CN116059367B - 一种治疗阿尔茨海默症的sarm1抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SARM1抑制剂及其在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，所述SARM1抑制剂为SARM1干扰序列SARM1‑i‑1shRNA、SARM1‑i‑2shRNA或SARM1‑i‑3shRNA。本发明的SARM1抑制剂可以显著改善记忆功能，降低脑组织中的Aβ沉积，该抑制剂为治疗阿尔茨海默病的药物研发提供实践基础。

Description

一种治疗阿尔茨海默症的SARM1抑制剂

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种SARM1抑制剂的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是一种慢性神经退行性疾病，占痴呆症患者的60-80％，全球有超过5000万人患有此病，65-75岁时发病率从5％升到10％，85岁时约15％，90岁及以上时发病率超过50％。作为老年痴呆症最常见的原因，AD是一种进行性的老年神经退行性疾病，以记忆丧失、认知障碍和行为异常为特征。患者常见的初始症状是健忘和日常工作的困难。最初的记忆障碍仅限于短期记忆，表现为学习新信息的能力减退，随着疾病的发展，AD患者会出现更严重的记忆丧失、语言障碍、视觉和空间障碍，以及协调和精细运动控制方面的缺陷。值得注意的是，在整个AD的进展过程中，记忆是受影响最严重的方面。因此，在发病率如此高和逐渐恶化的情况下，AD毫无疑问会给人类带来巨大的经济损失和心理创伤。作为AD发病与进展中受影响最严重的功能，记忆障碍应该是我们关注的要点。

AD的主要病理特征是β淀粉样沉积(Aβ)、神经元纤维缠结(NFTs)和神经元缺失。其中，有毒的淀粉样β(Aβ)肽的积累导致突触功能障碍、轴突变性，最终导致神经元死亡。最近许多研究表明，炎症的增加提高了AD的风险，而长期抑制炎症会减少并可能延迟其发病。虽然炎症反应被认为在抑制疾病进展的早期阶段有有益的作用，但慢性神经炎症和相关促炎症细胞因子的产生最终会导致神经元死亡。Aβ可以激活小胶质细胞，并使星形细胞反应性增殖，随后星形细胞分泌大量的炎症因子，如TNF-α、IFN-γ，并产生神经毒性物质，可导致神经元功能障碍。在APP/PS1小鼠中观察到NF-kB的磷酸化明显增加，这表明Aβ也能激活NF-kB。更重要的是，Aβ的积累以及伴随的炎症反应最终会导致神经元死亡和认知能力下降。因此，神经元功能障碍和神经炎症可能在AD的发病和进展中发挥关键作用。但是，AD的发病机制和其他情况的潜在机制和后果仍然是难以确定的。

Toll样受体是先天免疫的一个重要组成部分，而SARM1是TLR下游信号TIR结构域的适应蛋白，具有Toll/白细胞介素-1受体结构域，主要表达于哺乳动物的神经系统，广泛分布于海马、杏仁核、大脑皮层、中脑和小脑，在神经元中的表达高于星形细胞和小胶质细胞。SARM1通过调节轴突生长和神经元极性来介导神经元形态学变化，在体外培养海马神经元时，SARM1也促进Wallerian变性引起的轴突死亡，SARM1缺失对轴突变性有保护作用。SARM1除了参与神经发育的调控外，还参与了大脑的先天免疫，在神经退行性疾病和精神疾病中也有突出的作用。因此猜想SARM1在神经元中的表达可以积极介导AD神经元的炎症反应。

由此可见，SARM1有可能在AD发病机制中发挥着重要作用。但对于SARM1如何影响神经元功能从而导致AD的发生，目前尚不明确。通过SARM1抑制剂在小鼠中抑制SARM1基因的表达，希望能够为AD的发病机制和治疗方案提供新的研究方向。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种SARM1抑制剂及其在改善阿尔茨海默症神经中的应用。

