CN116056723A

CN116056723A - 增强细菌胞外囊泡的癌症治疗效果的方法和组合物

Info

Publication number: CN116056723A
Application number: CN202180051621.0A
Authority: CN
Inventors: 高用松; 李在珉; 高景润; 李在彧; 裴叙允
Original assignee: Rosetta Outer Row Body Corp
Current assignee: POSTECH Academy Industry Foundation
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2023-05-02
Also published as: KR20230027050A; JP2023531529A; EP4169520A4; WO2021261891A1; AU2021296649A1; US20230248783A1; EP4169520A1

Abstract

本发明涉及一种用于增强细菌的胞外囊泡的癌症治疗功效的方法和组合物，更具体地，涉及一种通过使用单一免疫检查点抑制剂或两种或更多种类型的免疫检查点抑制剂的各种组合来增强细菌的胞外囊泡的癌症治疗功效的方法和组合物。与各种抑制剂的单次剂量形式相比，所述组合物表现出协同作用，并表现出减轻由单次剂量形式的高剂量引起的副作用的作用，因此可有效地用于开发癌症药物。

Description

增强细菌胞外囊泡的癌症治疗效果的方法和组合物

技术领域

本申请要求于2020年6月22日提交的韩国专利申请10-2020-0076053的优先权，其整体通过引用并入本文。

本发明涉及一种增强细菌的胞外囊泡的癌症治疗效果的方法和组合物，更具体地，涉及一种使用单一免疫检查点抑制剂或两种或更多种类型的免疫检查点抑制剂的各种组合来增强细菌的胞外囊泡的癌症治疗效果的方法和组合物。

背景技术

癌症是死亡的主要原因之一，但如果在早期阶段发现，某些情况下是可以治愈的。然而，如果癌症发展到一定程度则很难治疗癌症，特别是涉及转移的情况下。最近，已经知道并认识到，由于大多数癌症中存在免疫抑制环境，癌症不受免疫系统调控。因此，已经开发了各种方法来促进免疫系统调控癌症。癌症免疫疗法是一种通过利用机体的免疫功能来治疗癌症的策略，并且自从19世纪晚期William B.Coley通过施用被称为Coley毒素的细菌混合物观察到肿瘤消退以来，已经受到了极大关注和期望。由于在20世纪80年代和90年代尝试的各种癌症免疫疗法导致了令人失望的结果，当务之急是开发一致的和可重复的癌症免疫疗法。最近，随着针对免疫检查点抑制剂的单克隆抗体对各种癌症显示出显著的治疗效果，癌症免疫疗法成为现实。通过阻断一个或多个免疫检查点，免疫检查点抑制剂移除了免疫系统中的一个障碍，并抑制了免疫抑制性肿瘤微环境。免疫检查点抑制剂包括针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和程序性死亡配体1(PDL1)的单克隆抗体。

抗原特异性T淋巴细胞的免疫应答是非常复杂和受到精心调控的，并且它是一种代表性的特异性免疫应答，如通过细胞毒性T淋巴细胞杀死含抗原的细胞，包括肿瘤细胞。抗原识别的同时，还需要共刺激信号来激活抗原特异性T淋巴细胞，这些信号是通过抗原呈递细胞上表达的CD80和CD40与其相应的配体，如T淋巴细胞表面表达的CD28和CD40L同时结合来实现的。

然而，活化的T淋巴细胞在一段时间后通过共抑制信号的激活而失活，从而防止由过度免疫刺激引起的组织损伤。有各种共抑制信号：例如，1)T淋巴细胞的CTLA4与抗原呈递细胞上的其配体CD80和CD86结合，并使幼稚或记忆T淋巴细胞失活。2)T淋巴细胞的PD1与在抗原呈递细胞上的其配体PDL1和PDL2结合，并抑制外周组织中T淋巴细胞的功能。人体的免疫功能通过在识别抗原的同时调节这些共刺激和共抑制信号来调控总体T淋巴细胞功能。这些信号被称为免疫检查点。

人体的免疫功能通过检测肿瘤细胞中表达的肿瘤特异性新生抗原来清除肿瘤细胞。相反，肿瘤细胞通过改变肿瘤微环境来激活抑制性免疫检查点，以逃避这些免疫攻击，或通过T淋巴细胞免疫耐受或免疫编辑来免避肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞的攻击。最近，已经发现通过激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞对各种癌症有治疗效果，如恶性黑色素瘤、肾癌或非小细胞肺癌，通过使用免疫检查点抑制剂(针对CTLA4、PD1或PDL1的单克隆抗体)，所述癌症被抑制。然而，免疫检查点抑制剂仅在某些癌症中有效，并且仅在患这些癌症的一些患者中有效，这表明不同类型的免疫抑制机制在各种癌症中起作用。

尽管免疫检查点抑制剂具有显著的癌症治疗效果，但治疗效果因患者而异。因此，许多对肿瘤微环境的特异性的研究正在积极进行，如癌症患者的CTLA4、PD1、PDL1或PDL2的表达水平和T淋巴细胞的数量，以及各种联合疗法。最近，已经发现免疫检查点抑制剂的癌症治疗效果根据患者肠道细菌的分布而变化，并且在动物实验中，特定的肠道细菌可以增加免疫检查点抑制剂的癌症治疗效果。然而，还没有发现这些特定的肠道细菌是如何以及源自肠道细菌的哪些物质增强了免疫检查点抑制剂的癌症治疗效果。

同时，据报道，所有细胞包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，都会天然释放胞外囊泡。源自革兰氏阴性菌的胞外囊泡也称为外膜囊泡。细菌的胞外囊泡的直径为20-200nm，具有多种生物活性物质，如蛋白质、脂类、遗传物质(DNA和RNA)和肽聚糖。从革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌释放的胞外囊泡也具有毒力因子，分别例如脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)。细菌的胞外囊泡通过内部特异性递送蛋白质或遗传物质和细胞信号而发挥通讯器的功能。它们还有助于杀死竞争性生物并提高细菌的存活。此外，它们向宿主细胞递送毒素，以调控细菌感染性疾病的发病机制。

