CN116042781A - 一种原位高通量检测rna与核糖体互作的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，提供了一种原位检测RNA与核糖体互作的方法，以及在检测过程中采用的锁式探针与18S rRNA引物探针的探针组合、解码探针和荧光探针。本发明的检测方法具有高信噪比、高通量编码能力、亚细胞分辨率、低成本、操作简便等优点，显著优于传统的翻译组学研究技术。

Description

一种原位高通量检测RNA与核糖体互作的方法及应用

技术领域

本发明涉及RNA与核糖体互作的检测技术，特别是涉及一种原位高通量检测RNA与核糖体互作的方法及应用，属于基因工程领域。

背景技术

基因表达在转录和翻译水平上都受到调控。对于许多基因来说，RNA和蛋白质水平的变化相关性不高，蛋白质丰度通常由翻译而不是转录主导。翻译调节是协调蛋白质合成的时间、数量和位置所必需的，也是包括细胞形态发生和迁移、有机体发育、细胞应激反应、记忆形成等生物学过程所必需的。

在过去，关于翻译机制的知识，大多来自标准而复杂的生化和分子生物学方法。各种涉及翻译的蛋白质和核酸在体外被纯化和重组从而进行机理研究。最近，一些基于测序的高通量分析方法通过揭示组学水平上RNA的翻译信息，革命性地改变了人们对翻译的看法，例如Ribosome Profiling等技术。然而翻译具有空间异质性，上述方法需要细胞从天然组织中解离，缺乏复杂组织中翻译事件的空间位置信息。因此如何原位检测细胞内的翻译活动越来越受到人们的重视。

目前原位检测翻译事件的主流方法是使用放射性标记的嘌呤霉素或者嘌呤霉素抗体标记新生多肽。由于嘌呤霉素无差异地掺入所有新生肽链，这些方法反映的是细胞内所有的翻译事件的整体情况。近期开发的基于蛋白特异性抗体和掺入新生肽链的嘌呤霉素邻接位置的特定RNA翻译研究方法则通量严重受限，且操作复杂，只能应用于活细胞。已开发出了基于原位杂交的可视化特异性RNA与核糖体相互作用的技术用于翻译研究：检测核糖体与RNA相互作用的荧光分析法(FLAIRM)，使用杂交链式反应(HCR)检测结合有核糖体的目标RNA分子，然而由于HCR天然的较强非特异性的限制，FLAIRM存在显著的探针非特异性结合产生的假阳性信号，无法进行高通量的应用。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供一种高通量、高特异性、高信噪比的原位检测RNA与核糖体互作的方法。

为此，本发明一方面提供了一种探针组合，其包含锁式探针和18S rRNA引物探针，其中所述的锁式探针与目标RNA靶向序列特异性结合。

在本发明优选的实施方案中，所述的锁式探针为挂锁状单链DNA，结合在目标RNA分子上，呈一个有缺口的环状单链DNA。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述的RNA靶向序列分为A，B两部分，所述锁式探针从5’端向3’端依次为A’序列、RNA特征序列、引物区序列C和B’序列，其中A’序列和B’序列分别与RNA靶向序列A、B两部分特异性结合，所述锁式探针的5’端进行磷酸化修饰。

在本发明优选的实施方案中，目标RNA靶向序列长度为32nt。

在本发明更加优选的实施方案中，A、B两部分长度均为16nt。

在本发明优选的实施方案中，RNA特征序列长度为25nt。

在本发明优选的实施方案中，引物区序列C长度为8nt。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述锁式探针的序列如SEQ ID No.1-8所示。

在本发明优选的实施方案中，所述的18S rRNA引物探针具有与核糖体18S rRNA裸露区靶向序列特异性结合的序列，以及与上述锁式探针特异性结合的序列。

在本发明优选的实施方案中，所述18S rRNA引物探针具有与上述锁式探针引物区序列C特异性结合的序列C’。

在本发明优选的实施方案中，所述18S rRNA引物探针为通用探针，适用于对真核生物任何基因进行检测。

在本发明优选的实施方案中，所述核糖体18S rRNA裸露区靶向序列长度为25nt。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述18S rRNA引物探针的序列如SEQ IDNo.9-32所示。

本发明另一方面提供了一种解码探针，其与RNA特征序列特异性结合，并且其具有侧翼序列，用于解码RNA的身份。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述解码探针的序列如SEQ ID No.33-34所示。

本发明另一方面提供了一种荧光探针，其与解码探针侧翼序列特异性结合，并且其3’端进行荧光标记。

在本发明优选的实施方案中，所述的荧光标记包括AF488、AF568、AF647、Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。