受SARM1在AD发生和发展中起关键作用的启示，发明人研究了其对这些过程的影响。APP/PS1双转基因小鼠是经典的阿尔茨海默模型小鼠，小鼠被分为对照组(正常小鼠)和AD组(APP/PS1双转基因小鼠)。动物行为学实验结果显示，干扰对照组小鼠的SARM1基因，不会影响小鼠的抑郁和焦虑样表型，也不会影响小鼠的记忆功能。而AD组小鼠存在明显的记忆障碍，在AD组中，与SARM1-scramble小鼠相比SARM1-siRNA1的小鼠在记忆功能方面出现明显好转。众所周知，Aβ沉积是AD的特征性改变，进一步研究发现AD组中，与SARM1-scramble小鼠相比，SARM1-siRNA1小鼠脑组织中的Aβ沉积在9个月时减少，推测可能是炎症细胞或者神经元在其中发挥重要作用。这些结果显示SARM1的表达在改善记忆功能中关键的调节作用，也提供了新的阿尔茨海默症的治疗靶点和药物形式。

基于上述发现，本发明提出的解决上述技术问题的技术方案如下。

本发明的第一方面提供一种治疗阿尔茨海默症的药物，所述药物包括SARM1抑制剂。

本发明的第二方面提供一种SARM1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。

优选的，所述SARM1抑制剂为降低SARM1核酸或蛋白表达的化合物。

优选的，所述SARM1抑制剂为SARM1干扰序列。

优选的，所述SARM1干扰序列为SARM1-i-1 shRNA、SARM1-i-2 shRNA或SARM1-i-3shRNA，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同源性，所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.3和SEQID NO.4具有至少90％的序列同源性，所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别与SEQID NO.5和SEQ ID NO.6具有至少90％的序列同源性。

更优选的，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2具有至少95％的序列同源性，或者至少98％的序列同源性，或者至少99％的序列同源性。

更优选的，所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4具有至少95％的序列同源性，或者至少98％的序列同源性，或者至少99％的序列同源性。

更优选的，所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6具有至少95％的序列同源性，或者至少98％的序列同源性，或者至少99％的序列同源性。

最优选的，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链为：5’-CCGGGCAGATCGGTTTCTCCAAGTACTCGAGTACTTGGAGAAACCGATCTGCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO.1)；

所述SARM1-i-1 shRNA序列的反链为：5’-AATTCAAAAAGCAGATCGGTTTCTCCAAGTACTCGAGTACTTGGAGAAACCGATCTGC-3’(SEQ ID NO.2)。

最优选的，所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链为：5’-CCGGGCAACTTTGTGTTGGTGCTATCTCGAGATAGCACCAACACAAAGTTGCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO.3)；

所述SARM1-i-2 shRNA序列的反链为：5’-AATTCAAAAAGCAACTTTGTGTTGGTGCTATCTCGAGATAGCACCAACACAAAGTTGC-3’(SEQ ID NO.4)。

最优选的，所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链为：5’-CCGGTATCAAGTGGTCCCACGAATACTCGAGTATTCGTGGGACCACTTGATATTTTTTG-3’(SEQ ID NO.5)；

所述SARM1-i-3 shRNA序列的反链为：5’-CCGGTATCAAGTGGTCCCACGAATACTCGAGTATTCGTGGGACCACTTGATATTTTTTG-3’(SEQ ID NO.6)。

优选的，所述治疗阿尔茨海默症的药物不产生焦虑和抑郁样行为。

本发明的第三方面提供一种SARM1抑制剂在制备减少脑组织中Aβ沉积的药物中的应用。

优选的，所述SARM1抑制剂为SARM1干扰序列。

优选的，所述SARM1干扰序列为SARM1-i-1 shRNA、SARM1-i-2 shRNA或SARM1-i-3shRNA，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同源性，所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.3和SEQID NO.4具有至少90％的序列同源性，所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别与SEQID NO.5和SEQ ID NO.6具有至少90％的序列同源性。

