CN116057163A - 将引物对分割到反应容器中的设计方法、目标核酸的扩增方法、管组、引物对的列表及将引物对分割到反应容器中的程序 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表示最佳分割例的将引物对分割到反应容器中的设计方法。将引物对分割到反应容器中的设计方法具有：设计工序，对多个目标核酸设计由两种引物构成的多个引物对；评价工序，在引物对之间评价非特异扩增诱导性；以及分配工序，基于非特异扩增诱导性，将具有非特异扩增诱导性的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配到反应容器中，分配工序具有：图表生成工序，生成以引物对为顶点、以非特异扩增诱导性为边的图表或以图表为标准的数据结构；上色工序，对于图表，应用针对图表上色问题的解法等进行分涂，以使相邻的顶点变为不同的颜色；以及对应工序，使多个颜色与反应容器相对应，使引物对与同色的反应容器相对应。

Description

将引物对分割到反应容器中的设计方法、目标核酸的扩增方法、管组、引物对的列表及将引物对分割到反应容器中的程序

技术领域

本发明涉及将引物对分割到反应容器中的设计方法、目标核酸的扩增方法、管组、引物对的列表及将引物对分割到反应容器中的程序，特别是涉及为了高效地扩增多个基因而将引物对分割到反应容器中的设计方法、目标核酸的扩增方法、管组、引物对的列表及将引物对分割到反应容器中的程序。

背景技术

近年来，在生物领域的研究中，对基因进行分析的重要性增大。基因通常为核酸碱基序列，基因的分析有原样读取碱基序列的方式、或者以基于微量资料的测量或筛选的成本降低为目标，扩增碱基序列之后读取的方式。作为扩增基因(碱基序列)的方式，通常进行PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链反应)。在PCR中，通过向目标核酸投入作为互补的碱基序列的引物，连锁地扩增目标核酸。此外，作为同时扩增多个基因的方式有MPCR(Multiplex PCR：多重PCR)。

但是，在MPCR方式中，由于在引物彼此引起副反应，产生被称为引物二聚体的目标试样中不含的噪声成分的情况、或者引物与源自目标基因的核酸以外的源自其他基因的核酸结合的情况等多个阻碍因素，无法扩增目标核酸，这已经成为问题。

为了解决这种问题，对引物的设计正在进行研究。但是，例如，当将只有被称为miRNA(micro-RNA：微RNA)的极短的碱基序列的基因作为对象时，由于引物的设计自由度小，因此通过引物的设计来对应是有限的。在该情况下，还考虑将引物分割到反应容器(管)中进行分配，从而防止与源自目标基因的核酸以外的核酸结合的对应。这是将基因和引物如何组合的组合最优化问题的一种，但对于应该如何最优化没有充分地探讨。

例如，在下述的专利文献1中，关于同时扩增目标核酸的方法，记载有在到达反应平台(扩增的饱和)之前调节引物的浓度的方法。在专利文献2中记载有在进行巢式PCR的同时，以不产生假阳性信号的循环次数进行调节的方法。另外，在专利文献3中记载有为了扩增短的核酸而具有将引物分到不同的反应容器中的工序的方法。

另一方面，在数理研究中有叫做图表的领域，特别是有被称为图表上色问题的领域。这是一个组合最优化问题，正如用K种颜色将无向图表G分涂成相邻顶点变为互不相同的颜色。在基因测定领域中，也在下述的专利文献4中记载有将图表上色问题应用到核酸扩增技术中的情况，作为其一例，示出以扩增子的尺寸分割管的例子。记载了当通过电泳法确认基因的扩增时，由于条带的位置因基因的尺寸不同而不同，因此，通过不使相同尺寸分配到同一管中，可以特定扩增的基因。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：专利第4436039号公报

专利文献2：专利第5709897号公报

专利文献3：专利第4879975号公报

专利文献4：美国专利第6074831号说明书

发明内容

发明要解决的技术课题

专利文献1及专利文献2所记载的方法均为湿式条件下的最优化的提案，对于干燥条件并未探讨。专利文献3对于如何将引物分别分配到反应容器中并未探讨。另外，在专利文献4所记载的方法中，对于考虑了引物间的非特异性、即，当不同种类的投入引物对被桥接时则诱导非特异扩增的实施方式并没有记载。

这样，在专利文献1至4所记载的方法中，对于在同时扩增多个目标核酸时，考虑到引物彼此引起副反应，生成目标试样中不含的噪声成分的情况、或者引物与源自目标基因的核酸以外的源自其他基因的核酸结合的非特异性，将引物分割到反应容器中的情况并未探讨。

本发明是鉴于这样的情况而完成的，目的在于提供表示在使用多个反应容器同时扩增多个目标核酸时，将引物对分割到反应容器中最佳的分割例的将引物对分割到反应容器中的设计方法、目标核酸的扩增方法、管组、引物对的列表及将引物对分割到反应容器中的程序。

用于解决技术课题的手段

为了实现本发明的目的，本发明所涉及的将引物对分割到反应容器中的设计方法是为了同时扩增多个目标核酸而将引物对分割到多个反应容器中的设计方法，其中，具有：设计工序，对多个目标核酸中的每一个设计由通过互补而成对的两种引物构成的引物对，来设计多个引物对；评价工序，在构成与一个目标核酸成对的引物对的引物和构成与其他目标核酸成对的引物对的引物之间评价非特异扩增诱导性；以及分配工序，基于在评价工序中进行了评价的非特异扩增诱导性，将包含具有非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配到多个反应容器中，分配工序具有：图表生成工序，生成以引物对为顶点、以构成引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表、或者以图表为标准的数据结构；上色工序，对图表应用针对图表上色问题的解法，或者对以图表为标准的数据结构应用以图表上色问题为标准的问题及解法，利用概念上的多种颜色对顶点进行分涂，使得隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色；以及对应工序，使在上色工序中分涂的概念上的多种颜色与反应容器相对应，使与顶点对应的引物对与同色的反应容器相对应。

在本发明的另一方式中，优选的是，图表生成工序具有：提取工序，从引物对中特定及提取由相似性高的引物对构成的引物集合；选择工序，从引物集合选择一个以上的代表引物对；以及删除工序，去除与引物集合中所含的引物对中在选择工序中未被选择为代表引物对的引物对成对的目标核酸，在图表中，删除与去除的目标核酸对应的引物对的顶点、及与顶点相接的边。

在本发明的另一方式中，优选的是，上色工序使利用每一种颜色分涂的顶点的数量均等化。

在本发明的另一方式中，优选的是，分配工序在图表生成工序之后具有输入工序和退避工序，在所述输入工序中，输入多个反应容器的数量k，在所述退避工序中，使边的数量为(k-1)以下的顶点从图表退避，在退避工序之后进行上色工序，在上色工序之后具有使退避的边的数量为(k-1)以下的顶点恢复的恢复工序。

在本发明的另一方式中，优选的是，恢复工序以分割到反应容器中的引物对的个数均等化的方式进行恢复。

在本发明的另一方式中，优选的是，恢复工序以在上色工序中分涂的概念上的多种颜色的每一种颜色的数量均等化的方式进行恢复。

在本发明的另一方式中，优选的是，分配工序在图表生成工序之后具有分割工序和整合工序，在所述分割工序中，将图表分割成各自独立的连结图表，对连结图表进行上色工序，在所述整合工序中，在上色工序后，对连结图表进行整合，制作图表。

在本发明的另一方式中，优选的是，目标核酸是碱基数为200碱基以下的smallRNA，引物对中的一侧为茎环引物，在评价工序中，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d(在此，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数)时，(A)对于茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者互补性得分S为S>5，判定引物彼此的非特异反应的诱导性，以及(B)对于通常引物，根据互补性得分S为S>9，判定引物彼此的非特异反应的诱导性，当满足(A)及(B)中的任一个时，判定为具有非特异扩增诱导性。