最近，已经表明各种细菌的胞外囊泡对包括癌症在内的各种疾病具有直接的治疗效果，并且它们可以用作治疗这些疾病的药物载体。它们已经被作为疫苗载体在临床上使用或开发以预防或治疗各种疾病，如脑膜炎。

此外，细菌的胞外囊泡具有各种可以激活免疫系统的成分。由于细菌的胞外囊泡不含活细菌，它们比细菌本身更安全。据报道，在给荷瘤小鼠静脉内施用细菌的胞外囊泡后，细菌的胞外囊泡诱导长期抗肿瘤免疫应答，有效地消除肿瘤组织而没有显著的副作用(Nature Communications.8:626,2017)。此外，由于细菌的胞外囊泡是纳米大小的实体，它们通过高通透性和滞留(enhanced permeability and retention，EPR)效应在肿瘤组织中特异性积累。它们被认为可以通过诱导自然杀伤细胞和T淋巴细胞释放IFN-γ来诱导抗肿瘤免疫应答(Nature Communications.8:626,2017)。

然而，还没有细菌的胞外囊泡和具有不同作用机制的抗癌剂(包括免疫检查点抑制剂)的联合是否能够增强抗癌的治疗效果的说明。

发明内容

技术问题

本发明人试图开发用于增强癌症治疗效果的方法和用于治疗癌症的组合药物，其有效抑制肿瘤生长并且未表现出副作用。本发明人发现，通过联合施用细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂可以达到上述目的，并完成本发明。

技术方案

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种通过将细菌的胞外囊泡与免疫检查点抑制剂联合施用来增强细菌的胞外囊泡的癌症治疗效果的方法，以及一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其由细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂组成。

此外，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其本质上由细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂组成。

通常，革兰氏阴性菌由外膜和内膜(或细胞质膜)两层膜组成，而革兰氏阳性菌只有一层细胞膜(细胞质膜)。在本发明中，所述细菌的胞外囊泡总体上是指从细菌(包括经转化的细菌)中天然释放的膜囊泡(天然胞外囊泡)，以及人工产生的膜囊泡(人工胞外囊泡)。所述天然胞外囊泡称为胞外囊泡、外膜囊泡、脱落囊泡、微泡、微粒或外泌体，可以理解所有这些实体都包括在本发明所述的胞外囊泡中。

所述人工胞外囊泡是一种通过选自由挤压、超声处理、细胞裂解、pH变化、温度变化、均质化、冻融、电穿孔、机械破碎，以及用各种化学材料如抗生素或表面活性剂(清洁剂)或其组合对细菌(或包括经转化的细菌)进行处理组成的组的方法人工形成的膜囊泡。此外，可以理解，所有这些实体都包括在本发明所述的胞外囊泡中，并且形成人工胞外囊泡的方法不限于此。此外，对于革兰氏阴性菌，所述人工胞外囊泡包括外膜衍生的囊泡(OMDV)、内膜衍生的囊泡(IMDV)和内外膜衍生的胞外囊泡(例如，具有外膜和内膜成分的囊泡、内膜存在于外膜内的囊泡、外膜存在于内膜内的囊泡等)，以及细胞膜衍生的囊泡(CMDV)，包括OMDV、IMDV和内外膜衍生的囊泡，具有20nm-1000nm的直径。此外，可以理解，所有这些实体都包括在本发明所述的人工胞外囊泡中。

在本发明中，细菌的类型不受限制。具体地，所述细菌可以是革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

所述革兰氏阴性菌的例子可以包括埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、奈瑟菌属(Neisseria)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、醋杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、衣原体属(Chlamydia)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、硫杆菌属(Thiobacter)、疏螺旋体属(Borrelia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙雷氏菌属(Serratia)、密螺旋体属(Treponema)、文肯菌属(Rikenella)、另枝菌属(Alistipes)、海滑菌属(Marinilabilia)、变形杆菌属(Proteus)、栖水菌属(Enhydrobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、摩根氏菌属(Morganella)、贪铜菌属(Cupriavidus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)、军团菌属(Legionella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和莫拉氏菌属(Moraxella)。所述革兰氏阳性菌的实例可以包括芽孢杆菌属(Bacillus)、诺卡菌属(Nocardia)、梭菌属(Clostridium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、放线菌属(Actinomyces)、肠球菌属(Enterococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、李斯特氏菌属(Listeria)、乳杆菌属(Lactobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、微球菌属(Micrococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、厌氧菌属(Anaerostipes)、粪球菌属(Coprococcus)、奇异菌属(Atopobium)、普氏粪植杆菌属(Faecalibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)和拟杆菌属(Bacteroides)细菌等。

在本发明的一个方面，所述细菌可以是经转化的细菌。所述经转化的细菌包括经转化以减弱胞外囊泡的毒性的细菌，其实例可包括内毒素产生基因经删除或修饰的细菌。优选地，所述经转化的细菌可以是经转化从而msbB基因被删除(ΔmsbB)的细菌，更优选地是经转化从而msbB基因被删除的革兰氏阴性菌，最优选地是经转化从而msbB基因被删除的大肠杆菌(Escherichia coli)，但不限于此。

此外，所述细菌包括经转化以很好地释放胞外囊泡的细菌。

此外，所述细菌包括经转化以靶向特定细胞或组织的细菌，其实例可包括经转化以靶向肿瘤血管、肿瘤组织或肿瘤细胞的细菌。此外，用于本发明的细菌包括经转化以与靶细胞的细胞膜融合的细菌、经转化以表达用于治疗和/或诊断疾病的物质的细菌以及经转化以抑制特定物质并同时表达另一特定物质的细菌，但不限于此。

