CN116057374A - 用于细胞的图案化和空间电化学标测的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于电评估和/或操纵细胞的装置。一方面涉及经由交叉电极阻抗测量在半导体衬底的表面上进行细胞的电标测。另外，根据一些方面，电极阵列使得能够使用CMOS电路实时地进行电信号的空间可寻址电刺激和/或记录。这些方面中的一些涉及使用电极阵列通过电化学气体产生和细胞外电化学标测来执行细胞图案化。

Description

用于细胞的图案化和空间电化学标测的系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求Park等人于2020年6月17日提交的标题为“Systems and Methods forPatterning and Spatial Electrochemical Mapping of Cells”的美国临时专利申请序列号63/040,439的权益，该美国临时专利申请通过引用全文并入本文。

背景技术

本公开涉及用于电评估细胞或其他生物样本的半导体器件。

发明内容

本文公开了用于电评估和/或操纵细胞的各种装置。一方面涉及经由交叉电极阻抗测量在半导体衬底的表面上进行细胞的电标测。另外，根据一些方面，电极阵列使得能够使用CMOS电路实时地进行电信号的空间可寻址电刺激和/或记录。这些方面中的一些涉及使用电极阵列通过电化学气体产生和细胞外电化学标测来执行细胞图案化。

一些实施例涉及一种用于标测一个或多个细胞的装置。该装置包括半导体衬底。所述半导体衬底包括：多个电极，所述多个电极在所述半导体衬底的表面处暴露；有源电路，所述有源电路耦接到所述多个电极并被配置为测量所述多个电极中的第一电极与其余电极中的一些或全部之间的第一组交叉电极电流，测量所述多个电极中的第二电极与所述其余电极中的一些或全部之间的第二组交叉电极电流。所述装置还包括一个或多个处理器，所述处理器被配置为从所述有源电路接收测得的交叉电极电流，并基于所述第一组交叉电极电流和所述第二组交叉电极电流来生成所述一个或多个细胞的标测。

在一些实施例中，所述有源电路还被配置为在所述多个电极中的所述第一电极处施加刺激信号，并且在正从其测量所述交叉电极电流的其余电极处施加参考电压。所述刺激信号可以具有小于10kHz且优选地在0.1kHz和5kHz之间的频率。所述多个电极可以被布置成具有小于30μm且优选地小于5μm的间距的阵列。所述半导体衬底可以包括硅。所述半导体衬底可以包括硅衬底，并且所述有源电路可以包括在所述硅衬底中的互补型金属氧化物半导体(CMOS)部件。所述多个电极可以包括部署在所述半导体衬底的绝缘表面上的多个焊盘。所述有源电路可以包括多个记录电路，每个记录电路被配置为测量所述多个电极中的电极处的电流。所述多个记录电路可以包括至少8个记录电路、至少10个记录电路以及优选地至少4000个记录电路。每个记录电路可以包括跨阻放大器(TIA)。TIA可以包括具有至少10MΩ、至少100MΩ或在10MΩ和1GΩ之间的电阻的阻抗部件，其中，所述TIA的输出电压与所述阻抗部件两端的电压成正比。所述阻抗部件可以包括开关电容器。所述一个或多个细胞可以部署在多孔板的第一孔中，并且所述多个电极可以是暴露于所述第一孔的第一电极阵列，并且所述装置还可以包括第二电极阵列，所述第二电极阵列暴露在所述半导体衬底的表面上，并暴露于所述多孔板的第二孔。所述多孔板可以包括至少24个、至少96个或至少384个孔。所述多个电极的大小可以被确定为使得不止一个电极被配置为与所述一个或多个细胞中的一个细胞接触。所述多个焊盘可以包括Au。所述多个焊盘可以包括Pt。

一些实施例涉及一种用于标测与部署在半导体衬底的表面区域上的电极阵列接触的一个或多个细胞的方法。所述电极阵列中的每个电极在表面区域上有电极位置。所述方法包括：针对所述电极阵列中的至少一个电极中的每个电极，在所述电极处施加刺激信号；测量所述电极与所述电极阵列中的其余电极中的一些或全部之间的一组交叉电极电流；基于所述一组交叉电极电流来生成与所述电极的电极位置相关联的代表值；以及基于所生成的所述代表值和所述至少一个电极的相应相关联的电极位置来生成所述表面区域上的代表值的图。

在一些实施例中，生成所述代表值包括选择所述一组交叉电极电流中的最大电流值作为所述代表值。生成所述代表值可以包括选择所述一组交叉电极电流中的最大电流值作为所述代表值。所述至少一个电极可以包括所述电极阵列中的所有电极。所述图的空间分辨率可以为20μm或更小且优选地5μm或更小。

在一些实施例中，所生成的所述图是在第一时间生成的第一图并且包括多个像素，并且所述方法还包括：在继所述第一时间之后的第二时间，在所述表面区域上生成所述代表值的第二图，其中，所述第二图包括多个像素；确定所述第一图中的具有预定范围内的代表值的像素的第一计数；确定所述第二图中的具有所述预定范围内的代表值的像素的第二计数；以及基于所述第一计数与所述第二计数的比较来确定细胞粘着特性。所述图可以包括多个像素，每个像素与代表值相关联。所述至少一个电极可以包括具有第一电极位置的第一电极和具有第二电极位置的第二电极，所述第一电极和所述第二电极在所述表面区域上彼此相邻，并且所述图可以包括分别与所述第一电极位置和所述第二电极位置对应的第一像素和第二像素。生成所述图可以包括确定与所述第一像素和所述第二像素之间的第三像素相关联的放大的代表值。确定所述放大的代表值可以包括：通过将当在所述第二电极处施加刺激信号时所述第一电极和所述第二电极之间的交叉电极电流I₁₂除以第一电流I₁与第二电流I₂的乘积来计算放大的电极电流，其中，I₁是当在第一电极处施加刺激信号时在全部其余电极处测得的交叉电极电流之和，并且I₂是当在第二电极处施加刺激信号时在全部其余电极处测得的交叉电极电流之和。所述图中的像素的数量可以多于所述电极阵列中电极的数量。所述电极阵列中的电极位置可以布置为多行多列。所述电极阵列可以具有M行N列，并且所述图可以具有至少3M×3N个像素。

一些实施例涉及一种用于标测一个或多个细胞的系统。所述系统包括：多个电极，所述多个电极在半导体衬底的表面区域处暴露；电路，所述电路部署在所述半导体衬底中，能被控制以在所述多个电极中的一个或多个电极处施加刺激信号和/或测量电流；至少一个非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质在其上存储有可执行指令；以及至少一个处理器，所述处理器由所述可执行指令编程以执行方法。所述方法包括以下动作：针对所述多个电极中的每个电极，控制所述电路以在所述电极处施加刺激信号；控制所述电路以测量所述电极与所述多个电极中的其余电极中的一些或全部之间的一组交叉电极电流；基于所述一组交叉电极电流来生成与所述电极的所述电极位置相关联的代表值；以及基于所生成的所述代表值和所述多个电极的相应相关联的电极位置来生成所述表面区域上的代表值的图。

在一些实施例中，生成所述代表值包括：选择所述一组交叉电极电流中的最大电流值作为所述代表值。生成所述代表值可以包括选择所述一组交叉电极电流中的最大电流值；以及基于作为所述代表值的所选择的所述最大电流值来计算阻抗。所述图可以包括多个像素，每个像素与代表值相关联。所述多个电极可以包括具有第一电极位置的第一电极和具有第二电极位置的第二电极，所述第一电极和所述第二电极在所述表面区域上彼此相邻。所述图可以包括分别与所述第一电极位置和所述第二电极位置对应的第一像素和第二像素，并且生成所述图可以包括确定与所述第一像素和所述第二像素之间的第三像素相关联的放大的代表值。

一些实施例涉及一种用于提供与在半导体衬底的表面上暴露的电极阵列的空间定位的电化学反应的方法。所述方法包括：选择所述电极阵列中的一个或多个电极；控制所述半导体衬底中的电路以在所述一个或多个电极处施加一个或多个刺激信号来在所述一个或多个电极处引发电化学反应。

在一些实施例中，所述电化学反应可以是在溶液中产生气体的半反应，并且所述一个或多个刺激信号可以包括高于用于产生所述气体的氧化还原电势的电势。所述溶液可以包括粘着到所述半导体衬底的所述表面的多个细胞，并且所述方法还可以包括：在所选择的所述一个或多个电极处产生气体，使得部署在所选择的所述一个或多个电极上的所述多个细胞中的至少一个细胞从所述半导体衬底的表面脱离。所述气体可以包括H₂、Cl₂或O₂。所述多个细胞可以是第一类型的多个细胞，并且所述方法还可以包括：在所述第一类型的至少一个细胞已从其脱离的位置处，在所述半导体衬底的表面上接种第二类型的一个或多个细胞。在一些实施例中，所述方法还可以包括：在所述至少一个细胞已从其脱离的位置处，在所述表面上标测所述多个细胞的再生长的时间序列；以及基于所述标测，确定所述多个细胞的生长速率。所述控制电路施加一个或多个预定电势可以包括在所选择的所述一个或多个电极处执行循环伏安法，并且所述方法还可以包括：利用所述电路，测量所述电极阵列中位于所选择的所述一个或多个电极之外的一些或所有其余电极中的每一个处的电特性的值；以及基于所述测量的结果来生成电特性的图。所述电特性可以是开路电势的特性。所述电特性可以是电流。所述电流的特性可以是循环电流的范围的最大程度。

在一些实施例中，控制电路施加一个或多个预定电势可以包括在所选择的所述一个或多个电极中的一个电极处施加脉动电压信号。在所述脉动电压信号内的第一部分期间，所述电极被氧化，并且在所述脉动电压信号的第二部分期间，所述电极上的氧化物被还原，并且所述方法还可以包括：利用所述电路，在所述脉动电压信号的所述第二部分期间，测量所述电极处的电流信号；基于所述电流信号的时间变化率，确定所述电极的位置处的氧浓度；以及基于所述确定的结果来生成氧浓度的图。所述一个或多个电势可以相对于参考电极的电势。

