[go: up one dir, main page]

CN116064335A - 一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064335A
CN116064335A CN202310143668.0A CN202310143668A CN116064335A CN 116064335 A CN116064335 A CN 116064335A CN 202310143668 A CN202310143668 A CN 202310143668A CN 116064335 A CN116064335 A CN 116064335A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aneurinibacillus
uranium
strain
bacillus
thiamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310143668.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116064335B (zh
Inventor
张丽娟
黄伟
王宁
王玮
罗义
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang Uyghur Autonomous Region Academy Of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute Of Microbial Applications Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences (china Xinjiang-Armenia Bioengineering Research And Development Center)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Microbial Applications Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences (china Xinjiang-Armenia Bioengineering Research And Development Center) filed Critical Institute Of Microbial Applications Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences (china Xinjiang-Armenia Bioengineering Research And Development Center)
Priority to CN202310143668.0A priority Critical patent/CN116064335B/zh
Publication of CN116064335A publication Critical patent/CN116064335A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116064335B publication Critical patent/CN116064335B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • B09C1/105—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes using fungi or plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/80—Soil conditioners
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K17/00—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials
    • C09K17/02—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials containing inorganic compounds only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2101/00—Agricultural use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.新菌株B1，该解硫胺素芽孢杆菌的保藏编号为GDMCCNO:61438，解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1能够分解有机磷、溶无机磷、解钾，可以耐受600mg·mL‑1以下的铀，并且能够产生IAA，并通过发芽和盆栽试验，验证菌株对上海青的优良促生效果。该菌株可为微生物‑植联合修复放射性污染土壤技术的开发提供理论依据，为原废弃铀矿区的土壤污染治理开发出低毒高效、无二次污染的微生物肥料提供试验材料。