细菌细胞的转化可包括通过刺激细胞以增加或改变如蛋白质等物质表达的方法，以及通过基因导入以增加或抑制蛋白质表达的方法，但不限于此。

增加特定蛋白质表达的方法可以使用质粒DNA、RNA或噬菌体，并且可以使用所有通常已知的方法，例如热休克、磷酸钙沉淀、脂质体转染、电穿孔和显微注射。为了抑制特定蛋白质的表达，可以从细胞中去除特定的基因，并且可以使用所有通常已知的方法，例如使用反义RNA的方法。

在本发明的一个方面，其特征在于，所述细菌可以是在化学限定培养基中培养的细菌。

在本发明中，“化学限定培养基”不同于使用具有不明确组分的天然来源物质(如血清和组织提取物)的“天然培养基”，而是指仅使用具有明确组分和化学性质的物质制备的合成培养基。可优选的是，在化学限定培养基中培养细菌，以产生表现出均一效果的胞外囊泡。

在本发明中，化学限定培养基可选自由M9培养基、DMEM培养基(Dulbecco’smodified Eagle’s medium)和RPMI 1640培养基(Roswell Park Memorial Institutemedium1640)组成的组，但不限于此。

在本发明的一个方面，所述细菌可以经转化以表达一种或多种选自由免疫检查点蛋白、细胞粘附分子、包括免疫检查点抑制剂在内的各种抗体、增强治疗效果的蛋白质(细胞因子、趋化因子、生长因子)如IL-12或干扰素γ、靶向蛋白、细胞膜融合物质及其融合蛋白组成的组，但不限于此。这些物质可以通过使用各种蛋白质(例如外膜蛋白或内膜蛋白)的融合蛋白(例如，一种PrsA(一种内膜蛋白)和人表皮生长因子(EGF；一种靶向蛋白)的融合蛋白)而有效地显示在胞外囊泡的表面。

优选地，所述细菌可以是经转化以显示人免疫检查点蛋白(PD1、PDL1等)或其抗体以抑制胞外囊泡表面的免疫检查点抑制剂作用的细菌，更优选是经转化以表达人免疫检查点蛋白(PD1、PDL1等)或其抗体的革兰氏阴性菌，最优选是经转化以表达人免疫检查点蛋白(PD1、PDL1等)或其抗体的大肠杆菌，但不限于此。

在本发明的一个示例性实施方案中，用表达人EGF和细菌内膜蛋白PrsA的融合蛋白的pHCE-prsA-EGF载体转化大肠杆菌ΔmsbB(其中脂多糖的毒性减弱),以产生大肠杆菌ΔmsbB-prsA-EGF，并从中分离胞外囊泡。

在本发明的一个方面，所述药物组合物可以进一步包括抑制细菌的胞外囊泡毒性的药物、免疫检查点抑制剂及其组合。所述药物包括抑制由内毒素引起的毒性的药物(例如多黏菌素B)、包括地塞米松和阿司匹林的抗炎剂、抗凝血剂和环氧化酶(COX)抑制剂，但不限于此。

在本发明的一个方面，所述药物组合物可以进一步包括用于增加抗癌效果的药物。所述药物包括抗癌剂、干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、TGFβ抑制剂、用于抑制辅助性T细胞17(Th17)免疫应答的药物、用于抑制白细胞介素(IL)-6的产生或活性的药物、用于抑制血管内皮生长因子(VEGF)的产生或活性的药物、以及用于抑制信号转导子和转录激活子3(STAT3)的信号转导的药物，但不限于此。用于抑制Th17免疫应答的药物的实例可包括阿司匹林，用于抑制VEGF的产生或活性的药物的实例可包括用于抑制VEGF受体的信号转导的药物。

在本发明的一个方面，所述细菌的胞外囊泡的膜可以进一步包括除所述细菌的细胞膜以外的组分。

所述细胞膜以外的组分可以包括靶向物质、细胞膜融合物质(融合素)、环糊精和聚乙二醇。此外，所述细胞膜以外的组分可以通过各种方法加入，包括细胞膜的化学修饰。

例如，细菌的胞外囊泡的膜组分可以为使用巯基(-SH)或胺基(-NH2)的化学方法修饰的。细菌的胞外囊泡的膜组分也可以为通过化学结合至所述细菌的胞外囊泡的聚乙二醇化学修饰的。

因此，本发明所述的细菌的胞外囊泡可以进一步通过包括膜组分的化学修饰的步骤来制备。

本发明所述的细菌的胞外囊泡可以根据本领域已知的各种方法从细菌培养物中分离。从细菌培养物中分离胞外囊泡的技术类型没有特别的限制，例如，可以使用例如超速离心、密度梯度超速离心、超滤、尺寸排阻色谱、离子交换层析、免疫亲和捕获、基于微流体的分离、双水相系统或沉淀的方法。

在本发明中,“免疫检查点”是参与包括在免疫细胞表面诱导免疫反应的刺激性或抑制性信号，操纵癌细胞以防止免疫应答的刺激和抑制癌细胞的进展顺利而逃避免疫系统的监视的蛋白质的上位概念。优选地，免疫检查点蛋白可以包括程序性细胞死亡-1(PD1)、程序性细胞死亡配体1(PDL1)、程序性细胞死亡配体2(PDL2)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、分化簇70(CD70)、分化簇80(CD80)、分化簇86(CD86)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、分化簇137(CD137)、分化簇276(CD276)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)、4-IBB配体(4-1BBL)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)、腺苷A2A受体(A2aR)、含V-set结构域的T细胞活化抑制因子1(VTCN1)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和含粘蛋白结构域-3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、杀伤细胞凝集素样受体亚家族A(KLRA)，优选地为PDL1、TIGIT、CD80或CTLA4。

