CN116064699A - 平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用。所述平菇胞外多糖的提取方法，包括以下步骤：S1：使用培养基接种菌种，发酵，得发酵产物；S2：发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液；S3：将发酵液过滤，蒸馏，加入乙醇，离心，干燥，得平菇胞外多糖干粉。本发明还提供了平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用。所述的平菇胞外多糖能够有效的降低藻毒素暴露导致的肝脏脂质过度积累、肝脏和肠道炎症与氧化水平，以及降低肠道内毒素LPS含量和提升肠道溶菌酶含量，能提升肝脏GSH含量和GST活力有利于藻毒素排出体外。

Description

平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用。

背景技术

多糖(Polysaccharide)是线性或分支的聚合物，由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成。食用菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一级结构是指其单糖残基的种类、排列顺序和连接方式等。二级结构是指多糖以氢键结合成多聚链的连接方式。三级结构是指羟基、羧基、甲基、氨基等糖残基及其他官能团通过非共价作用形成的空间构象。四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力结合形成的聚集体。平菇多糖是平菇子实体、菌丝体以及发酵液中提取一种高活性的功能性生理调节剂，平菇多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血压、降血脂、抗衰老、抗氧化、增强机体免疫力和促进消化吸收等功能。

微囊藻是富营养化水体中最常见的优势种，其次级代谢产物—微囊藻毒素是富营养化水体中出现频率最高、分布最广、危害最严重的环肽藻毒素。藻毒素(MCs)分子结构中氨基酸的变化能够产生近280种毒素同源物，其中，最常见、毒性最强的是微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)，占淡水MCs总量的46％至99.8％。在结构上，MC-LR是一类环状七肽化合物，由5个保守氨基酸和2个可变L-氨基酸构成，2号位置和4号位置上可变性的Mdha和Adda存在甲基化/去甲基化差异导致MC存在多种异构体。藻毒素很容易导致水生动物肝脏脂质代谢紊乱、肝脏和肠道炎症等毒性症状。目前单位面积池塘饲料投喂量不断加大，但仅20％-25％的饲料氮被水产动物利用，75％-80％的氮存留在养殖水体及底泥中，容易导致养殖水体富营养化，而滋生大量微囊藻。

中国专利CN107987180A中公开了从平菇中提取多糖的方法，其具体步骤为：将平菇超微粉碎得平菇粉；向平菇粉加水，超声提取，离心，将上清液浓缩，乙醇沉淀，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖；将平菇粗多糖溶于水中，加入酶溶液酶解，离心，再将上清液用Sevage去蛋白得脱蛋白多糖液；采用阴离子交换层析柱分级纯化，透析，浓缩即得不同级分的平菇多糖，乙醇沉淀，冷冻干燥得平菇多糖；用SephadexG-100凝胶层析纯化，冷冻干燥，即得平菇多糖纯品。该发明提取方法简单可行，平菇多糖的提取率高、纯度高，具有良好的应用价值和市场潜力，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，保持多糖的活性不被破坏。

但尚未见有高效制备平菇胞外多糖的方法及其在调节藻毒素诱导蛙蝌蚪肝脏和肠道等适应症和提升机体外排藻毒素能力中的应用。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种平菇胞外多糖在制备解蛙类藻毒素毒性药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种平菇胞外多糖的提取方法，包括以下步骤：

