CN116033903A - 奎宁及其产生先天免疫应答的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于使用具有鼻上皮细胞的气液界面模型来测定病毒的感染性和对上呼吸道中此类病毒的潜在治疗；以及通过用刺激NO产生和/或抗微生物蛋白产生的苦味受体激动剂治疗来治疗上呼吸道病毒感染的方法和组合物。

Description

奎宁及其产生先天免疫应答的用途

技术领域

本发明一般地涉及用于治疗呼吸道病毒感染的方法和组合物。

背景技术

病毒性上呼吸道感染是儿童和成人最常见的疾病。这些包括多种甲型流感毒株，如H5N1禽流感、H1N1和H3N2“猪”流感、乙型流感、副流感病毒、人类偏肺病毒、鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞体病毒和冠状病毒。儿童通常每年经历7-8次此类感染，而成年人每年将经历3-4次病毒感染。由于成人患病或需要花更多的时间在家照顾生病的孩子，此类感染导致收入的重大损失。其中一些病毒与显著的发病率和死亡率有关。例如，由H5N1、H7N9、H1N1和H3N2v引起的甲型流感病毒暴发的死亡率在0.5-1.5％的范围内。腺病毒感染是儿童和成人结膜炎的一种病因，可导致免疫抑制者的致命感染。除了引起导致普通感冒的自限性上呼吸道感染的冠状病毒外，自2002年以来，出现了三种高致病性冠状病毒毒株：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和SARS-CoV-2，也称为COVID-19。

病毒SARS-CoV-2正在导致目前正在进行的大流行，全球确诊病例超过200万，死亡人数近15万。SARS-CoV-2的死亡率范围很广，从韩国的2％到其他国家的10％以上。MERS-CoV自2012年以来一直在进行，全球约有3,000例病例，但死亡率更高，为36％。2002年出现了SARS-CoV，在接下来的一年中，发现了近10,000例病例，死亡率为约10％。目前，还没有治疗SARS-CoV-2的方法，尽管至少有一种药物，瑞德西韦，一种阻断病毒复制的核苷类似物，可能具有临床活性。类似地，没有针对SARS-CoV-2的疫苗。

奎宁是一种从金鸡纳树树皮中分离出来的天然化合物，200多年来一直是治疗疟疾的药物。奎宁被英国人用作奎宁水和苦柠檬饮料混合剂的主要成分而流行起来，在热带地区，它们同样被用作预防疟疾的手段。奎宁是一种苦味化合物，可与苦味受体TAS2R4、TAS2R7、TAS2R10、TAS2R14、TAS2R31、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R43结合。苦味受体存在于II型味觉细胞上，也表达于纤毛鼻上皮细胞和呼吸系统、胃肠道的其他细胞以及它们在先天免疫功能中发挥作用的其他地方(Lee等人,JCI 2012,2014)。奎宁在小鼠模型中也表现出减少气道炎症(通过BAL、组织学(减少炎症浸润和气道增厚)和维持正常PFT。在专利出版物US2015/0017099A1中，奎宁被建议作为先天免疫系统的一部分，通过触发苦味受体信号传导通路而具有抗微生物作用。

随着SARS-CoV-2大流行和担忧的增加，而且没有治疗方法，仍然需要有效的治疗。此外，需要安全的抗病毒疗法来治疗上呼吸道病毒感染。

发明内容

本发明的一个方面是治疗患有上呼吸道感染的受试者中的病毒感染的方法，包括将苦味受体激动剂的制剂作为微粒分散；将所述分散的制剂施加到所述受试者的上呼吸道腔的粘膜表面上；以及通过刺激苦味受体生成NO产生或刺激抗微生物肽产生，或两者。苦味受体激动剂是引起导致NO产生或刺激抗微生物肽产生或其组合的苦味受体信号传导的激动剂。

在本发明的另一方面，存在使用气液界面检测鼻上皮病毒感染的方法，包括：在培养瓶中建立生长至融合的人鼻窦上皮细胞的细胞培养物；分化鼻窦上皮细胞；用已知感染哺乳动物上呼吸道的病毒毒株感染顶端表面上的上皮细胞；用苦味受体激动剂处理鼻窦上皮细胞；温育鼻窦上皮细胞；以及分析鼻窦上皮细胞培养物释放的病毒水平。

在一些实施方式中，苦味受体激动剂选自：苯甲地那铵、苯硫脲(PTC)、高丝氨酸内酯、硫氰酸钠(NaSCN)、6-正丙基硫脲嘧啶(PROP或PTU)、小白菊内酯、苦杏苷、五月茶(包括其提取物)、秋水仙碱、氨苯砜、水杨苷、白杨素、芹菜素、奎宁和奎宁盐。优选的激动剂是苯甲地那铵、苦艾素或奎宁及其盐。病毒感染可以是由选自以下的病毒引起的感染：SARS；SARS-CoV-2；MERS-CoV；SARS-CoV；甲型流感、乙型流感；副流感病毒；鼻病毒；腺病毒；人类偏肺病毒；呼吸道合胞体病毒；以及非致病性冠状病毒。优选地，使用鼻递送装置每天重复三次分散和施用步骤。鼻递送装置可选自将制剂施用于粘膜层的多种可用递送装置中的一种，并且可包括定量雾化吸入器、干粉吸入器、滴管、雾化器、喷雾器或灌洗器。

附图说明

图1A和图1B描述了当用0.1％奎宁在0.9％氯化钠中的溶液处理时IAV_NP和IAV_M1基因的减少。

图2A描述了SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N)的染色，如实施例中所述，以红色显示。

图2B描述了粘蛋白(MUC5AC)或β-微管蛋白的对照染色，如实施例中所述，以绿色显示。

图2C和图2D描述了在用于如实施例所述，年龄大于80岁的西班牙裔男性非吸烟者的ALI模型中的感染研究中的未处理的(图2C)和奎宁处理(图2D)细胞。

图2E和图2F描述了在用于如实施例中所述，50多岁的吸烟男性的ALI模型中的感染研究中的未处理(图2E)和奎宁处理(图2F)细胞。

图3A、图3B和图3C描述了感染MERS-CoV的人鼻窦ALI，其中MERS-CoV核衣壳蛋白(N)的染色显示为红色，而粘蛋白(MUC5AC)或β微管蛋白的对照染色显示为绿色，如实施例中所述。