一些实施例涉及一种系统。所述系统包括半导体衬底。所述半导体衬底包括：电极阵列，所述电极阵列包括部署在所述半导体衬底的表面上的多个可独立寻址的电极；以及电路，所述电路能由一个或多个处理器控制以在所述电极阵列中的电极组处施加相对于所述电极阵列中的电极的电势或参考电极的电势的一个或多个电势，以在所述电极组处引发电化学反应。

在一些实施例中，所述电极阵列可以包括部署在所述半导体衬底的绝缘表面上的多个焊盘。所述多个焊盘可以包括Au或Pt。所述参考电极可以是Ag/AgCl参考电极。所述电极阵列可以包括至少1000个、至少4000个或至少1,000,000个电极，并且所述电路可以包括多个记录电路，每个记录电路被配置为测量所述电极阵列中的电极处的电流。所述多个记录电路可以包括至少10个记录电路或至少4000个记录电路。每个记录电路可以包括跨阻放大器(TIA)。所述TIA可以包括具有至少10MΩ的电阻的阻抗部件，其中，所述TIA的输出电压与所述阻抗部件两端的电压成正比。所述阻抗部件可以包括开关电容器。

一些实施例涉及一种用于提供空间定位的电化学反应的系统。所述系统包括：电极阵列，所述电极阵列在半导体衬底的表面区域处暴露；电路，所述电路部署在所述半导体衬底中并耦接到所述电极阵列；至少一种非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质在其上存储有可执行指令；以及至少一个处理器，所述处理器由所述可执行指令编程以执行一种方法。所述方法包括以下动作：选择所述电极阵列中的电极的图案；以及控制电路以在所述电极的图案处施加相对于所述电极阵列中的电极的电势或参考电极的电势的一个或多个预定电势，使得在所述电极的图案处引发电化学反应。

附图说明

将参考以下附图来描述各种方面和实施例。应该理解，附图不一定是按比例绘制的。在多个图中出现的物品在出现它们的所有图中都由相同的参考编号指示。在附图中：

图1a是根据一些实施例的半导体衬底的示意性侧视图；

图1b是图1a中示出的装置中的模拟电压分布的二维数据曲线图；

图1c是与图1b中示出的示例对应的模拟电场线的数据曲线图；

图2a是根据一些实施例的在不存在细胞的情况下具有半导体衬底的装置的示意性侧视图；

图2b是图示了在图2a中的电极阵列的一些电极上方部署细胞的场景的示意性侧视图；

图2c是图示了在图2a中的电极阵列之外以及在一些电极之间部署细胞的场景的示意性侧视图；

图3a和图3b图示了使用最大电流分布的细胞标测的示例；

图4A是图示了使用交叉电极电流的高分辨率放大标测的示例的示意图；

图4B是细胞-电路模型的示意性电路图；

图5a和图5b图示了与荧光显微镜图像相比的放大的交叉电极阻抗标测的示例；

图6a至图6c图示了使用交叉电极阻抗标测来量化细胞粘附的示例；

图7是一系列荧光显微镜图像和归一化交叉电极阻抗图；

图8a是没有添加四环素的情况下对照测量的归一化阻抗直方图；

图8b是MDCK细胞在6-7天体外培养(DIV)的归一化阻抗直方图；

图9示出了在不同频率刺激信号下的一系列归一化交叉电极阻抗图；

图10a图示了经由交叉电极阻抗测量的标测细胞及其随时间推移的粘着的示例；

图10b图示了测量细胞-细胞粘着的示例；

图11是图示了通过电化学气体产生进行的细胞图案化的示意图；

图12图示了细胞空间图案化和限定共培养物的示例；

图13A至图13D是图示了使用电极阵列进行的细胞图案化的变型的一系列示图；

图14示出了一系列荧光显微镜图像，图示了经由图案化来限定共培养物然后接种第二细胞类型的过程；

图15是一系列示意图，图示了异质细胞群、在选择的电极上使用图案化的电化学气体产生消除不期望的细胞以及在后续细胞生长之后期望性质的同质培养物；

图16图示了伤口愈合试验的示例；

图17a至图17d示出了论证透化技术的实验；

图18A至图18B图示了使用电穿孔协议的实验，其中使用Fluo-4 AM将Fluo-4注入到细胞中；

图19示出了一系列示意图，图示了使用空间寻址和经由气体产生的串行传递来生成控制和交叉效应传递；

图20a至图20b图示了细胞外电化学标测的示例；

图21a图示了表示随时间推移绘制的选择电极电压的数据曲线图；

图21b至图21c是热图，图示了针对一个周期的在阵列内绘制的开路电势的总量值；

图22a至图22b图示了细胞的电化学氧标测的示例；

图23a示出了图示可用于活细胞评估的三个参数的电成像的一系列示意图；

图23b是图示了封装在安装在显微镜下方的芯片顶部上以同时进行光学和电学测量的流体孔的图像；

图23c是图示了细胞和电极阵列的彩色显微镜图像；

图23d是图示了连接到示例性像素电路的电极的示意图；

图24a、图24b是图示了根据一些实施例的细胞-细胞连接性测量的一些附加方案的示意图；

图25a是图示了被配置为用于代谢状态测量的缓冲器的像素放大器的示意图；

图25b是示出了多参数测量结果的一系列数据曲线图；

图25c是接种后72小时的一对核荧光图像(顶部)和细节区域1比较(底部)，示出了与后缘相比，前缘上的细胞密度最低；

图25d是示出了覆在细胞核上的细节区域2和细胞粘着的复合图；

图26a是图示了在三种场景下电极阻抗的比较研究结果的一系列荧光图像；

图26b是图示了PtB降低了裸电极的Z_te测量值的数据曲线图；

图26c图示了不同频率下的细胞屏障图与参考的关系；

图26d示出了从荧光图像的核中提取的细胞密度和连接性的图；

图26e示出了在没有参考和有参考的情况下测量的Z_te之间的比较；

图26f示出了对照提取的细胞密度的Z_te和Z_s之间的比较。

具体实施方式

本公开涉及用于电评估和/或操纵细胞的各种装置。在一个实施例中，该装置包括具有与电极阵列电接合的互补型金属氧化物半导体(CMOS)电路的半导体衬底，电极阵列也可以使用CMOS兼容制造技术在半导体衬底的表面上制造并暴露于细胞。发明人已认识到并理解，通过使用半导体处理技术，可以以经济的方式制造电极阵列并将其与有源电路集成。此外，与使用比细胞尺寸大的电极相比，电极阵列中的电极具有小电极尺寸和电极-电极间距可以使得能够对多个细胞进行更高的空间分辨率评估。例如，与被细胞集合覆盖的大电极相比，当使用高密度电极阵列进行标测时，各个细胞可以是可区分的。另外，根据一些方面，电极阵列使得能够使用CMOS电路实时地进行电信号的空间可寻址电刺激和/或记录。这些方面中的一些涉及使用电极阵列通过电化学气体产生和细胞外电化学标测来执行细胞图案化。

一方面涉及经由交叉电极阻抗测量在半导体衬底的表面上进行细胞的电标测。发明人已认识到并理解，在两个电极之间测量的电阻抗或交叉电极阻抗可受到沿着电极之间的电流路径的阻抗的影响。因此，沿着电流路径的一个或多个细胞的存在可影响交叉电极阻抗，使得可以使用交叉电极阻抗测量来标测细胞。

图1a是根据一些实施例的半导体衬底的示意性侧视图。图1a示出了具有电极阵列106的装置100，电极阵列包括部署在半导体衬底102的表面104上的多个电极106_1、106_2、106_3...106_n。图1a图示了通过向第一电极(诸如106_1)施加电压激励并且测量在第二电极(诸如106_2)处的电流来进行交叉电极阻抗测量的示例。测量的电流(也被称为电极106_1和106_2之间的交叉电极电流)沿着与电极阵列106接触的介质108中的一条或多条电流路径109流动。电极106_1可以连接到刺激源电路110，并可以被称为刺激电极。电极106_2可以连接到电流测量电路112，并可以被称为记录电极。

可以使用本领域中已知的任何合适方法，例如，通过将刺激电压量值除以交叉电极电流量值，来从电极对之间的交叉电极电流和刺激电压的值获得电极106_1和106_2之间的交叉电极阻抗。可以提供从半导体衬底102内的有源电路接收信号并执行交叉电极阻抗确定的处理单元120。应该理解，不需要计算实际阻抗值，并且可以使用指示两个电极之间的阻抗的任何代表性测量值。作为计算阻抗值的替换或补充，如果刺激电压量值被编程为已知常数，则当比较不同电极处的测量值时，交叉电极电流可以被用作交叉电极阻抗的指标。

图1b是图1a中示出的装置中的模拟电压分布的二维数据曲线图，并示出了当向刺激电极106_1施加电压时，介质108中的电势沿着垂直方向(V)和横向方向(L)二者背离刺激电极106_1而下降。图1c是与图1b中示出的示例对应的模拟电场线的数据曲线图。图1c示出了从刺激电极106_1发出的电场线114沿着从电极106_1向上指向的线流动，横向地朝向记录电极(诸如记录电极106_2)弯曲，之后向下指向以终止于记录电极106_2。

细胞的存在可以改变电极之间的电场线114的形状和分布，进而导致交叉电极阻抗的变化，如以下关于图2详细讨论的。图2a是根据一些实施例的在不存在细胞的情况下的具有半导体衬底202的装置200的示意性侧视图。在图2a中，电极阵列206的电极206_0被配置为刺激电极，其中电场线214_1和214_2链接刺激电极206_0和记录电极206_1。图2b是图示了细胞220部署在图2a中的电极阵列的一些电极上方的场景的示意性侧视图。图2c是图示了细胞230部署在图2a中的电极阵列外部以及一些电极之间的场景的示意性侧视图。

发明人已认识到并理解，生物细胞具有在细胞周围形成连续膜屏障的脂质双层。在电方面，膜可以表现为与高电阻并联的电容器，并且与周围介质(诸如包含细胞的溶液)相比，可以具有不同的电阻抗。位于电极阵列顶部上的具有高阻抗膜的细胞随后将影响溶液(诸如图2a至图2c中的溶液208)中的电流分布。在图2c中，悬浮的细胞阻挡了溶液中的场线，并降低了电极之间的最近邻近耦接。相比之下，粘着到表面并覆盖刺激电极和记录电极二者的细胞将通过阻挡垂直场线来增加交叉电极耦接。