在本发明中，“免疫检查点抑制剂”是一种靶向该免疫检查点蛋白的拮抗剂，所述免疫检查点抑制剂能增强刺激免疫应答的蛋白或阻断抑制免疫应答的蛋白，从而通过免疫应答表现出抗癌效果。

在本发明的一个方面，所述免疫检查点抑制剂可以是蛋白质或肽，例如可溶性融合蛋白。在一个方面，所述蛋白质包括PD1、PDL1、PDL2、CD27、CD28、CD70、CD80、CD86、TIGIT、CD137、CD276、KIRs、LAG3、TNFRSF4、GITR、GITRL、4-1BBL、CTLA4、A2aR、VTCN1、BTLA、IDO、TIM3、VISTA或KLRA的受体/配体结合结构域(例如，胞外结构域)。在一个方面，所述受体/配体结合结构域可以与免疫球蛋白Fc结构域融合。这种融合蛋白可以通过标准的重组DNA技术制备(例如，参见Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.,eds.,John Wiley&Sons:1992)。此外，许多编码融合部分的表达载体已经是商业上可获得使用的。

在本发明的另一个方面，所述免疫检查点抑制剂可以是与待抑制的免疫检查点蛋白(例如PD1、PDL1、PDL2、CD27、CD28、CD70、CD80、CD86、TIGIT、CD137、CD276、KIRs、LAG3、TNFRSF4、GITR、GITRL、4-1BBL、CTLA4、A2aR、VTCN1、BTLA、IDO、TIM3、VISTA或KLRA)结合的抗体或其抗原结合片段。在本发明中，“抗体”可以指完整的抗体及其抗原结合片段。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单链抗体和抗原结合抗体片段。所述抗体的抗原结合片段指的是能够结合抗原的抗体的一个或多个片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、用二硫键连接的Fv、Fd、抗体二聚体(diabodies)、单链抗体、骆驼抗体、分离的CDR-H3和其他至少有完整抗体可变区的一部分的抗体片段。这种抗体片段可以使用常规的重组和/或酶技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选抗原结合。

在本发明的另一方面，所述免疫检查点抑制剂可以是抑制性核酸(例如siRNA分子、shRNA分子、反义RNA)，其特异性结合编码免疫检查点蛋白(例如PD1、PDL1、PDL2、CD27、CD28、CD70、CD80、CD86、TIGIT、CD137、CD276、KIRs、LAG3、TNFRSF4、GITR、GITRL、4-1BBL、CTLA4、A2aR、VTCN1、BTLA、IDO、TIM3、VISTA或KLRA)的mRNA。抑制性核酸分子可以通过化学合成、体外转录或通过Rnase III或Dicer剪切长dsRNA来制备。所述抑制性核酸分子可被递送至体外细胞或哺乳动物体内的肿瘤或缺氧组织。可以使用本领域已知的所有常规递送方式。例如，全身递送干扰RNA可以使用例如描述于PCT申请号PCT/US2009/036223(其中每一项都通过引用全部并入本文)的方法和组合物。在一个具体的实施方案中，所述抑制性核酸局部递送。例如，当使用本文所述的抑制性核酸治疗癌症时，向肿瘤的递送可以通过注射到肿瘤中进行，例如Takahashi et al.,Journal of Controlled Release 116:90-95(2006)和Kim et al.,Journal of Controlled Release 129:107-116(2008)中所述(其中每一项都通过引用全部并入本文)。

在本发明的一个方面，所述免疫检查点抑制剂可以选自由度伐利尤单抗(Durvalumab)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、BMS986016、西米普利单抗(Cemiplimab)和利瑞鲁单抗(Lirilumab)组成的组，但不限于此。

与一般的抗癌细胞毒性药物相比，免疫检查点抑制剂具有更少的副作用，例如呕吐和脱发，并且具有更高的治疗效果。由于他们利用具有良好记忆的免疫应答系统，所述治疗效果在停止给药后还能持续很长时间。然而，还不知道他们的抗癌作用是否通过与细菌的胞外囊泡联合而增强。因此，通过联合免疫检查点抑制剂和细菌的胞外囊泡的癌症治疗的协同效应可能是本发明的一个技术特征。

在本发明的一个方面，细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂可以同时地、依次地或分别地共同施用。在本发明中,“同时地”是指两种药物同时施用，而“依次地”是指一种药物在另一种药物施用后的5分钟内、10分钟内或几小时内给药。然而，提供首先施用药物的循环中的半衰期，以使两种药物以治疗有效剂量同时存在。此外，同时、依次或分别施用的方法不限于一次，并且这些施用方法可以重复或联合施用。

在一个方面，细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂可以与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂一起包含在相同组合物中。

在另一个方面，细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂可以以单独的药物形式或试剂盒形式提供。

在本发明的一个方面，癌症可以选自由胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、骨癌、非小细胞骨癌、血液系统恶性肿瘤、皮肤癌、头或颈癌、子宫癌、直肠癌、肛周癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、唾液腺癌、肉瘤、假粘液瘤、肝胚细胞瘤、睾丸癌、胶质母细胞瘤、唇癌、卵巢生殖细胞瘤、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、胆囊癌、脉络膜黑色素瘤、瓦特氏壶腹癌、腹膜癌、舌癌、小细胞癌、小儿淋巴瘤、成神经细胞瘤、十二指肠癌、输尿管癌、星形细胞瘤、脑膜瘤、肾盂癌、外阴癌、胸腺癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤组成的组，但不限于此。

如本发明所述的药物组合物可以仅包括细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂，或者可以与药学上可接受的载体，进一步包括赋形剂或稀释剂一起配制成合适的形式。所述载体包括所有种类的溶剂、分散介质、水包油或油包水乳剂、水性组合物、脂质体、微珠和微粒体。

本发明的组合物可以通过任何方法向包括人类在内的哺乳动物施用。例如，所述组合物可以口服或肠胃外给药。肠胃外给药方法可以包括静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药，但不限于此。