图4A、图4B、图4C和图4D描述了感染SARS-CoV2(COVID-19)的人鼻窦ALI，其中SARS-CoV2核衣壳蛋白(N)的染色显示为绿色，如示例中所述。

具体实施方式

定义：

除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与由本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下文描述了优选的方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用其全部内容并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在是限制性的。

如本文所用，术语“包括(comprise(s))”、“包括(include(s))”，“具有(having)”、“具有(“has)”，“可以(can)”、“含有(contain(s))”及其变体旨在是不排除其他行为或结构可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。本公开还设想了“包括(comprising)”、“由...组成(consisting of)”和“基本上由...组成(consisting essentially of)”本文所呈现的实施方式或元件的其他实施方式，无论是否明确阐述。

如本文所用，“免疫应答”是指宿主免疫系统(例如哺乳动物的免疫系统)响应于抗原的引入的激活。免疫应答可以是细胞或体液反应的形式，或两者。

如本文所用，“先天免疫”是指受试者免疫系统的非特异性部分。先天免疫应答不像适应性免疫应答那样对特定病原体具有特异性。它们依赖于一组蛋白质和吞噬细胞，它们识别病原体的保守特征，并迅速被激活以帮助消灭侵入种。

如本文所用，“受试者”可指能够被施用本文描述的免疫原性组合物的哺乳动物。例如，哺乳动物可以是人类、黑猩猩、狗、猫、马、牛、兔子、土拨鼠、松鼠、小鼠、大鼠或其他啮齿动物。

如本文所用，“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”可指通过预防、抑制、阻遏或完全消除疾病的方式保护受试者免受疾病的影响。

对于本文中数值范围的阐述，明确考虑了其间具有相同精度的每个中间数字。例如，对于范围6-9，除了6和9之外，还考虑数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

描述

在第一方面，本发明涉及使用能够上调NO产生和/或抗微生物肽的苦味受体激动剂的组合物治疗呼吸道病毒感染，尤其是上呼吸道病毒感染的方法，所述激动剂优选为奎宁或其盐，且更优选为硫酸奎宁盐。所描述的方法包括通过分散装置(液体或固体形式)鼻内施用苦味受体激动剂奎宁的局部递送以在耳鼻咽喉道(或上呼吸道)中产生分散形式的组合物，从而提供对包括SARS；SARS-CoV-2；MERS-CoV；SARS-CoV；流感病毒，包括多种甲型流感毒株，如H5N1禽流感、H1N1和H3N2“猪”流感、和乙型流感；副流感病毒；鼻病毒；腺病毒；人类偏肺病毒；呼吸道合胞体病毒和非致病性冠状病毒的上呼吸道病毒的预防和/或治疗。

苦味信号传导除了具有检测进入口腔或鼻子的物质味道的功能外，还具有指示上呼吸道中存在细菌和在细菌感染期间激活先天免疫应答的功能。对苦味的第一反应是导致上呼吸道上皮细胞[Ca2+]升高的信号。当苦味受体被苦味受体激动剂激活时，细胞内钙浓度[Ca2+]升高，这也可能导致纤毛摆动频率(CBF)增加。

除[Ca2+]升高外，上皮细胞中苦味信号传导激活引起的第二种反应是分泌抗病毒产物，这是先天免疫应答的一部分。抗病毒产品包括许多肽，包括溶菌酶、乳铁蛋白和防御素，这些肽具有抑制或杀死病毒的活性。

苦味信号传导激活的另一个效应是一氧化氮(NO)产生。能够激活NO产生的苦味受体激动剂优选用于激活针对上呼吸道病毒感染的先天免疫应答。在这种苦味受体激动剂的一个实例中是奎宁包括其盐。

因此，对味觉信号传导通路的某些组分的干扰，即激活苦味信号传导和/或抗微生物肽产生，可用于激活上呼吸道中针对病毒感染的即时而有力的先天抗病毒应答。激活苦味信号传导以增强NO产生和/或抗微生物肽产生并由此增强先天抗病毒应答的任何组分可用于本发明。

通过苦味信号传导的NO产生和/或抗微生物肽产生的激活优选通过激活多个苦味受体来实现。已知有25种苦味受体属于T2R家族。不同的苦味受体可能对同一激动剂具有不同的亲和力。因此，使用苦味受体激动剂激活苦味信号传导将具有不同程度的活性，这取决于激动剂可能与哪些苦味受体结合。

在优选的实施方式中，能够激活NO产生和/或刺激抗微生物蛋白产生的苦味受体激动剂包括苯甲地那铵、苯硫脲(PTC)、高丝氨酸内酯、硫氰酸钠(NaSCN)、6-正丙基硫脲嘧啶(PROP或PTU)、小白菊内酯、苦杏苷、五月茶(包括其提取物)、秋水仙碱、氨苯砜、水杨苷、白杨素、芹菜素、奎宁和奎宁盐。

在一些实施方式中，刺激鼻窦上皮细胞中一氧化氮(NO)产生的奎宁可用作激活苦味信号通路的试剂。同时，在一些实施方式中，刺激鼻窦上皮细胞中抗微生物肽产生的苦味受体激动剂可用作激活苦味信号通路的试剂。在其他实施方式中，来自五月茶属(Anti-desma sp.)(例如，五月茶(Anti-desmabunius))果实或其他部分的提取物或化合物可用作激活苦味信号通路的试剂。来自五月茶属(Antidesma sp.)的提取物或化合物可刺激鼻窦上皮细胞中的NO产生，包括奎宁或其盐。奎宁是一种碱性胺，通常以盐的形式提供，其包括盐酸盐、二盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐和葡糖酸盐，优选为硫酸盐。

在优选的实施方式中，苦味受体激动剂能够通过苦味信号传导通路刺激抗微生物肽产生，其包括苯甲地那铵和苦艾素。由苯甲地那铵刺激的抗病毒产品至少是蛋白质的。另一种受刺激的抗微生物肽是β-防御素2，它是由苯甲地那铵和/或苦艾素诱导的。对味觉信号传导通路的某些组分的干扰，即激活苦味信号传导可用于激活上呼吸道中即时而有力的先天抗病毒应答。激活苦味信号传导并由此增强先天抗病毒应答的任何组分可用于本发明中。