作为细胞对交叉电极阻抗的影响的示例，并且不希望受特定理论的约束，发明人认识到，如果如图2b中所示的细胞(诸如细胞220)粘附到表面204从而覆盖刺激电极206_0和记录电极206_1的部分或全部，细胞220将通过阻挡两个电极之间的电场线214_1和214_2垂直穿过溶液208来增加交叉电极耦接。结果是，与不存在细胞的图2中相比，抑制了较垂直的场线214_2并且加强了更多场线214_1’，从而导致电极206_0和206_1之间的阻抗降低。

另一方面，如果细胞没有粘附到表面204，或者如果细胞(诸如如图2c中所示的细胞230)粘附到表面204但在电极对206_0、206_2的外部并在其间横向地部署，细胞可以阻挡电极对之间的电场线214_3并减少电极206_0、206_2之间的交叉电极耦接。结果，电极206_0、206_2之间的交叉电极阻抗可以增加。

因此，可以使用交叉电极阻抗测量值来检测电极阵列上方的细胞的存在以及它是否粘附到表面。应该理解，粘附到表面的细胞在细胞膜的外部范围和表面之间可以具有不同程度的非零间隔。根据本申请的一些方面的装置可以提供对细胞粘附程度的检测。例如，较强的粘附性将更强烈地增加交叉电极耦接，因为在细胞和半导体衬底的表面之间沿着垂直方向的间隙距离较小。

交叉电极测量可以提供几个优点。例如，这种测量是非侵入性的，并可以在不影响细胞活力或电极的情况下重复进行。

在一些实施例中并且如以上关于图2b描述的，交叉电极阻抗技术测量由于细胞存在而抑制垂直电场线所导致的电极对之间的交叉电极耦接的增加，这与测量由于细胞存在导致的阻挡而造成的交叉电极耦接减少(或测得的阻抗增加)的技术形成对照。使用交叉电极耦接的增加作为检测细胞存在的指标的一个优点在于，该增加主要归因于彼此靠近的电极对，在某些情况下归因于电极对之间的最近的邻近耦接。因此，交叉电极耦接的增加(或测得的阻抗减小)可以与通过刺激电极流向电极阵列中的许多其余电极的总的本底电流分开。结果是，可以提高信号-背景比和细胞检测的灵敏度。

与交叉电极阻抗技术对比，发明人已认识到，在各个电极处测量的简单阻抗将无法检测到细胞的存在。在一个电极上进行这种测量时，所有返回电流的总和被测量为电极上阻抗的信号。即，这种测量只是电极的阻抗测量，而不是测量电极上的溶液中的电场的变化。结果是，发明人已观察到，电极本身的阻抗对细胞的存在不敏感，即使直接在其表面上培养细胞。

返回参照图1a，在一些实施例中，由刺激源电路110施加到刺激电极106_1的刺激信号是频率小于10kHz、小于5kHz、在0.1kHz和5kHz之间或在0.1kHz和2kHz之间的低频交流(AC)信号。选择低频刺激信号是因为细胞膜充当具有高电阻的并联电容器，并且在高频下，电容器阻抗将降低并致使细胞具有高导电性。发明人已认识到并理解，通过在低频下测量交叉电极电流可以为检测细胞粘附提供高的信号对比度。在下面的示例4中提供交叉电极阻抗测量的频率响应的示例。

仍参照图1，半导体衬底102可以包括有源电路116。有源电路116可以包括多个刺激电路110和多个记录电路112。在一些实施例中，刺激电路110可以包括一个或多个电流注入器、一个或多个电压源或其组合。有源电路设计的一些方面涉及用于生电细胞(electrogenic cell)的基于电流的刺激器和相关方法，如在特此通过引用全文并入的国际申请公开No.WO 2019/010343(代理人案卷号No.H0776.70105WO00)中公开的。一些方面还可以涉及用于分析生电细胞的电子电路和相关方法，如在特此通过引用全文并入的国际申请公开No.WO 2019/089495(代理人案卷号No.H0498.70647WO00)中公开的。在一些实施例中，有源电路可以包括用于使用电极阵列中的一个或多个电极作为工作电极和/或反电极(counter electrodes)来执行电流-电压测量的可编程电流注入器。

在一些实施例中，每个记录电路包括具有开关电容器作为阻抗部件的跨阻放大器(TIA)。阻抗部件的电阻为至少10MΩ(兆欧)、至少100MΩ(兆欧)或在10MΩ和1GΩ(吉欧)之间，以提供TIA的输入端处的记录的电流信号的放大，而TIA的输出端提供与记录的电流信号和阻抗部件两端的电压成正比的输出电压。

可以使用有源电路116将电极阵列106中的电极重新配置为刺激电极或记录电极。在一些实施例中，有源电路116包括可编程以将电极阵列106的选定电极连接到激励源电路110、电流测量电路112或其他电路部件以启用不同功能的路由和开关组件。根据应用，可以将不止一个电极配置为刺激电极，并且可以同时记录不止一个电极。例如，当使用交叉电极阻抗测量来标测局部细胞特性时，通常一次只有一个电极充当刺激电极。在一些其他实施例中，可以选择一个或多个电极的子集充当刺激或者施加一个或多个电势或电流以在选择的一个或多个电极的位置处引发电化学反应。将在以下关于细胞的细胞-细胞粘着测量、图案化和空间电化学标测的部分中更详细地讨论后面的实施例。

在一些实施例中，可以使用有源电路中的低阻抗源/回路将电极偏置。例如，可以使用低输出阻抗电压源在刺激电极处提供刺激信号，而可以提供低输入阻抗跨阻放大器在记录电极处进行电流测量。在这样的实施例中，每个电极可以选择性连接到用于刺激的电压源、用于电流测量的跨阻放大器、用于回路的电压源或用于同时进行刺激和电流测量的跨阻放大器。发明人已理解并认识到，低阻抗源/回路可以促成在如图1c中的示例中图示的溶液中形成边缘电场线。

半导体衬底102可以包括硅，并且在这样的实施例中，有源电路116可以是包括使用标准CMOS处理技术制造的CMOS部件的集成电路。电极阵列106可以部署在半导体衬底102内，例如，作为从半导体衬底102的面对介质108的表面104暴露的导体。在一些实施例中，表面104是绝缘表面，其向电极阵列106提供机械支撑和电隔离，同时还为细胞提供合适的表面以生长。虽然图1a示出了电极阵列106部分嵌入在半导体衬底102中，但这种布置仅是例示性示例而非要求。在一些实施例中，电极阵列106中的电极的顶表面可以在半导体衬底102的表面104的上方、与其垂直对准或在其下方。另外地或可替换地，电极的顶表面可以具有钝化层或功能化层。在一些实施例中，可以在电极顶部上的钝化层或功能化层中将孔图案化，以将电极的导电表面暴露于介质。

应该理解，半导体衬底102可以是使用半导体处理技术制造的任何衬底，并不限于硅晶片。例如，半导体衬底102可以包括IV族半导体、III-V族半导体、II-V族半导体、sp²杂化碳材料、硫族化物、金属、金属化合物、氧化物、氮化物、硅化物、聚合物材料或其组合。半导体衬底102可以是单一部件或多个部件的复合物。半导体衬底102中的部件可以包括有源电路层、布线层、重分布层、电路板或其组合。半导体衬底中的元件层可以在CMOS处理期间的附加处理中形成，或者可以使用本领域中已知的封装技术单独形成并彼此接合。在将有源电路116与电极阵列106互连的半导体衬底102中提供导体。在一些实施例中，连接点设置在半导体衬底的底表面处，用于将半导体衬底内的部件与处理单元120电接合。可以经由任何合适方式(诸如但不限于受控的塌陷芯片连接或倒装芯片接合、引线接合、柔性电缆或无线通信)提供处理单元120与半导体衬底102之间的电连接。

返回参照图1a。在一些实施例中，装置100可以进行操作以执行诸如标测或执行选择性电化学的方法。装置100的操作可以在程序控制下进行。在一些实施例中，装置100中的处理单元120可以包括带有存储介质21、存储器23和处理器25的计算机20，并且这样的处理可以在计算机20或任何其他计算设备中执行。存储介质21和存储器23可以是任何合适的非暂态计算机可读介质，诸如而不限于计算机存储器、压缩盘、光盘、磁带、闪存、现场可编程门阵列(FPGA)或其他半导体器件中的电路配置，或其他有形计算机存储介质。在一些实施例中，存储介质21可以是非易失性存储器，并且存储器23可以是易失性存储器。计算机可执行指令可以从存储介质21加载到存储器23，之后由处理器25执行，以执行贯穿本公开描述的方法中的一些或全部。然而，存储介质21与存储器23之间的区别不是关键的，并且在一些实施例中，可以存在任一者或二者。

处理器25可以是任何合适的处理设备，诸如而不限于一个或多个处理器、中央处理单元(CPU)、数字信号处理器(DSP)、控制器、可寻址控制器、通用或专用微处理器、微控制器、可寻址微处理器、可编程处理器、可编程控制器、专用处理器、专用控制器或其他任何合适的处理设备。处理单元120内的一些或所有部件可以被封装为片上系统(SOC)。此外，应该理解，图1a是处理单元120的示意图。处理单元120的实际实现方式可以具有分布式处理。例如，主机可以控制测量、标测和结果分析的总体流程。

现在转到电极阵列106。在一些实施例中，作为半导体制造工艺的一部分，电极阵列106可以在表面104上被图案化，以在半导体衬底102内形成有源电路116，并可以是包括金属(诸如Au或Pt或其合金)的导电焊盘。例如，焊盘可以由镀有Au作为顶层的Al形成。在这样的实施例中，衬底110可以另外包括将暴露的电极阵列14垂直地互连到衬底110内的电路的导体。

电极阵列106中的电极可以以任何合适布置方式(诸如沿着行列方向具有规则节距的二维阵列)布置在表面104上。在基于交叉电极阻抗的标测的一些实施例中，电极阵列的间距可以被选择为约典型细胞的大小或小于它，使得细胞可以覆盖至少两个电极，以增加细胞与至少两个电极之间的耦接。例如，当细胞的大小为约30μm时，电极阵列的间距可以被设置为小于30μm、小于20μm、小于5μm或在1μm至20μm之间。在电极之间提供小间距使细胞能够覆盖两个或更多个电极，从而允许经由在细胞下方的电极处的交叉电极耦接的增加来测量细胞-衬底间隙距离。