S1：使用上述的培养基接种菌种，发酵，得发酵产物；

S2：发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液；

S3：将发酵液过滤，减压蒸馏，加入乙醇，离心，干燥，得平菇胞外多糖干粉。

优选地，所述S1中培养基包括：玉米浆和豆渣，所述培养基中玉米浆的浓度为5-12g/L；所述培养基中豆渣的浓度为20-30g/L。

进一步优选地，所述培养基中玉米浆的浓度为8g/L。

进一步优选地，所述培养基中豆渣的浓度为25g/L。

优选地，所述培养基还包括糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸铵。

优选地，所述糖选自单糖、二糖中的至少一种。

进一步优选地，所述单糖选自果糖、葡萄糖、半乳糖中的至少一种。

进一步优选地，所述二糖选自蔗糖、麦芽糖、纤维二糖中的至少一种。

最优选地，所述糖为蔗糖。

优选地，所述培养基中糖的浓度为10-20g/L；

进一步优选地，所述培养基中糖的浓度为15g/L。

优选地，所述培养基中磷酸二氢钾的浓度为0.05-2g/L；

进一步优选地，所述培养基中磷酸二氢钾的浓度为1g/L。

优选地，所述培养基中硫酸镁的浓度为0.01-1g/L；

进一步优选地，所述培养基中硫酸镁的浓度为0.05g/L。

优选地，所述培养基中硫酸铵的浓度为1-5g/L；

进一步优选地，所述培养基中硫酸铵的浓度为3g/L。

优选地，所述S1中菌种为苏引六号平菇菌种。

优选地，所述菌种的浓度为8-12％(v/v)；

进一步优选地，所述菌种的浓度为10％(v/v)。

优选地，所述S1还包括前处理步骤，具体为将培养基灭菌；

进一步优选地，所述灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为20min。

优选地，所述灭菌机的旋转转数为130-160r/min；

进一步优选地，所述灭菌机的旋转转数为150r/min。

优选地，所述S1中发酵时的通气量为10-30NL/min；

进一步优选地，所述S1中发酵时的通气量为20NL/min。

优选地，所述S1接种后还包括培养步骤，所述培养的温度为25-30℃，培养的时间为3-5d；进一步优选地，所述培养的温度为28℃，培养的时间为4d。

优选地，所述S3中发酵液过滤采用4-6层纱布过滤；

进一步优选地，所述S3中发酵液过滤采用4层纱布过滤。

优选地，所述S3中减压蒸馏至原体积5-15％；进一步优选地，所述减压蒸馏至原体积的10％。

优选地，所述S3中乙醇的体积浓度为85-95％；进一步优选地，所述乙醇的体积浓度为95％。

优选地，所述S3中乙醇的加入量为发酵液体积的3-6倍；进一步优选地，所述乙醇的加入量为发酵液体积的4倍。

优选地，所述S3中加入乙醇后还包括沉淀步骤，所述沉淀的温度为2-6℃，沉淀的时间为20-30h；

进一步优选地，所述沉淀的温度为4℃，沉淀的时间为24h。

优选地，所述S3中干燥的方式选自冷冻干燥、超临界干燥、常压干燥中的一种或多种。

进一步优选地，所述S3中干燥的方式为冷冻干燥。

再进一步优选地，所述冷冻干燥的温度为-40℃至-50℃，冷冻干燥的时间为30-40h；

最优选地，所述冷冻干燥的温度为-45℃，冷冻干燥的时间为36h。

又一方面，本发明提供了上述的提取方法提取的平菇胞外多糖在制备解蛙类藻毒素毒性的药物中的应用。

优选地，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.1-2份；

进一步优选地，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.5-1份；

最优选地，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.5份。

优选地，所述平菇胞外多糖可以与其他解藻毒素毒性的活性成分联用。

优选地，所述藻毒素毒性包括导致肝脏脂质过度积累、肝脏和肠道的炎症发生、肠道内LPS含量升高、肠道的溶菌酶含量降低、肝脏的GSH水平下降和肝脏的GST活力下降。

优选地，所述平菇胞外多糖的数均分子量为3.83×10²-1.54×10⁴Da；

优选地，所述平菇胞外多糖的重均分子量为3.93×10²-1.83×10⁴Da；

优选地，所述平菇胞外多糖的粘均分子量3.92×10²-1.78×10⁴Da；

优选地，所述平菇胞外多糖的分布宽度为1.03-1.21。

具体的，所述数均分子量是所有分子的分子量和其所占数量分数的乘积之和，数均分子量的物理意义是不同分子量分子的分数及其对应的分子量产物的总和。

具体的，所述重均分子量是将所有分子的分子量和其所占重量分数的乘积之和。

具体的，所述粘均分子量是用稀溶液粘度法测得的聚合物的分子量。

具体的，所述Da为道尔顿，是将分子中所有原子按个数求原子量的代数和。

优选地，所述平菇胞外多糖的单糖包括：乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glu)、鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)和核糖(Rib)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明对平菇胞外多糖的制备工艺进行改进，提供了一种新的平菇胞外多糖的提取方法，使用该方法制得的平菇胞外多糖能够降低由藻毒素-LR诱导的甘油三脂(TG)、胆汁酸(TBA)和胆固醇(TCHO)等血脂指标、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)肝功能指标和脂多糖内毒素含量。