药物组合物

本发明的组合物优选用药学上可接受的载体配制。优选的组合物是可分散的组合物，使得苦味受体激动剂可被递送至ENT道中的粘膜层，优选上呼吸道，并且优选递送至邻近苦味受体的粘膜层。

本文提供的组合物可以通过直接或间接方式施用。直接方式包括鼻喷雾剂、滴鼻液、鼻软膏剂、鼻冲洗剂、鼻灌洗、鼻填塞、支气管喷雾剂和吸入器，或这些和类似施用方法的任何组合。间接方式包括使用咽喉锭剂、漱口水或漱口剂，或使用涂抹在鼻孔、鼻梁上的软膏剂，或这些和类似施用方法的任何组合。

根据期望的施用方法，组合物可能具有不同的粘度要求。在一个实施方式中，组合物具有足够高的粘度，以确保组合物可粘附于粘膜足够长的时间，以诱导NO介导的对病毒的天然免疫和/或刺激抗微生物肽产生。换句话说，一旦将组合物施用到ENT道粘膜上，由于粘度相对较高，组合物不容易在该道中流动，和/或增加了组合物在期望粘膜上的停留时间。

在其他实施方式中，可能期望组合物具有相对低的粘度。例如，当期望的施用方法为鼻灌洗时，通常将组合物相对大量地施用到鼻腔。灌洗有两个功能：一个是冲洗掉上呼吸道的粘液和葡萄糖，另一个是提供活性成分以诱导抗病毒活性。因此，为了实现鼻灌洗的两个功能，可能期望具有相对低粘度的制剂。一个优选实施方式使用苦味激动剂(苯甲地那铵或苦艾素)洗脱窦支架作为半刚性制剂以刺激抗微生物肽产生。

在一个示例性实施方式中，可将组合物雾化并喷涂到ENT道粘膜上，优选地，上呼吸道粘膜上。雾化可以使细小的液滴深入鼻窦和ENT道的其他部分。

先天抗病毒活性对盐敏感，可能是因为抗病毒肽如溶菌酶、乳铁蛋白、抗菌肽(cathelicidin)和β-防御素被紧张地分泌到呼吸道中。因此，这些肽的抗病毒活性可能对离子强度(这导致电荷)敏感。本发明的组合物优选用低强度的离子配制。离子强度可高达约306mEq/L，与间隙流体中的离子强度相同。优选的离子强度为约50％的PBS(约150mEq/L的离子)。离子强度的优选范围为约150-200mEq/L。

制剂中的离子强度可随递送体系而变化。较高体积的递送体系(Netti-Pot)将允许溶液更接近最佳离子强度范围(150-200mEq/L)，因为与粘液混合的效果将是最小的。较低体积的递送体系可能需要治疗溶液中甚至更低的离子强度。在一个实施方式中，配制组合物使得施用到上呼吸道后的最终离子强度优选在150-200mEq/L的范围内。

通常，本发明的组合物可以是液体和/或气雾剂的形式，包括但不限于溶液、悬浮液、部分液体、液体悬浮液、喷雾剂、喷雾剂(nebulae)、薄雾、雾化蒸汽和酊剂。在其他实施方式中，组合物可以是能够以微粒形式分散到ENT道粘膜上的干粉形式。

在鼻腔递送的实施方式中，水溶液和悬浮液可具有10μl-2500μl、20μl-2500μl、30μl-2500μl、40μl-2500μl、50μl-2500μl、60μl-2500μl、70μl-2500μl、80μl-2500μl、90μl-2500μl、100μl-2500μl、110μl-2500μl、120μl-2500μl、130μl-2500μl、140μl-2500μl、150μl-2500μl、10μl-2000μl、20μl-2000μl、30μl-2000μl、40μl-2000μl、50μl-2000μl、60μl-2000μl、70μl-2000μl、80μl-2000μl、90μl-2000μl、100μl-2000μl、110μl-2000μl、120μl-2000μl、130μl-2000μl、140μl-2000μl、150μl-2000μl、10μl-1500μl、20μl-1500μl、30μl-1500μl、40μl-1500μl、50μl-1500μl、60μl-1500μl、70μl-1500μl、80μl-1500μl、90μl-1500μl、100μl-1500μl、110μl-1500μl、120μl-1500μl、130μl-1500μl、140μl-1500μl、150μl-1500μl、10μl-1000μl、20μl-1000μl、30μl-1000μl、40μl-1000μl、50μl-1000μl、60μl-1000μl、70μl-1000μl、80μl-1000μl、90μl-1000μl、100μl-1000μl、110μl-1000μl、120μl-1000μl、130μl-1000μl、140μl-1000μl、150μl-1000μl、10μl-500μl、20μl-500μl、30μl-500μl、40μl-500μl、50μl-500μl、60μl-500μl、70μl-500μl、80μl-500μl、90μl-500μl、100μl-500μl、110μl-500μl、120μl-500μl、130μl-500μl、140μl-500μl、150μl-500μl、10μl-250μl、20μl-250μl、30μl-250μl、40μl-250μl、50μl-250μl、60μl-250μl、70μl-250μl、80μl-250μl、90μl-250μl、100μl-250μl、110μl-250μl、120μl-250μl、130μl-250μl、140μl-250μl、150μl-250μl、10μl-200μl、20μl-200μl、30μl-200μl、40μl-200μl、50μl-200μl、60μl-200μl、70μl-200μl、80μl-200μl、90μl-200μl、100μl-200μl、110μl-200μl、120μl-200μl、130μl-200μl、140μl-200μl、150μl-200μl、10μl-180μl、20μl-180μl、30μl-180μl、40μl-180μl、50μl-180μl、60μl-180μl、70μl-180μl、80μl-180μl、90μl-180μl、100μl-180μl、110μl-180μl、120μl-180μl、130μl-180μl、140μl-180μl、150μl-180μl、10μl-160μl、20μl-160μl、30μl-160μl、40μl-160μl、50μl-160μl、60μl-160μl、70μl-160μl、80μl-160μl、90μl-160μl、100μl-160μl、110μl-160μl、120μl-160μl、130μl-160μl、140μl-200μl、10μl-140μl、20μl-140μl、30μl-140μl、40μl-140μl、50μl-140μl、60μl-140μl、70μl-140μl、80μl-140μl、90μl-140μl、100μl-180μl，且优选50μl-140μl的给药体积范围可在，以及用于加压定量雾化吸入器(pMDI)中的溶液或悬浮液。递送体积可以在10μl-10,000μl、25μl-9,000μl、50μl-8,000μl、100μl-7,000μl、100μl-6,000μl、100μl-5,000μl、100μl-4,000μl、100μl-3,000μl、100μl-2,000μl、100μl-1,000μl、25μl-10,000μl、25μl-9,000μl、25μl-8,000μl、25μl-,000μl、25μl-6,000μl、25μl-5,000μl、25μl-4,000μl、25μl-3,000μl、25μl-2,000μl、25μl-1,000μl、25μl-900μl、25μl-800μl、25μl-700μl、25μl-600μl、25μl-500μl、25μl-400μl、25μl-300μl、25μl-200μl、25μl-100μl、25μl-75μl，且优选25μl的范围内。悬浮制剂中API的主要粒径还需要考虑给药过程中递送的液滴尺寸以及一旦沉积在鼻腔中，它可能对颗粒溶解产生的任何影响。