在本发明的另一方式中，优选的是，目标核酸的碱基数为32碱基以下。

在本发明的另一方式中，优选的是，上色工序利用基于图表上色问题的方法即ZDD，探索上色结果。

在本发明的另一方式中，优选的是，上色工序利用基于图表上色问题的方法即ZDD，列举图表上的极大独立集合，求出由列举出的极大独立集合的一部分或全部覆盖图表的顶点的组合，由此，探索上色结果。

为了实现本发明的目的，本发明所涉及的目标核酸的扩增方法具有如下工序：将包含多个目标核酸的试样添加到多个反应容器中的工序；基于上述记载的将引物对分割到反应容器中的设计方法，将引物对添加到对应的反应容器中的工序；以及扩增反应容器内的目标核酸的工序。

为了实现本发明的目的，本发明所涉及的管组是包含用于同时扩增碱基数为32碱基以下的多个目标核酸的多个管的管组，其中，在多个管中的每一个管中，针对多个目标核酸中的每一个，包含有由通过互补而成对的两种引物构成的引物对中的至少一个，引物对中的一侧为茎环引物，在一个管内包含两个以上的引物对的情况下，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d(在此，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数)时，(A)对于茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者互补性得分S为S>5，判定管内的引物彼此的非特异反应的诱导性，以及(B)对于通常引物，根据互补性得分S为S>9，判定管内的引物彼此的非特异反应的诱导性，不含满足(A)及(B)中的任一个的引物对。

在本发明的另一方式中，优选的是，多个目标核酸的总数为50个以上的目标核酸。

在本发明的另一方式中，优选的是，多个目标核酸的总数为100个以上的目标核酸。

为了实现本发明的目的，本发明所涉及的引物对的列表是被分割为用于同时扩增碱基数为32碱基以下的多个目标核酸的多个组的引物对的列表，其中，在多个组中的每一个组中，针对多个目标核酸中的每一个，包含有由通过互补而成对的两种引物构成的引物对中的至少一个，引物对中的一侧为茎环引物，当在一个组内包含两个以上的引物对的情况下，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d(在此，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数)时，(A)对于茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者互补性得分S为S>5，判定组内的引物彼此的非特异反应的诱导性，以及(B)对于通常引物，根据互补性得分S为S>9，判定组内的引物彼此的非特异反应的诱导性，不含满足(A)及(B)中的任一个的引物对。

在本发明的另一方式中，优选的是，多个目标核酸的总数为50个以上的目标核酸。

在本发明的另一方式中，优选的是，多个目标核酸的总数为100个以上的目标核酸。

为了实现本发明的目的，本发明所涉及的将引物对分割到反应容器中的程序是为了同时扩增碱基数为200以下的small RNA的多个目标核酸而将引物对分割到多个反应容器中的程序，其中，具有如下步骤：针对多个目标核酸中的每一个，设计由通过互补而成对且一方为茎环引物的两种引物构成的引物对，来设计多个引物对的步骤；在构成与一个目标核酸成对的引物对的引物和构成与其他目标核酸成对的引物对的引物之间评价非特异扩增诱导性的步骤；以及基于在评价非特异扩增诱导性的步骤中进行了评价的非特异扩增诱导性，将包含具有非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配到多个反应容器中的步骤，分配的步骤具有如下步骤：生成以引物对为顶点、以构成引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表、或者以图表为标准的数据结构的步骤；对图表应用针对图表上色问题的解法，或者对以图表为标准的数据结构应用以图表上色问题为标准的问题及解法，利用概念上的多种颜色对顶点进行分涂，使得隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色的上色步骤；以及使在上色步骤中分涂的概念上的多种颜色与反应容器相对应，使与顶点对应的引物对与同色的反应容器相对应的步骤，在评价的步骤中，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d(在此，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数)时，(A)对于茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者互补性得分S为S>5，判定引物彼此的非特异反应的诱导性，以及(B)对于通常引物，根据互补性得分S为S>9，判定引物彼此的非特异反应的诱导性，当满足(A)及(B)中的任一个时，判定为具有非特异扩增诱导性。

发明效果

根据本发明，当使用多个反应容器同时扩增多个目标核酸时，能够通过抑制构成向反应容器添加的引物对的引物彼此的非特异扩增的最佳的分割方法将引物对分割添加到反应容器中。因此，能够防止目标核酸的扩增及目标核酸以外的核酸的扩增。

附图说明

图1是表示引物分割设计装置的结构的框图。

图2是表示处理部的结构的框图。

图3是表示将引物分割到反应容器中的设计方法的流程图。

图4是表示分配工序的工序的流程图。

图5是对引物对被桥接而扩增的状态进行说明的图。

图6是对分配工序进行说明的图。

图7是对通过ZDD列举图表例的极大独立集合的步骤进行说明的图。

图8是对通过ZDD列举图表例的极大独立集合的步骤进行说明的图。

图9是对通过ZDD列举基于MIS的图表整体覆盖的步骤进行说明的图。

图10是表示目标核酸的扩增方法的流程图。

图11是表示第一变形例的分配工序的工序的流程图。

图12是第一变形例的退避工序的示意图。

图13是第一变形例的分割工序的示意图。

图14是第一变形例的整合工序及恢复工序的示意图。

图15是表示第二变形例的图表生成工序的工序的流程图。

图16是对实施例1的将引物对分割到反应容器中的设计方法进行说明的流程图。

图17是表示实施例1的第三图表的部分图表上色的一例的图表。

具体实施方式

下面，按照附图对本发明的将引物对分割到反应容器中的设计方法、目标核酸的扩增方法、管组、引物对的列表及将引物对分割到反应容器中的程序进行说明。首先，对用于执行本实施方式的将引物分割到反应容器中的设计方法的引物分割设计装置进行说明。

《引物分割设计装置》

图1是表示引物分割设计装置(以下，也简称为“设计装置”)10的结构框图。设计装置10是进行为了同时扩增多个目标核酸而将引物对分割到多个反应容器中的设计的装置，能够使用计算机实现。如图1所示，设计装置10具备处理部100、存储部200、显示部300及操作部400，相互连接并收发需要的信息。对于这些构成要素，可以采用各种设置方式，各构成要素可以设置于一个部位(一个框体内、一室内等)，也可以经由配置于分开的位置的网络连接。另外，设计装置10能够经由互联网等网络NW与外部服务器500及外部数据库510连接，根据需要在评价工序中获取用于非特异扩增诱导性的评价的算法等信息。另外，在分配工序中，能够获取在使用将顶点分涂成多个颜色时使用的以图表为标准的数据结构、及以图表上色问题为标准的问题及其解法、ZDD(Zero-suppressed BDD(Binary DecisionDiagram))的探索等中所使用的程序的信息。

＜处理部的结构＞

图2是表示处理部100的结构的框图。处理部100具备设计部105、评价部110、分配部115、输出部120、显示控制部125、CPU130(CPU：Central Processing Unit)、ROM135(ROM：Read Only Memory)及RAM140(RAM：Random Access Memory)。

设计部105对扩增的目标核酸中的每一个，设计由通过互补而成对的两种引物构成的引物对。在本实施方式中，假定同时扩增多个目标核酸的情况，由于是针对多个目标核酸中的每一个设计引物对，所以设计多个引物对。评价部110在构成由设计部105设计的引物对的引物彼此之间评价非特异扩增诱导性。在设计部105中，设计有多个引物对，评价构成每一个引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性。分配部115基于由评价部110评价的非特异扩增诱导性，将包含具有非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配在多个反应容器中。