本发明的药物组合物可以根据如上所述的给药途径配制成用于口服给药或肠胃外给药的制剂。

本发明组合物的总有效剂量可以以单次剂量施用于患者，或者根据分次治疗方案，可以以长期多次剂量施用于患者。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可以根据疾病的严重程度而变化。优选地，本发明的药物组合物的优选总剂量可以是约0.01μg至10,000mg，最优选每天0.1μg至500mg每1kg患者体重。然而，药物组合物的有效剂量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况和性别、疾病的严重程度、饮食和排泄率以及配制方法、给药途径和治疗次数，本领域技术人员可以通过考虑这些因素来确定本发明组合物的合适有效剂量。如本发明所述的药物组合物不特别限于配方、给药途径和给药方法，只要显示出本发明的效果。

在本发明中，“靶细胞”统指参与结合细菌的胞外囊泡、表面修饰的胞外囊泡或免疫检查点抑制剂结合的细胞，或参与诱导生理刺激性或抑制性信号的细胞。所述靶细胞包括癌细胞、免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、骨髓源性抑制细胞等)、内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞，但不限于此。

本发明提供了细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂在制备癌症治疗剂中的用途。

本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂作为活性成分。

本发明的“有效剂量”是指当施用给受试者时，显示出改善、治疗、检测和诊断癌症、或抑制或减缓癌症进程的效果的量，并且所述“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人类在内的动物，也可以是来自动物的细胞、组织和器官。受试者可以是需要这些效果的患者。

本发明的“治疗”全面地指改善癌症或由癌症引起的症状，并且可以包括治疗或基本上预防癌症，或改善其状况，并且包括减轻、治疗或预防由癌症引起的症状或大部分症状，但不限于此。

本文使用的术语“包含”与“包括”或“特征在于”具有相同的含义，不排除在如本发明所述的组合物或方法中没有具体提及的额外成分或方法步骤。此外，除非另有说明，术语“由……组成”意味着排除额外的元件、步骤或成分。术语“本质上由……组成”是指除了在组合物或方法的范围内描述的物质或步骤之外，还包括对其基本特性没有实质性影响的物质或步骤。

有益效果

根据本发明，与使用每种药物的单一疗法相比，包含细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂(无论是单一类型还是两种或更多种类型的组合)作为活性成分的组合物在癌症治疗中表现出协同效应。所述组合物还表现出降低由单一药物的高剂量给药引起的副作用的效果。因此，通过提供增强癌症治疗效果的方法，所述组合物可以非常有效地用于开发癌症治疗剂。

附图说明

图1说明了向移植有结肠直肠癌细胞(CT26)的小鼠共同施用抗PD1抗体和天然胞外囊泡(^EGFEV^M9+)的实验方案。

图2，包括图2A和2B，说明了在对移植有结肠直肠癌细胞(CT26)的小鼠共同施用抗PD1抗体和天然胞外囊泡(^EGFEV^M9+)期间，测量动物的存活率、肿瘤体积、体重以及体温变化的结果。

图3，包括图3A至3G，说明了在向移植有膀胱癌细胞(MB49)的小鼠施用天然或人工胞外囊泡EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB后，通过流式细胞术分析肿瘤微环境中存在的细胞，确认免疫检查点蛋白(PDL1、CTLA4和CD80)表达变化的结果。

图4，包括图4A至4G，说明了在向移植有结肠直肠癌细胞(CT26)的小鼠施用天然或人工胞外囊泡EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB后，通过流式细胞术分析肿瘤微环境中存在的细胞，确认免疫检查点蛋白(PDL1、CTLA4和CD80)表达变化的结果。

图5说明了在向移植有膀胱癌细胞(MB49)的小鼠施用天然或人工胞外囊泡EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB后，通过qRT-PCR分析肿瘤微环境中存在的细胞来确认免疫检查点蛋白(IDO1)表达变化的结果。

图6，包括图6A至6F，说明了用天然或人工胞外囊泡EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB处理从移植有小鼠结肠直肠癌细胞(CT26)的小鼠中提取的脾细胞后，通过流式细胞术分析细胞，确认免疫检查点蛋白(PDL1和TIGIT)表达变化的结果。

具体实施方式

在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅是对本发明的说明，本发明的内容并不限于以下实施例。

实施例1:体内共同施用细菌的胞外囊泡(EV)和免疫检查点抑制剂的效果

实验方法

天然胞外囊泡的制备

如下表1所示，制备一种培养基(M9+)，其中将维生素和微量元素加入到M9化学限定培养基中。用表达人EGF和细菌内膜蛋白prsA的融合蛋白的pHCE-prsA-EGF载体转化大肠杆菌ΔmsbB(其中脂多糖的毒性减弱)，从而得到大肠杆菌ΔmsbB-prsA-EGF。使用M9+培养基培养经转化的细菌。

[表1]

将培养物两次在4℃下以6,000×g离心20分钟以除去细菌，并用0.45μm孔径的过滤器过滤上清液。然后，使用能够去除分子量小于100kDa的蛋白质的膜将过滤物浓缩50倍。用孔径为0.22μm的过滤器过滤浓缩物后，将过滤物在4℃、150,000×g超速离心3小时。将颗粒物悬浮在2.5mL的50％碘克沙醇中，放入5mL容量的超速离心管中，然后依次放入1.5mL的40％碘克沙醇和1.25mL的10％碘克沙醇。此后，通过在200,000×g、4℃超速离心2小时，从10％碘克沙醇和40％碘克沙醇之间的层中获得纯的细菌的胞外囊泡。