适用于递送至上呼吸道鼻腔的本发明的组合物的pH/缓冲液包括：鼻腔内部的pH可影响可电离药物的吸收速率和程度。据报道，平均基线人类鼻腔pH为约6.3，且几种可商购鼻喷雾产品的pH在3.5至7.0的范围内。在本发明的一些实施方式中，鼻制剂的pH范围可为4.5至6.5。在一些实施方式中，组合物的渗透压可以在以下范围内：100m-1000m、100m-900m、100m-800m、100m-700m、200m-1000m、200m-900m、200m-800m、200m-700m、300m-3000m、300m-900m、300m-800m、或优选300m-700m Osmol/K。

本发明的组合物可包含一种或多种选自增稠剂、防腐剂、乳化剂、着色剂、增塑剂和溶剂的附加常规组分。

可用于调节组合物粘度的增稠剂包括本领域技术人员已知的增稠剂，例如化妆品和制药行业中常用的亲水性和水醇性胶凝剂。在一些实施方式中，增稠剂包括海藻酸、海藻酸钠、纤维素聚合物、卡波姆聚合物(卡波普)、卡波姆衍生物、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯醇、泊洛沙姆

多糖(例如壳聚糖等)、天然树胶(例如阿拉伯树胶(arabic)、黄芪胶、黄原胶和瓜尔胶)、明胶、膨润土、蜂蜡、硅酸镁铝

等，及其混合物。优选地，亲水性或水醇性胶凝剂包括

(B.F.Goodrich,Cleveland,Ohio)、

(Kingston Technologies,Dayton,N.J.)、

(Aqualon,Wilmington,Del.)、

(Aqualon,Wilmington,Del.)或

(ISP Technologies,Wayne,N.J.)。其他优选的胶凝聚合物包括羟乙基纤维素、纤维素胶、MVE/MA癸二烯交联聚合物、PVM/MA共聚物或其组合。在一个优选方面，通过掺入增稠剂来调节组合物和制剂的粘度，并且优选地使得奎宁制剂增加在ENT内粘膜上的停留时间。

防腐剂也可用于本发明的组合物中，且优选占组合物重量的约0.05％至0.5％。防腐剂的使用确保如果产品受到微生物污染，制剂将防止或减少不必要的微生物生长。可用于本发明的一些防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯扎氯铵、西曲溴铵(又名溴化十六基三甲基铵)、西吡氯铵、苄索氯铵、烷基三甲基溴化铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、乙醇、苯乙醇、苄醇、甾醇、苯甲酸、山梨酸、氯乙酰胺、三氯碳酰替苯胺、硫柳汞、咪唑烷基脲、拌棉醇、氯己定、4-氯甲酚、双氯酚、六氯酚、氯二甲酚、4-氯二甲酚、苯甲酸钠、DMDM乙内酰脲、3-碘-2-丙基氨基甲酸丁酯、山梨酸钾、葡萄糖醛酸氯己定或其组合。

合适的溶剂包括但不限于，水或醇类，例如乙醇、异丙醇和二醇类，包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油和聚氧乙烯醇。极性溶剂还包括质子溶剂，包括但不限于水、含有一种或多种药学上可接受的盐、醇、二醇类或其混合物的盐水溶液。在一个替代实施方式中，用于本制剂的水应满足或超过用于药物的适用法规要求。

一种或多种乳化剂、润湿剂或悬浮剂可用于组合物中。本文使用的此类试剂包括但不限于，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酯或聚山梨醇酯，包括但不局限于聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(聚山梨醇酯80)、聚山梨醇酯20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、聚山梨醇酯65(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三硬脂酸酯)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单硬脂酸酯；卵磷脂；海藻酸；海藻酸钠；海藻酸钾；海藻酸铵；海藻酸钙；海藻酸丙烷-1,2-二醇酯；琼脂；角叉菜胶；刺槐豆胶；瓜尔胶；黄芪胶；阿拉伯树胶；黄原胶；刺梧桐胶；果胶；酰胺化果胶；磷脂铵；微晶纤维素；甲基纤维素；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；乙基甲基纤维素；羧甲基纤维素；脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的乙酸酯；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的乳酸酯；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的柠檬酸酯；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的酒石酸酯；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的单-和双乙酰酒石酸酯；脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的混合乙酸和酒石酸酯；脂肪酸蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸聚甘油酯；蓖麻油缩聚脂肪酸的聚甘油酯；脂肪酸丙-1,2-二醇酯；硬脂酰-2-乳酸钠；硬脂酰-2-乳酸钙；酒石酸硬脂酰酯；山梨糖醇酐单硬脂酸酯；山梨糖醇酐三硬脂酸酯；山梨糖醇酐单月桂酸酯；山梨糖醇酐单油酸酯；山梨糖醇酐单棕榈酸酯；皂树提取物；大豆油二聚脂肪酸的聚甘油酯；氧化聚合大豆油；和果胶提取物。