更优选的，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

本发明的第四方面提供一种SARM1抑制剂在制备改善记忆功能，且不产生焦虑和抑郁样行为的药物中的应用。

优选的，所述SARM1抑制剂为SARM1干扰序列。

优选的，所述SARM1干扰序列为SARM1-i-1 shRNA、SARM1-i-2 shRNA或SARM1-i-3shRNA，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2具有至少90％的序列同源性，所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别与SEQ ID NO.3和SEQID NO.4具有至少90％的序列同源性，所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别与SEQID NO.5和SEQ ID NO.6具有至少90％的序列同源性。

更优选的，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2；所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SARM1-i-1、SARM1-i-2和SARM1-i-3所示的核酸序列或其变体，只要其片段与前述核酸序列同源性在90％以上，或具有相同功能，均属于本发明保护范围之列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

本发明的有益效果：

本发明意外发现SARM1主要表达在神经元中，干扰阿尔茨海默症模型小鼠神经干细胞中的SARM1基因能够使得小鼠在记忆功能方面出现明显好转，且降低小鼠脑组织中的Aβ沉积，研制降低SARM1表达的物质有助于改善记忆功能，干预阿尔茨海默症的发生发展。基于上述发现，本发明提供了一种SARM1抑制剂及其在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用，为新型治疗阿尔茨海默病的药物研发提供实践基础。

附图说明

图1是3月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的旷场试验结果；

图2是3月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的高架十字迷宫试验结果；

图3是3月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的蔗糖偏好试验结果；

图4是3月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的悬尾试验结果；

图5是3月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的莫里斯水迷宫试验结果；

图6是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的旷场试验结果；

图7是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的高架十字迷宫试验结果；

图8A是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的蔗糖偏好试验结果；

图8B和图9A是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的悬尾试验结果；

图9B是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的强迫游泳实验结果；

图10是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的Y迷宫试验结果；

图11是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的新物体识别试验结果；

图12是8月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的莫里斯水迷宫试验结果；

图13是9月龄的对照组和AD组小鼠使用SARM1抑制剂后的小鼠脑组织的SARM1、Iba1、Aβ沉积免疫荧光染色结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

试验例1、SARM1基因对小鼠记忆功能、抑郁和焦虑的影响

1、试验方法

以动物行为学试验证实SARM1基因对于改善阿尔茨海默症记忆功能的重要性，特异性SARM1抑制物能够使得AD小鼠的记忆功能好转，但不影响小鼠的焦虑和抑郁样行为。

为了研究SARM1在阿尔茨海默症中的可能性和重要性，利用高特异性的SARM1抗体，以动物行为学试验测试了SARM1基因在小鼠的记忆功能、抑郁和焦虑方面的影响。

1.1、构建SARM1基因干扰的模型小鼠

首先构建特异性识别SARM1的SARM1-i-1 shRNA，经过大规模数据分析和实验验证，不靶向任何已知的人、小鼠、大鼠基因。将100μL的感受态细胞点离后放冰上，加入构建好的SARM1-i-1 shRNA序列(SARM1-i-1 shRNA序列的正、反链分别为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2)；冰上放置30min后再置于42℃环境中90s；接着继续冰上放置5min，最后加1ml温育的LB培养基在37℃，250rpm的摇床摇1h，取一半涂板(Amp+)，37℃过夜。将平板分隔成若干小格子，取平板中不同的单菌落在小格子中划线。挑取单菌落，扩增，提取质粒。

将得到的SARM1-i-1 shRNA质粒(250μg/kg)以肌肉注射的方式构建SARM1基因干扰的小鼠(来源于上海南方模式生物科技有限公司)，对APP/PS1双转基因小鼠(来自南京南方模型动物中心，经典的AD模型小鼠)也进行相同处理，产生四种类型的小鼠，包括APP/PS1；SARM1-scramble、APP/PS1；SARM1-siRNA1、SARM1-scramble和SARM1-siRNA1小鼠。小鼠都是基于C57BL/6背景。

1.2、模型小鼠行为学实验

将上述四种类型的小鼠进行以下动物行为学试验：

(1)旷场试验：开始试验之前将小鼠提前30分钟放在进行旷场试验的屋内，30分钟后小鼠被放在开放视野箱的中心，并在适宜光照条件下自由探索环境5min。Panlab视频行为学分析软件SMART用于测量和记录在中心区域的时间。