在一些实施例中，在CMOS兼容的制造工艺期间在包含CMOS有源电路的半导体衬底的顶部上制造电极阵列的情况下，可以通过考虑CMOS有源电路的间距和密度来选择电极阵列的间距和每个电极的大小。例如，在一些实施例中，在半导体衬底内可以设置至少8个、至少10个或至少4000个记录电路，并且电极阵列可以具有至少1000个或至少4000个或至少1,000,000个电极。在这样的实施例中，每个电极可以具有不超过10μm或不超过5μm的横向尺寸，使得电极阵列的整体横向范围被包含在半导体衬底的表面内。根据本公开的各方面的电极阵列也可以被称为CMOS微电极阵列(MEA)。

返回参照图1，介质108可以是细胞培养基，并可以是除了细胞之外还包括任何数量的化学和/或生物试剂的溶液。虽然在图1中未示出，但介质108可以包含在部署在半导体衬底102顶部上的容器中。在一些实施例中，容器可以是粘着到半导体衬底的多孔板的孔，其中一个或多个孔具有将孔的内容物暴露于半导体衬底的开放底部。半导体衬底可以包括不止一个电极阵列，使得多个孔中的电评估可以并行地进行。

可以用于生物医学或其他应用的CMOS兼容的晶片级多孔平台，以及操作它的方法。在一些应用中，在多孔阵列下方设置电路，以与孔中的电极电接合。该平台有时可以被称为CMOS-多孔平台。发明人已认识到并理解，为了与大阵列中的电极接合，可以在尺寸至少与多孔阵列的尺寸相同或比其大的单个硅(Si)晶片上制造电路。根据本公开的一方面，可以使用标准CMOS制造工艺，诸如已知在标准半导体制造厂中使用的工艺，例如，不用昂贵地定制复杂的制造过程，由此在某些情况下可以降低制作成本。根据本公开的一些方面的CMOS-多孔平台可以用于包括使用电气方法的电生理学研究和一般细胞评估的应用中和/或高吞吐量格式(例如，24、96和384孔板格式)。

在一些实施例中，Si晶片是半导体器件的一部分，并具有掩模版区域的阵列，其中掩模版区域中的一些或全部具有相同设计的多个电路。发明人已认识到并理解，在制造期间，在某些情况下，晶片的掩模版区域可以重复使用对于各晶片重复的相同光刻掩模设计，从而降低加工成本并增加晶片制造吞吐量。

根据一方面，当多孔阵列耦接在晶片顶部上时，掩模版区域内的数字和模拟电路可以被布置为对应于一个或多个孔。因此，一些实施例可以通过使用不切割晶片和/或与使用标准CMOS兼容技术的标准兼容以降低制造成本的制造方法来提供电接口与多孔阵列的晶片级集成。

本公开的一方面涉及一种使用交叉电极阻抗测量来标测细胞的空间分布和尺寸的技术。标测可以另外表示各个细胞的特性，诸如对半导体衬底表面的粘附。在一些实施例中，因为主要在刺激电极和附近记录电极之间的交叉电极耦接中局部地反映细胞的存在，所以通过首先选择单个电极作为刺激电极，并测量在整个电极阵列的位置处对照其他电极测量交叉电极阻抗数据的集合来执行标测。随后，选择不同的电极作为刺激电极，并测量新的一组交叉电极阻抗数据。通过在电极阵列中顺序地设置电极以施加刺激信号来重复交叉电极测量，并且随后可以处理对应的一组测量交叉电极阻抗数据，以生成针对刺激电极的每个位置指示是否存在细胞或细胞特性的强度的值。然后，可以组合经处理的值，以形成跨电极阵列区域的图。在一些实施例中，通过高分辨率原位阻抗和电化学测量来论证活细胞培养物的“电化学成像”。一些实施例涉及使用CMOS-MEA执行细胞生长动力学的无标记和非侵入性跟踪以及细胞-衬底粘着、细胞-细胞粘附和代谢状态的准确测量。

另一方面涉及提供使用图案化电极阵列的空间定位的电化学反应。利用电极阵列中的选定数量的电极，半导体衬底中的有源电路可以施加电势以在选定电极正上方的溶液区域中引发电化学反应。结果是，可以基于半导体衬底表面上选定电极的大小、形状和分布，在编程的空间图案处选择性执行电化学。

在一些实施例中，可以使用空间编程的电化学执行细胞图案化。例如，通过在电极上以电化学方式产生小气泡，可以从电极表面选择性去除粘附到电极的细胞。

在一些实施例中，可以使用电化学电极的阵列在空间上标测使用半导体衬底中的有源电路测得的分析物浓度。一种应用是使用氧化还原电化学对溶液进行电化学标测。

以下申请各自通过引用全文并入本文：Park等人在2020年6月17日提交的美国临时专利申请序列号63/040,439；Ham等人在2020年6月17日提交的美国临时专利申请序列号63/040,424；以及Ham等人在2020年6月17日提交的美国临时专利申请序列号63/040,412。此外，以下各自通过引用全文并入本文：在2021年6月16日提交的标题为“ComplementaryMetal-Oxide-Semiconductor(CMOS)Multi-Well Apparatus for Electrical CellAssessment”的PCT专利申请和在2021年6月16日提交的标题为“Apparatuses for CellMapping Via Impedance Measurements and Methods to Operate the Same”的PCT专利申请。

以下实例旨在说明本发明的某些实施例，但没有例示本发明的全部范围。

实例1：使用CMOS微电极阵列(MEA)和成像系统的实时细胞测量

该实例描述了可用于活细胞评估的三个参数的电成像(图23a)：细胞-衬底阻抗Zs(反映细胞粘着和细胞-衬底粘附)、跨膜阻抗Zte(反映细胞-细胞粘附以及细胞单层的完整性和屏障功能)和细胞外氧化还原电势Vredox(反映细胞代谢状态和呼吸作用)。

在该实例中，使用定制设计的CMOS IC，其在64×64＝4,096电极阵列上实现并行阻抗和电化学功能(图23b-d)。将流体孔封装在芯片顶部以培养细胞并安装在自上而下的荧光显微镜下方，以同时进行光学测量和电测量(图23b)。电极阵列安置在设备的中心，由针对单细胞或少数细胞分辨率(例如，图23c中的MDCK细胞)以20μm间距间隔开的8μm直径的Pt电极组成，并得到1.26×1.26mm²的总感测面积。用其行为类似于玻璃培养板的氮化硅来使表面的其余部分绝缘。与传统培养板相比，在设备上培养的细胞的生长或形态方面，没有观察到差异。对于长期测量，集成的温度传感器和加热器将细胞调节至35-37℃，并且将小型孵育室置于设备上方以将CO₂调节至5％。

阵列中的每个电极都连接到其自身的像素电路(图23d)，该像素电路是高度可配置的并经由数字接口进行编程。像素电路包括运算放大器，运算放大器可以被配置为用于电极电压Ve测量的缓冲器或被配置为用于电极电流Ie测量的跨阻放大器。像素电路配置的一些方面涉及用于生电细胞的基于电流的刺激器和相关方法，如在特此通过引用全文并入的国际申请公开No.WO 2019/010343(代理人卷号No.H0776.70105WO00)中公开的。一些方面还可以涉及用于分析生电细胞的电子电路和相关方法，如在特此通过引用全文并入的国际申请公开No.WO 2019/089495(代理人案卷号No.H0498.70647WO00)中公开的。

图23a是图示了使用用于活细胞评估的互补型金属氧化物半导体(CMOS)集成电路(IC)电测量的三个细胞参数的示意图，其中活细胞评估为：经由细胞-衬底阻抗Z_s评估细胞粘着、经由跨膜阻抗Z_te评估细胞-细胞粘附，和经由细胞外氧化还原电势V_redox评估代谢状态。每次测量都是非侵入式且快速的(<1分钟)，从而使每5至10分钟能够顺序地重复测量一次以进行实时调查。图23b是示出了荧光显微镜可以与封装的CMOS IC配对以同时进行光学细胞测量和电细胞测量的图片。参考电极Pt(示出)或Ag/AgCl也可以在该实例中使用。图23c是在CMOS电极阵列的顶部上培养的犬肾传代(Madin-Darby Canine Kidney,MDCK)上皮细胞的彩色荧光图像。64×64＝4,096个圆形8μm直径铂电极以20μm间距间隔开。铂黑(PtB)可以电沉积到电极上以降低电极阻抗，从而实现更高的信噪比Z_te测量。图23d是用于电极阵列中的电极的示例性电路的电路图。4,096个电极中的每一个经由屏蔽布线(约1至10毫米)连接其自身的外围电路。基于运算放大器的电路可以被配置为经由V_s施加电压并经由反馈电阻R_f(约100MΩ)测量电流，或者经由I_s施加电流并缓冲/测量电极电压V_e。运算放大器的输出V_amp被路由到芯片外，以进行模数转换。使用实时软件界面对交换机进行数字编程。

根据一些方面，该实例中的测量技术有高通道计数(4,096)、并联电流和开路电势测量的特征，其提供了优于其他MEA设备的独特优势。例如，在测量电极电容、利用用于阻挡DC信号的高通滤波器测量电压或利用少量通道(<32)测量电流的MEA设备中，防止了在该实例中描述的测量。

实例1A：使用最大电流分布的细胞标测

该实例描述了使用CMOS电极阵列标测细胞的技术，该CMOS电极阵列包含20μm间距的4,096个铂电极的64×64阵列。

发明人已认识到并理解，一对电极之间的交流(AC)阻抗测量可以使用绝缘细胞膜和导电培养基之间的对比来检测细胞。在经典的阻抗测量中，围绕细胞的溶液路径将测量分路并降低了检测灵敏度，因为测得的电极-电极电流的溶液贡献远大于由于细胞引起的电流的小变化。如本文公开的设备通过替代地测量由于细胞引起的电场分布变化来提高检测灵敏度。