最后，分离出的细菌的胞外囊泡为天然胞外囊泡，命名为^EGFEV^M9+。

细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂的联合治疗

为了评估细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂组合的抗癌活性，将小鼠结肠直肠癌细胞(CT26，1×10⁶细胞/头)皮下施用给小鼠(BALB/c，雄性，5周龄)。施用肿瘤细胞五天后，将小鼠分成四个实验组，每组由五只小鼠组成(见表2)。将纯化的细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂单独或联合施用于每组，在实验中使用的免疫检查点抑制剂是抗PD1抗体(InVivoMAb抗小鼠PD1；Bio X Cell(莱巴嫩，新罕布什尔州，美国)，目录号BE0273)。首先，在施用肿瘤细胞后5天，每组施用PBS或免疫检查点抑制剂(Ab)。

在施用肿瘤细胞后6天，每组施用PBS或^EGFEV^M9+(EV)。在施用肿瘤细胞后9天，每组施用PBS或Ab，然后在施用肿瘤细胞后18天，每组再次施用PBS或Ab。最后，在施用肿瘤细胞后20天，每组施用PBS或Ab(图1)。

接下来，对于每个实验组，在施用肿瘤细胞后的第6天至第24天，每天监测小鼠的存活，并测量肿瘤体积。通过测量最长长度(l)和与其垂直的长度(s),用等式V＝l x s²/2计算肿瘤体积(V)。

此外，在施用肿瘤细胞后的第6天到第24天，每天连续观察各实验组中小鼠的体重和体温的变化。

[表2]

组号	PBS或Ab	PBS或EV
			1	PBS	PBS
2	PBS	EV(0.2μg)
			3	Ab(50μg)	PBS
4	Ab(50μg)	EV(0.2μg)

实验结果

实验结果如图2所示。

如图2所示，在PBS-PBS对照组、PBS-EV(0.2μg)和Ab(50μg)-EV(0.2μg)实验组中，没有小鼠死亡，而在Ab(50μg)-PBS实验组中，所有小鼠在第22天死亡(图2A)。

与PBS-PBS对照组相比，PBS-EV(0.2μg)和Ab(50μg)-EV(0.2μg)实验组中的最终肿瘤体积显著减小，并且Ab(50μg)-PBS实验组因为该组中的所有小鼠最终都死亡而不能进行比较。此外，与PBS-EV(0.2μg)实验组相比，Ab(50μg)-EV(0.2μg)实验组的最终肿瘤体积显著减小(图2B)。

因此，与单独施用EV或Ab的实验组相比，联合施用Ab和EV的组中的肿瘤生长显著降低，证实了协同效应。特别地，在单独施用Ab的实验组中，所有小鼠在第22天死亡，但是在联合施用Ab和EV的实验组中，直到实验结束都没有小鼠死亡，这表明两种药物的组合可以降低毒性。

在整个实验期间，对照组和所有实验组的体重和体温没有显著变化(图2C，图2D)。

实施例2：细菌的胞外囊泡的制备和表征

为了进行实验以寻找上述实施例1中证实的协同效应(联合细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂的协同效应)的科学基础，进行了一个额外的实验。额外的实验中使用的细菌的胞外囊泡是通过以下方法制备的。

天然胞外囊泡的制备

实验中使用的天然胞外囊泡来自大肠杆菌BL21(DE3)ΔmsbB，并根据2021年6月21日在韩国提交的KR10-2021-0080108的实施例4制备，最终分离出的天然胞外囊泡被称为EV^VP-LB。

人工胞外囊泡的制备

实验中使用的人工胞外囊泡包括细胞膜衍生的囊泡(CMDV)和外膜衍生的囊泡(OMDV)。为了分离CMDV和OMDV，使用基于植物蛋白胨的溶菌肉汤(VP-LB)培养大肠杆菌BL21(DE3)ΔmsbB-AmCyan。将培养物离心(6,000×g，15分钟)，弃去上清液以获得细菌细胞颗粒物，将其悬浮于载体-2(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，5％蔗糖)中。通过将悬浮液通过微流体装置(10,000psi，5次)来裂解细菌细胞，并离心(6,000×g，20分钟)以获得含有裂解的细胞片段的上清液。使用切向流过滤器(切向流过滤：>500kDa过滤器)将上清液浓缩3倍。将浓缩物分成两半，一半用于分离CMDV，另一半用于分离OMDV。

为了制备CMDV，在37℃下用Benzonase(终浓度：50单位/mL)和MgCl₂(终浓度：2mM)一起处理先前制备的浓缩物30分钟。此后，将载体-2以4倍体积加入浓缩物中，并使用切向流过滤器(>500kDa)浓缩5倍。随后，通过密度梯度超速离心分离CMDV(样品6.5mL，0.8M蔗糖3.0mL，2.5M蔗糖3.0mL；200,000×g，2小时)。

为了制备OMDV，在室温下用十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl，终浓度：1％)处理先前制备的浓缩物30分钟。此后，将载体-2以4倍体积加入浓缩物中，使用切向流过滤器(>500kDa)浓缩5倍。随后，在37℃下用Benzonase(最终浓度：50单位/mL)和MgCl₂(终浓度：2mM)一起处理浓缩物30分钟。此后，将载体-2以4倍体积加入浓缩物中，并使用切向流过滤器(>500kDa)浓缩25倍。随后，通过密度梯度超速离心分离OMDV(样品6.5mL，0.8M蔗糖3.0mL，2.5M蔗糖3.0mL；200,000×g，2小时)。

最终分离的CMDV和OMDV分别被称为CMDV^VP-LB和OMDV^VP-LB。

细菌的胞外囊泡的表征

按照以前的文献(Biomaterials.113:68-79,2017)描述，对分离的细菌的胞外囊泡进行了表征。首先，使用Zetasizer Nano ZS(马尔文仪器)通过动态光散射测量尺寸分布。此外，使用Bradford测定法测量蛋白质浓度和总蛋白质量，使用LM10-HS(马尔文仪器)通过纳米粒子追踪分析测量粒子浓度和总粒子数。