(2)高架十字迷宫试验：将小鼠头朝开放臂，放在高架迷宫的中心区域，并允许其自由探索5min。所有行为均通过摄像机监控记录。使用Panlab视频行为学分析软件SMART测量在开臂和闭臂所花费的时间。

(3)蔗糖偏好试验：一共分为两个阶段，第一阶段为适应阶段：将小鼠单只放于笼中适应48h，放置两个瓶子其中一个瓶子装水，另一个瓶子装1％的蔗糖，24h后需要更换两个瓶子的位置以避免产生位置偏好。第二阶段为测试阶段：适应结束后禁食禁水24h。在禁食禁水结束后，正常给水和饲料，24h后测量水和蔗糖的消耗量。蔗糖偏好指数＝糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)。

(4)悬尾试验：开始前将小鼠带入试验环境应适应一个小时，适应后将小鼠尾部后1/3处用胶带固定，悬挂于支架上，头部距离台面15cm。记录小鼠6min中后4min内的不动时间。使用Panlab视频行为学分析软件SMART对小鼠后四分钟的不动时间进行统计。

(5)莫里斯水迷宫试验：一共分为两个阶段，第一个阶段为获得性训练：将小鼠头朝池壁放入水中，记录动物找到水下平台的时间(秒)。小鼠放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。在前几次训练中，如果小鼠找到水下平台的时间超过60秒，则引导动物到平台，让动物在平台上停留10秒后擦干。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔30min，连续训练4天。第二阶段为探查训练：探查训练在最后一次获得性训练结束后的第二天，这一阶段平台被撤除，小鼠开始60秒的探索。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

(6)强迫游泳试验：在2L玻璃烧杯中放入1.6L的水，水温控制在24℃左右，将小鼠放在烧杯中游泳6min。记录小鼠6min中后4min内的不动时间。

(7)Y-迷宫试验：由三个完全相同的臂组成，每两个臂之间夹角均为120度，迷宫的内臂以及底部均涂为黑色。将小鼠放在Y-迷宫任意一臂末端，任其自由探索10min，摄像系统记录动物10min的行为变化，记录10分钟内小鼠进入各个臂的顺序。Alternation被定义为连续进入三个臂，如(1，2，3或1，3，2)最大Alternation为进臂次数的总和-2，自发轮流行为得分＝总轮流次数/*大轮流次数*100％。

(8)新物体识别试验：第一阶段为适应期，第一天小鼠在试验装置内(无物体)自由运动5分钟，第二天和第三天小鼠自由运动的时间延长到15分钟。第二阶段为熟悉期，第四天时，在装置中放入2个相同的物体(确保物体没有气味，不被推动)，物体距离两侧壁10cm，将小鼠背朝物体从距物体等距离处放入装置中，用摄像头及软件来纪录小鼠在每个物体上的探索时间(以嘴或者鼻子接触到物体和凑近物体约2-3cm范围都算对物体的探索)，在10min内测定动物探索每个物体的次数、时间和距离。第三阶段为测试期，第2阶段完成后的1h作为检测记忆的时间间隔。将两个相同物体中的一个物体替换成一个不同的物体放入装置中，同样将小鼠背朝物体从距物体等距离处放入装置中5min。测量小鼠探索两个目标物的时间。如果受试小鼠的记忆功能正常，那么与探索熟悉的物体相比，它们花费更多的时间探索这个新颖的物体。如果所有对象的探索都相同，则此行为表示小鼠存在记忆障碍。

2、试验结果

(1)旷场试验和高架十字迷宫试验

焦虑症是AD中最普遍的合并症之一，因此对3月龄的小鼠进行了旷场和高架十字迷宫试验。结果显示，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠在旷场试验的中心区域所花费的时间并没有明显差异，此外，四组小鼠在旷场中的运动距离也没有差异，这表明其并不存在明显的焦虑样行为(图1)。为了使现象更加明确，进一步采用了高架十字迷宫试验，结果发现与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠的运动距离也没有明显差异(图2)。这些结果表明了在3月龄时，抑制SARM1基因的表达并不会影响小鼠的焦虑样行为。