分配部115具备图表生成部116、上色部117及对应部118。图表生成部116以由设计部105设计的引物对为顶点，以由评价部110评价为在与引物之间具有非特异扩增诱导性的引物对彼此为边，生成图表。或者，生成以图表为标准的数据结构。上色部117对于由图表生成部116生成的图表、或者以图表为标准的数据结构，将顶点上色。在对顶点进行上色时，应用针对图表上色问题的解法、或者以图表上色问题为标准的问题及其解法，利用概念上的多种颜色进行上色，使得隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色。即，以与具有非特异扩增诱导性的引物对所对应的顶点彼此成为不同的颜色的方式进行上色。对应部118使由上色部117上色的概念上的多种颜色与反应容器相对应，使与顶点对应的引物对与同色的反应容器相对应。

输出部120输出由设计部105设计的多个引物对。另外，输出部120在分配部115输出由图表生成部116生成的图表及由上色部117上色的图表。显示控制部125控制获取的信息及处理结果向监视器310的显示。稍后对使用处理部100的这些功能的、将引物对分割到反应容器中的设计方法的处理进行详述。此外，基于这些功能的处理在CPU130的控制下进行。

上述的处理部100的各部的功能可使用各种处理器(processor)来实现。各种处理器中例如包括执行软件(程序)来实现各种功能的通用处理器即CPU。另外，上述的各种处理器中还包括FPGA(Field Programmable Gate Array)等在制造后可变更电路结构的处理器即可编程逻辑器件(Programmable Logic Device：PLD)。此外，ASIC(ApplicationSpecific Integrated Circuit)等具有为了执行特定的处理而专门设计的电路结构的处理器即专用电路等也包括在上述的各种处理器中。

各部的功能可以由一个处理器实现，也可以将多个处理器组合来实现。另外，也可以由一个处理器实现多个功能。作为由一个处理器构成多个功能的例子，有以下两种方式：第一，以客户端、服务器等计算机为代表，由一个以上的CPU和软件的组合构成一个处理器，该处理器作为多个功能实现；第二，以片上系统(System On Chip：SoC)等为代表，使用由一个IC(Integrated Circuit)芯片实现系统整体的功能的处理器。这样，各种功能使用一个以上的上述的各种处理器作为硬件结构来构成。此外，更具体而言，这些各种处理器的硬件结构是将半导体元件等电路元件组合而成的电路(circuitry)。

在上述的处理器或者电路执行软件(程序)时，将执行的软件的处理器(计算机)可读代码存储于ROM135(参照图2)等非暂时性记录介质中，处理器参照该软件。预先存储于非暂时性记录介质中的软件包含本发明所涉及的将引物对分割到反应容器中的程序。也可以将代码记录于各种磁光记录装置、半导体存储器等非暂时性记录介质中而不是ROM135。在进行使用软件的处理时，例如将RAM140用作暂时性存储区域，另外，例如也可参照存储于未图示的EEPROM(Electronically Erasable and Programmable Read Only Memory)的数据。

＜存储部的结构＞

存储部200由DVD(Digital Versatile Disk)、硬盘(Hard Disk)、各种半导体存储器等非暂时性记录介质及其控制部构成，存储由通过互补而与核酸成对的两种引物构成的引物对、在构成引物对的引物和构成其他引物对的引物之间评价的非特异扩增诱导性的评价基准、针对在以相邻的顶点彼此成为不同的颜色的方式对图表进行分涂时使用的图表上色问题的解法、及以图表上色问题为标准的问题及其解法等。另外，存储有由设计部105设计的多个引物对。此外，存储有由评价部110评价的非特异扩增诱导性的评价结果。此外，存储有由分配部115的图表生成部116生成的图表及以图表为标准的数据结构、及由上色部117上色后的图表及以图表为标准的数据结构。

＜显示部及操作部的结构＞

显示部300具备监视器310(显示装置)，能够显示输入的信息、存储在存储部200的信息、及处理部100进行的处理的结果等。操作部400包括作为输入设备和/或定点设备的键盘410及鼠标420，用户能够经由这些设备及监视器310的画面进行本实施方式所涉及的将引物对分割到反应容器中的设计方法的执行所需的操作。在用户可执行的操作中包括扩增的多个目标核酸的设定及反应容器的数量的设定等。另外，在后述的分配工序中，进行提取工序时，包括特定引物集合的相似性的范围及从引物集合中选择的代表引物对的指定等。

＜引物分割设计装置中的处理＞

在上述的引物分割设计装置10中，能够根据用户经由操作部400做出的指示进行向反应容器分割引物对的、将引物对分割到反应容器中的设计。

《将引物对分割到反应容器中的设计方法》

图3是表示本实施方式的将引物对分割到反应容器中的设计方法的流程图。本实施方式的将引物对分割到反应容器中的设计方法是为了同时扩增多个目标核酸而将引物对分割到多个反应容器中的设计方法，具有：设计工序，针对多个目标核酸中的每一个，设计由通过互补而成对的两种引物构成的引物对，来设计多个引物对；评价工序，在构成与一个目标核酸成对的引物对的引物和构成与其他目标核酸成对的引物对的引物之间评价非特异扩增诱导性；以及分配工序，基于在评价工序中评价的非特异扩增诱导性，将包括具有非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配到多个反应容器中。

另外，图4是表示分配工序的工序的流程图。分配工序具有：图表生成工序，生成以引物对为顶点、以构成引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表、或以图表为标准的数据结构；上色工序，对图表，应用针对图表上色问题的解法，或者对以图表为标准的数据结构，应用以图表上色问题为标准的问题及解法，利用概念上的多种颜色对顶点进行分涂，使得隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色；以及对应工序，使在上色工序中分涂的概念上的多种颜色与反应容器相对应，使与顶点对应的引物对与同色的反应容器相对应。

下面，对各工序进行说明。

＜设计工序(步骤S12)＞

设计装置10的设计部105进行设计工序(步骤S12)。设计工序是对多个目标核酸中的每一个，设计由通过互补而成对的两种引物构成的引物对，从而设计多个引物对的工序。

首先，进行多个目标核酸的选择。就多个目标核酸而言，列举想要计测的基因，选择扩增的目标核酸(碱基序列)。就目标核酸而言，可选择任意的个数及任意的目标。在本实施方式中，目标核酸的总数优选为50个以上，更优选为100个以上，进一步优选为1000个以上。根据本实施方式的将引物对分割到反应容器中的设计方法，由于考虑到引物彼此的非特异诱导性而向反应容器分割引物对，因此即使目标核酸的数量较多，也能够防止目标核酸以外的核酸扩增，所以是有效的。

目标核酸并非特别限于DNA(deoxyribonucleic acid)及RNA(ribonucleic acid)等，但在诱导非特异反应的可能性高的情况下特别有效。作为诱导非特异反应的可能性高的核酸，可举出碱基序列短的核酸，例如一般的ncRNA(non-coding RNA)，特别是作为碱基序列短的核酸的miRNA(microRNA)等，能够适用于这些核酸。作为碱基序列短的核酸，优选的是碱基数为200碱基以下，更优选的是32碱基以下的small RNA。另外，不仅是原本就短的核酸，还能够选择碎片化的核酸作为目标核酸。

但是，在后述的引物设计中，还考虑有严格的约束条件等的情况、设定的目标核酸的数量多的情况等。在本实施方式中，无论引物的长短，都能够选择任意的碱基序列作为目标核酸。

接下来，针对多个目标核酸中的每一个，设计通过互补而成对的引物对。引物对由目标核酸的碱基序列各自的两端通过互补而成对的两种引物构成。在本实施方式中，为了对多个目标核酸中的每一个来设计引物对而设计了多个引物对。引物对的设计能够根据目的等在各种条件下设定。例如，为miRNA等时，配设茎环RT引物(Stem Loop RT Primer)等，引物的类别也没有限制。