Description

一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用
技术领域
本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用的技术领域。
技术背景
目前放射性核素的超累积植物种类偏少、生物量小、富集率低、修复周期长，极大限制了植物修复在大面积放射性污染土壤中的商业化应用。采用微生物进一步提高植物富集、修复效率是植物提取修复技术的研究热点之一。
微生物尤其是土著微生物能够显著强化植物的修复效果，能有效增加植物的生物量、提高植物对新环境的抗性或者适应性。Pramanik等从原位土壤中所筛分的产气肠杆菌具有抗镉和产IAA等特性，可显著促进镉胁迫下水稻幼苗的生长。Muhammad等研究表明，褐藻乳杆菌能减轻土壤放射性污染对褐藻的胁迫作用，进一步提高褐藻对铀、铅的吸收能力。Tan等从污染矿区分离出三株植物根际促生菌，在铜、镉重度污染土壤中，提高黑麦草地上部分和根系的生物量，稳定植物修复效率。Pal等从重金属污染农田土壤分离出的变异乳杆菌KUBM17和恶臭假单胞菌KUBM18具有高度的镉和铅耐受能力，能改善镉和铅胁迫条件下萝卜幼苗的生长状况。王焯等从某铀尾矿区的本土植物酸模根际分离出一株木糖氧化无色杆菌D16，能显著提高苜蓿的生物量和铀富集量。铀矿区本土微生物往往具有较强的抗性，能够很好的适应含铀环境，能够经受这种苛刻条件，利用无机成分来驱动其代谢机制，保护自己免受重金属毒性，同时对当地微生物群落扰动小，降低铀在环境中的流动性，遏制土壤铀污染发挥了关键作用。土著微生物-植物联合修复方法能够实现在最低的环境扰动、最小的成本投入条件下达到最优的治理效果，并且能够改良土壤结构和营养，有利于铀矿山污染土壤的循环利用。目前还没有解硫胺素芽孢杆菌耐铀促生方面的报道。
发明内容
本发明的目的是以中轻度污染的废弃铀矿区土壤为材料，通过铀耐受实验和促生性能测定结果，筛选出一株具有耐铀促生特性的功能菌株，解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，能够产生IAA，并且对于铀有良好的的耐受能力，对受到铀胁迫的上海青具有的优良促生效果。该菌株可为微生物-植联合修复放射性污染土壤技术的开发提供理论依据，为原废弃铀矿区的土壤污染治理开发出低毒高效、无二次污染的微生物肥料提供试验材料。
为了实现本发明的目的,本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，该解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1的保藏编号为GDMCC NO:62406。
本发明所提供的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，从韶关某退役铀矿区污染土壤样品中分离、筛选获得，菌种编号为B1，经微生物分类学检测鉴定，确定为解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus sp.)潜在新菌种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。地址：地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年4月21日，保藏号为GDMCCNO:62406。
本发明具体提供的Aneurinibacillus sp.B1属于解硫胺素芽孢杆菌潜在新菌种，为革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，两端钝圆，周生鞭毛，细胞大小0.3-0.4μm×1.9-2.6μm，生长在培养基上培养后，菌落呈灰白色，呈煎蛋形，边缘不整齐，表面光滑，湿润，中间凹陷，半透明。
以解硫胺素芽孢杆菌潜在新菌种Aneurinibacillus sp.B1的基因组总DNA为模板扩增其16S rDNA序列，经PCR扩增和测序，菌株B1的16SrDNA序列长度为1526bp，与解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus soli亲缘关系最近，同源性为96.58％。与Aneurinibacillus属其它种的相似性为93.56％～95.47％。初步确定为菌株B1是解硫胺素芽孢杆菌属的潜在新种。进一步提取菌株基因组DNA，通过Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150平台进行基因组测序，获得完整的B1菌株基因组，大小3,853,322bp，GC含量45.26mol％，与Aneurinibacillus soli CB4基因组序列(NZ_AP017312.1)的ANI为89.02％、dDDH56.50％，ANI<95％且dDDH<70％，进一步表明B1是有别于Aneurinibacillus soli的Aneurinibacillus属新种。
本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1采用NA培养基或R2A培养基或NB培养基进行培养。
本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1在温度为20℃-45℃，pH值为6-7的范围内生长。