将AC电压(1.9kHz频率，200mV量值)施加到一个电极，并且使用跨阻放大器通过其余的4,095个电极测量所得的AC电流。在图3a中图示了结果，示出了当不存在细胞时测得的最接近的11×11个记录电极到一个刺激电极311的电流分布热图301。在热图301中，每个像素对应于电极的位置。每个电极具有可以以多种方式表示的电极位置或电极地点，诸如但不限于坐标或像素数。热图302是测得的类似于热图301的电流分布，但在电极311的顶部上有细胞。阻抗测量是用1.9kHz信号频率进行的。

图3a中的测得的交叉电极电流相对于到刺激像素的距离的数据曲线图303表现出，与顶部上没有细胞的电极相比，在存在细胞时，与相邻电极的交叉电极耦合高出几乎一个数量级。

在该实例中，荧光核MDCK细胞系用于光学确认。图3b示出跨整个64×64电极阵列的荧光显微镜图像304，其中，较亮的像素表示指示存在细胞的荧光信号。为了生成与图像304相同区域的交叉电极阻抗图，跨阵列顺序地扫描刺激电极。对于每个给定的刺激电极，从作为记录电极的其余电极测量交叉电极电流值。收集所记录的交叉电极电流并确定最大值，该最大值被称为对应于给定刺激电极的最大电流值。图3b示出了使用从每个像素位置处的刺激电极确定的最大电流值(Ie)生成的跨电极阵列的热图305。

图3b还示出了作为最大电流信号309和核荧光信号307的选择区域1的重叠的图306，表示以单细胞分辨率标测细胞簇的能力。结果，该实例演示了使用核荧光标记确认细胞的存在，最大电流图与荧光成像之间的对应性强。

使用基于从记录电极测量的交叉电极电流的集合的任何合适方法，针对每个刺激电极位置确定最大电流值(Ie)。该确定可以是交叉电极电流的绝对算术值的简单比较，并且在比较之前可以另外地包括数据处理，诸如噪声滤波、背景消除或本领域中已知的任何合适的信号处理技术。可以在测得的电流值数字化之后并且使用图1a中所示的处理单元(诸如处理单元120)来执行电流值的处理和比较。

实例2：使用交叉电极电流的高空间分辨率标测

该实例描述了用于生成具有比电极阵列间距高的空间分辨率的交叉电极耦合的放大图的方法。

根据一些实施例，最邻近的交叉电极测量可以用于每个刺激电极。图4A示出了针对电极1至9中的每一个使用3×3阻抗网格的高分辨率放大标测的示例。在一些实施例中，在放大阻抗网格中可以跳过电极阵列的边缘处的电极，如下所述。

图4B是示意性电路模型，其可以用于针对施加AC刺激电压V_A和测量交叉电极电流I₁₂而计算细胞-衬底阻抗Z_s和跨膜阻抗Z_te。在针对每个电极提取单个Z_te时，针对Z_s计算使用3×3阻抗网格。

为了测量细胞-衬底粘着，形成交叉电极场的变化。作为在两个电极之间施加偏压的替代，从一个电极向所有其余电极施加偏压。这使得从刺激电极开始并延伸远至培养孔中的场线能够终止于远离刺激的电极上。否则，这些场线将需要朝向相邻电极向后卷曲，从而增加测得的与紧邻的细胞-电极界面不相关的电流的量。

可以使用横截面类型模型对界面进行建模，以增加空间分辨率。如果我们假定Z_s<<Z_te、Z_e,1和Z_e,2(根据某些方面发现其对于大多数测量是有效的)，则：

测得的交叉电极电流也可以用(式A1)的形式来编写和表示，

为了确定Z_e,1和Z_e,2，当向电极n施加刺激时，使用跨阵列测得的电流之和。

然后，可以使用测得的所有电流针对(A3)和(A2)求解Z_s，

为了生成Z_s的高空间图，针对每个刺激电极使用最近的邻近交叉电极测量：针对每个电极使用3×3网格(除了电极阵列的边缘处的电极之外)。参见图4A。这创建了190×190个像素的整体Z_s图像(与阵列中的64×64个电极相比)。

在图4A中示出的示例中，针对中心电极5的3×3网格405中的9个像素中的每一个，基于测得的到其最近的邻近电极的电流使用归一化阻抗值Z来填充。每个归一化阻抗值Z被计算为，

其中，V_AC是施加的AC电压的量值，I_xy是当向电极x施加AC信号时通过电极y测得的AC电流的量值，并且I_x[I_y]是当向电极x[y]施加AC信号时通过所有其他电极测得的AC电流的量值之和。然后，将边缘归一化阻抗值计算为

其中，确定2的平方根，以归一化边缘和角电极之间的距离差。然后，将中心归一化阻抗值计算为，

Z₅₅＝median(Z₅₂,Z₅₄，Z_s6，Z₅₈) (式3)

与使用电流分布的最大值相比，使用交叉电极电流不仅增加了有效的空间分辨率，而且还使得能够标测造成交叉电极电流减小的未粘附的细胞。

图5a和图5b示出了与荧光显微镜图像相比放大的交叉电极阻抗标测的示例。图5a示出了跨电极阵列的荧光显微镜图像501以及细胞培养物的恰在接种之后的归一化交叉电极阻抗的热图曲线502。热图502的一部分的放大图504示出了具有单细胞分辨率的未粘附细胞的交叉电极归一化细胞-衬底阻抗Zs的减小。与细胞未覆盖电极相比，恰在细胞接种之后的使得细胞没有粘附的标测表示较小的归一化阻抗值。

图5b示出了培养24小时之后的荧光显微镜图像505和交叉电极阻抗图506。图5b还示出了放大图507，其是选择区域处的荧光显微镜图像和交叉电极阻抗图的重叠。结果表明，许多细胞已粘附于表面，从而造成归一化的交叉电极阻抗急剧增加。

实例3：细胞粘附量化

该实例描述了使用交叉电极阻抗标测来量化细胞粘附的方法。

将乙二胺四乙酸(EDTA)施加于细胞。EDTA是去除整联蛋白所需的Ca²⁺以维持细胞粘附的钙螯合剂。施加EDTA，细胞在约50分钟的时间过程内快速脱离。然后，通过添加正常培养基来洗涤EDTA，其中细胞在约200分钟的时间过程内重新粘着。

使用交叉电极阻抗标测以高空间和时间分辨率捕获细胞的脱离和重新粘着，如图6a中演示的，该图示出了MDCK细胞的随时间推移的一系列的归一化阻抗图，其中在t＝约5分钟处施加5mM EDTA并且在t＝约55分钟处洗涤。

图6b是示出了如在图601中指定的细胞培养物的不同区域随时间推移的平均归一化阻抗的数据曲线图。图6cc是跨阵列洗涤EDTA之前、期间和之后的归一化阻抗值的直方图。

为了表示量化细胞粘附的生物学相关实例，测量经基因修饰的MDCK细胞系，其中使用四环素开启和关闭RasV12和GFP基因。在图7中示出了结果。图7是MDCK细胞在7天体外培养(DIV)中的一系列荧光显微镜图像和归一化交叉电极阻抗图。在2DIV测量之后添加四环素，以开启与癌症相关的基因RasV12，该基因还表达GFP使得可以对基因表达进行成像。然后，在4DIV测量之后去除四环素，以关闭基因表达。当RasV12基因被表达时，细胞表现为与表面的粘附较少，并在它被关闭之后恢复到正常。

RasV12是癌基因并且已知在被强烈表达时增加细胞代谢并减少细胞粘附，而这共同造成了癌症样细胞生长和肿瘤。最初，四环素被排除在培养基外并且细胞正常粘附。当引入四环素时，基因表达，从而造成GFP增加和细胞粘附降低。然后，去除四环素逆转细胞粘附，以造成细胞粘附更强，同时也降低了整体GFP表达；细胞培养物的某些部分没有像其他部分那样被强烈地关闭。如图8中所示，将对细胞粘附的影响与未引入四环素的对照培养物进行定量比较。图8b是MDCK细胞在6至7天体外培养(DIV)中的归一化阻抗直方图。在2DIV测量之后添加四环素，以开启与癌症相关的基因RasV12。图8a是未添加四环素的对照测量的归一化阻抗直方图。直方图已被归一化为高于约8kΩ的无细胞阻抗值的最大像素数。与对照相比，细胞粘附降低，表现出随时间推移的较小的下降趋势。

实例4：频率响应

该实例描述了在交叉电极阻抗测量中使用的频率的影响。

扫描标测频率来确定最佳频率，以使用交叉电极阻抗标测来测量细胞粘附。图9示出了在不同频率刺激信号下的一系列的归一化交叉电极阻抗图。这些图被归一化为中值+/-1标准偏差。较低的频率表现出与图7中所示的光学测量的GFP荧光相关的较高的信号对比度，这指示低频对于测量细胞粘附是更好的。所使用的1.9kHz与240Hz相比仍表现出良好的对比度，但在10kHz以上，细胞层看起来更加均匀。

实例5：细胞-细胞粘附

先前的实例涉及如何经由交叉电极阻抗测量来标测细胞及其随时间推移的粘附，如图10a中描绘的。在图10a中，向单个电极施加AC电压，并且使用跨阻放大器通过其余的电极阵列测量电流。粘附主要随细胞-衬底粘着以及所得间隙高度的变化而变化。

该实例描述了测量细胞-细胞粘着的方法或者细胞彼此间的连接程度如何。培养物中的细胞不仅粘着于表面，而且还经由细胞-细胞连接彼此粘着。这些连接的紧密性限定了细胞层的渗透性，并且对于充当身体表面、内部器官衬和其他组织的屏障的上皮组织而言是重要的。在该实例中，通过执行跨膜阻抗Z_te的标测来测量该屏障功能。以这种方式，可以使用仅被细胞覆盖的电极来评估细胞-细胞连接性以减少任何孔，同时还使得能够进行空间异质性评估。