更优选用于鼻递送本文描述的组合物包括美国FDA鼻产品非活性成分指南(IIG)中列出的有限数量的赋形剂，其包括：

递送和施用

任何装置可用于将本发明的组合物作为微粒施用在ENT道粘膜上，包括但不限于球泡、吸入器、罐、喷雾器、喷雾器/雾化器、吸管、滴管和面罩。在一个实施方式中，只要容器材料与制剂相容，则将组合物包装在常规喷雾施用容器中。在优选的实施方式中，将本发明的组合物包装在适于将组合物作为薄雾直接分散到每个鼻孔中的容器中。例如，容器可以由柔性塑料制成，使得挤压所述容器将薄雾通过喷嘴挤出到鼻腔中。备选地，小泵或另一物理制动器如活塞可以将空气泵入容器并使液体喷雾射出。

在替代实施方式中，本发明的组合物被包装在容器中，该容器用对使用者和组合物成分惰性的气体加压。气体可以在压力下溶解在容器中，或者可以通过固体材料的溶解或反应产生，其作为溶解产物或作为反应产物形成气体。可使用的合适惰性气体包括氮气、氩气和二氧化碳。

此外，在其他实施方式中，组合物可与液体推进剂如二氯二氟甲烷、氯三氟乙烯或一些其他常规推进剂一起包装在加压容器中。

在一些实施方式中，本发明的组合物包装在计量剂量喷雾泵或计量雾化泵中，使得泵的每次致动都将固定体积的制剂(即，每个喷雾单元)作为微粒物质递送。

对于以逐滴方式施用，本发明的组合物可适当地包装在配备有常规滴管/闭合装置的容器中，该容器包括吸管等，优选地还递送基本上固定体积的制剂。

递送装置

适合于递送苦味受体激动剂的一类递送装置是定量雾化吸入器。计量剂量量吸入器提供多种优点，如便携性、无需外部电源以及递送固定剂量的制剂。通过加压定量雾化吸入器(pMDI)可以有效地雾化递送药物。pMDI是一种加压系统，由推进剂、调味剂、表面活性剂、防腐剂和活性药物组合物组成的混合物。当混合物通过计量阀和阀杆从递送装置中释放时，通过pMDI进行药物递送，该阀杆安装在致动器罩的设计中。致动器设计的较小变化可影响气雾剂特性和加压定量雾化吸入器的输出。较新的pMDI可分类为协调装置或呼吸驱动装置。呼吸驱动的pMDI，如

是一种旨在克服患者呼吸和吸入器驱动之间协调不良问题的装置。

装置根据患者的呼吸速率工作，并自动调整装置激活的触发器灵敏度。pMDI是呼吸协调的，设计用于同步吸入速率和吸入器的剂量释放。pMDI的可靠性可以通过药物致动和患者变异性之间的协调吸入流速来确定。为了减少pMDI排放后的液滴尺寸，Kelkar和Dalby提出了一种更聪明的方法，即向氢氟烷烃-134和乙醇共混物中添加溶解的CO2减小液滴尺寸。间隔物作为管或延伸装置的优点在于，它被放置在患者和pMDI装置之间的界面处。使用诸如AeroChamber

的VHC(带阀保持室)可吸入并防止呼气进入由吹口端单向阀组成的室中。VHC的优点在于它不需要呼吸协调，因为它使患者能够从站立的气雾剂云状物中呼吸。静电沉淀现象减少了pMDI的剂量递送。吸入式药物递送装置，如较新的间隔装置和VHC，由于其由抗静电聚合物构成，因此有助于将发射的颗粒粘附到间隔物的内壁降低到最小程度。新一代间隔物可以指示患者是有效地吸入还是不符合治疗要求。粒径范围非常窄的单分散气雾剂可将药物递送至肺部最有效的特定区域。然而，由于较小的颗粒更容易通过肺泡吸收到肺循环中，这些制剂可能与较高的全身副作用发生率有关。

适于递送苦味受体激动剂的另一递送装置是干粉吸入器。干粉吸入器(DPI)以干粉的形式将药物递送到ENT道粘膜层。干粉吸入器的制剂递送雾化的药物粉末，其中制剂受到较大的分散力，以解团聚成单个颗粒。设计了一系列装置，如肺部输药器(Clickhaler)、Multihaler和Diskus，它们能够将粉末送入高速气流，将聚集的颗粒分离，从而获得可呼吸的颗粒。旋转式吸入器(Spinhaler)和Turbuhaler装置取决于颗粒和装置表面之间的碰撞导致的解团聚机制。干粉吸入器的设计受到一个限制，即装置中流速和吸入器阻力之间的平衡。在干粉吸入器中，需要更快的气流来增加颗粒解团聚，并且通过更强的碰撞可以获得更高的细颗粒分数。虽然干粉吸入器存在与递送到肺部有关的问题；将所述组合物施用到ENT道粘膜不需要相同水平的渗透(到肺)，因此避免了这些问题。

DPI系统的性能取决于粉末制剂和吸入器装置的性能。目前正在探索基于呼吸激活或动力驱动机制的不同粉末制剂(单剂量或多剂量粉末吸入器)的现代装置。目前市场上销售的被动装置依靠患者的吸气气流将粉末分散到单个颗粒中。DPI装置可以通过控制患者自身所需吸气努力的气流阻力的差异来区分。为了从吸入器装置获得最大剂量，应适当产生吸气流速，这在装置阻力增加期间变得困难。

干粉吸入器可根据一些因素进行相应分类，例如粉末分散机制、装置中的装载剂量数量以及患者对粉末雾化装置的依附性和协调性。在单剂量DPI中，剂量在单个胶囊内配制。单剂量递送的机制是，患者在每次施用之前必须给装置装载一个胶囊。单剂量DPI可进一步分类为可重复使用或一次性装置，而多单位剂量DPI的优点是，在施用前，它不必重新装载，因为它使用工厂计量和密封的包装剂量，以便装置可以同时容纳多个剂量。Rotahaler^TM和Spinhaler^TM，它们是单剂量装置，也是第一个被动上市的干粉吸入器。在Rotahaler^TM中，粉末剂量装载在装置中的胶囊内。