细菌的胞外囊泡的表征结果如下表3所示。

[表3]

实施例3：施用细菌的胞外囊泡后肿瘤微环境(TME)变化的分析

实验方法

将小鼠膀胱癌细胞(MB49：施用于C57BL/6；1×10⁶细胞/头)和结肠癌细胞(CT26：施用于BALB/c；1×10⁶细胞/头)皮下施用于小鼠(C57BL/6，雄性，7周龄和BALB/c，雌性，7周龄)，肿瘤生长7天。将小鼠分成每组5只小鼠，如下表2所示，肿瘤内施用EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB。在施用EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB后24小时，从每组中提取肿瘤组织，并通过流式细胞术或实时RT-PCR分析肿瘤微环境的变化。

[表4]

组号	样品
		1	载体-1(用于EV^VP-LB)
2	EV^VP-LB 5μg
		3	载体-2(用于CMDV^VP-LB和OMDV^VP-LB)
4	CMDV^VP-LB 10μg
		5	OMDV^VP-LB 10μg

载体-1：10mM L-组氨酸(pH 7.4)，107mM NaCl，2％蔗糖

载体-2：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，5％蔗糖

(1)肿瘤微环境的流式细胞术分析

使用文献(Methods Mol Biol.1458:95-110,2016)中描述的方法制备用于流式细胞术分析的细胞。将来自BD生物科学公司(BD Biosciences Co.,Ltd.)的抗PDL1和抗CTLA4用作抗体，将来自BD生物科学公司的LSR Fortessa(5激光)模型用作分析设备。

(2)肿瘤微环境的实时RT-PCR分析

使用文献(Invitrogen,TRIzol^TM试剂用户指南)中描述的方法制备用于实时RT-PCR分析的RNA，并且使用GoScirpt^TM逆转录酶试剂盒(Promega)将制备的RNA制备成cDNA。GAPDH被用作内部对照，在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行实时PCR，实时PCR所需的引物购自Bioneer。

实验结果

(1)肿瘤微环境的流式细胞术分析

通过流式细胞术对肿瘤微环境中存在的细胞进行了免疫检查点蛋白PDL1、CTLA4和CD80的表达变化的评估(图3A至3G和图4A至4G)。

首先，对给小鼠施用了小鼠膀胱癌细胞(MB49)的胞外囊泡的情况进行分析。与对照组相比，在EV^VP-LB施用组中，PDL1的表达增加了45.0％(27.7％→72.7％)，CTLA4的表达增加了43.3％(4.5％→47.8％)，CD80的表达增加了14.0％(48.6％→62.6％)(图3A至3C)。在CMDV^VP-LB施用组中，PDL1的表达增加了46.8％(41.5％→88.3％)，CTLA4的表达增加了71.9％(24.0％→95.9％)(图3D和3E)。同时，在OMDV^VP-LB施用组中，PDL1的表达增加了29.1％(41.5％→70.6％)，CTLA4的表达增加了65.3％(24.0％→89.3％)(图3F和3G)。

此外，还对给小鼠施用了小鼠结肠癌细胞(CT26)的胞外囊泡的情况进行了分析。与对照组相比，在EV^VP-LB施用组中，PDL1的表达增加了65.9％(27.9％→93.8％)，CTLA4的表达增加了61.5％(19.6％→81.1％)，CD80的表达增加了16.4％(71.5％→87.9％)(图4A至4C)。在CMDV^VP-LB施用组中，PDL1的表达增加了30.9％(11.5％→42.4％)，CTLA4的表达增加了38.8％(26.8％→65.6％)(图4D和4E)。同时，在OMDV^VP-LB施用组中，PDL1的表达增加了17.2％(11.5％→28.7％)，CTLA4的表达增加了33.9％(26.8％→60.7％)(图4F和4G)。

因此，当施用细菌的胞外囊泡时，小鼠肿瘤微环境中表达免疫检查点蛋白PDL1、CTLA4和CD80的细胞比例增加。

上述结果可以科学地解释联合实施例1的细菌的胞外囊泡和PDL1的协同效应。此外，除了PDL1抑制剂之外，当与能够抑制CD80和CTLA4的物质共同施用时，可以预期细菌的胞外囊泡的抗癌效果增加。

(2)肿瘤微环境的实时RT-PCR分析结果

通过实时RT-PCR测量免疫检查点蛋白IDO1的表达变化的结果如图5所示。

如图5所示，当施用EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB时，小鼠肿瘤微环境中免疫检查点蛋白IDO1的表达增加。因此，当与IDO抑制剂共同施用时，可以预期细菌的胞外囊泡的抗癌效果增加。

实施例4：细菌的胞外囊泡对脾细胞的影响的分析

脾脏是一个次级淋巴器官，其中存在各种免疫细胞并影响全身免疫应答。如果肿瘤存在，假设脾脏影响肿瘤组织并受其影响。因此，通过观察用细菌的胞外囊泡处理的荷瘤小鼠的脾细胞的变化，可以为癌症治疗提供重要的线索。

实验方法

对小鼠(BALB/c，雌性，7周龄)皮下施用结肠直肠癌细胞(CT26，1×10⁶细胞/头)。在施用肿瘤细胞后14天，取出脾脏，分离单个脾细胞。用EV^VP-LB、CMDV^VP-LB或OMDV^VP-LB(各1g/mL)处理分离的单个脾细胞24小时，并进行流式细胞术。使用如文献(Methods MolBiol.1458:95-110,2016)中描述的方法制备用于流式细胞术分析的细胞。将来自BD生物科学公司(BD Biosciences Co.,Ltd.)的抗PDL1和抗CTLA4用作抗体，将来自BD生物科学公司的LSR Fortessa(5激光)模型用作分析设备。