在本发明优选的实施方案中，所述荧光探针为通用探针，适用于对真核生物任何基因进行检测。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述荧光探针的序列如SEQ ID No.35-36所示。

本发明另一方面提供了本发明所述的探针组合、本发明所述的解码探针、或者本发明所述的荧光探针在原位检测RNA与核糖体互作中的应用。

本发明另一方面提供了一种检测试剂盒，其包含本发明所述的探针组合、本发明所述的解码探针、以及本发明所述的荧光探针。

本发明另一方面提供了本发明所述的检测试剂盒在原位检测RNA与核糖体互作中的应用。

本发明再一方面提供了一种原位检测RNA与核糖体互作的方法，包括如下步骤：

1、将本发明所述的探针组合中的锁式探针与目标RNA靶向序列特异性结合；

2、将目标RNA靶向序列作为夹板，通过DNA连接酶将锁式探针连接成环状单链DNA分子；

3、将本发明所述的探针组合中的18S rRNA引物探针与核糖体18SrRNA裸露区靶向序列特异性结合，以及与本发明所述的探针组合中的锁式探针特异性结合；

4、以上述环状单链DNA分子作为模板，18S rRNA引物探针作为引物，进行滚环扩增；

5、采用本发明所述的解码探针以及本发明所述的荧光探针，通过单分子荧光原位杂交，进行杂交成像，检测RNA与核糖体互作的空间位置信息。

在本发明优选的实施方案中，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。

本发明通过采用上述技术方案，获得了以下的有益效果：

1、本发明具有空间位置信息：本发明相比基于测序的翻译组检测技术，保留了RNA的原始空间位置。

2、本发明具有亚细胞分辨率：本发明基于成像，可实现单细胞水平上正在翻译的RNA的单分子检测。

3、本发明具有高通量检测能力：本发明可进行多轮灌流，结合多轮组合编码成像可实现数十到数百个基因的翻译状态检测。

4、本发明具有极高信噪比：本发明经过滚环扩增，信号得到显著放大，对较短的RNA翻译检测也非常友好。

5、本发明操作简便：本发明仅需几步探针杂交和酶促反应，即可实现原位的翻译状态的RNA检测。

综上所述，本发明将滚环扩增应用于核糖体和RNA的临近位置检测中，结合有核糖体的RNA信号被滚环扩增数千倍放大，在保留空间位置的同时检测了RNA的翻译状态，推动了高通量空间翻译组学的发展。

附图说明

图1为本发明RiboFISH检测单个基因的原理示意图及阴性对照示意图。

图2为本发明RiboFISH原位检测Hek293T细胞中eEF2 RNA及Malat1RNA翻译状态及阴性对照结果图。

图3为翻译抑制剂嘌呤霉素处理Hek293T细胞前后HybISS原位检测eEF2 RNA及本发明RiboFISH原位检测翻译状态eEF2 RNA的结果图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本申请进一步详细说明。通过这些说明，本申请的特点和优点将变得更为清楚明确。

实施例1：在Hek293T细胞中应用本发明RiboFISH原位检测eEF2 RNA及Malat1 RNA的翻译情况

本实施例的实验原理如附图1所示，具体步骤如下：

(一)探针设计

1、锁式探针设计

选择Hek293T细胞中的管家基因eEF2和非编码RNA(ncRNA)Malat1作为待测基因，筛选高特异性、GC含量适中、无显著二级结构的RNA序列作为靶向序列。为每种RNA分配不同的特征序列，用于信号读出和RNA的识别。根据每种RNA的特征序列，设计锁式探针序列，锁式探针序列与待测基因RNA的靶向序列特异性结合。锁式探针序列如表1所示(SEQ IDNO.1-8)。

表1锁式探针序列表

锁式探针	探针序列	修饰
			eEF2-1	TTGTCGGAGGTTGGCATAGAAACGGCCGGCTGACTAGCTCGAGGACAGTAGCAGACGTGAAGGCGTAGAACCGACCT	5’P
eEF2-2	TCGGTGAGGATGTTGGTAGAAACGGCCGGCTGACTAGCTCGAGGACAGTAGCAGACGTGAACACACCCTTGGTGATG	5’P
			eEF2-3	TTCAGGCCCTTGCGCTTAGAAACGGCCGGCTGACTAGCTCGAGGACAGTAGCAGACGTGAAGGCAGGGATGCCTTCT	5’P
eEF2-4	CCCTACTAAGAGGGCGTAGAAACGGCCGGCTGACTAGCTCGAGGACAGTAGCAGACGTGAAGACCGGCCCATTAAGT	5’P
			Malat1-1	TGCAGGGACGGTTGAGACGAGTACGTCGGCATTCGACCTGAAGGACAGTAGCAGACGTGAAAACTGAGCCCCAGCCT	5’P
Malat1-2	AAGCCGCCTGCTACCTACGAGTACGTCGGCATTCGACCTGAAGGACAGTAGCAGACGTGAAGTGTGGTTGCCAAGCC	5’P
			Malat1-3	GGAAGGCTCCATGGTTACGAGTACGTCGGCATTCGACCTGAAGGACAGTAGCAGACGTGAATGTCTCTCCTGCCACA	5’P
Malat1-4	AAAGCCCTCTCAGCCAACGAGTACGTCGGCATTCGACCTGAAGGACAGTAGCAGACGTGAATTTGCATTCCCACCCA	5’P