本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1在盐度(v/w)为0％-1％的环境中生长。
本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1耐受600mg·mL-1以下的铀。
本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1具有分解有机磷、溶无机磷、解钾的特性。
进一步的，本申请还提供解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus sp.)B1菌株在植物耐铀促生中的应用。
进一步的，本申请还提供解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1菌株在生产IAA及其相关制品中的应用。
进一步的，本申请还提供解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1菌株在微生物制剂制备中的应用。
通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果∶
(1)本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1具耐铀特性，能够耐受含铀浓度600mg·L-1的培养环境，并且在培养过程中，通过测量发酵液上清液中剩余的铀浓度，发现培养基中的铀浓度并未减少，菌株B1对培养液中的铀无吸附、吸收作用。
(2)本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1具有分解有机磷、溶无机磷、解钾的特性。
(3)本发明所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1具有良好的IAA生产特性，菌株B1在R2A、LB和NB培养基中培养48h后，菌液中IAA的浓度分别能够达到7.07μgmL-1、4.72μgmL-1和6.37μgmL-1。
(4)本发明的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1具有良好耐铀促生作用，通过不同铀浓度处理后的上海青种子施加菌株B1发酵液后，在0mg/L铀时发芽指数显著提高；在50mg/L铀浓度下，发芽指数和平均根长显著提高；在50mg/L铀浓度下，平均根长和株高显著提高；菌株B1能够效缓解低浓度铀(50mg/L)对上海青根生长的毒害作用，降低高浓度铀(100mg/L)对上海青根生长和芽生长的胁迫作用，提高上海青种子对铀的耐受性。
(4)本发明的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1该菌株可为微生物-植联合修复放射性污染土壤技术的开发提供理论依据，为原废弃铀矿区的土壤污染治理开发出低毒高效、无二次污染的微生物肥料提供试验材料，对于微生物的应用及其相关制剂的开发具有巨大的潜在开发价值。
附图说明
图1所示为菌株B1菌落图(A、B)和菌体图(C：光学显微镜；D：扫描电镜)。
其中图A、图B所示为菌落图；图C所示为光学显微镜菌体图；图D所示为扫描电镜菌体图。
图2所示为基于16SrDNA序列构建的系统发育树。
图3所示为B1菌株在不同铀浓度下的生长曲线图。
图4所示为不同培养基发酵液中IAA的浓度。
图5所示为B1菌株在不同铀浓度下对上海青种子的促生效果图。
其中图A所示为铀浓度为0mg/L处理结果图；图B所示为铀浓度为50mg/L处理结果图；图C所示为铀浓度为100mg/L处理结果图。
图6所示为菌株B1菌液灌根处理对上海青的促生效应图。
具体实施方式：
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：
主要试剂：NA培养基、R2A培养基、LB培养基、UO2(NO3)2·6H2O、FeCl3、H2SO4、偶氮胂Ⅲ、吲哚乙酸(IAA)等。
主要仪器：高压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA，HVE-50)、超净工作台(浙江孚夏，型号SW-CJ-1F)、生物显微镜(日本尼康，型号EclipseCi-L)、恒温培养箱(上海一恒、型号bluepard)、酶标仪(美国BioTek，型号Epoch2)、离心机(塞洛捷克，型号CF1524R)、TS恒温振荡箱(上海天呈，型号TS-2102C)。
本发明采用的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1简称B1菌株。
本申请中设计的培养基配置如下：
基础培养基：NA培养基、R2A培养基、LB培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。
含铀培养基：在NA培养基中，加入过滤除菌的5.0g·L-1UO2(NO3)2母液至对应浓度。
促生特征筛选用培养基：硅酸盐细菌培养基、阿须贝氏培养基、有机磷细菌培养基、无机磷细菌培养基、CAS检测培养基分别用于筛选解钾、固氮、解磷、产铁载体的菌株。酪素培养基、羧甲基纤维素钠培养基分别用于筛选产蛋白酶、纤维素酶的菌株。溴甲酚紫显色培养基用于筛选产有机酸的菌株。在基础培养基中加入200mg·L-1的色氨酸，用于筛选产IAA的菌株。
Salkowski比色液：4.5g·L-1FeCl3、10.8mol·L-1H2SO4。