(2)本发明提取的平菇胞外多糖降低了由MC-LR诱导的肝脏组织损伤水平、肝脂代谢指标(TG、TBA和TCHO)、肝脏组织中嗜酸性粒细胞数量、炎症因子白介素-1β(IL-1β)、活性氧(ROS)和肝体指数(HSI)。

(3)本发明提取的平菇胞外多糖增加了肝脏MC-LR外排水平，MC-LR外排过程关键性指标谷胱甘肽-S-转移酶活力(GST)和谷胱甘肽(GSH)含量，肝脏、脑、肠道、性肾复合体、鳃、皮肤、肌肉等组织中MC-LR积累量减少。

(4)本发明提取的平菇胞外多糖降低了由MC-LR诱导的肠道组织损伤水平、LPS含量、炎症因子IL-1β和ROS，此外，增加了肠道非特异免疫物质溶菌酶(LZM)含量。

附图说明

图1：提取的平菇胞外粗多糖的红外吸收光谱图。

图2：标准多糖的LC-MS图。

图3：平菇胞外多糖的LC-MS图。

图4：提取的平菇胞外粗多糖的核磁共振氢谱分析图。

图5：平菇胞外多糖的核磁共振碳谱分析图。

图6：血液脂质代谢生化指标TG含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图7：血液脂质代谢生化指标TBA含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图8：血液脂质代谢生化指标TCHO含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图9：血液肝功能生化指标AST活力分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图10：血液肝功能生化指标ALT活力分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图11：血液LPS含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图12：肠道病理指标分析图；其中，A：空白对照组的肠道组织；B：平菇胞外多糖暴露组的肠道组织；C：1μg/L MC-LR暴露组的肠道组织；D：0.5％平菇胞外粗多糖与1μg/L MC-LR联合暴露组的肠道组织；E：肠道组织嗜酸性粒细胞的定量分析，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)；Al，不定层；Sml，粘膜下层；Mi，微绒毛；N，核；M，粘膜；EOS，嗜酸性粒细胞。

图13：肝脏病理指标分析图，其中，A：空白对照组的肝脏组织；B：平菇胞外多糖暴露组的肝脏组织；C：1μg/L MC-LR暴露组的肝脏组织；D：0.5％平菇胞外粗多糖与1μg/L MC-LR联合暴露组的肝脏组织；E：肝脏组织嗜酸性粒细胞的定量分析，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)；h：肝细胞；m：巨噬中心；EOS，嗜酸性粒细胞。

图14：肝体指数分析图；其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图15：肝脏脂质代谢生化指标TG含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图16：肝脏脂质代谢生化指标TBA含量分析图，其中，a、b、c、d表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图17：肝脏脂质代谢生化指标TCHO含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图18：肝脏炎症因子IL-1β含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图19：肝脏氧化指标ROS水平的分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图20：肠道炎症因子IL-1β含量指标分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图21：肠道LPS含量分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图22：肠道ROS水平分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图23：肠道LZM含量指标分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图24：GST活力分析图，其中，a、b、c表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图25：:GSH含量分析图，其中，a、b、c、d表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

图26：不同组织器官藻毒素-LR积累含量分析图，其中，a、b表示不同组间差异显著性(P<0.05)。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。

武汉博士德生物工程有限公司的石蜡组织切片与HE染色试剂盒分析组织病理。

中国科学院水生生物研究所提供高纯度MC-LR和检测藻毒素含量的酶联检测试剂盒。

实施例1

1、平菇胞外多糖的制备：

(1)制备发酵罐培养基：

所述培养基的组分如下表1：

表1.

