以下步骤：

(1)TaqMan探针设计(下划线标记为SNP位点，双下划线标记为引入的错配碱基)：

针对检测的等位基因A设计普通TaqMan探针，其中探针5’端带荧光基团FAM，3’端带有荧光淬灭基团BHQ1，序列为rs2274223-TaqMan-probe1：FAM-CAGTTTCTGTTCCACGTTCACTTCG-BHQ1(SEQ ID NO.1)。

针对检测等位基因G设计左侧第1位引入错配碱基的TaqMan探针，其中5’端带有荧光基团JOE，3’端带有荧光淬灭基团BHQ1，序列为rs2274223-Taq Man-probe2：JOE-AGCAGTTTCTGTTC

GCGTTCACTTCGAAG-BHQ1(SEQ ID NO.2)。

为增加对比，本发明针对检测等位基因G设计了一种未引入错配碱基的探针rs2274223-TaqMan-probe3-1：JOE-AGCAGTTTCTGTTCCGCGTTCACTTCGAAG-BHQ1(SEQ IDNO.3)，和一种左侧第2位引入错配碱基的探针rs2274223-TaqMan-probe3-2：JOE-AGCAGTTTCTGTT

CGCGTTCACTTCGAAG-BHQ1(SEQ ID NO.4)，以及一种右侧第1位引入错配碱基的探针rs2274223-TaqMan-probe3-3：JOE-AGCAGTTTCTGTTCCG

GTTCACTTCGAAG-BHQ1(SEQ ID NO.5)。

(2)引物设计：

针对rs2274223位点设计一对PCR引物：

上游引物rs2274223-5F：5’-TCGAAACACCCTGAACCCCATGT-3’(SEQ ID NO.6)；

下游引物rs2274223-3R：5’-GTTTTCCACAACTGCAAAACGAAGAAA-3’(SEQ ID NO.7)。

(3)引物组配置：

引物组Pmix的配置浓度：上游PCR引物2μM、下游PCR引物2μM、检测等位基因ATaqMan探针1μM和检测等位基因G TaqMan探针1μM。

(4)反应体系：

PCR反应体系用30μL体系反应组，组分分别为：10×Takara Buffer 3μL、dNTP(2.5mM)3.6μL、MgCl2(25mM)及Pmix 1.5μL、Takara Taq(5U/μL)0.18μL、样本DNA 1μL(20ng)和ddH₂O 19.52μL。

PCR反应程序：95℃10min，40×(95℃15s，64℃40s收集荧光信号)。

结果：应用

-96S全自动医用PCR分析系统软件进行数据分析，结果图2-5所示(黑色为FAM，灰色为JOE)。

在理想状态下，AA基因型只有FAM荧光峰(黑色)或者FAM荧光Ct值远小于JOE荧光(灰色)，AG基因型同时存在FAM和JOE荧光峰且Ct值接近，GG基因型只存在JOE荧光峰或者JOE荧光Ct值远小于FAM。

如图2所示，在AA基因型结果中，G探针会与等位基因A的模板发生交叉反应，从而产生荧光信号，对检测造成较大干扰，其FAM和JOE的Ct值分别为31.43和31.38，无明显差异；在AG基因型检测结果中，FAM和JOE的Ct值差异也较大，分别为33.10和30.88。引入错配碱基之后，这种非特异性结合效率会大大降低(图3、图4和图5所示)。而在本实施例中在探针SNP位点左侧第1位引入错配碱基和右侧第1位引入错配碱基的效果最好(如图3和图5所示)，在AA基因型中FAM和JOE荧光信号Ct值相差最大，分别为29.36、31.64和30.52、32.88；在AG基因型中两种Ct值也最为接近，分别为32.07、31.83和33.06、32.90。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种检测核苷酸多态性的TaqMan探针，其特征在于，所述探针特异性结合多态位点所在的靶序列，并且所述探针在距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处存在错配碱基。

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的错配碱基与靶序列对应位置碱基形成选自下组的错配：A/G、A/C、A/A、T/G、T/C、T/T、G/G、C/C、或其组合。

3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的探针与靶序列之间存在至少1个(优选1-5个，更优选1-3个，更优选1-2个)碱基错配。

4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的错配碱基位于距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处，优选1-3个碱基处，更优选1-2个碱基处，更优选1个碱基处。

5.一种检测核苷酸多态性的TaqMan探针组合，其特征在于，包括探针A和探针B，其中探针A特异性结合野生基因型靶序列，探针B特异性结合突变基因型靶序列，并且

所述探针A和/或探针B是如权利要求1-4中任一项所述的探针。

6.如权利要求5所述的探针组合，其特征在于，所述的野生基因型序列和突变基因型序列具有至少1个差异碱基，优选具有1个差异碱基。

7.如权利要求5所述的探针组合，其特征在于，所述的探针A与突变基因型靶序列之间存在至少2个碱基错配，和/或所述的探针B与野生基因型靶序列之间存在至少2个碱基错配。

8.如权利要求5所述的探针组合，其特征在于，所述的探针A和探针B的5'端分别连接有不同的荧光基团。

9.一种如权利要求1所述探针、或如权利要求5所述的探针组合的用途，其特征在于，用于制备检测核苷酸多态性的试剂或试剂盒。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的试剂或试剂盒用于检测单核苷酸多态性(SNP)。

11.一种如权利要求1所述探针、或如权利要求5所述探针组合的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(i)针对检测的野生型位点和突变型位点分别设计探针；

(ii)在所述探针上距离结合多态位点的碱基1-5个碱基处引入错配碱基。

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