偶氮胂Ⅲ，分子式C22H18O14N4S2As2，分析纯；硝酸铀酰，分子式UO2(NO3)2`6H2O，分析纯；吲哚乙酸(IAA)，分子式C10H9NO2。
UO2(NO3)2储液：取1.05gUO2(NO3)2·6H2O和100mL蒸馏水，配制成5g·L-1的UO2(NO3)2母液。
IAA母液：精确称取10mgIAA加少量无水乙醇溶解，并用蒸馏水定容至100mL，配制成100μg·mL-1的IAA母液。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：耐铀细菌初筛
采用稀释平板法，称取5.0g铀尾矿区的新鲜土壤，加入含有45mL无菌水三角瓶内，于30℃，120rmin-1震荡培养30min。取出土壤悬液以10-4、10-5、10-6倍梯度稀释涂布于浓度为200mg·L-1浓度梯度的含铀培养基。置30℃培养箱中培养1-2d。
按照菌落的不同形态，以初筛时含铀固体培养基中的菌株作为菌源，在无菌操作条件下，用竹签挑取单个菌落的在新的含铀固体培养基上划线分离，进行分离纯化，培养2d后，观察菌落形态。进行初步去重。
经过初筛，从中轻度放射性污染的土壤样品中分离获得具有耐铀的特性的细菌B1。
实施例二：耐铀菌株的促生性能初步测定挑取耐铀菌株的单菌落，接种至50mLNA液体培养基30℃震荡24h作为种子液，吸取约5μL菌液以点板的方式将菌液至硅酸盐细菌培养基、阿须贝氏培养基、解有机磷细菌培养基、解无机磷细菌培养基、CAS检测培养基、脱脂奶粉培养基、羧甲基纤维素钠培养基和溴甲酚紫显色培养基于30℃恒温培养，观察菌落周边是否产生透明圈。并取100μL菌悬液与200μLSalkowski比色液在白色陶瓷板上混合，以不加菌液培养的培养液作空白对照，将白色陶瓷板放于常温暗处等待30min，观察颜色是否变红，若颜色变红，说明菌株具有产IAA的能力，且颜色越深，产IAA能力越强。B1菌株具有解有机磷、溶无机磷、解钾和产IAA的特性，详见表1所示。
表1：B1菌株促生能力测定结果表
指标 结果 指标 结果
固氮 - 纤维素酶 -
解有机磷 + 蛋白酶 -
溶无机磷 + 铁载体 -
解钾 + IAA +
注：+，阳性；-，阴性。
实施例三：菌株鉴定
1.生理生化特征
将B1菌株接种至NA培养基上，通过平板划线获得单菌落，28℃培养48h，观察菌落大小、质地、颜色等特征。菌体进行革兰氏染色，用光学显微镜镜检。生理生化特征采用API20E、API 50CH和Biolog GEN III微孔板测定。
2.分子生物学鉴定
采用细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN，DP302)提取菌株DNA。以总DNA为模板，用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR。扩增体系30μL：模板DNA 2μL、引物27F 1μL、引物1492R 1μL、PCR Buffer Mix 15μL、双蒸水11μL。扩增程序：94℃4min；94℃30s，65℃40s，72℃90s，30cycles；72℃10min。扩增产物在1％琼脂糖电泳合格后，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测序后序列提交GenBank数据库，经NCBI和EzBioCloud数据库对比分析，选取序相近菌株的16SrDNA序列下载，用MEGA7.0软件进行构建系统发育进化树，选用NJ法，Bootstrap值1000。
基因组测序比较。采用STE的方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性，利用Qubit进行定量。分别构建符合Nanopore测序平台的10kb文库和Illumina测序平台的350bp小片段文库。测序数据经过质控后获得有效数据，使用Unicycler软件采用二代+三代数据进行基因组组装，获得完整的B1染色体基因组。与参考基因组序列的ANI(Average Nucleotide Identity)和dDDH(digital DNA-DNAHybridization)分别由在线工具CJ Bioscience's online Average NucleotideIdentity(ANI)calculator、GGDC Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0计算获得。
通过培养观察，菌株B1在NA培养基上菌落呈灰白色，呈煎蛋形，边缘不整齐，表面光滑，湿润，中间凹陷，半透明，参见附图1中图A、图B。为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，两端钝圆，周生鞭毛，细胞大小0.3-0.4μm×1.9-2.6μm，参见附图1中图C、图D。。
经PCR扩增和测序，菌株B1的16SrDNA序列长度为1526bp，与解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus soli亲缘关系最近，同源性为96.58％。与Aneurinibacillus属其它种的相似性为93.56％～95.47％。菌株B1是解硫胺素芽孢杆菌属的新种,，参见附图2。进一步提取菌株基因组DNA，通过Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq PE150平台进行基因组测序，获得完整的B1菌株基因组，大小3853322bp，GC含量45.26mol％，与Aneurinibacillus soliCB4基因组序列(NZ_AP017312.1)的ANI为89.02％、dDDH56.50％，ANI<95％且dDDH<70％，进一步表明B1是有别于Aneurinibacillus soli的Aneurinibacillus属新种。