组分	浓度
		蔗糖	15g/L
玉米浆	8g/L
		豆渣	25g/L
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]>	1g/L
		<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>]]>	0.5g/L
<![CDATA[(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>]]>	3g/L

将上述的培养基置于121℃灭菌20min。

(2)50L发酵罐装液体培养基40L，接种10％(v/v)的平菇液体菌种，搅拌转数150r/min，通气量20NL/min，28℃恒温培养4d，发酵产物经过滤固液分离获得菌丝体和发酵液。

(3)发酵液用4层纱布过滤，滤液经减压蒸馏至原体积10％，加入4倍体积浓度为95％的乙醇，置于4℃冰箱沉淀24小时，离心，将沉淀物在-45℃冷冻干燥36小时，获得平菇胞外粗多糖干粉158.2g。

实施例2

1、平菇胞外多糖的制备：

(1)制备发酵罐培养基：

所述培养基的组分如下表2：

表2.

组分	浓度
		蔗糖	10g/L
玉米浆	5g/L
		豆渣	20g/L
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]>	0.5g/L
		<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>]]>	0.1g/L
<![CDATA[(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>]]>	1g/L

将上述的培养基置于121℃灭菌20min。

(2)50L发酵罐装液体培养基40L，接种8％(v/v)的平菇液体菌种，搅拌转数130r/min，通气量10NL/min，25℃恒温培养3d，发酵产物经过滤固液分离获得菌丝体和发酵液。

(3)发酵液用4层纱布过滤，滤液经减压蒸馏至原体积5％，加入3倍体积浓度为85％的乙醇，置于4℃冰箱沉淀20小时，离心，将沉淀物在-40℃冷冻干燥30小时，获得平菇胞外粗多糖干粉102.1g。

实施例3

1、平菇胞外多糖的制备：

(1)制备发酵罐培养基：

所述培养基的组分如下表3：

表3.

将上述的培养基置于121℃灭菌20min。

(2)50L发酵罐装液体培养基40L，接种12％(v/v)的平菇液体菌种，搅拌转数160r/min，通气量30NL/min，30℃恒温培养4d，发酵产物经过滤固液分离获得菌丝体和发酵液。

(3)发酵液用6层纱布过滤，滤液经减压蒸馏至原体积15％，加入4倍体积浓度为95％的乙醇，置于4℃冰箱沉淀30小时，离心，将沉淀物在-50℃冷冻干燥40小时，获得平菇胞外粗多糖干粉119.5g。

对比例1

与实施例1的区别在于，培养基中豆渣的浓度为40g/L，其余皆相同。

所述培养基的组分如下表4：

表4.

组分	浓度
		蔗糖	15g/L
玉米浆	8g/L
		豆渣	40g/L
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]>	1g/L
		<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>]]>	0.5g/L
<![CDATA[(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>]]>	3g/L

对比例1中所获得平菇胞外粗多糖干粉85.6g。

对比例2

与实施例1的区别在于，用黄豆粉替换豆渣，其余皆相同。

所述培养基的组分如下表5：

表5.

对比例2中所获得平菇胞外粗多糖干粉95.3g。

对比例3

与实施例1的区别在于，玉米浆的浓度为15g/L，其余皆相同。

所述培养基的组分如下表6：

表6.

组分	浓度
		蔗糖	15g/L
玉米浆	15g/L
		豆渣	25g/L
<![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]>	1g/L
		<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>]]>	0.5g/L
<![CDATA[(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>]]>	3g/L

对比例3中所获得平菇胞外粗多糖干粉97.1g。

实验例1、平菇胞外粗多糖的结构分析：

对实施例1提取的胞外粗多糖分别进行红外光谱、分子量、单糖组成和核磁共振分析，具体方法如下：

1、红外光谱分析：

分别称取10mg胞外多糖与100mg干燥的KBr粉末进行研磨，混合均匀后压片，在400-4000cm^-1范围内进行红外扫描。使用PerkinElmer Spectrum Two红外光谱仪进行扫描，结果见图1。

结果表明，在3392.01cm^-1、2930.95cm^-1、1651.46cm^-1、1407.98cm^-1、1371.29cm^-1、1238.44cm^-1、1076.81cm^-1、1038.39cm^-1等处均存在多糖的特征峰。其中，3392.01cm^-1为OH伸缩振动峰，2930.95cm^-1为CH2的伸缩振动峰，1651.46cm^-1为醛羰基HC＝O的伸缩振动峰，1407.98cm^-1、1371.29cm^-1为烷基CH的弯曲振动峰，950-1200cm^-1附近为C-O-C和C-O的伸缩振动峰。图谱显示样品具有多糖的典型特征吸收峰。