后续对8月龄的小鼠进行了焦虑样行为相关表型的检测。旷场试验结果显示，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠在中心区域所花费的时间百分比没有明显差异(图6A-6B)。此外，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，AD组小鼠在旷场中的距离减少，猜测可能在AD模型下抑制SARM1基因可能会一定程度的影响小鼠的运动功能(图6C-6D)。为了使现象更加明确，进一步采用了高架十字迷宫试验，发现与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠并未表现出焦虑样行为(图7A)，但在高架十字迷试验中的运动距离也有所减少(图7B)。这些结果表明，在8月龄时小鼠并未表现出明显的焦虑样行为。

(2)蔗糖偏好试验和悬尾试验

除焦虑症外，AD最常见的合并症还有抑郁样行为，因此对四组小鼠进行了蔗糖偏好试验和悬尾试验。蔗糖偏好试验结果显示，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠对蔗糖的偏好指数没有明显差异，表明不存在明显的抑郁样行为(图3)。

为了使现象更加确定，还进行了悬尾试验，结果发现对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠的不动时间百分比没有明显差异(图4)。这些结果表明，在3月龄时，抑制SARM1基因的表达并不会影响小鼠的抑郁样行为。

继续测定8月龄小鼠的抑郁样行为，蔗糖偏好试验结果表明，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，AD组SARM1-scramble小鼠对蔗糖的偏好指数下降，表明存在明显的抑郁样行为，但AD组SARM1基因干扰小鼠并不具有抑郁样行为(图8A)。

(3)莫里斯水迷宫试验

由于AD模型小鼠会出现记忆障碍，为了验证抑制SARM1基因是否会影响小鼠的记忆功能，因此对AD小鼠进行了记忆相关表型的检测。莫里斯水迷宫试验结果显示，在3月龄的AD组小鼠中，与SARM1-scramble相比，抑制SARM1基因的小鼠潜伏期并没有明显差异(图5)。

对8月龄小鼠进行莫里斯水迷宫试验结果显示，相对于AD组SARM1-scramble小鼠出现的记忆障碍，SARM1基因干扰小鼠记忆功能有所好转(图12)。

(4)悬尾试验和强迫游泳试验

为了确定现象，还进行了悬尾试验(图8B和9A)和强迫游泳试验(图9B)，结果发现，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组小鼠的不动百分比没有明显统计学差异。上述结果表明，在8月龄时，小鼠并未表现出明显的抑郁样行为。

(5)Y-迷宫试验

针对3月龄小鼠记忆功能的Y-迷宫试验结果显示，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，其他三组的自发交替百分比没有明显差异。上述试验结果表明，小鼠在3月龄时并未出现记忆障碍。

针对8月龄小鼠记忆功能的Y迷宫试验结果显示，与对照组SARM1-scramble小鼠相比，AD组对照小鼠在Y迷宫试验中的自发交替率降低，表明8月龄的AD模型小鼠存在明显的记忆障碍，且与AD组SARM1-scramble小鼠相比，AD组SARM1基因干扰小鼠的记忆障碍有所缓解，说明SARM1可影响AD模型小鼠的记忆功能(图10)。

(6)新物体识别试验

新物体识别试验结果显示，与对照组SARM1-scramble小鼠更喜欢新物体的现象相比，AD组SARM1-scramble小鼠对于新物体的偏好降低，但AD组SARM1基因干扰小鼠对新物体的偏好也没有明显改变(图11)。

综上所述，小鼠在3月龄时抑制SARM1并不会影响小鼠的焦虑、抑郁样行为和记忆功能。8月龄的AD模型小鼠会出现明显的记忆障碍，而SARM1在AD模型小鼠中发挥着至关重要的作用，抑制SARM1基因能够缓解AD模型小鼠的记忆障碍。