＜评价工序(步骤S14)＞

设计装置10的评价部110进行评价工序(步骤S14)。评价工序在设计工序中设计的多个引物对中构成与一个目标核酸成对的引物对的引物和构成与其他目标核酸成对的引物对的引物之间评价非特异扩增诱导性。非特异扩增诱导性的评价例如可基于引物之间的碱基相同性来进行。碱基相同性可通过固定3'末端序列侧的局部序列比对算法等来计算。可通过基于碱基相同性检查一致数(所谓“Match”)、不一致数(“Mismatch”)、插入/删除(In/Del)进行评价。

但是，在本实施方式中，不限于特定的判定方法及阈值，也可以通过各种方法进行非特异扩增诱导性的评价。特别是在扩增碱基序列较短的核酸即miRNA时，当在一端部使用茎环引物时，碱基相同性的阈值的一例、及从末端侧起的连续一致数是重要的，使用该值对于非特异扩增诱导性的评价有效。例如，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d(在此，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数)时，条件(A)对于茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者互补性得分S为S>5，判定引物彼此的非特异反应的诱导性，以及条件(B)对于通常引物，根据互补性得分S为S>9，判定引物彼此的非特异反应的诱导性，当满足条件(A)及(B)中的任一个条件时，判定为具有非特异扩增诱导性。此外，互补性得分是指包含引物序列和另外的序列的3'末端这一约束下的局部比对得分的最大值。进而在此时的两个序列的对比中，一致数是指序列碱基一致的数量，不一致是指序列碱基不一致数量，插入/删除是指删除或插入一方的序列碱基。另外，在本实施方式中，所谓通常引物是指相对于茎环引物被用作通常的引物且一部分没有环的直线状的普通引物。

引物对向反应容器的分割在存在任意的核酸这一条件下，以构成相对于目标核酸投入的引物对的引物的组合丰富为前提进行引物对的分割。此外，所谓任意的核酸是指存在于试样中的核酸，例如，当为了测定特定的人类miRNA而进行扩增时，是指已知为人类miRNA的核酸。因此，例如，能够去除可通过事前的预处理将大部分排除的长的核酸等进行计算。但是，也可以将可能无法去除的核酸包含在内进行计算。

就在评价工序中评价的非特异扩增诱导性而言，具体地说，检查“任意核酸“桥接”的投入引物对之间的非特异性”，投入的引物与不同于目标核酸的任意核酸桥接，将构成引物对的情况视为诱导非特异扩增的情况。图5是对引物对被桥接而扩增的状态进行说明的图。在图5中，图案VA是表示正常的引物对的组合的状态的图。当想要扩增miRNA-1作为目标核酸时，使前向引物-1(Forward Primer-1)在miRNA-1的3'末端侧反应，使茎环RT引物-1(Stem-loop RT Primer-1)在另一端侧反应。此外，设为前向引物-1和茎环RT引物-1被桥接而将miRNA-1作为目标核酸扩增进行说明。同样地，前向引物-2和茎环RT引物-2被桥接而将miRNA-2作为目标核酸扩增，前向引物-3和茎环RT引物-3被桥接而将miRNA-3作为目标核酸扩增。

然而，在目标核酸的扩增中，如果不将引物分割就投入到相同反应容器中，则如图案VB所示，有时前向引物-1和茎环RT引物-2的对被与不同于目标核酸的miRNA-3桥接而将miRNA-3扩增。另外，如图案VC所示，有时前向引物1被与作为目标核酸的miRNA-1桥接，但另一端侧被桥接茎环RT引物-2。另外，如图案VD所示，有时在miRNA-2的3'末端侧被桥接目标核酸不同的前向引物-1，在另一端侧被桥接茎环RT引物-2。在图案VC中，对于前向引物-1将目标核酸miRNA-1扩增，在图案VD中，对于茎环RT引物-2将目标核酸miRNA-2扩增，但并非在适当的引物对之间扩增。另外，如图案VE所示，有时前向引物-1和茎环RT引物-1对被与不同于目标核酸的miRNA-2桥接而将与目标核酸不同的miRNA-2扩增。由于有时将前向引物-1和茎环RT引物-2投入到相同的反应容器(管)内，从而产生图案VB、VC、VD，所以将前向引物-1和茎环RT引物-2分开投入到反应容器内。即，如果前向引物-1和茎环RT引物-1的引物对-1、前向引物-2和茎环RT引物-2的引物对-2存在于相同的反应容器内，则可能会在前向引物-1和茎环RT引物-2之间将与作为目标核酸的miRNA-1不同的核酸扩增。因此，通过将引物对-1和引物对-2分开投入到反应容器内，能够避免这样的非特异扩增。

另外，如图案VE所示，还考虑通过与作为目标核酸的miRNA-1互补而成对的引物对即前向引物-1和茎环RT引物-1同与目标核酸不同的miRNA-2反应的情况。如图案VE所述的情况，不易避免，但可考虑将引物对1和与目标核酸miRNA-2成对的引物对2分割。如图案VE所述的情况，也能够作为本实施方式的分割对象。

另外，非特异扩增诱导性的评价不是图5的图案VB、VC、VD、VE的全部，也可从它们之中进行限定以作为分割的对象。另外，在图5中，利用作为核酸的miRNA和前向引物及茎环引物的交叉扩增的图案进行了说明，但像引物彼此结合而形成二聚体这样的情况也需要分割引物对。优选非特异扩增诱导性的评价也要确认这样的引物彼此的结合。

＜分配工序(步骤S16)＞

设计装置10的分配部115进行分配工序(步骤S16)。分配工序是基于在评价工序中评价的非特异扩增诱导性，以包含具有非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此不存在于相同反应容器内的方式向多个反应容器分配引物对的工序。分配工序通过以下工序将引物对分配到多个反应容器中：图表生成工序(步骤S22)，制作以引物对为顶点、以构成引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表、或者以图表为标准的数据结构；上色工序(步骤S24)，对图表，应用针对图表上色问题的解法，或者对以图表为标准的数据结构，应用以图表上色问题为标准的问题及解法，利用概念上的多种颜色进行分涂，使得隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色；以及对应工序(步骤S24)，使分涂的概念上的多种颜色与反应容器相对应，使引物对与同色的反应容器相对应。

＜图表生成工序(步骤S22)＞

分配部115的图表生成部116进行图表生成工序(步骤S22)。图表生成工序是生成以引物对为顶点、以构成引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表的工序。图6是对分配工序进行说明的图，图表VIA是表示引物非特异图表(图表)的一例的图。图表VIA是对七个引物对制作的引物非特异图表，分别用A～G表示引物对。将各引物对分别设为顶点(节点)，在评价工序中，构成引物对的引物彼此用边(边缘、链环)连接被评价为具有非特异扩增诱导性的引物对。图表的顶点的数量成为引物对的个数、即目标核酸的个数。另外，边的数量取决于评价工序中的计算结果，成为被判断为具有非特异扩增诱导性的数量。

＜上色工序(步骤S24)＞

分配部115的上色部117进行上色工序(步骤S24)。上色工序是对图表应用针对图表上色问题的解法，利用概念上的多种颜色对顶点进行分涂，使得隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色的工序。如后所述，在此由于分涂的颜色与反应容器(管)相对应，所以优选为少的颜色。另外，如果利用每一种颜色分涂的顶点的数量是均等的，则能够使分配到反应容器中的引物对的数量按每个反应容器均等。因此，优选使利用每一种颜色分涂的顶点的数量均等化而进行上色工序。图6的图表VIB是对图表VIA所示的引物非特异图表进行了上色的图。如图表VIB所示，将引物对A、E上色为红色，将引物对B、G上色为青色，将引物对C、F上色为绿色，将引物对D上色为紫色，从而能够使得无论相邻的哪个顶点都不会成为相同的颜色。

将以最小的色数对图表进行上色的问题称为“图表上色问题”，在图表理论中众所周知。作为启发式的图表上色问题的解法，已知有Welsh-Powell法等，可以使用这种方法进行上色。