2、多糖分子量分析：

称取适量样品，将超纯水做溶剂，配置成浓度约为1mg/ml的溶液后，超声30min后过滤，使用Agilent 1260型号进行GPC检测，进样量为40μl，流速1.00ml/min。以检测器的响应信号为纵坐标，时间为横坐标记录色谱图，计算分子量。

结果表明，食用菌胞外粗多糖呈现多个分子量分布，其中数均分子量Mz为3.83×10²-1.54×10⁴Da，重均分子量Mw为3.93×10²-1.83×10⁴Da，粘均分子量Mv为3.92×10²-1.78×10⁴Da，分布宽度为1.03-1.21。

3、多糖的单糖组成分析：

多糖的单糖组成采用LC-MS进行分析：

色谱和质谱条件：

使用Shim-pack Scepter PFPP-120(2.1mm×100mm，3μm)色谱柱；

流动相A:25mM乙酸铵；流动相B:乙腈(含5％水)；

柱温：40℃；

流速：0.3mL/min；

进样体积：1μL；

梯度洗脱；切阀时间：0-2min；2min后进质谱。

质谱条件：离子源：ESI；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；雾化气流量：2.8L/min；加热气流量：10L/min；干燥气流量：10L/min；采集模式：正离子MRM；仪器型号：LCMS-8050。

测定方法：

取多糖样品适量于顶空瓶中，加入4mL3M三氟乙酸，充氮气保护。至顶空瓶中，于鼓风干燥箱中，120℃水解4h。水解完冷却后分别取1mL至顶空瓶中，减压蒸干。加入1mL甲醇复溶，减压蒸干，重复3次。加入0.5mL水至顶空瓶中复溶水解产物，加入0.5mL0.3M氢氧化钠溶液和0.5mLPMP溶液，封盖后涡旋混匀1min，水浴70℃衍生1h。衍生结束后，精密加入0.5mL0.3M盐酸溶液摇匀中和，精密加入3mL二氯甲烷，涡旋混匀2min，静置，弃去下层二氯甲烷溶液，重复萃取步骤4次后，将所有溶液稀释500倍，用于进样分析。

对照标准单糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖。做同样衍生化处理上机。根据出峰时间确定每种单糖的出峰时间。

LC-MS的色谱图如图2-3所示，结果表明，本发明提取的胞外多糖是由乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖和核糖七种单糖组成，摩尔比见表7。

表7胞外多糖中各单糖所占的摩尔比

注：Glu:葡萄糖，Gal:乳糖，Man:甘露糖，Ara:阿拉伯糖，Rha：鼠李糖，Xyl:木糖，Rib:核糖。

4、多糖的核磁共振分析：

称取胞外多糖20mg，溶于D₂O，用Bruker AVANCE III 400M型核磁共振仪，测定¹H-NMR、¹³C-NMR。

核磁氢谱结果如图4所示，碳谱结果如图5所示，氢谱在δ3.0-6.0ppm之间出峰，碳谱在δ60-100ppm出峰，对应为糖类羟基质子和烷基质子的响应信号。

实验例2平菇胞外多糖解蛙类藻毒素毒性实验

1、试验方法：

1.1黑斑侧褶蛙蝌蚪的饲养

健康的黑斑侧褶蛙亲本来自于芜湖县朗田黑斑蛙养殖专业合作社。在实验室内自然交配产卵。在水温为25±0.5℃，明暗周期14:10h和不间断曝气的条件下进行孵化。等蝌蚪出膜后G24期开始分缸，设置空白对照组、1μg/LMC-LR暴露组、平菇胞外多糖暴露组、0.5％平菇胞外多糖与1μg/L MC-LR联合暴露组，每组3个平行缸。暴露缸规格为50cm×35cm×20cm，每缸装有15L曝气自来水，pH为6.8-7.0，暴露期间无菌空气连续泵送。每天一次定时给蝌蚪喂食大约为体重10％饲料，饲养30天。

1.2蝌蚪组织总蛋白和血浆的获取

准确称取待测组织，按重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入9倍体积的任氏液，冰浴匀浆，2500rpm/min，离心10min，取含总蛋白的上清放置-80℃待用。使用含EDTA抗凝剂的微量采集针头，在心脏和尾部采集血液样品，4000rpm/min，4℃，离心10min分离血浆，分离后的血浆样品用液氮速冻后，于-80℃冰箱保存。