在该实例中，刺激协议被修改以测量垂直场分量1014，如图10b中的示图中所示。在图10b中，电极1006_2及其周围电极1006_1、1006_3被AC电压偏置。通过中心电极1006_2测量电流Ie,n。因为中心电极1006_2被相同信号偏置，所以其将不使电流传递到周围电极，因此它将仅由于电极上方的细胞层的阻抗而传递电流。在中心及其周围电极的外侧，阵列的其余部分被偏置到地或参考电压电平，以充当电流回路。这种类型的测量类似于测量跨膜电阻(TEER)，TEER是使用悬浮多孔膜上细胞培养物相对侧的两个电极测量的。图10b中示出的技术使得能够跨电极阵列顶部上的细胞标测TEER，而不需要特殊的悬浮液。优点包括需要较少的细胞、评估空间异质性的能力以及使用同一设备将细胞-细胞和细胞-衬底粘附测量结合的能力。

图24包括图示了根据一些实施例的细胞-细胞连接性测量的一些附加方案的示意图。在图24中，测量电极上方垂直场的变化，以使用两种电路配置最好地隔离细胞-细胞连接的影响：1)对照参考的快速(<1s/测量)平行电极测量(图24a)，以及2)没有参考的慢速扫描(40s/测量)相对测量(图24b)。快速测量对于跨多个频率扫描是理想的，而扫描的测量不需要参考，其有助于使长期测量更加稳定并且对于设备小型化更加理想。对于两种类型的测量，铂黑(PtB)沉积可以可选地用于将Z_e降低约5倍以改善Z_te灵敏度。跨频率的实验表明，约2kHz至5kHz的中频对于评估细胞-细胞连接性是最佳的。

现在，在下面讨论使用图24中的方案计算跨膜阻抗Zte。

在图24a、图24b中，为了测量细胞-细胞粘附或者细胞彼此间的连接程度，可以修改刺激协议以测量垂直场分量。通过向所有电极施加AC电压，对照接地参考(左侧)进行测量，经由跨阻放大器测量每个跨膜电极电流I_te,n(n＝1、2、…4096)(测量持续时间1s/频率)。所得的场分布与细胞的连接性垂直对准，从而减小I_te。通过向电极(n)及其邻近电极施加AC电压以在其余电极接地的情况下创建有效的垂直场测量，可以进行非参考测量(右侧)。为了生成细胞图，跨阵列扫描所施加的信号(每次扫描40s/频率)。

在图24a中的平行方案中，对照参考向每个电极施加AC电压，测量每个电极的电流I_te,n，从而在溶液中创建垂直场，外围电极也将具有针对低频的边缘场。由于电流随后需要经过细胞层，电流的量值将与跨膜阻抗Z_te成比例。第二扫描方案(图24b)用AC电压偏置电极及其周围电极，并测量仅通过中心电极的电流。因为中心电极被相同信号偏置，所以其将不使电流传递到周围电极，因此它将仅由于电极上方的细胞层的阻抗而传递电流。在中心及其周围电极的外侧，阵列的其余部分被偏置到地，以充当电流回路。

在任一种情况下，测得的垂直电流I_te,n可以表示为，

使用(A3),可以求解Z_te，

对于测量，确定约1-5kHz的中频与细胞-细胞连接性最佳相关(参见下面的实例15)。对于PtB电极，Z_e,n随后充分小于Z_te(也参见下面的示例15)，使得估计：

对于仅用到Pt电极的Z_te实验，减去来自细胞-衬底阻抗的I_n测量值。由于扫描阵列测量来使用3×3组电极来计算Z_{te,no ref}，因为外围电极没有邻近的偏置电极来创建垂直场，所以产生的总图为62×62个像素。对照参考的测量创建了包含64×64个像素的图。

实例5A：经由细胞外氧化还原电势V_redox进行标测的代谢状态

除了阻抗测量之外，铂电极还用于氧气的电势感测和细胞外氧化还原监测二者。该实例表明，可以使用活细胞正下方的Pt电极的毗邻位置来原位标测细胞外氧化还原电势V_redox以监测细胞的氧化还原环境，甚至还可以使用O₂消耗来标测出细胞培养物的代谢状态。

为了完成测量，像素放大器被配置为缓冲器，如图25a中的示意图中所示。

通常，在有氧代谢过程中，细胞使用由电子从可氧化有机分子(例如，葡萄糖)向O₂移动而产生的能量。为了有助于调整这些电子流，常见还原环境由常常被视为细胞氧化还原缓冲物的硫醇-化合物谷胱甘肽(GSH)来创建。在简化的术语中，细胞的氧化还原电势随后是上拉电势(氧化)的O₂与下拉电势(还原)的GSH之间的平衡。氧化还原环境不仅对于电子转移是重要的，而且对于中和有害的活性氧自由基、细胞-细胞信令和细胞状态调节也是重要的。例如，在从负到正的范围内，氧化还原电势可以确定细胞是否处于增殖、分化、凋亡或坏死状态。

图25b是示出了多参数测量结果的一系列数据曲线图。在MDCK细胞接种之后的+24、+48和+72小时执行测量，包括细胞粘着(顶部)、细胞-细胞粘附(中间)和代谢状态(底部)。细胞表现出从右下侧到左上侧的生长，其中，与更休眠的后缘相比，增殖的前缘细胞增殖表现出最负的V_redox。Z_te在前缘也是最高的，因为细胞密度最低(参见细节区域1)，因此细胞-细胞连接最少。图25c是接种之后的+72小时的一对核荧光图像(顶部)和细节区域1比较(底部)，其示出了与后缘相比在前缘上的最低细胞密度。图25d是示出了覆盖细胞核和细胞粘着的细节区域2的合成图。图25d示出了与单细胞分辨率的良好空间对应关系。

该实例的一个目标是通过将其与用于监测细胞生长的阻抗技术配对来研究接近V_redox可以提供什么信息(图25b)。在该实例中，与没有细胞的电极相比，对于带有细胞的电极，观察到30mV至80mV范围内的负V_redox(图25b)。从详细区域比较来看，V_redox的空间信息与细胞粘附或细胞屏障有区分且不同，其中，最负的V_redox位于前缘而不是最低密度。一般而言，负信号可以指示在细胞附近局部较小的[O₂]或局部较高的[GSH]。

为了进一步探索V_redox信号起源，通过氧吹扫在单独的MDCK细胞培养物上测试O₂依赖性。在去除O₂后，有细胞和没有细胞的区域之间的信号差异被消除。为了补充，经由氧化滴定测试基于GSH的还原能力。选择铁氰化物[Fe(CN)6]^3-进行滴定是由于其先前在细胞培养物中的无毒使用以及其与细胞环境相比的氧化半细胞电势。培养基表现出4μM的还原能力，而细胞具有>200μM的大得多的容量。

总之，这些测量表明，测得的V_redox与细胞的原位[O₂]和基于[GSH]二者的还原能力相关。可推理，在有氧呼吸作用下，[O₂]从其在大气条件下的正常溶解浓度(约200μM)降低，这使V_redox降低，直到其受到细胞的细胞外还原电势的调节。因此，尽管用我们的技术难以量化耗氧率，但细胞外氧化还原电势的V_redox测量结果可以用于监测细胞的代谢状态，因为它可以显示O₂的使用量和细胞的还原环境。因此，细胞层前缘上的较负的信号(图25b)归因于呼吸与增殖状态(细胞的最负的氧化还原电势状态)相结合。

实例6：抗体-细胞结合

对于抗体-细胞结合的筛选可以是低吞吐量的，因为需要对抗体进行荧光标记，其需要洗涤步骤来去除未结合的荧光抗体或者需要特殊光学测量，诸如表面等离子体共振(SPR)。根据一方面，本文描述的交叉电极阻抗技术可以提供通过细胞-衬底或细胞-细胞粘附测量来测量抗体-细胞结合事件的能力。随着抗体结合在细胞下侧，间隙距离有效地变小，从而导致测得的交叉电极电流的量减少。同样，随着抗体结合到细胞侧面，细胞-细胞的间隙距离也应该变小，从而导致测得的垂直电流的量减少。若能够在没有标记的情况下执行这种抗体结合，则使得能够在不需要洗涤步骤的情况下按顺序添加不同的抗体，从而大幅提高吞吐量。

实例7：通过电化学气体产生的细胞图案化

该实例描述了一种在电极阵列顶部将细胞图案化的方法。发明人已认识到并理解，可以以电化学方式产生小气泡，以在细胞膜上产生小孔，从而通过去极化杀死细胞。在死亡后，细胞将从表面脱离，如图11中的示意图中图示的。因此，通过控制哪些电极产生气体，可以利用电极阵列的空间分辨率将细胞图案化。

不希望受特定理论的束缚，本发明人认识到，对于大多数惰性电极材料(铂、金等)，可以通过将电极电势调整到低于氢离子/氢气氧化还原半细胞还原电位(E⁰)来产生氢气，

或者可以通过将电极电势调整为高于氧气/水氧化还原电势来产生氧气，

同样，由于大多数细胞培养基含有氯化物盐，因此也可以通过将电极电势调整为高于氯气/氯化物氧化还原电势来产生氯化物气体，

因此，可以通过选择性施加高于氧化还原电势的预定电势以在一个或多个电极位置处产生气体来执行细胞去除。可以例如通过将图1a中的一个或多个刺激源电路110连接到所选择的电极来施加电势。对于所有选择的电极，电势不需要是相同的，并且当电极被不同地偏置时，可以使用可编程的异质性。电势可以是相对于电极上方的基质中的参考电极的电势的电势。

为了更可控地图案化，可以使用电极电流来设置电子传递速率，进而设置气体产生速率。控制气体产生速率可以优化选择性电化学反应，因为使用过快的气体产生速率可在表面上形成大气泡，从而阻挡电极接触溶液。

图13是图示了使用电极阵列的细胞图案化变化的一系列图。图13a和图13b图示了向所选择电极施加一个或多个预定的图案化电压以通过电化学气体产生将细胞图案化去除的实施例。图13c和图13d图示了向所选择的电极施加一个或多个预定的图案化电流以将细胞图案化去除的实施例。图13a和图13c图示了将参考电极充当回路的电压/电流图案化的示例。图13b和图13d图示了使用交叉电极气体产生而不使用参考电极的差分电压/电流图案化的示例，其中，正电流经过一组电极并且负电流经过第二组电极(回路)。