此外，在此，虽然记载为最容易理解的“图表上色问题”，但图表上色问题所属的NP完全问题大多被证明互相等同，变形后作为其他问题来解决，即，也能够应用图表以外的数据结构及算法(相当于“以图表为标准的数据结构”)。

例如，可将图表上色问题重新定义为独立集合的列举问题和基于这些独立集合的集合覆盖问题。首先，独立集合是指图表上的彼此不相邻的顶点集合。此外，如果还考虑到极大独立集合，则是高效的。根据该定义可知，在图表上色问题的解中，分涂为某一个颜色的顶点的集合形成独立集合。但是，当在独立集合之间存在能够分涂重复的颜色的顶点时，也可以将该顶点分配到任一个颜色类别中。因此，相反地，如果能够由多个独立集合中所含的顶点覆盖(整体覆盖)图表的顶点整体，则会解开图表上色问题。

此外，独立集合的补集为顶点覆盖(无论取图表的哪个边，至少一端点包含在顶点覆盖中)。在此，顶点覆盖问题能够变形为部分和问题是公知的。因此，图表上色问题能够变形为部分和问题与集合覆盖问题这样的乍一看图表未明显地表现的问题，通过考虑这样的变形问题及针对该问题的解法，能够以解决图表上色问题的情况同样地通过使顶点与反应容器相对应来分配引物。

另外，以上记述了等值变形，但可例如变形为满足充分条件的另外的问题，或者变形为可获得近似的解的另外的问题。与这些图表上色问题同样的另外的问题、及它们的解法统称为“以图表为标准的数据结构及以图表上色问题为标准的问题及解法”。能够进行多种这样的变形，但对于想要挪用于现有的优异的或者惯用的各种算法及软件模块等的情况等是有效的。

此外，作为上色工序，也可以利用ZDD进行探索。具体而言，例如，可以将上述的上色问题分割为“极大独立集合(MIS)的列举”和“基于MIS的图表整体覆盖的列举”，构建各自对应的ZDD。

图7及图8是对通过ZDD列举图表例的极大独立集合的步骤进行说明的图。首先，通过“剪枝”及“节共享”对通过图表制作工序(步骤S22)制作的引物非特异图表削减应识别的图案。所谓“剪枝”是指如下处理：通过选择某顶点，识别即使不考虑剩余的选择的有无也不合适的情况是否确定，从而削减应识别的图案。另外，所谓“节共享”是指如下处理：在不同的选择图案中，如果后续的选择一致，则汇总其分支相同的图案组，削减应识别的图案。

图7的图表VIIA是对剪枝条件(1)进行说明的图，图表VIIB是对剪枝条件(2)进行说明的图。剪枝条件(1)选择选定顶点的相邻顶点，在该时刻成为“剪枝”。在上色工序中，由于以隔着边相邻的顶点彼此成为不同的颜色的方式进行分涂，所以在选择与选定顶点A相邻的B、C、D的时刻，基于该选择的组合变得不合适，因此不需要考虑以后的选择。另外，剪枝条件(2)在没有选择可追加(可选择)的顶点的时刻成为“剪枝”。这是因为即使对都未选择A～D时获得的独立集合追加顶点A，也仍然为独立集合，所以不会成为“极大”独立集合。

图7的图表VIIC是对节共享条件进行说明的图。在选定顶点及相邻顶点的集合一致的时刻成为节共享。即，将选定顶点A和其相邻顶点(B)作比较时，顶点(A)的相邻顶点为顶点B、C、D，顶点B的相邻顶点为顶点A、C、D。因此，由于选择A时和选择B时，以后的选择是共同的，所以使ZDD的分支合流，共享以后的选择处理。由此，当选择顶点A、B中的任一个顶点时，也可以不单独地重复处理每一个。例如，在图8中，由于选择A(A▼)、不选择A而选择B(A▽B▼)与相同的F合流，所以当选择顶点A、B中的任一个顶点时，也可以不单独地分别进行重复处理。

如果根据这些条件列举极大独立集合、即颜色类别的全候补，则获得如图8所示的图表VIIIA的极大独立集合列举的ZDD表现。当使用该图表VIIIA用箭头▼表示时选择其顶点，当用箭头▽表示时不选择其顶点，将可选择的组合设为1，将不可选择的组合设为0。即，成为1的组合为如下情况：选择隔着边相邻的顶点彼此中的任一个，且选择判断选择的可否的顶点及隔着边与该顶点相邻的顶点中的任一个。例如，在图表VIIIA中，选择A、不选择F、以及选择E，从而能够制作表示图表VIIIB所示的极大独立集合的提取例的图表。

图9是对通过ZDD列举基于MIS的图表整体覆盖的步骤进行说明的图。图9的表IXA是通过图表制作工序(步骤S22)制作的图表(参照图6的图表VIA)的极大独立集合的一览表，在图8的图表VIIIA中，是将成为1的组合作成一览表的表。即，按照上述的步骤，从图8的图表VIIIA中提取成为1的所有极大独立集合，将每一个极大独立集合依次称为要素＜1＞、＜2＞……等，制作其一览表。在表IXA中，剪枝条件(1)在确定不能覆盖的顶点的时刻成为“剪枝”。即，在未选择要素＜1＞、＜2＞、＜3＞中的所有要素的情况下，由于顶点A未被选择，因此顶点A未被覆盖，漏掉了顶点A，因此不需要考虑以后的选择。另外，剪枝条件(2)在不能选择已设定的选择个数的数量k个的时刻成为“剪枝”。例如，当选择的要素的数量超过k个时，或者当在选择了j个要素的时刻选择及未选择的要素的数量少于(k-j)个时，由于选择数不是k个，因此不需要在该时刻考虑以后的选择。此外，k是在上色工序中分涂的颜色的数量。

另外，作为节共享条件，当(1)选定要素的顶点及(2)选择要素数一致时成为节共享。例如，在表IXA中，当选择了要素＜1＞、＜5＞时和选择了要素＜2＞、＜4＞时，选择出的顶点为{A,B,E,F}，选择要素数也是两个，是一致的。在该情况下，如果其他选择出的要素为相同条件，则上色结果相同，因此，在要素＜1＞、＜5＞或要素＜2＞、＜4＞中的任一个组合中，以后的选择也共同，所以使ZDD的分支合流，共享以后的选择处理。由此，当选择了要素＜1＞、＜5＞或要素＜2＞、＜4＞中的任一个要素时，也可以不必单独地重复处理每一个。

通过进行上述的“剪枝”及“节共享”，能够削减应识别的图案，通过列举集合覆盖即最终的图表上色结果，能够获得用图表IXB表示的图表整体覆盖列举的ZDD表现。根据图表IXB求出可选择所有顶点A～G的组合。例如，通过选择要素＜7＞、＜8＞、＜2＞、＜6＞(▼)，能够覆盖所有的顶点，通过按各要素进行上色，能够用不同的颜色对相邻的顶点彼此进行上色。当＜7＞、＜8＞均未选择(▽)时，由于顶点C未上色，因此该组合不会被选中。

＜对应工序(步骤S26)＞

分配部115的对应部118进行对应工序(步骤S26)。对应工序是使在上色工序中分涂的概念上的多种颜色与反应容器相对应，使与顶点对应的引物对与同色的反应容器相对应的工序。用同色分涂的引物对在构成的引物彼此中不具有非特异扩增诱导性。因此，即使投入到相同的反应容器中，也不会使与目标核酸不同的miRNA扩增，因此，能够仅扩增目标的目标核酸。

具体而言，在图6所示的已上色的引物非特异图表(参照图表VIB)中，将红色作为管1分配引物A、E，将绿色作为管2分配引物B、G，将青色作为管3分配引物C、F，将紫色作为管4分配引物D。此外，不用说，编号和颜色的对应是任意的。