1.2.1血液脂质代谢生化指标

TG：取处理后的血液2.5μL，依据南京建成生物工程研究所提供的TG测试试剂盒(A042-2-1)说明书操作，在波长510nm处测得吸光值，计算TG含量。

TBA：取处理后的血液3μL，依据南京建成生物工程研究所提供的TBA测试试剂盒(E003-2-1)说明书操作，在波长405nm处测得吸光值，计算TBA含量。

TCHO：取处理后的血液2.5μL，依据南京建成生物工程研究所提供的TCHO测试试剂盒(A1111-1-1)说明书操作，在波长405nm处测得吸光值，计算TCHO含量。

1.2.2血液LPS和肝功能生化指标

LPS：取处理后的血液50μL，依据南京建成生物工程研究所提供的LPS测试试剂盒(H255)说明书操作，在波长450nm处测得吸光值，计算LPS含量。

ALT：取处理后的血液5μL，依据南京建成生物工程研究所提供的ALT测试试剂盒(C010-2-1)说明书操作，在波长510nm处测得吸光值，计算ALT活力。

AST：取处理后的血液5μL，依据南京建成生物工程研究所提供的AST测试试剂盒(C009-2-1)说明书操作，在波长510nm处测得吸光值，计算AST活力。

1.2.3肝脏和肠道组织病理指标

将组织以1:10的比例固定在4％多聚甲醛溶液中48h后进行冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋，待凝固后修整蜡块进行切片、烤片、脱蜡复水、HE染色分化、返蓝复染、脱水透明、封片，最后使用Olympus-BX61型号显微镜观察拍照分析。每组三个平行缸随机取6个样品，每个样品10张切片用于统计嗜酸性粒细胞的数量，用Image-Pro Plus 6.0软件执行。

1.2.4肝体指数(HSI)

用精确度万分之一的分析天平称体重和肝脏组织重。计算公式：HSI(％)＝体重/肝重*100％。

1.2.5肝脏脂质代谢生化指标

TG：取处理后的肝脏组织粗提总蛋白2.5μL，依据南京建成生物工程研究所提供的TG测试试剂盒(A042-2-1)说明书操作，在波长510nm处测得吸光值，计算TG含量。

TBA：取处理后的肝脏组织粗提总蛋白3μL，依据南京建成生物工程研究所提供的TBA测试试剂盒(E003-2-1)说明书操作，在波长405nm处测得吸光值，计算TBA含量。

TCHO：取处理后的肝脏组织粗提总蛋白2.5μL，依据南京建成生物工程研究所提供的TCHO测试试剂盒(A1111-1-1)说明书操作，在波长405nm处测得吸光值，计算TCHO含量。

1.2.6肝脏炎症因子和氧化指标生化指标

IL-1β：取处理后的肝脏组织粗提总蛋白50μL，依据南京建成生物工程研究所提供的IL-1β测试试剂盒(H002-1-2)说明书操作，在波长450nm处测得吸光值，计算炎症因子IL-1β含量。

ROS：取新鲜的肝脏组织依据南京建成生物工程研究所提供的ROS测试试剂盒(E004-1-1)说明书操作，在激发波长488nm，发射波长525nm处测得吸光值，计算活性氧的水平。

1.2.7肠道炎症因子、LPS、ROS含量和溶菌酶活性

IL-1β：取处理后的肠道组织粗提总蛋白50μL，依据南京建成生物工程研究所提供的IL-1β测试试剂盒(H002-1-2)说明书操作，在波长450nm处测得吸光值，计算IL-1β含量。

LPS：取处理后的肠道组织粗提总蛋白50μL，依据南京建成生物工程研究所提供得LPS测试试剂盒(H255)说明书操作，在波长450nm处测得吸光值，计算LPS含量。

ROS：取新鲜的肝脏组织依据南京建成生物工程研究所提供的ROS测试试剂盒(E004-1-1)说明书操作，在激发波长488nm，发射波长525nm处测得吸光值，计算ROS的水平。