参照上述试验例1的方法，将SARM1-i-2 shRNA质粒和SARM1-i-3 shRNA质粒(250μg/kg)分别以肌肉注射的方式构建SARM1基因干扰的小鼠，进行试验例1的上述试验，试验结果同样验证了抑制SARM1基因能够缓解AD模型小鼠的记忆障碍。

试验例2、SARM1干扰对AD模型小鼠脑组织中Aβ沉积的影响

以免疫荧光试验证明在AD模型小鼠中，注射SARM1-i-1 shRNA质粒的小鼠(构建方法同试验例1)脑组织中的Aβ沉积减少。SARM1在神经元中的表达可能参与AD神经元的炎症反应。

1、试验方法

对AD模型小鼠脑区的Aβ沉积进行了染色。用Aβ斑块的生物标志物6E10和小胶质细胞生物标志物Iba1对小鼠的脑组织进行了免疫荧光染色。

首先将冰冻切片于室温晾片5-10min后置于55℃烘箱中45min，以便使组织贴得更牢固；接着用PBS缓冲液清洗切片5min，重复3次，以去除切片上的OCT；使用0.3％Triton打孔30min；之后用5％BSA封闭45-60min(根据室温调整封闭时间)；将组织切片用阻水笔画好，5％BSA配制新鲜的一抗后4℃孵育过夜，回收一抗；一抗稀释液：鼠抗Aβ(Covance 6E10，BioLegend，浓度1:500)，羊抗Iba1(ab5076，Abcam，浓度1:500)，兔抗Iba1(ab178847，Abcam，浓度1:500)；用PBS清洗5min，重复3次后，将组织切片再次用阻水笔画好，用新鲜的5％BSA配制相应种属的荧光二抗室温孵育60min(二抗稀释浓度1:1000)，敷育完成后再次用PBS清洗；最后加适量的含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，之后用指甲油封边，防止盖玻片滑脱和干燥，晾干后在Nikon荧光显微镜和免疫荧光共聚焦显微镜上采图。

2、试验结果

结果显示，9月龄AD组SARM1-scramble和SARM1-siRNA1小鼠脑组织中都存在Aβ沉积，但SARM1干扰后的小鼠中Aβ沉积减少(图13A-B)。硫磺素S染色显示AD模型下两组小鼠Aβ沉积的情况，可以看出SARM1抑制小鼠的海马和皮层中Aβ沉积都减少(图13C)。小胶质细胞对Aβ斑块有吞噬和清除作用，通过双重免疫荧光染色6E10和Iba1来分别显示Aβ斑块和小胶质细胞在皮层(图13D)和海马(图13F)的空间表达情况，并对Aβ斑块进行统计(图13E-G)。结果表明，与AD组SARM1-scramble相比SARM1-siRNA1小鼠中Aβ斑块沉积减少，而且斑块周边都伴随着小胶质细胞的聚集。

将SARM1-i-2 shRNA质粒和SARM1-i-3 shRNA质粒(250μg/kg)分别以肌肉注射的方式构建SARM1基因干扰的小鼠，进行试验例2的上述试验，试验结果同样验证了抑制SARM1基因能够使小鼠脑组织中的Aβ沉积减少。

由于目前已有的阿尔茨海默症药物疗效不佳，因此使用基因调节的方法在转录水平抑制SARM1的表达，结合其他治疗手段联合使用，以达到更好的治疗阿尔茨海默症效果。

本发明也可应用于其他系统疾病的诊断和药物开发靶点。凡针对以检测SARM1的表达来诊断，以及以降低或抑制SARM1的表达来进行疾病的治疗，均在本发明的保护范围。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种治疗阿尔茨海默症的药物，其特征在于，所述药物包括SARM1抑制剂，所述SARM1抑制剂为SARM1-i-1 shRNA、SARM1-i-2 shRNA或SARM1-i-3 shRNA，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

2. 一种SARM1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，所述SARM1抑制剂为SARM1-i-1 shRNA、SARM1-i-2 shRNA或SARM1-i-3 shRNA，所述SARM1-i-1 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述SARM1-i-2 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述SARM1-i-3 shRNA序列的正链和反链分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。