另外，当假定多重PCR作业时，通常优选的是，管数少且管内所含的引物均等。但是，也可以将所分配的颜色进一步任意分割成两部分以上。但是，如果相反地将颜色合并，则可能产生存在非特异扩增诱导性的引物对的组合，因此，不优选。

此外，在本实施方式中所述的分割设计是指引物向反应容器的分配的构成方法，不一定必须准备物质的引物。例如，也可从网络上输入想要扩增的目标核酸等信息，构成返回向反应容器的分配(将向反应容器分割的引物对分割成组的列表)的服务。

另外，作为包含分割到反应容器(管组)中的引物对的反应容器的组合，也可以设为管组。如果扩增的目标核酸已确定，则成对的引物对也确定。因此，能够将在引物对之间没有特异扩增诱导性的引物对彼此分配到管中，作为管组。在非特异扩增诱导性的评价中，在引物对中的一侧为茎环引物的情况下，例如，当满足条件(A)关于茎环引物的非特异反应的诱导性，3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者不一致数小于两处、以及条件(B)通常引物的一致数为不一致数及插入/删除数的3倍之和以上时，判定为具有非特异扩增诱导性，因此，以这样的引物对不包含在相同反应容器内的方式向管组分割引物对。

接下来，对目标核酸的扩增方法进行说明。图10是表示目标核酸的扩增方法的流程图。目标核酸的扩增方法具有将包含多个目标核酸的试样添加到多个反应容器中的试样添加工序(步骤S32)、基于上述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，将引物对分割添加到对应的反应容器中的引物对添加工序(步骤S32)、以及扩增反应容器内的目标核酸的工序。

＜试样添加工序(步骤S32)＞

当实际扩增目标核酸时，首先，将试样添加到多个反应容器中。试样的添加可利用通常的方法进行。

＜引物对添加工序(步骤S34)＞

引物对添加工序是将在上述的分配工序(步骤S16)中分配到多个反应容器中的引物对添加到各个反应容器中的工序。

＜扩增工序(步骤S36)＞

扩增工序是使用在试样添加工序(步骤S32)及引物对添加工序(步骤S34)中添加了试样及引物对的反应容器扩增目标核酸的工序。扩增工序可参考各种文献并利用通常的方法实施。

在扩增工序后，通过读取扩增的核酸的信息，能够获取细胞的信息。当读取核酸的信息时，在用NGS(下一代测序)读取的情况下，多重PCR反应后的反应物混合，能够读取信息作为概述的样品。

＜其他实施方式＞

在上述说明的实施方式中，以顶点引物为七个的情况进行了说明，但实际上需要分割非常大的数量的引物对。为了使计算高效化，进行了各种方法，可利用以下的变形例所示的实施方式进行。

(第一变形例)

在第一变形例中，在分配工序(步骤S16)中，在图表生成工序(步骤S22)后，使所生成的引物非特异图表的顶点中比在上色工序中分涂的颜色的数量(k)少的数量(k-1以下)的顶点回归退避，这一点与上述实施方式不同。

图11是表示第一变形例的分配工序的工序的流程图。图12是第一变形例的退避工序的示意图，图13是分割工序的示意图。

具体而言，如果能够容许k色(＝反应容器数k)，则顶点退避进行输入k的输入工序(步骤S222)。接下来，进行使次数(k-1)以下的顶点回归退避的退避工序(步骤S224)。在此，次数是指与顶点连接的边的数量。

如图12的图表XIIA所示，就次数(k-1)的顶点V₀而言，对相邻的(k-1)个顶点分别涂上不同的颜色，对顶点V₀涂上第k个的颜色，由此，能够将相邻的顶点彼此上色为不同的颜色。因此，通过使次数(k-1)以下的顶点退避，并在退避的图表上色，能够简化上色工序(步骤S24)。另外，如图表XIIB所示，次数(k-1+α)[α是与次数(k-1)以下的顶点相邻的边的数量]的顶点V_{A_0}经由边与次数(k-1)以下的顶点V_{B_0}相邻，但顶点V_{B_0}的次数为(k-1)以下，所以能够退避。因此，通过使这样的能够退避的顶点退避，当顶点V_{A_0}的次数为(k-1)以下时，还能够使这样的顶点退避。

此外，可容许的数值k可以任意设定，但当假定分割多重PCR作业时，例如，优选的是，如果假定使用8连吸移管的作业，则k＝8，如果假定使用12连吸移管的作业，则k＝12等。另外，也可考虑基于分割的试剂成本来确定。即，可按照作业性及成本等各种尺度来设定k。

通过进行退避工序(步骤S224)，能够提高将退避的每一个图表分割成多个图表(连结图表)的可能性。如图13所示，在分割的图表被分为高次顶点为中心的密集部和低次顶点占据过半的粗网的区域的情况下，进行使低次顶点退避(在低次顶点的部分分割)的分割工序(步骤S226)。通过进行分割工序，能够进一步简化上色工序(步骤S24)。

在进行了分割工序(步骤S226)后，在各个连结图表中进行图表的上色(上色工序)。对图表进行上色的方法可通过上述的方法进行。通过进行退避工序(步骤S224)及分割工序(步骤S226)并对每一个连结图表使用上述的ZDD实施上色工序(步骤S24)，能够有效地进行网罗探索，能够担保所需的反应容器的数量(管数)的必要充分性。

在进行了上色工序(步骤S24)后，对在分割工序(步骤S226)中退避的连结图表进行整合，进行制作图表的整合工序(步骤S242)。

在进行了整合工序(步骤S242)后，进行恢复在退避工序(步骤S224)中退避的次数(k-1)以下的顶点的恢复工序(步骤S246)。由于退避的顶点为(k-1)以下，因此通过将退避的顶点上色为和与退避的顶点相邻的相邻顶点不同的颜色，能够用与相邻顶点分别不同的颜色进行上色。另外，在退避工序(步骤S224)中退避的图表之间、在分割工序(步骤S226)中退避的连结图表之间，顶点不相邻，所以也可仅对每一个上色结果进行整合，或者可使用最大的色数在各图表内重新对顶点进行上色，从而对图表整体进行上色。

图14是第一变形例的整合工序及恢复工序的示意图。优选的是，在恢复顶点退避的图表或分割图表时，进行上色，使得属于各颜色的类别的顶点的个数、即分割到反应容器中的引物对的数量均等。具体而言，可通过调节图表上色结果的整合、极大独立集合的重复顶点的分配、及顶点恢复的分配等来进行。

作为第一方法，在恢复连结图表时，对原来的图表的已上色且顶点数少的颜色类别分配连结图表中的多的颜色类别。作为第二方法，当可分配为多个中的任一个颜色时，分配为少的颜色。作为第三方法，对于退避顶点，从可选择的颜色中的少的颜色类别依次分配。当退避顶点多时，能够利用第三方法使反应容器内的引物对数均等化。

在进行了恢复工序(步骤S246)之后，进行对应工序(步骤S26)，使在上色工序中分涂的多个颜色与反应容器相对应，使与顶点对应的引物对与同色的反应容器相对应。

通过以上的方法，在第一变形例中，能够高效地进行图表上色。另外，因为还能够将反应容器内的引物数均等化，所以也能够使扩增的目标核酸的数量在各反应容器中均匀。

由于图表上色问题是较难的问题，因此图表规模的削减非常重要。通过适当的顶点退避及图表分割，减少各顶点的相邻顶点的数量，从而能够使图表上色探索大幅高效化。而且，如果上色结果最后为k以上，则顶点退避后的上色数满足本来的颜色数量的必要充分条件。另外，对于图表分割也同样。