LZM：取处理后的肠道组织粗提总蛋白200μL，依据南京建成生物工程研究所提供的LZM商业测试试剂盒(A050-1-1)说明书操作，在波长530nm处测得透光值，计算LZM活性。

1.2.8GST活力和GSH含量

GST：取处理后的肝脏组织粗提总蛋白100μL，依据南京建成生物工程研究所提供的GST测试试剂盒(A004-1-1)说明书操作，在波长412nm处测得吸光值，计算GST活力。

GSH：取处理后的肝脏组织粗提总蛋白100μL，依据南京建成生物工程研究所提供的GSH测试试剂盒(A006-2-1)说明书操作，在波长405nm处测得吸光值，计算GSH含量。

1.2.9不同组织中MC-LR积累含量分析

准确称量组织重量后置于洁净的玻璃样品瓶中，加入适量100％甲醇完全覆盖组织，浸泡2d后磁力搅拌2h，离心后取上清；残渣再重复提取2次，离心，合并上清；用等体积正己烷萃取上清3次，弃去正己烷。将上清氮吹至近干，用双蒸水稀释至约20％，然后过预先已活化的Sep-Pak C18固相萃取小柱(6ml 100％甲醇活化，6ml双蒸水调整)。依次用6ml双蒸水、6ml 20％甲醇淋洗小柱，吹干，然后用6ml含0.1％三氟乙酸的甲醇洗脱。洗脱液氮吹至干后用1ml去离子水定容，-20℃冷冻保存待测。采用间接竞争酶联免疫法测定样品中MC-LR的浓度，按照微囊藻毒素ELISA试剂盒说明书进行，以λ＝450nm在酶标仪上测定吸光值，记录并处理数据。

2、分析方法

实验所得数据用SPSS26.0软件进行统计学分析，各组数值变量参数以均数±标准差表示。组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD(leastsignificantdifference)检验，方差分析前对各组数据进行正态性检验(Shapiro-Wilk Test)和方差齐性分析检验(Levene’s Test)。对于没有正态分布或同质方差的数据组，用独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis Test)，对存在显著差异的指标进行两两比较，并采用Bonferroni校正，以P<0.05为检验水准。

3、实验结果

3.1血液脂质代谢生化指标

血液脂质代谢相关指标(TBA、TG和TCHO)呈现出平菇胞外多糖组与空白对照组无差异，MC-LR暴露后含量上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR暴露组相对MC-LR暴露组呈现下降。该结果表明平菇胞外粗多糖能降低MC-LR诱导的高血脂指标。见图6-8。

3.2血液LPS和肝功能生化指标

血液中LPS含量、AST和ALT酶活力呈现出平菇胞外多糖组与空白对照组无差异，MC-LR暴露后含量上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR暴露组相对MC-LR暴露组呈现下降。该结果表明平菇胞外粗多糖添加能缓解肝功能损伤和降低血液中细菌内毒素LPS含量。见图9-11。

3.3肝脏和肠道组织病理指标

肝脏组织以及肠道组织中的嗜酸性粒细胞数目呈现平菇胞外多糖组与空白对照组无差异，MC-LR暴露后上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR暴露组相对MC-LR暴露组呈现下降。嗜酸性粒细胞数目聚集能暗示肝脏组织和肠道组织有炎症趋势。因此，表明平菇胞外粗多糖能够降低MC-LR引起的炎症水平。见图12-13。

3.4肝体指数

肝体指数呈现平菇胞外多糖组与空白对照组无差异，MC-LR暴露后指数上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR组相对MC-LR组呈现下降。结果表明平菇胞外粗多糖能够减小MC-LR引起的肝体指数变大。见图14。

3.5肝脏脂质代谢生化指标

TG和TCHO呈现出平菇胞外多糖组与空白对照组无差异，MC-LR暴露后含量上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR暴露组相对MC-LR暴露组呈现下降。TBA呈现出平菇胞外多糖暴露组与空白对照组存在差异且平菇胞外多糖暴露组含量下降，MC-LR暴露后含量上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR暴露组相对MC-LR暴露组呈现下降。结合添加多糖后肝体指数变小的结果，表明平菇胞外粗多糖能够降低MC-LR引起的肝脏脂肪积累。见图15-17。