实例8：细胞空间图案化和限定共培养物

该实例描述了细胞的空间图案化和使用电极阵列的共培养物限定。

在该示例中使用如图12中所示的CMOS电极阵列、MDCK细胞和H₂气体产生。在该实验中，通过对照Ag/AgCl伪参考电极向铂电极施加-1.25V来产生H₂气体。图12示出了施加图案化电压80秒之前(中间)和之后(右)的荧光显微镜图像，并示出了基于电极图案成功地限定细胞中的图案。在电极间距为20μm的情况下，在具有高空间分辨率的均匀细胞层上制成各种大小的方孔，如使用细胞核荧光标记和荧光成像确认的。

图14示出了图示了经由图案化然后接种第二种细胞类型来限定共培养物的过程的一系列荧光显微镜图像。通过不同的核荧光标记来区分细胞类型。在图14中的实验中，通过在初始图案化之后用不同的细胞核荧光标记物接种第二MDCK细胞系来限定两种不同细胞类型的共培养物。第二种细胞类型被填充在产生的空间中，表现出以高空间分辨率在空间上限定共培养物的能力。还可以执行进一步的图案化和接种，从而以自下而上的方法限定多个细胞共培养物和图案。

实例9：通过消除培养物异质性的定向细胞进化

该实例描述了从细胞培养物中消除其特性并不期望的细胞的定向细胞进化的方法。

图15是图示了异质细胞群、使用在选择电极上产生图案化的电化学气体来消除不期望的细胞以及在后续细胞生长之后所期望特性的同质培养物的一系列示意图。可以经由光学成像或者经由使用电极阵列测得的其他特性来选择消除哪些细胞。从培养物中消除细胞而不必从培养板中去除的能力优于当前方法，当前方法将需要悬浮细胞并使用细胞分选机分离(有进一步的重新接种步骤以再次培养)，或者使用微量移液管去除具有所期望性质的单细胞，然后重新接种。此外，因为每个细胞的空间位置因细胞在该过程期间保持粘附而不改变，所以细胞历史的世系可以保留。这种消除过程也可以用于在培养电极阵列之后对细胞子集执行进一步分析，其中，在细胞悬浮和去除之前，首先杀死不想要进一步测量的细胞。

实例10：伤口愈合试验

该实例描述了交叉电极阻抗标测和细胞图案化二者的组合应用是伤口愈合试验。

这些试验测量了细胞生长速率和代谢，并且可以用于筛选影响这些参数的药物。与本文描述的电化学图案化相比，其他工具经由机械刮擦在细胞培养物中以机械方式产生伤口，在伤口图案化方面这既难以控制又受到限制。

在该实例中，在MDCK细胞中形成伤口，然后实时地标测生长。图16示出了在设备表面的中心限定的细胞中具有不同分离距离的锯齿状图案。这些图案是通过对照Ag/AgCl伪参考电极施加-10nA的电极电流40s来限定的。然后，使用阻抗标测方法测量培养物的再生长。典型的细胞培养物耗时约3天来填充在伤口中，而带有生长抑制药物的培养物表现出极少的再生长。如图16中归一化的交叉电极阻抗图所图示的，对照培养物在培养物中72小时之后表现出再生长。使用减缓生长的药物(细胞松弛素B(1μM))进行的第二培养物在72小时的过程内表现出非常小的生长，这演示了试验用于药物筛选的能力。

实例11：分子输送

该实例描述了使用平面电极进行膜透化和分子输送的技术。与施加集中的电场来分解细胞膜的电穿孔不同，平面电极透化经由气泡形成来工作，在概念上类似于本文讨论的图案化技术。与杀死细胞以执行图案化的图案化细胞不同，对于分子输送，在细胞上形成之后将随时间推移重新密封的较小的孔。

图17图示了演示了使用纳米线电极的透化技术的实验，而该技术的一些方面也可以使用利用平面电极的电极阵列来应用。在图17中示出的实验中，进行活体测定，将Fluo-4溶解在细胞外溶液中(左图，图17a)。使用像素刺激器(中间图，图17a)将电穿孔方案应用于纳米电极，并使其在Fluo-4中恢复。如果成功电穿孔，则Fluo-4渗透到细胞中。在回收之后，进行死亡测定，将EthD-1溶解在细胞外溶液中，以揭示细胞是否由于不可逆电穿孔而死亡(右图，图17a)。成功电穿孔并回收的细胞保留Fluo-4进行成像。图17b示出了热图，该热图示出了用HEK 293细胞执行的增加电压量值的八种研究协议(20Hz下的5个双相脉冲的3列)的平均EthD-1和Fluo-4强度。对于八种协议中的每一种，CNEA阵列被划分成128个像素的子组，并在跨阵列的网格中重复。对每个像素执行成像，并且将每种协议的128个图像一起求平均。图17c示出了针对HEK 293细胞的图17b的平均强度结果。成功的电穿孔被视为从约1.3V开始，而不可逆的电穿孔从约1.7V开始。图17d示出了相同测试条件下神经元的结果，对于成功的电穿孔，较低阈值为<1.2V，而对于不可逆的电穿孔，较低阈值为约1.5V。

图18图示出了使用Fluo-4 AM将Fluo-4注入到细胞中的另一实施例。在监视荧光的同时，使用像素刺激器(中间)将电穿孔协议应用于纳米电极。如果被成功电穿孔，Fluo-4能够流出细胞，从而造成荧光降低。对于成功的协议，细胞膜在电穿孔之后恢复(图18a，右图)。图18b图示了使用神经元及其荧光和施加的电穿孔信号的实例。在电穿孔期间，荧光下降。紧接在此后，细胞膜恢复并造成荧光稳定。可以多次施加电穿孔信号而不影响细胞活力。

在图17和图18中示出的两个实验中，观察到电压信号需要具有一定的持续时间(至少>50ms)，以看到任何透化/输送。这表明需要法拉第过程来产生气泡，因为所需的电压也与使用铂电极的水窗口电压(经由水分解产生H₂和O₂气体)相当。在图18中，这种透化信号被示出为通过造成荧光染料瞬时泄漏而有效，而在图17中，荧光染料被输送到细胞。

这种输送能力可以容易地用于针对膜不可渗透化合物对细胞和细胞-细胞相互作用的影响来筛选它们。在细胞-细胞相互作用的该后一种应用中，可以选择细胞进行输送的电极阵列的空间能力可以是有用的，其中可以针对化合物的影响来测量输送的细胞及其未输送的邻近物。在没有这样的输送能力的情况下，膜不可渗透化合物原本会需要化学改性以便输送，这是昂贵且耗时的，或者使用基于单细胞的微量移液管输送，这也是昂贵且耗时的。除了化合物之外，还可以输送RNA/DNA/质粒来应用于合成生物学。

实例12：交叉效应分析的串行输送

该实例描述了使用电极阵列在细胞中多步输送化合物。

图19示出了一系列示意图，说明了经由气体产生使用空间寻址和串行输送来产生控制和交叉效应输送。由于电极的特性在气体析出期间没有被改性，因此结合可寻址电极的空间能力提供了交叉化合物效应筛选的进一步优势。例如，如果期望针对两种化合物对细胞的影响来研究它们，只需要两个化合物输送步骤来形成完整的药物效应矩阵。

实例13：细胞外电化学标测

该实例描述了在电极阵列上使用氧化还原电化学的电化学标测。

使用电极对细胞的电化学测量可以使用单个大的工作电极来测量溶液中分析物的本体浓度。这种基于电化学电极的测量包括用于溶解的氧浓度测量和氢离子浓度(pH)测量的Clark电极。根据本公开的一方面，电化学电极的阵列可以用于对经由CMOS集成电路内的电子器件测量的分析物浓度进行空间标测。然后，这种电化学标测可以应用于直接在电极阵列顶部上培养的细胞的细胞分析。

在该实例中，为了演示使用利用CMOS集成电路测量的电极阵列进行电化学标测的能力，使用铁氰化物/亚铁氰化物的常见氧化还原对[Fe(CN)₆]^3-/[Fe(CN)₆]^4-执行循环伏安法。

图20a是示出了循环伏安法配置的示意图，该配置使用CMOS集成跨阻放大器测量每个Pt电极的电流并且使用外部跨阻放大器测量通过Ag/AgCl伪参考电极的电流。在图20a中的实验中，用1.5M KCl+5mM K3[Fe(CN)6]以35mV/s的扫描速率施加循环电压斜坡。13×13个电极的电流之和用于测量，其等于参考电极的电流之和。图20b示出了与铁氰化物(起始反应物)的扩散相关的电极电流的最大范围(|I_e,max–I_e,min|；左上)以及与亚铁氰化物扩散(产物)相关的电流的最大范围减去最大/最小电压电流(|I_e,max–I_e,min|–|I_e,vmax–I_e,vmin|；左下)的两个空间图。在限定了这些参数的情况下，在右侧的图20b中示出了实例的各个电极记录。亚铁氰化物的非径向扩散归因于溶液中的对流效应。

在该实验中，64×64电极阵列的子集13×13＝169连接到相同数量的相应跨阻放大器，并施加循环线性电压斜坡，如图20a中的示意图中图示的。图20b示出了电流密度的空间图，该空间图示出了电极边缘上阴极和阳极电流量值的增加，其可归因于与中心电极的平面扩散相比边缘的径向扩散/质量传输的增加。同样，产物的产生限制了由峰值电流范围减去电压最大/最小电流范围而可视化的电流密度，如图20中的数据曲线图2001中图示的。循环伏安数据曲线图2001示出了产物朝向右上角扩散的趋势。这种电流的空间测量示出了基于电流的电化学标测的能力。

也可以使用电极的开路电势来测量溶液中化学物质的浓度。对于溶液中高浓度的氧化还原偶，铂电极在溶液中的开路电势可以由能斯特方程来确定。能斯特方程将电化学反应的还原电势与标准电极电势、温度和经历还原和氧化的化学物质的活性相关联，

其中，E_H是相对于标准氢电极(S.H.E)的电极电压电势，E⁰是半细胞还原电势，

是热电压(25℃下约25.7mV)，[Ox][Red]是氧化/还原的化学物质的浓度，并且n是细胞半反应中输送的电子的数量。对于铁氰化物/亚铁氰化物反应，开路电势的测量接着反映了溶液中这些离子的浓度比。