一次性干粉吸入器可以设计用于口服药物递送，因为它们使用经济。MDI以紧凑和便携的包装提供降低成本和方便的药物递送。基于胶囊的DPI技术用于治疗应用，这是上世纪中期随着

用于抗生素递送而引入的。20世纪60年代末推出的下一个装置是

因为它是第一个在明胶胶囊中含有支气管活性药物粉末制剂的DPI，其可在患者施用之前装载到装置中。这样的装置可以被修改以使该装置能够将大部分或全部分散的粉末递送到ENT道的粘膜。在一些实施方式中，可用的递送选项，主要是DPI，由与较大载体颗粒(通常为乳糖)共混的细粉末药物(粒度<5μm)组成。乳糖的存在有助于改善药物制剂雾化递送之前的粉末流动。吸入或主动强制分散期间的粉末制剂可沉积在鼻腔或口腔的靶向区域。已经发现，细长的其他颗粒通过颗粒的不稳定相互作用而释放更高的细颗粒部分。药物和载体颗粒之间的相互作用对制剂的性能很重要。表面结构的不规则性避免了颗粒之间的更紧密的相互作用，并且在空气动力学应力作用下，相互分离没有困难。胶囊表面特性的改变可用于改变粉末保留率，以达到制剂和装置内的最佳性能目标。

最近基于胶囊的DPI的实例。这是一种单剂量DPI系统，采用改进的Aerolizer技术，由旨在改进装置管理和外观的设计更改组成Breezhaler是另一种用于从胶囊中递送药物的装置。与基于胶囊的DPI系统的HandiHaler装置(0.22cmH2O/L/min)相比，该装置的设计具有更低的内部气流阻力(0.15cmH2O/L/min)。

Turbuhaler是一种装置，它在储液器中存储多达200剂药物，并以两倍于pMDI的效率递送药物。Turbuhaler中含有微粉化药物的原始制剂仅含有纯药物，尽管在最近的制剂中，活性药物与与药物颗粒大小相似的乳糖颗粒共混。有最先进的不同类型的喷雾器以纳米级的形式递送制剂。新型智能药物载体的发展得益于纳米技术的进步和先进的液体喷雾形式，使得这些智能雾化颗粒能够被递送。喷雾装置旨在用于通过细液滴递送药物或制剂。用于气雾剂递送的吸入颗粒的优化应在1-5μm的尺寸范围内进行喷雾器，如射流、超声波和纳米液滴雾化气雾剂产生尺寸在1-5μm之间的颗粒。纳米载体递送通过雾化纳米颗粒或悬浮液实现。纳米载体递送具有多种优点，如起效快、效果长、更定期的给药以及在较低剂量水平下的等效效率。探索纳米液滴的新方法是通过射流或超声波喷雾器，该喷雾器可设计用于产生微液滴，并可进一步产生纳米液滴。以下是DPI装置的实例：

Spinhlaer(Aventis)是一种包含在透明橙色和白色胶囊中的干粉，称为spincaps；Rotahaler(GlaxoSmithKline)是一种呼吸驱动的吸入器装置，从Rotacap释放药物；Diskhaler(GlaxoSmithKline)是一种干粉吸入器，它将小袋(或小泡)放在一个圆盘上，每个小袋(或小泡)中含有一定剂量的药物；Diskus(GlaxoSmithKline)是用于治疗哮喘或COPD引起的突然呼吸问题；Turbuhaler(Astra Zeneca)，建议在紧急情况下使用可用的吹气器和间隔物；Handihaler(Boehringer-Ingelheim)是用于递送含有支气管扩张剂噻托溴铵的Spiriva吸入胶囊的内容物；Titropium吸入器(Boehringer-Ingelheim)是一种易于使用的装置，具有精细的表面处理、高强度和尺寸精度；Cyclohaler(Pharmachemie)是使用明胶胶囊进行药物配制的单剂量系统；Aerolizer(Novartis)帮助肺部气道周围的肌肉保持放松，以治疗哮喘病况；Pulvinal用于治疗胸部疾病，避免因运动或其他“诱因”引起的哮喘症状；Easyhaler(Orion Pharma)是一种环境友好、高效、易于使用的治疗呼吸系统疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)；Clickhaler(Innovata Biomed/ML Labs Celltech)有效地将药物直接递送到需要的肺部；二丙酸倍氯米松Novolizer(ASTA Medical)是一种多剂量、可重复充填的药物，可从一个药筒中递送多达200计量剂量的药物；Twisthaler(Schering-Plough)是一种相对独立于流速的吸入装置；Aerohaler(Boehringer-Ingelheim)是一种易于使用的吸入器，可从胶囊等中吸入药物。可以在普通技术人员的技术范围内进一步修改这种装置，以增加微粒和/或减少气流，使得微粒基本上或大部分地被递送到鼻和口的ENT腔。

在用于递送苦味受体激动剂、优选奎宁及其盐的递送装置的另一实例中，是喷雾和雾化器系统。吸气时，大气穿过喷雾器进行雾化递送，呼气时，气雾剂内的空气将气雾剂排出到大气外部。因此，在大气条件下，可能会有残留药物从喷雾器泄漏。射流喷雾器是为生产气雾剂而开发的第一种技术操作。它的工作原理是利用压缩机的气流。制剂的雾化通过气体通过的喷雾器中的小孔进行。雾化颗粒由空气驱动至挡板，它由小液滴和大液滴组成。挡板造成的碰撞影响较大的液滴，然后迫使其流向另一侧，这意味着在喷雾器内以液体形式再循环。由于泄漏，在呼气过程中可能会有大量的气雾剂颗粒损失。还有另外三种类型的射流喷雾器，它们是根据吸入时的输出来定义的。在患者的吸气和呼气阶段有恒定输出的情况下，使用标准的无通气式喷雾器。