3.6肝脏炎症因子和氧化指标生化指标

肝脏中IL-1β含量和ROS水平呈现出平菇胞外多糖组与空白对照组无差异，MC-LR暴露后含量上升，添加平菇胞外粗多糖的MC-LR暴露组相对MC-LR暴露组呈现下降。结合联合暴露组肝脏组织切片分析的嗜酸性粒细胞数目聚集减少的结果，表明平菇胞外粗多糖能够减缓MC-LR引起的炎症和氧化损伤水平。见图18-19。

3.7肠道炎症因子、LPS、ROS和LZM含量指标

肠道中IL-1β、LPS、ROS含量呈现空白对照组与平菇多糖暴露组无差异、MC-LR暴露组最高、平菇胞外粗多糖与MC-LR联合暴露组相对MC-LR暴露组下降。此外，LZM含量呈现空白对照组与平菇多糖暴露组无差异，MC-LR暴露组最低，平菇胞外粗多糖与MC-LR联合暴露组相对MC-LR暴露组上升。结合联合暴露组肠道组织切片分析的嗜酸性粒细胞数目聚集减少的结果，表明平菇胞外粗多糖能够降低MC-LR引起的肠道炎症水平、肠道LPS含量、氧化损伤水平以及可以提升非特异性免疫物质LZM含量。见图20-23。

3.8GST酶活和GSH含量生化指标

肝脏中GST酶活呈现空白对照组与平菇多糖暴露组无差异、MC-LR暴露组最低、平菇胞外粗多糖与MC-LR联合暴露组上升。同时，GSH含量呈现对照组与平菇胞外多糖暴露组存在差异，平菇胞外多糖暴露组GSH含量稍有降低，MC-LR暴露组最低、平菇胞外粗多糖与MC-LR联合暴露组相对MC-LR暴露组上升。在GST酶催化下MCs与GSH偶联形成毒性较低的谷胱甘肽偶联物GS-MCs，接着在肝脏和肾脏中迅速转化成更稳定的半胱氨酸偶联物MC-Cys，最终通过尿液排出体外。因此，表明平菇胞外粗多糖能够增强MC-LR外排的能力。见图24-25。

3.9不同组织器官藻毒素-LR积累含量

不同组织器官藻毒素-LR积累含量不同，但都呈现MC-LR暴露组最高、平菇胞外粗多糖与MC-LR联合暴露组呈现显著下降。结合联合暴露组MCs外排关键指标GST酶活和GSH含量增加的结果，进一步表明平菇胞外粗多糖增加了MC-LR外排。见图26。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种平菇胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：使用培养基接种菌种，发酵，得发酵产物；

S2：发酵产物过滤，得菌丝体和发酵液；

S3：将发酵液过滤，蒸馏，加入乙醇，离心，干燥，得平菇胞外多糖干粉。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述S1中培养基包括：玉米浆和豆渣，所述玉米浆的浓度为5-12g/L；所述豆渣的浓度为20-30g/L。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述玉米浆的浓度为8g/L；所述豆渣的浓度为25g/L。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述培养基还包括糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸铵。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述糖的浓度为10-20g/L；所述磷酸二氢钾的浓度为0.05-2g/L；所述硫酸镁的浓度为0.01-1g/L；所述硫酸铵的浓度为1-5g/L。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述糖的浓度为15g/L，所述磷酸二氢钾的浓度为1g/L；所述硫酸镁的浓度为0.05g/L；所述硫酸铵的浓度为3g/L。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述S1中菌种的浓度为8-12％(v/v)。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述S1中发酵时的灭菌机的旋转转数为130-160r/min；通气量为10-30NL/min。

9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述S3中干燥的温度为-40℃至-50℃，干燥的时间为30-40h。

10.根据权利要求1-9任一项所述的提取方法提取的平菇胞外多糖在制备解藻毒素毒性的药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.1-2份。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药物中按照重量份数计包括平菇胞外多糖0.5份。

13.根据权利要求10-12任一项所述的应用，其特征在于，所述藻毒素毒性包括导致肝脏脂质过度积累、肝脏和肠道的炎症发生、肠道内LPS含量升高、肠道的溶菌酶含量降低、肝脏的GSH水平下降和肝脏的GST活力下降。

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