通过比较B1菌株与Aneurinibacillus soli KCTC33505T和Aneurinibacillusaneurinilyticus JCM9024T的生理生化特征，B1菌株的生长温度范围为20℃-45℃，pH为6-7，盐度(v/w)为0％-1％。经API试剂条20E、50CH和BiologGENIII板测试，VP试验、梓檬酸利用、明胶酶、硝酸盐还原试验阳性，细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、产硫化氢和吲哚、脲酶试验阴性。B1不能发酵甘油和D-塔格糖产酸，可以发酵5-酮基-葡萄糖酸盐产酸；能够利用碳源β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、D-半乳糖、D-海藻糖、肌醇、甘油、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、L-焦谷氨酸。可知B1菌株虽然属于解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus，具有Aneurinibacillus属中鲜明的新菌种特征，B1菌株属于Aneurinibacillus属中新种。
表2：B1菌株的生理生化特征
Figure BDA0004088428690000111
Figure BDA0004088428690000121
Figure BDA0004088428690000131
注：+，阳性；-，阴性；w，弱阳性。参考菌株的基因组大小和GC含量取该种已测序菌株的平均值。
实施例四：菌株在铀胁迫下的生长曲线
制备OD600为1.0的种子培养液，接种于含铀培养基，铀浓度分别为0、100、200、400、600、800mg·L-1的含铀培养基，接种量为2％。每个处理作3个重复。30℃恒温震荡48h，以空白培养基作对照，每2h测定菌液在600nm条件下的吸光度值，以时间为横坐标，吸光度OD600值为纵坐标，绘制B1菌株在在0-800mg·mL-1铀浓度下的生长曲线。
铀标准曲线：取300μL未接菌的不同铀浓度的培养液,依次加入0.5mLHCI、1.0mLEDTA、2.0mL偶氮胂，用蒸馏水定容至10.0mL，混匀作为待测液。取200μL待测液，测定OD652，以铀浓度作为横坐标，OD652作为纵坐标，绘制标准曲线。
菌液剩余铀浓度的测定：菌液震荡培养48h后，10000r·min-1离心5min，取300μL上清液，参照标准曲线的做法测定OD652下测量吸光度，以确定菌液中剩余的铀浓度。
将所得数据进行吸附率计算：
Figure BDA0004088428690000141
通过测定B1菌株在不同浓度含有培养基的生长曲线，可以看出，当铀浓度在0-400mg·L-1时，B1菌株的生长曲线呈S型，100和200mg·L-1的铀对菌株生长有促进作用；当培养基铀浓度为400mg·L-1时，B1的生长受到轻微抑制，延迟期明显增长，进入稳定期后的菌量也明显降低；培养基含铀浓度达到600mg·L-1时，菌株B1的生长完全被抑制，参见附图3。然而，通过测量发酵液上清液中剩余的铀浓度，发现培养基中的铀浓度并未减少，菌株B1对培养液中的铀无吸附、吸收作用。
实施例五：IAA定量测定
IAA标准曲线的绘制：取IAA母液配成0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg·mL-1的系列标准液作为工作液(现配现用)。分别取2mL上述工作液加入8支干净试管，再加入4mLSalkowski比色液，避光反应30min，再于测定OD530，并以IAA浓度为横坐标，吸光度OD530为纵坐标，绘制IAA标准曲线。
IAA含量测定：100μL种子液接种至5mL含200mg·L-1L-色氨酸的R2A培养基、NB培养基、LB培养基中，28℃、150rmin-1恒温震荡培养48h，测定OD600。将菌液于10000r·min-1离心5min，取上清液与Salkowski比色液1：2混合，避光30min后测量OD530，根据IAA标准曲线计算出菌液浓度IAA产量(μg·mL-1)。并计算出菌液浓度OD为1.0时IAA产量(μg·mL-1)。
通过测定结果显示，菌株B1在R2A、LB和NB培养基中培养48h后，菌液中IAA的浓度分别为7.07μg·mL-1、4.72μg·mL-1和6.37μg·mL-1，在R2A培养基中产生的IAA高于另外两种培养基，参见附图4。
实施例六：耐铀促生试验
将30℃，150r/min恒温振荡培养24h的菌液进行离心，收集菌体，用无菌水冲洗3次去除残留培养基，最后再用无菌水将菌液重新悬浮混匀至OD＝1.0(约为108CFU/mL)，作为菌液备用。
挑选颗粒饱满的种子，用1％(m/V)的次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水漂洗种子3次，每次1min，然后浸泡于无菌水中7h，捞出沥干后，用菌液浸泡2h后，在无菌环境晾干，备用。采用滤纸发芽床法进行种子萌发，重金属铀胁迫，将硝酸铀酰配成0、50、100mg/L3个浓度，以不加菌液处理的种子作为对照，每个处理设置3个重复，每个培养皿中放置15粒种子，于20℃、12h/12h光照黑暗交替、湿度为80％的光照培养箱中静置培养，持续7d。7d后统计发芽率，测量根长和株高，计算发芽势、发芽指数计算公式如(1)-(2)所示。