实验结果

给小鼠施用小鼠结肠直肠癌细胞(CT26)，用细菌的胞外囊泡处理从小鼠分离的脾细胞，并通过流式细胞仪进行分析。结果，免疫检查点蛋白PDL1和TIGIT的表达变化(图6A至6F)。

如图6A至6F所示，当用EV^VP-LB处理脾细胞时，PDL1的表达增加了26.9％(6.0％→32.9％)，TIGIT的表达增加了10.0％(15.0％→25.0％)(图6A和6B)。当用CMDV^VP-LB处理时，PDL1的表达增加了26.2％(7.0％→33.2％)，TIGIT的表达增加了14.3％(17.3％→31.6％)(图6C和6D)。同时，当用OMDV^VP-LB处理时，PDL1的表达增加了30.2％(7.0％→37.2％)，TIGIT的表达增加了10.7％(17.3％→28.0％)(图6E和6F)。

用细菌的胞外囊泡处理从荷瘤小鼠分离的脾细胞，并观察PDL1和TIGIT的表达，结果是PDL1和TIGIT的表达都显著增加。因此，可以合理地预期，当细菌的胞外囊泡与PDL1和TIGIT抑制剂联合施用时，抗癌效果可能增加。

工业适用性

根据本发明，与使用每种药物的单一疗法相比，包含细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂(无论是单一类型还是两种或更多种类型的组合)作为活性成分的组合物在癌症治疗中表现出协同效应。所述组合物还表现出降低由单一药物的高剂量给药引起的副作用的效果。因此，通过提供增强癌症治疗效果的方法，所述组合物可以非常有效地用于开发癌症治疗剂，因此工业适用性非常高。

Claims

1.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含细菌的胞外囊泡(extracellularvesicle)和免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor)作为活性成分。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌是革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述革兰氏阴性菌选自由埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Hemophilus)、奈瑟菌属(Neisseria)、蓝细菌属(Cyanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、醋杆菌属(Acetobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、衣原体属(Chlamydia)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、硫杆菌属(Thiobacter)、疏螺旋体属(Borrelia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙雷氏菌属(Serratia)和密螺旋体属(Treponema)组成的组。

4.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述革兰氏阳性菌选自由芽孢杆菌属(Bacillus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、梭菌属(Clostridium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、放线菌属(Actinomyces)、肠球菌属(Enterococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、李斯特菌属(Listeria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、加德纳菌属(Gardnerella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、微球菌属(Micrococcus)和链球菌属(Streptococcus)组成的组。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌为经转化的细菌。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述细菌为经转化以减弱所述胞外囊泡的毒性的细菌。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述细菌为内毒素产生基因经删除或修饰的细菌。

8.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述细菌为经转化以靶向特定细胞或组织的细菌。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌为在化学限定培养基中培养的细菌。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述化学限定培养基选自由M9培养基、DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和RPMI 1640培养基(Roswell ParkMemorial Institute medium 1640)组成的组。

11.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述细菌为经转化以表达一种或多种选自由细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合材料及其融合蛋白组成的组的细菌。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述细胞膜融合材料为人表皮生长因子(EGF)。

13.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌的胞外囊泡的膜进一步包含除所述细菌的细胞膜以外的组分。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述除所述细菌的细胞膜以外的组分选自由靶向材料、细胞膜融合材料、环糊精和聚乙二醇组成的组。

15.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌的胞外囊泡的膜组分为化学修饰的。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述细菌的胞外囊泡的膜组分为使用硫醇基或胺基进行化学修饰的，或为化学结合至所述细菌的胞外囊泡的聚乙二醇。

17.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌的胞外囊泡通过选自由超速离心、密度梯度超速离心、超滤、尺寸排阻色谱、离子交换层析、免疫亲和捕获、基于微流体的分离、双水相系统和基于聚合物的沉淀组成的组的方法分离。

18.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自由程序性细胞死亡-1(PD1)、程序性细胞死亡配体1(PDL1)、程序性细胞死亡配体2(PDL2)、分化簇27(CD27)、分化簇28(CD28)、分化簇70(CD70)、分化簇80(CD80)、分化簇86(CD86)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、分化簇137(CD137)、分化簇276(CD276)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)、4-IBB配体(4-1BBL)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)、腺苷A2A受体(A2aR)、含V-set结构域的T细胞活化抑制因子1(VTCN1)、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和含粘蛋白结构域-3(TIM3)、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、杀伤细胞凝集素样受体亚家族A(KLRA)及其组合组成的组。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂为蛋白质、肽、抗体、其抗原结合片段或抑制性核酸。

20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述抑制性核酸为siRNA、shRNA或反义RNA。

21.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自由度伐利尤单抗(Durvalumab)、阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、BMS986016、西米普利单抗(Cemiplimab)和利瑞鲁单抗(Lirilumab)组成的组。

22.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细菌的胞外囊泡和所述免疫检查点抑制剂同时地、依次地或分别地共同施用。

23.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述癌症选自由胃癌、肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、结肠癌、宫颈癌、骨癌、非小细胞骨癌、血液系统恶性肿瘤、皮肤癌、头或颈癌、子宫癌、直肠癌、肛周癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、唾液腺癌、肉瘤、假粘液瘤、肝胚细胞瘤、睾丸癌、胶质母细胞瘤、唇癌、卵巢生殖细胞瘤、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、胆囊癌、脉络膜黑色素瘤、瓦特氏壶腹癌、腹膜癌、舌癌、小细胞癌、小儿淋巴瘤、成神经细胞瘤、十二指肠癌、输尿管癌、星形细胞瘤、脑膜瘤、肾盂癌、外阴癌、胸腺癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤和垂体腺瘤组成的组。

24.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物通过口服方法或肠胃外方法施用于包括人类在内的哺乳动物。

25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述肠胃外给药方法选自由静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下和直肠给药。

26.一种细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂在制备癌症治疗剂中的用途。

27.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含细菌的胞外囊泡和免疫检查点抑制剂作为活性成分。