在该实例中，测量电极阵列的其余部分的电势。特别地，使用开路电势来标测亚铁氰化物的产生和跨CMOS电极的传输。

向一组13×13个电极施加循环电势(13×13个电极的组内排除了9个电极，如图21b中图示的)，同时测量其余电极的开路电势。图21a是示出了随时间推移绘制的选择电极电压V_el的数据曲线图，其示出了与铁氰化物/亚铁氰化物浓度相关的增加和减少。图21b是图示了针对一个周期跨阵列绘制的开路电势的总量值(最大值减去最小值)以表现趋向左上角的扩散/质量传输的热图。图21c示出了图示对照与13×13个电极的中心的距离绘制的开路电势的最少时间的热图和数据曲线图，表现了扩散/质量传输的瞬态方面。

总之，对于循环伏安法，测量电极周围的开路示出了亚铁氰化物朝向设备右上角的流动。

实例14：细胞的电化学氧标测

该实例描述了将电化学标测应用于细胞分析的技术。例如，可以通过施加用于顺序地氧化然后还原铂的脉动电压或电压脉冲序列来测量基于铂的Clark电极。由于氧化铂阻挡了氧还原，因此在氧化物形成之后电流下降至零。当氧化物随后被还原时，由于氧的存在，负电流经过铂电极，

然后，消耗局部氧浓度，并且电极等待另外的氧进一步扩散到电极以使电流经过。因此，方程的速率受氧扩散的限制，该氧扩散与溶液中的氧浓度成正比，并且可以通过测量电极电流来测量。

在使用电极阵列的实验中，使用暴露于环境空气的盐溶液(磷酸盐缓冲盐水)执行测量，随后用氮气吹扫，以降低氧浓度。图22a示出了施加到电极阵列中的刺激电极的电压脉冲序列2202以及在环境空气中使用CMOS电极阵列的测量的一系列数据曲线图2204，分别进行部分氮气吹扫和部分恢复(N₂吹扫停止)。数据曲线图2204示出了电极电流反映氧浓度。

比较吹扫前后的电流I_el表现出显著的降低。然后，用HEK293细胞执行实验，并且结果在图22b中示出。图22b示出了使用电极阵列区域内的交叉电极最大电流I_max的交叉电极阻抗热图2206以及电极阵列区域上方的电极电流ΔI_el的变化的热图2208。用HEK293细胞进行的相同样式的氧测量表现出细胞所处位置的氧浓度降低，如用阻抗图确认的。

细胞消耗氧气作为有氧代谢的一部分，因此细胞周围的氧气浓度小于没有细胞的地方。实际上，如使用交叉电极阻抗图成像的，标测跨阵列的电极电流表现出细胞的位置的电流量值比没有细胞的地方小。图2208的左边缘和底边缘也表现出更大的电流量值，这归因于边缘效应和增加的扩散/质量传输。

实例15：铂黑和频率对细胞屏障灵敏度的影响

在该实例中，使用铂黑(PtB)降低电极阻抗Z_e，以提高细胞屏障测量灵敏度。图26a示出了针对约72小时培养的细胞的电极阻抗与低密度、高密度和没有细胞这三种情况下的电极的比较研究结果。图26b是图示了PtB将裸电极的Z_te测量结果降低约5倍从而使得能够在较高的信噪比情况下测量两种不同密度的细胞-细胞连接的数据曲线图。图26c图示了在不同频率下对照参考的细胞屏障图。当与从成像中提取的密度图相比时，较低的频率测量结果表现出更多的扩展并且不捕获细胞层边缘，但1.8kHz测量结果表现出细胞连接测量的最高对比度。图26d示出了从荧光图像的细胞核中提取的细胞密度和连接性图。图26e示出了在1.8kHz下没有参考和有参考的情况下测量的Z_te之间的比较。在没有参考的情况下测得的Z_te略微更小，但对于有细胞和没有细胞的区域(两个簇)，关系是直接的。因为可以容易地从细胞-衬底粘着测量结果中减去Z_e贡献，所以没有参考的测量是优选的。图26f示出了对照细胞密度的Z_te和Z_s之间的比较。对于该比较，经由双线性插值对Z_s进行下采样，以具有与Z_te测量结果相同的空间分辨率。由于细胞屏障测量结果是针对细胞-细胞连接性，导致细胞屏障对细胞密度的依赖性更强。Zs与细胞密度之间的相关性同样小，这可以在细胞-电路模型(图4B)中视为在Z_s高时有影响，并且在Z_s计算中使用的关于Z_s<<Z_te的假定不再成立。

因此，已描述了本发明的至少一个实施例及其实例的几个方面，要理解的是，本领域的技术人员将容易地想到各种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在成为本公开的一部分，并旨在属于本发明的精神和范围。另外，尽管指示了本发明的优点，但应该理解，并非本文描述的技术的每个实施例都将包括所描述的每个优点。一些实施例可以不实现本文描述为有利的任何特征，并且在某些情形下，可以实现所描述特征中的一个或多个以实现其他实施例。因此，前述描述和附图仅是作为示例。

本发明的各个方面可以被单独地、组合地或以在前面描述的实施例中未具体讨论的各种布置使用，因此，其应用不限于在前面描述中阐述或在附图中图示的部件的细节和布置。例如，在一个实施例中描述的方面可以以任何方式与在其他实施例中描述的方面组合。

另外，本发明可以被实施为已提供其实例的方法。作为该方法的部分执行的动作可按任何合适的方式排序。因此，可以构造实施例，其中以与所例示不同的次序来执行动作，可包括同时执行一些动作，即使在例示实施例中被示出为顺序的动作。

在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素的任何优先级、位次或顺序超过执行方法中的动作的另一个或时间顺序，而是仅仅用作标签来区分具有某个名称的一个权利要求元素与具有相同名称(只是使用了该序数词)的另一个要素以区分权利要求元素。

术语“大致”和“约”可以用于意指在一些实施例中目标值的±20％内、在一些实施例中目标值的±10％内、在一些实施例中目标值的±5％内以及在一些实施例中目标值的±2％内。术语“大致”和“约”可以包括目标值。

Claims (22)

1.一种用于提供与在半导体衬底的表面上暴露的电极阵列的空间定位的电化学反应的方法，所述方法包括：

选择所述电极阵列中的一个或多个电极；以及

控制所述半导体衬底中的电路，以在所述一个或多个电极处施加一个或多个刺激信号来在所选择的所述一个或多个电极处引发电化学反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电化学反应是在溶液中产生气体的半反应，并且其中，所述一个或多个刺激信号包括高于用于产生所述气体的氧化还原电势的电势。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述溶液包括粘着到所述半导体衬底的所述表面的多个细胞，并且所述方法还包括：

在所选择的所述一个或多个电极处产生气体，使得部署在所选择的所述一个或多个电极上的所述多个细胞中的至少一个细胞从所述半导体衬底的表面脱离。

4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中，所述气体包括H₂、Cl₂或O₂。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中，所述多个细胞是第一类型的多个细胞，并且所述方法还包括：

在所述半导体衬底的表面上在所述第一类型的至少一个细胞已从其脱离的位置处，接种第二类型的一个或多个细胞。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，所述方法还包括：

在所述表面上在所述至少一个细胞已从其脱离的位置处，标测所述多个细胞的再生长的时间序列；以及

基于所述标测，确定所述多个细胞的生长速率。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，控制电路施加一个或多个预定电势包括在所选择的所述一个或多个电极处执行循环伏安法，并且所述方法还包括：

利用所述电路，测量所述电极阵列中位于所选择的所述一个或多个电极之外的一些或所有其余电极中的每一个处的电特性的值；

基于所述测量的结果来生成电特性图。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述电特性是开路电势的特性。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述电特性是电流。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述电流的特性是循环电流的范围的最大程度。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，控制电路施加一个或多个预定电势包括在所选择的所述一个或多个电极中的电极处施加脉动电压信号，其中，

在所述脉动电压信号内的第一部分期间，所述电极被氧化，并且在所述脉动电压信号的第二部分期间，所述电极上的氧化物被还原，并且所述方法还包括：

利用所述电路，在所述脉动电压信号的所述第二部分期间，测量所述电极处的电流信号；

基于所述电流信号的时间变化率，确定所述电极的位置处的氧浓度；以及

基于所述确定的结果来生成氧浓度图。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个刺激信号是相对于参考电极的电势的电势。

13.一种系统，所述系统包括：

半导体衬底，所述半导体衬底包括：

电极阵列，所述电极阵列包括部署在所述半导体衬底的表面上的多个可独立寻址的电极；以及

电路，所述电路能由一个或多个处理器控制，以在所述电极阵列中的电极组处施加相对于所述电极阵列中的电极的电势或参考电极的电势的一个或多个电势，以在所述电极组处引发电化学反应。

14.根据权利要求13所述的系统，其中，所述电极阵列包括部署在所述半导体衬底的绝缘表面上的多个焊盘。

15.根据权利要求13或14中任一项所述的系统，其中，所述多个焊盘包括Au或Pt。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的系统，其中，所述参考电极是Ag/AgCl参考电极。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的系统，其中，所述电极阵列包括至少1000个、至少4000个或至少1,000,000个电极，并且所述电路包括多个记录电路，每个记录电路被配置为测量所述电极阵列中的电极处的电流。

18.根据权利要求17所述的系统，其中，所述多个记录电路包括至少10个记录电路或至少4000个记录电路。

19.根据权利要求17所述的系统，其中，每个记录电路包括跨阻放大器TIA。

20.根据权利要求19所述的系统，其中，所述TIA包括具有至少10MΩ的电阻的阻抗部件，其中，所述TIA的输出电压与所述阻抗部件两端的电压成正比。

21.根据权利要求20所述的系统，其中，所述阻抗部件包括开关电容器。

22.一种用于提供空间定位的电化学反应的系统，所述系统包括：

电极阵列，所述电极阵列在半导体衬底的表面区域处暴露；

电路，所述电路部署在所述半导体衬底中并耦接到所述电极阵列；

至少一种非暂态计算机可读介质，所述非暂态计算机可读介质在其上存储有可执行指令；以及

至少一个处理器，所述处理器由所述可执行指令编程，以执行包括以下动作的方法：

选择所述电极阵列中的电极的图案；以及

控制电路以在所述电极的图案处施加相对于所述电极阵列中的电极的电势或参考电极的电势的一个或多个预定电势，使得在所述电极的图案处引发电化学反应。

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