Figure BDA0004088428690000151
Figure BDA0004088428690000152
Figure BDA0004088428690000153
式中：Gt指t日的种子发芽个数，Dt为种子相应的发芽日数。
取颗粒饱满的上海青种子，置于育苗盘中催芽育苗，待上海青苗长出第4片真叶移栽至内径20cm、高14cm圆形花盆中，花盆中预先装入2kg含100mg·kg-1的含铀土壤。缓苗一周后，施加300mL制备好的100倍稀释的菌液(菌数约为106cfu·mL-1)，对照组施加等量蒸馏水。根据情况每天施加等量水，保持土壤一定含水量。7d后进行第2次施菌(方法同第1次)，共施加4次菌液。35d后测量株高、根长、茎粗、叶片数、叶宽、叶长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重。用Excel2010进行原始数据整理，SPSS25.0进行单因素方差分析和主成分分析。本文图、表中的数据均为平均值±标准误差。
通过不同铀浓度处理后的上海青种子，参见附图5，发芽率和发芽率较对照组无显著差异(P>0.05)，在0mg/L铀浓度梯度下，平均根长和株高较对照组无显著差异(P>0.05)，发芽指数较对照组有显著性提高(P<0.05)；在50mg/L铀浓度梯度下，株高较对照组无显著差异(P>0.05)，平均根长极显著高于对照组(P<0.01)，发芽指数较对照组有显著性提高(P<0.05)，在100mg/L铀浓度梯度下，发芽指数较对照组无显著差异(P>0.05)，而平均根长和株高较对照组有极显著差异(P<0.01)。由此可知，菌株B1对有效缓解低浓度铀(50mg/L)对上海青根生长的毒害作用，降低高浓度铀(100mg/L)对上海青根生长和芽生长的胁迫作用，提高上海青种子对铀的耐受性。
在含铀土壤中，菌株B1处理后的上海青叶宽和地下鲜重极显著高于对照组，根长、茎粗、叶长、地上鲜重和地下鲜重显著高于对照组，参见附图6，表3。接种菌株B1对上海青生长具有明显促生效果。
表3：菌株B1处理对上海青生长性状的影响
处理 CK B1
株高 14.38±1.57* 15.83±1.52
根长 12.87±2.86 17.75±4.14*
茎粗 3.57±0.53 4.67±0.82*
叶片数 4.57±0.79 5.17±0.98
叶宽 3.32±0.67 3.96±0.91**
叶长 5.37±1.04 6.06±1.28*
地上鲜重 2.70±0.94 5.36±2.15*
地下鲜重 0.32±0.19 1.13±0.49**
地上干重 0.43±0.15 0.59±0.25
地下干重 0.10±0.02 0.17±0.06*
注：*表示差异显著；**表示差异极显著
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1的微生物保藏号为GDMCC NO:62406。
2.如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1采用NA培养基或R2A培养基或NB培养基进行培养。
4.如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1在温度为20℃-45℃，pH值为6-7的范围内生长。
5.如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1在盐度(v/w)为0％-1％的环境中生长。
6.如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1耐受600mg·mL-1以下的铀。
7.如权利要求1所述的解硫胺素芽孢杆菌Aneurinibacillus sp.B1，其特征在于，所述的Aneurinibacillus sp.B1能够分解有机磷、溶无机磷、解钾。
8.如权利要求1所述的Aneurinibacillus sp.B1菌株在植物耐铀促生中的应用。
9.如权利要求1所述的Aneurinibacillus sp.B1菌株在生产IAA及其相关制品中的应用。
10.如权利要求1所述的Aneurinibacillus sp.B1菌株在微生物制剂制备中的应用。
CN202310143668.0A 2023-02-20 2023-02-20 一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用 Active CN116064335B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310143668.0A CN116064335B (zh) 2023-02-20 2023-02-20 一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310143668.0A CN116064335B (zh) 2023-02-20 2023-02-20 一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116064335A true CN116064335A (zh) 2023-05-05
CN116064335B CN116064335B (zh) 2024-10-15