射流喷雾器是雾化递送的优选装置，由以下特征组成，如-A.额外吸入空气；B.吹口-旨在用于患者吸入；C.通过使加压气体通过孔口释放气雾剂产生。D.挡板-气雾剂递送通过挡板进行；E.储液器-它含有合适的药物制剂；F.通过制剂的加压空气供应。

超声喷雾器主要优选用于气雾剂疗法，因为它们具有比空气喷射喷雾器更大的输出能力。当所需振动在压电晶体的(1.2-2.4MHz)范围内时，通过高频超声波产生雾化颗粒。振动机制被传递到液体制剂，其进一步产生由较小和较大液滴组成的液体药物喷泉。较大的液滴被回收到液体药物储液器中。较小的液滴储存在患者吸入的喷雾器的室内。与射流喷雾器相比，残留质量被限制在喷雾器装置中，但振动机制的优点克服了泄漏，因为气雾剂的递送不涉及气体源。有两类超声喷雾器，主要用于可吸入疗法。标准喷雾器是指药物与压电换能器直接接触的喷雾器。这导致换能器加热导致药物温度升高。然而，压电换能器很难消毒。

具有水界面的超声喷雾器利用压电换能器和药物制剂的不同储液器之间的水。水有助于减少药物过热和换能器。超声喷雾器不会喷雾高粘度液体或悬浮液或具有较高表面张力的液体或悬浮液。只有当残留质量为药物质量的约50％时，才能加热气雾剂。与压缩空气喷雾器不同，超声波喷雾器既昂贵又笨重。

网状喷雾器可用于递送液体药物制剂以及悬浮液；然而，在悬浮液的情况下，相对于吸入气雾剂的质量和输出速率，性能似乎降低。体外研究结果表明，市售的网状喷雾器在不影响药物效率的情况下缩短了喷雾时间。可影响已市售网状喷雾器性能的参数是清洁和消毒。静态网状喷雾器能够在喷雾器内递送液体药物制剂，通过施加力进行递送。20世纪80年代，Omron Healthcare(Bannockburn,IL,USA)推出了第一台静态网状喷雾器。网状喷雾器提供了一种对热和湿气敏感的医疗装置进行灭菌的替代方法，这是通过将0.1％苯扎氯铵溶液浸泡10-15分钟进行高压灭菌所无法实现的。振动网状喷雾器利用振动机制通过网格递送液体药物。环形压电元件由于其与网格直接接触的位置而可能导致网格变形。制剂和装置对于成功使用喷雾系统进行肺靶向同样重要。振动网状喷雾器通过在最有可能到达肺部深处时产生雾化颗粒，提供连续喷雾技术。最近的振动网状喷雾器是一种便携式装置，能够以减少浪费、方便和能源效率以及高药物定位效率的方式提供精确剂量。具有大横截面积的锥形网结构使药物制剂的泵送和装载变得容易。网格变形会影响通过孔的液滴，随后改善吸入剂的呼吸道吸收。有三种主要类型的气雾剂装置(MDI、DPI和喷雾器)被发现在某些临床情况下是安全有效的。增加剂量的治疗可能需要增加MDI喘息的次数，以达到与喷雾器的较大标称剂量相当的效果。MDI、DPI和喷雾化器的设计和肺部沉积改善的示例包括新的氢氟烷烃推动的倍氯米松MDI制剂、计量剂量液体喷雾Respimat和Spiros的DPI系统。另一个实例是

Go，这是一种振动网状喷雾器，其水平网格面积由在100kHz下通过电解获得的1000个孔组成。通过网状喷雾器底部的碰撞现象，液滴以中等速度从网格的孔中释放。气雾剂颗粒的递送以低速进行。能够将本发明的组合物递送至ENT道的喷雾器模型的一些实例包括：

一种优选的雾化器是

MAD NASAL^TM鼻内粘膜雾化装置(Teleflex,Morrisville,NC)。

另一种能够递送所述液体组合物的装置是来自Silgan Holdings(Stamford,CT)的能够将这种液体组合物雾化的递送装置。能够递送本发明组合物的另一装置阵列是MDI、DPI、鼻泵和其他喷雾装置，以及基于致动器的递送装置，例如来自Aptar Pharma的装置。例如，递送装置可以是VP7喷雾泵(Aptar pharma)、预压缩鼻腔泵或VP3多剂量泵喷雾装置(Aptarpharma)。可从Nemera获得的泵递送装置也能够递送目前描述的液体组合物。

此外，Optinose(Yardley,PA)的呼气递送装置可用于将所述组合物递送至ENT腔，以将苦味受体激动剂应用于其中的粘膜层。优选地，无论使用何种递送装置，本文描述的制剂均经鼻内递送至纤毛鼻窦细胞所在的鼻腔；例如，递送装置可以将制剂施加到后鼻腔以覆盖鼻甲。在一些实施方式中，基于鼻建模将本文的制剂雾化喷洒到鼻甲上。

实验实施例

通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明目的，除非另有规定，否则不旨在作为限制。因此，本发明不应被解释为局限于以下实施例，而是应被解释成包含由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

在没有进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制作和利用本发明并实践要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

ALI病毒感染模型：

在培养的鼻窦上皮细胞的气液界面(ALI)模型中完成奎宁溶液制剂的体外效果评估。先前描述的利用ALI模型的研究使用的细菌只存在于细胞顶部，不会侵入细胞。在本实施方式中，ALI模型涉及病毒，其侵入细胞中并使用细胞的宿主机制繁殖。此外，以中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)为例，使用该模型表明ALI模型中的感染细胞也表现出合胞体形成。