2、18S rRNA引物探针设计

筛选24条核糖体18S rRNA裸露区靶向序列，设计核糖体18S rRNA引物探针，作为滚环扩增的引物。该探针除具有与核糖体18S rRNA裸露区靶向序列特异性结合的序列之外，还具有一段与锁式探针序列特异性结合的引物序列。18S rRNA引物探针序列如表2所示(SEQ ID NO.9-32)。

表2 18S rRNA引物探针序列表

将上述锁式探针和18S rRNA引物探针进行组合，形成探针组合。

3、解码探针设计

根据RNA特征序列及其侧翼序列，设计解码探针序列，其与RNA特征序列特异性结合，用于解码RNA的身份。解码探针序列如表3所示(SEQ IDNO.33-34)。

表3解码探针序列表

解码探针	探针序列
		eEF2-e561	TAGAAACGGCCGGCTGACTAGCTCGAGGACTGTGATGGAAGTTAGAGGGT
Malat1-e647	ACGAGTACGTCGGCATTCGACCTGAAGGACTGAAAGGAATGGGTTGTGGT

4、荧光探针设计

根据解码探针序列，设计荧光探针序列，其与解码探针侧翼序列特异性结合，在荧光探针序列的3’端进行荧光标记。荧光探针序列如表4所示(SEQ ID NO.35-36)。

表4荧光探针序列表

荧光探针	探针序列	修饰
			R561	ACCCTCTAACTTCCATCACA	Cy3
R647	ACCACAACCCATTCCTTTCA	Cy5

(二)细胞培养及加药处理

Hek293T细胞接种至多聚赖氨酸预先处理过的玻片上，于37℃，5％ CO₂培养箱中培养24h；200μg/ml嘌呤霉素处理293T细胞1h。

(三)细胞固定

4％多聚甲醛(PFA)处理细胞10min以固定细胞，PBS补充2mM VRC(PBSV)洗涤细胞3次，充分去除残余的PFA。

(四)细胞通透

-20℃预冷甲醇于-80℃处理细胞15min，恢复至室温5min，PBS补充2mM VRC，0.1％Triton(PBSTV)洗涤细胞3次。

(五)锁式探针杂交

洗涤缓冲液a:20％甲酰胺，2x SSC，2mM VRC，预处理细胞5min；洗涤缓冲液a补充100nM锁式探针，加入样品反应体系，于37℃培养箱杂交24h；洗涤缓冲液a于37℃处理细胞30min，2次，去除未杂交的锁式探针。

(六)连接反应

将Splint R连接酶以1:20比例加入连接酶反应体系，于37℃孵育样品2h，进行锁式探针缺口连接；PBS补充0.5％小鼠RNA酶抑制剂(PBSR)，洗涤细胞3次。

(七)18S rRNA引物探针孵育

洗涤缓冲液b:30％甲酰胺，2x SSC，2mM VRC，预处理细胞30min，洗涤缓冲液b补充20nM 18S rRNA引物探针，加入样品反应体系，于37℃培养箱杂交12h；洗涤缓冲液b于37℃处理细胞30min，去除未杂交的18SrRNA引物探针。

(八)滚环反应

将Phi29 DNA聚合酶以1:50比例加入聚合酶反应体系，于30℃孵育样品2h，进行滚环扩增；PBS洗涤细胞3次。

(九)原位核酸杂交检测空间位置

洗涤缓冲液c:10％甲酰胺，2x SSC，预处理细胞5min，洗涤缓冲液c补充50nM eEF2及Malat1对应的解码探针，加入样品反应体系，于37℃培养箱杂交2h；洗涤缓冲液c于37℃处理细胞30min，去除未杂交的解码探针。