Family

ID=86174852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310143668.0A Active CN116064335B (zh) 2023-02-20 2023-02-20 一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064335B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007086898A2 (en) * 2005-03-31 2007-08-02 University Of South Carolina Methods and compositions related to anthrax spore glycoproteins
CN104403951A (zh) * 2014-11-26 2015-03-11 新疆农业科学院微生物应用研究所 一种耐辐射镰孢霉菌及在吸附铯生物处理中的应用
CN106793782A (zh) * 2014-08-06 2017-05-31 恩威拉有限责任公司 用于工业用途的细菌孢子组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007086898A2 (en) * 2005-03-31 2007-08-02 University Of South Carolina Methods and compositions related to anthrax spore glycoproteins
CN106793782A (zh) * 2014-08-06 2017-05-31 恩威拉有限责任公司 用于工业用途的细菌孢子组合物
CN104403951A (zh) * 2014-11-26 2015-03-11 新疆农业科学院微生物应用研究所 一种耐辐射镰孢霉菌及在吸附铯生物处理中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘波;王阶平;陶天申;喻子牛;: "芽胞杆菌属及其近缘属种名目录", 福建农业学报, no. 01, 15 January 2015 (2015-01-15) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116064335B (zh) 2024-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114107092B (zh) 一株降解邻苯二甲酸酯的植物内生菌戈登氏菌l191及其应用
CN111876351A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用
CN107460143B (zh) 一株能生物活化-矿化重金属镉的蜡样芽孢杆菌及其应用
CN116676227B (zh) 白色伯克霍尔德氏菌、菌剂及其应用以及促进植物生长的方法
CN119193367A (zh) 一种耐铀蜡样芽胞杆菌及其在铀污染土壤生物联合修复中的应用
CN117603853A (zh) 一株科萨克氏菌scsio 43801及应用
CN104974959B (zh) 景天根际铅抗性菌株普罗维登斯菌,筛选方法及其应用
CN110904004A (zh) 一株产海藻糖水解酶的细菌及其选育方法和应用
CN108841742B (zh) 一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株zh-1及其制备方法和应用
CN109486698A (zh) 一株高耐铅的肠杆菌及其应用
CN116064335B (zh) 一种解硫胺素芽孢杆菌及其应用
CN104805018A (zh) 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E
CN111893063B (zh) 一种玫瑰单胞菌Roseomonas sp.M0104及其应用
Huq et al. Flavobacterium chungangensis sp. nov., a bacterium isolated from soil of Chinese cabbage garden
CN101298600A (zh) 红树植物根际促生固氮菌(dzy-hs14)及其应用
CN101319198B (zh) 红树植物根际促生固氮菌(dzy-n56)及其应用
CN104845890A (zh) 壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E在降解多种邻苯二甲酸酯中的应用
CN117487697A (zh) 一株降解农药残留的假单胞菌及其酶制剂和应用
CN110295125B (zh) 一株类产碱假单胞菌nyj3.6及其应用
CN114774330A (zh) 解纤维素雌植菌新物种及其应用
CN104845891A (zh) 一种降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌菌悬液及其应用
CN120310665B (zh) 一种红酵母菌m1及其应用
CN118755482B (zh) 一种盐碱地改良的方法
CN115029275B (zh) 一种氯苯降解菌及其应用
CN119614411B (zh) 一种固定化菌剂及其在降解丁基黄原酸盐和苯甲羟肟酸污染中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20230505

Assignee: XINJIANG HUISEN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF MICROBIAL APPLICATIONS, XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES (CHINA XINJIANG-ARMENIA BIOENGINEERING RESEARCH AND DEVELOPMENT CENTER)

Contract record no.: X2024980030615

Denomination of invention: A sulfur-containing Bacillus subtilis and its application

Granted publication date: 20241015

License type: Common License

Record date: 20241204

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20251112

Address after: 841700 Xinjiang Uygur Autonomous Region Urumqi City Shayaibake District Nanchang Road 403 No.

Patentee after: Xinjiang Uyghur Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences

Country or region after: China

Address before: 830091 Nanchang road the Xinjiang Uygur Autonomous Region Urumqi shayibake District No. 403

Patentee before: INSTITUTE OF MICROBIAL APPLICATIONS, XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES (CHINA XINJIANG-ARMENIA BIOENGINEERING RESEARCH AND DEVELOPMENT CENTER)

Country or region before: China

TR01 Transfer of patent right