此外，在图11中，利用进行退避工序(步骤S224)及分割工序(步骤S226)双方的方法进行了说明，但在顶点数足够少时等，可通过仅进行退避工序(步骤S224)及分割工序(步骤S226)中的任一者而进行分配工序。在图11中，当进行退避工序(步骤S224)时，进行恢复工序(步骤S246)，当进行分割工序(步骤S226)时，进行整合工序(步骤S242)。

(第二变形例)

在第二变形例中，在图表生成工序(步骤S22)中，从由相似性高的引物对构成的引物集合中提取代表引物对，使用与该引物对对应的顶点进行图表上色，由此，谋求图表上色的高效化。

图15是表示第二变形例的图表生成工序的工序的流程图。第二变形例的图表生成工序具有：提取工序(步骤S232)，从引物对中特定及提取由相似性高的引物对构成的引物集合；选择工序(步骤S234)，从引物集团中选择一个以上的代表引物对；以及删除工序(步骤S236)，去除与引物集合中所含的引物对中在选择工序中未被选择为代表引物的引物成对的目标核酸，在图表中，删除与去除的目标核酸对应的引物对的顶点、及与顶点相邻的边。此外，所谓“由相似性高的引物对构成的引物集合”，是指相对于一个引物对，存在具有多个非特异扩增诱导性的引物对，为这些引物对的集合。

在第二变形例的图表生成工序中，首先进行提取工序(步骤S232)。因为相似性高的引物集合中所含的引物对相对于多个引物对非特异扩增诱导性变高，因此当制作非特异图表时，从一个顶点产生多个边，分别与顶点连结。因此，在对顶点进行上色时，需要多个颜色，因此在之后的上色工序(步骤S24)中，需要过剩的管。

例如，当目标核酸X1、X2、……X16这16个核酸彼此在图表中形成团(Clique)(成为完全图表的部分图表)时，如第一变形例所示的顶点退避不能在k<16时实施，因此，确定图表上色需要16种颜色以上。

另一方面，如果目标核酸X1、X2、……X16类似，则本来就难以对它们进行判别计数。因此，从目标核酸X1、X2、……X16中仅将任意一种、或少数种作为计测对象(选择工序(步骤A234))，将其他从计测对象去除，即，将与从计测对象去除的目标核酸对应的引物对的顶点从非特异图表删除(删除工序(步骤S236))。由此，能够减少用边与对应于作为计测对象的目标核酸的引物连接的引物的顶点。因此，能够减少进行图表上色时所使用的颜色，能够减少管分割的个数。

另外，发现的团的次数成为作为进行第一变形例中所示的顶点退避的对象的次数k的候补。团的次数是上色数的下限，即使与k对应，也满足必要充分条件。相反地，当以适当的k进行顶点退避，进一步分割图表而获得完全图表、或以其为标准的高密图表时，成为以基因为代表的目标核酸的代表的候补。

此外，为了简化说明，以团进行了说明，但在能够提取以团为标准的高密部分图表的情况下，通过从该高密部分图表将任意一种或少数种作为计测对象，也能够获得同样的效果。例如，在本实施方式中进行了说明的次数(k-1)以下的顶点退避处理或图表分割是提取高密部分图表的方法之一。

通过以上的方法，在第二变形例中，能够高效地进行图表上色。另外，扩增类似的目标核酸中一个以上的任意的目标核酸并进行检查，但通过进行与除外的核酸类似的目标核酸的检查，也能够类推检查结果。

[实施例]

下面，举出本发明的实施例，对本发明进一步具体地进行说明。

《实施例1》(干式探讨)

以人类miRNA全部2,656种引物设计为目标。其中，从其他引物去除独立的孤立顶点(与无论和哪种引物都不显示非特异诱导性的引物对应的顶点)之后，将顶点数1,178(最大次数30)的图表作为上色对象。此时，最大的连结图表的顶点数为777。此外，为了确认发明效果，首先，将茎环引物特有的检查除外。

图16是对实施例1的将引物对分割到反应容器中的设计方法进行说明的流程图。在实施例1中，以容许系数k＝8执行。首先，使次数k为7以下的顶点退避。次数k为7以下的顶点的数量为1123个。通过使次数k为7以下的顶点退避，能够将图表分割为三部分，各个图表中，第一图表：顶点数21，最大次数20，第二图表：顶点数18，最大次数17，第三图表：顶点数16，最大次数15。

接下来，对于各图表，通过ZDD对每一个进行图表上色。其结果是，第一图表能够以7色(χ(G’⁷ ₁＝7))上色，第二图表能够以7色(χ(G’⁷ ₂＝7))上色，第三图表能够以10色(χ(G’⁷ ₃＝10))上色。图17表示第三图表的部分图表上色的一例。在第三图表中，用[#1]D、E、H、J、M、P(红)、[#2]K、N(橙)、[#3]A(黄绿)、[#4]B(绿)、[#5]C(黄)、[#6]F(青)、[#7]G(藏青)，[#8]I(蓝)，[#9]L(紫)，[#10]O(桃)这十种颜色分涂颜色。虽然在本实施例中未进行，但也可以通过使任意一个代表第三图表的一组引物来减少色数。

接下来，恢复分割图表。在下述的表1中示出恢复后的各颜色类别的顶点数(向各反应容器分割的引物数)。在恢复分割为三部分的分割图表时，对分配完成的顶点数少的颜色类别分配多的颜色类别。另外，退避的顶点从可选择的颜色中的少的颜色类别依次分配。在实施例1中，通过如上所述分配颜色，能够对各颜色(各反应容器)均等地分配颜色(引物)。在表1中示出通过传统启发式手法分配的比较例作为参考例。如表1所示，相对于比较例，在实施例1的方法中可确认能够将顶点数均等化。

[表1]

《实施例2》(干式及湿式探讨)

对于由人类丰富表达的hsa-let-7a-5p，准备更换了其反转互补序列的一部分碱基的15种前向引物及54种茎环引物，通过qPCR确认ΔCt值，调查表示非特异扩增诱导性的引物设计的阈值。当[ΔCt<8]时，判定为存在非特异扩增。

对于前向引物的设计，按照国际公开第2016/159132小册子进行。关于茎环引物，根据表示非特异扩增的12种引物的排列特征，将表示非特异扩增的引物设计的阈值设定为3'末端侧的连续一致数为4以上，或者不一致数少于两处。使用设定值判定54条件的引物的非特异扩增时，结果可将有问题的12件判定为存在非特异扩增。在表2中示出结果。此外，所谓判定是根据在本发明中公开的参数事前判定出的结果，所谓结果是指实际上扩增所生成的结果。实际上存在非特异扩增的引物当然是结果存在非特异扩增的引物，但因为可以事前将其全部判定为存在非特异扩增，所以可确认到在本发明中公开的参数有效地发挥了作用。

[表2]

接下来，使用由MSC(Mesenchymal Stem Cell：间充质干细胞)特征性高表达的177种miRNA[Ferguson,Scott W.,et al.,2018]实施多重PCR，评价管分割设计方法的有效性。

作为比较对象，准备水准1(无分割：188种判定为存在非特异扩增的NG对)、水准2(以名称顺序排序的名称顺序分割：85种判定为存在非特异扩增的NG对)、及水准3(将名称顺序进一步随机排序后的名称顺序再分割：29种判断为存在非特异扩增的NG对)，并对计测精度进行了比较。

与单个qPCR测定值(计测精度的指标)进行对比时，结果确认到，测定精度(qPCR对比R²)随着NG对数而降低，通过利用本发明的将引物对分割到反应容器中的设计方法进行分割，对miRNA的测定精度提高有效。

[表3]

符号说明

10 引物分割设计装置

100 处理部

105 设计部

110 评价部

115 分配部

116 图表生成部

117 上色部

118 对应部

120 输出部

125 显示控制部

130 CPU

135 ROM

140 RAM

200 存储部

300 显示部

310 监视器

400 操作部

410 键盘

420 鼠标

500 外部服务器

510 外部数据库

NW 网络

Claims (20)