洗涤缓冲液c补充50nM eEF2及Malat1对应的荧光探针、0.1μg/ml DAPI，加入样品反应体系，杂交样品1h，PBS洗涤3次，去除未杂交的荧光探针，于转盘共聚焦显微镜进行双色成像，561nm为eEF2信号通道，647nm为Malat1信号通道，设置Z stack步长1μm进行多层成像，进行原位信号读出。

(十)结果分析

如说明书附图2所示，本发明RiboFISH检测到显著的翻译状态的eEF2RNA信号，对于不进行翻译的ncRNA Malat1，本发明RiboFISH检测到翻译状态Malat1信号的概率极低，两个阴性对照实验也进一步表明了本发明RiboFISH信号的准确性。

如说明书附图3所示，翻译抑制剂嘌呤霉素加药处理细胞后，本发明RiboFISH检测到的翻译状态的eEF2信号数目显著降低，表明了本发明RiboFISH可检测细胞内各RNA翻译状态的变化。

以上结合了优选的实施方式对本申请进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本申请进行多种替换和改进，这些均落入本申请的保护范围内。

Claims (23)

1.一种探针组合，其包含锁式探针和18S rRNA引物探针，其中所述的锁式探针与目标RNA靶向序列特异性结合。

2.根据权利要求1所述的探针组合，其中所述锁式探针为挂锁状单链DNA，结合在目标RNA分子上，呈一个有缺口的环状单链DNA。

3.根据权利要求1或2所述的探针组合，其中所述的目标RNA靶向序列分为A，B两部分，所述锁式探针从5’端向3’端依次为A’序列、RNA特征序列、引物区序列C和B’序列，其中A’序列和B’序列分别与RNA靶向序列A、B两部分特异性结合，所述锁式探针的5’端进行磷酸化修饰。

4.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的目标RNA靶向序列长度为32nt，A、B两部分长度优选均为16nt。

5.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的RNA特征序列长度为25nt。

6.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的引物区序列C长度为8nt。

7.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的锁式探针的序列如SEQ IDNo.1-8所示。

8.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的18S rRNA引物探针具有与核糖体18S rRNA裸露区靶向序列特异性结合的序列，以及与上述任一项权利要求所述的锁式探针特异性结合的序列。

9.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的18S rRNA引物探针具有与上述任一项权利要求所述的锁式探针引物区序列C特异性结合的序列C’。

10.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的18S rRNA引物探针为通用探针，适用于对真核生物任何基因进行检测。

11.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的核糖体18SrRNA裸露区靶向序列长度为25nt。

12.根据上述任一项权利要求所述的探针组合，其中所述的18S rRNA引物探针的序列如SEQ ID No.9-32所示。

13.一种解码探针，其与RNA特征序列特异性结合，并且其具有侧翼序列，用于解码RNA的身份。

14.根据权利要求13所述的解码探针，其序列如SEQ ID No.33-34所示。

15.一种荧光探针，其与解码探针侧翼序列特异性结合，并且其3’端进行荧光标记。

16.根据权利要求15所述的荧光探针，其中所述的荧光标记包括AF488、AF568、AF647、Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。

17.根据权利要求15或16所述的荧光探针，其为通用探针，适用于对真核生物任何基因进行检测。

18.根据上述任一项权利要求所述的荧光探针，其序列如SEQ ID No.35-36所示。

19.权利要求1-12任一项所述的探针组合、权利要求13或14所述的解码探针、或者权利要求15-18任一项所述的荧光探针在原位检测RNA与核糖体互作中的应用。

20.一种检测试剂盒，其包含权利要求1-12任一项所述的探针组合、权利要求13或14所述的解码探针、以及权利要求15-18任一项所述的荧光探针。

21.权利要求20所述的检测试剂盒在原位检测RNA与核糖体互作中的应用。

22.一种原位检测RNA与核糖体互作的方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求1-12中任一项所述的探针组合中的锁式探针与目标RNA靶向序列特异性结合；

(2)将目标RNA靶向序列作为夹板，通过DNA连接酶将所述的锁式探针连接成环状单链DNA分子；

(3)将权利要求1-12中任一项所述的探针组合中的18S rRNA引物探针与核糖体18SrRNA裸露区靶向序列特异性结合，以及与权利要求1-12中任一项所述的探针组合中的锁式探针特异性结合；

(4)以上述环状单链DNA分子作为模板，18S rRNA引物探针作为引物，进行滚环扩增；

(5)采用权利要求13或14所述的解码探针以及权利要求15-18中任一项所述的荧光探针，通过单分子荧光原位杂交，进行杂交成像，检测RNA与核糖体互作的空间位置信息。

23.根据权利要求22所述的方法，所述DNA连接酶为Splint R连接酶。

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