1.一种将引物对分割到反应容器中的设计方法，为了同时扩增多个目标核酸，将引物对分割到多个反应容器中，所述设计方法具有：

设计工序，对所述多个目标核酸中的每一个，设计由通过互补而成对的两种引物构成的引物对，来设计多个引物对；

评价工序，在构成与一个目标核酸成对的引物对的引物和构成与其他目标核酸成对的引物对的引物之间评价非特异扩增诱导性；以及

分配工序，基于在所述评价工序中进行了评价的所述非特异扩增诱导性，将包含具有所述非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配到多个反应容器中，

所述分配工序具有：

图表生成工序，生成以所述引物对为顶点、以构成所述引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表、或者以所述图表为标准的数据结构；

上色工序，对所述图表，应用针对图表上色问题的解法，或者对以所述图表为标准的数据结构应用以图表上色问题为标准的问题及解法，利用概念上的多种颜色对所述顶点进行分涂，使得隔着所述边相邻的所述顶点彼此变为不同的颜色；以及

对应工序，使在所述上色工序中分涂的概念上的多种颜色与所述反应容器相对应，使与所述顶点对应的所述引物对与同色的所述反应容器相对应。

2.根据权利要求1所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述图表生成工序具有：

提取工序，从所述引物对中特定及提取由相似性高的引物对构成的引物集合；

选择工序，从所述引物集合中选择一个以上的代表引物对；以及

删除工序，去除与所述引物集合中所含的引物对中在所述选择工序中未被选择为代表引物对的引物对成对的所述目标核酸，在所述图表中，删除与去除的所述目标核酸对应的所述引物对的顶点、及与顶点相接的边。

3.根据权利要求1或2所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述上色工序中，使利用每一种颜色分涂的顶点的数量均等化。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述分配工序在所述图表生成工序之后具有输入工序和退避工序，

在所述输入工序中，输入所述多个反应容器的数量k，

在所述退避工序中，使所述边的数量为(k-1)以下的所述顶点从所述图表退避，

在所述退避工序之后进行所述上色工序，

在所述上色工序之后，具有使退避的所述边的数量为(k-1)以下的所述顶点恢复的恢复工序。

5.根据权利要求4所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述恢复工序以被分割到所述反应容器中的所述引物对的个数均等化的方式进行恢复。

6.根据权利要求4所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述恢复工序以在所述上色工序中分涂的概念上的多种颜色中的每一种颜色的数量均等化的方式进行恢复。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述分配工序在所述图表生成工序之后具有分割工序和整合工序，

在所述分割工序中，将所述图表分割成各自独立的连结图表；

对所述连结图表进行所述上色工序，

在所述整合工序中，在所述上色工序后对所述连结图表进行整合，制作所述图表。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述目标核酸是碱基数为200碱基以下的small RNA，

所述引物对中的一侧为茎环引物，

在所述评价工序中，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d时，其中，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数，(A)对于所述茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者所述互补性得分S为S>5，判定所述引物彼此的非特异性反应的诱导性，以及(B)对于通常引物，根据所述互补性得分S为S>9，判定所述引物彼此的非特异性反应的诱导性，当满足(A)及(B)中的任一个时，判定为具有非特异扩增诱导性。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述目标核酸的碱基数为32碱基以下。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述上色工序利用基于图表上色问题的方法即ZDD，探索上色结果。

11.根据权利要求10所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，其中，

所述上色工序利用基于图表上色问题的方法即ZDD，列举所述图表上的极大独立集合，求出由列举出的所述极大独立集合的一部分或全部覆盖所述图表的顶点的组合，由此探索上色结果。

12.一种目标核酸的扩增方法，具有如下工序：

将包含多个目标核酸的试样添加到多个反应容器中的工序；

基于权利要求1至11中任一项所述的将引物对分割到反应容器中的设计方法，将所述引物对添加到对应的所述反应容器中的工序；以及

扩增所述反应容器内的目标核酸的工序。

13.一种管组，其包含用于同时扩增碱基数为32碱基以下的多个目标核酸的多个管，其中，

在所述多个管中的每一个管中，针对所述多个目标核酸中的每一个，包含有由通过互补而成对的两种引物构成的引物对中的至少一个，

所述引物对中的一侧为茎环引物，

在一个所述管内包含两个以上的所述引物对的情况下，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d时，其中，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数，(A)对于所述茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或所述互补性得分S为S>5，判定所述管内的引物彼此的非特异性反应的诱导性，及(B)对于通常引物，根据所述互补性得分S为S>9，判定所述管内的引物彼此的非特异性反应的诱导性，不含满足(A)及(B)中的任一个的引物对。

14.根据权利要求13所述的管组，其中，

所述多个目标核酸的总数为50个以上的目标核酸。

15.根据权利要求14所述的管组，其中，

所述多个目标核酸的总数为100个以上的目标核酸。

16.一种引物对的列表，其被分割为用于同时扩增碱基数为32碱基以下的多个目标核酸的多个组，其中，

在所述多个组中的每一个组中，针对所述多个目标核酸中的每一个，包含有由通过互补而成对的两种引物构成的引物对中的至少一个，

所述引物对中的一侧为茎环引物，

当在一个所述组内包含两个以上的所述引物对的情况下，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d时，其中，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数，(A)对于所述茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者所述互补性得分S为S>5，判定所述组内的引物彼此的非特异性反应的诱导性，及(B)对于通常引物，根据所述互补性得分S为S>9，判定所述组内的引物彼此的非特异性反应的诱导性，不含满足(A)及(B)中的任一个的引物对。

17.根据权利要求16所述的引物对的列表，其中，

所述多个目标核酸的总数为50个以上的目标核酸。

18.根据权利要求17所述的引物对的列表，其中，

所述多个目标核酸的总数为100个以上的目标核酸。

19.一种将引物对分割到反应容器中的程序，其为了同时扩增作为碱基数为200以下的small RNA的多个目标核酸，将引物对分割到多个反应容器中，所述程序具有如下步骤：

针对所述多个目标核酸中的每一个，设计由通过互补而成对且一方为茎环引物的两种引物构成的引物对，来设计多个引物对的步骤；

在构成与一个目标核酸成对的引物对的引物和构成与其他目标核酸成对的引物对的引物之间评价非特异扩增诱导性的步骤；以及

基于在评价所述非特异扩增诱导性的步骤中进行了评价的非特异扩增诱导性，将包含具有所述非特异扩增诱导性的引物的引物对彼此以不存在于相同反应容器的方式分配到多个反应容器中的步骤，

所述分配的步骤具有如下步骤：生成以所述引物对为顶点、以构成所述引物对的引物彼此的非特异扩增诱导性为边的图表、或以所述图表为标准的数据结构的步骤；

对所述图表应用针对图表上色问题的解法、或者对以所述图表为标准的数据结构应用以图表上色问题为标准的问题及解法，利用概念上的多种颜色对所述顶点进行分涂，使得隔着所述边相邻的所述顶点彼此成为不同的颜色的上色步骤；以及

使在所述上色步骤中分涂的概念上的多种颜色与所述反应容器相对应，使与所述顶点对应的所述引物对与同色的所述反应容器相对应的步骤，

在所述评价的步骤中，当将互补性得分S设为S＝m-u-3d时，其中，m：一致数，u：不一致数，d：插入/删除数，(A)对于所述茎环引物，根据3'末端侧的碱基的连续一致数为4以上、或者所述互补性得分S为S>5，判定所述引物彼此的非特异性反应的诱导性，及(B)对于通常引物，根据所述互补性得分S为S>9，判定所述引物彼此的非特异性反应的诱导性，当满足(A)及(B)中的任一个时，判定为具有非特异扩增诱导性。

20.一种记录介质，其为非暂时性且计算机可读的记录介质，记录有权利要求19所述的程序。

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