根据批准的方案，在获得知情同意后，从鼻窦手术期间获得的残留临床材料中获取鼻窦粘膜标本。ALI培养物从酶解的人组织鼻窦上皮细胞(HSEC)中建立，并在组织培养瓶中(75cm)与由补充有100U/mL青霉素，100lug/mL链霉素的DMEM/Ham's F-12和支气管上皮基础培养基(BEBM；Clonetics,Cambrex,East,N.J.)组成的增殖培养基中持续7天生长至融合。然后将细胞胰蛋白酶化并接种在多孔聚酯膜(每膜6-7x10”细胞)上，在用100uL的包衣溶液IBSA(0.1mg/mL；Sigma-Ald rich)、I型牛胶原蛋白(30g/mL；BD)、纤连蛋白(10ug/mL；BD)在LHC基础培养基(Invitrogen)中包衣并置于组织培养层流罩中过夜的细胞培养插入物(Transwell-clear，直径12mm，0.4um孔；Corning,Acton,Mass.)中。五天后，从上部隔室中取出培养基，并通过使用由1:1DMEM(Invitrogen,Grand Island,N.Y.)和BEBM(Clonetics,Cambrex,East Rutherford,N.J.)组成的分化培养基，以及hEGF(0.5ng/mL)、肾上腺素(5g/mL)的Clonetic补体，使上皮分化。BPE(0.13mg/mL)。氢化可的松(0.5g/mL)、胰岛素(5g/mL)、三碘甲状腺氨酸(6.5g/mL)和转铁蛋白(0.5g/mL)，在基底室中补充有100UI/mL青霉素、100g/mL链霉素、0.1nM维甲酸(Sigma-Aldrich)和10％FBS(SigmaAldrich)。人支气管上皮细胞(Lonza,Walkersville,Md.)的培养方法与前述相似。临床微生物实验室使用血琼脂和MacConkey琼脂处理微生物拭子，以分离革兰氏阴性细菌。这种细胞和分析方法在美国专利公开第2015/0017099A1号中提供，其通过引用全文并入。

苦味受体刺激能够引起鼻上皮细胞(鼻窦ALI培养物)的抗微生物分泌。可以用PBS(3x200uL体积)洗涤鼻ALI培养物的顶部表面，然后抽吸并添加含30uL的50％PBS或50％PBS的苯甲地那铵或本发明的其他苦味受体激动剂之一。在37℃下温育30分钟后，可以去除顶端表面液体(ASL，含有任何分泌的抗微生物剂)并与病毒(如流感或冠状病毒)混合。可以使用低盐条件(50％PBS；25％细菌培养基)，因为气道抗微生物剂的抗微生物活性已被证明具有强烈的盐依赖性。在37℃下温育2小时后，病毒性ASL混合物可以用连续稀释液铺板并温育过夜。从用苯甲地那铵刺激的培养物中去除的ASL将被证实具有抗病毒活性。

本发明的苦味受体激动剂，包括苯甲地那铵、苦艾素或奎宁(及其盐)可用于刺激鼻窦细胞培养物中的抗病毒活性以杀死病毒，包括例如流感和冠状病毒。杀灭试验可应用来自用单独的50％PBS(未刺激)处理的培养物的ASL，加上本文描述的苦味受体激动剂。在一些实例中，激动剂为苯甲地那铵、苦艾素、奎宁(包括其盐)，特别地可为10mM苯甲地那铵和300uM苦艾素。

人类ALI感染甲型流感：

用甲型H1N1流感感染人类鼻窦ALI，并在人纤毛鼻腔气液界面(ALI)模型中评估奎宁预处理对上皮细胞死亡和病毒载量终点的影响(如通过qPCR测定的)。

建立了衍生自两个独立患者(A和B)的ALI。受试者B的ALI更成熟，顶端表面的纤毛密度更高，因此被认为对奎宁具有先天更高的反应性。以1或10的感染倍数(MOI)用人类H1N1甲型流感菌株PR8感染细胞。感染后1小时，用0.1％硫酸奎宁二水合物刺激细胞。将细胞维持72小时，同时每天喂饲奎宁并用奎宁处理。细胞保持活力和视觉健康。在感染后72小时收集细胞。从细胞裂解物中收集病毒RNA。对病毒NP、IAV-M1和M1基因进行PCR。如图1a)IAV_NP和1b)IAV_M1所示，在更成熟的受试者B ALI培养物中，NP和IAV-M基因的转录物都有显著的相对减少，在MOI为1时，用0.1％奎宁在0.9％氯化钠溶液处理时，受试者A细胞的相对减少较小。

实验将在来自多个人类供体的ALI模型中测试甲型流感，副流感病毒对人类纤毛鼻窦上皮细胞的作用。将从治疗前奎宁开始评估培养物，随后在半小时后进行病毒感染，以及在感染细胞1小时后进行感染后处理，然后在1小时后用奎宁进行处理，每天重复，持续3天。评估ALI的生存力，病毒RNA的评估每天通过从根尖液孔中取样到第三天，这时收获细胞并对病毒蛋白的存在进行染色。。细胞将以1和5的感染倍数被感染。

SARS-CoV-2感染人类ALI：

人类鼻窦ALI感染了严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)。成熟的纤毛ALI用SARS-CoV-2感染1小时，细胞保持72小时。SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N)的染色显示为红色，在图2A和2B)中分别在两个小图中的粘蛋白(MUC5AC)或β-微管蛋白的对照染色显示为绿色。

在气液界面(ALI)模型中在组织培养中培养人鼻窦上皮细胞。作为正在进行的方案的一部分，从宾夕法尼亚大学的患者身上收货细胞，并在该大学获得批准。材料被保留为未识别，但有相关的人口统计学和临床数据。培养的细胞将在空气界面上形成与临床原位鼻窦上皮相称的纤毛。这些细胞还产生粘液，并显示正常的纤毛运动和纤毛摆动频率。

在另一项研究中，将两名患者的ALI分离到单独的孔中，并暴露于10^4的SARS-CoV-2(UPenn/Philadelphia菌株)。1小时后，用1mg/mL的硫酸奎宁在0.9％盐水中的溶液处理细胞或不处理。然后将培养的细胞与病毒和奎宁溶液(如图所示)温育48小时，然后收获、固定并染色细胞，以检测细胞中的SARS-CoV-2核衣壳蛋白。细胞也用4’6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色以检测细胞核。然后测量DAPI蓝色染色细胞和感染(红色染色)细胞的数量。

ALI模型中的感染研究如图2C和2D所示适用于年龄大于80岁的西班牙裔男性非吸烟者。来自该患者的未处理细胞(如图2C所示)显示SARS-CoV-2感染细胞(红色染色细胞)的高频率，而奎宁处理的细胞(如图2D所示)显示出明显更少的感染(红色染色)细胞。

第二名患者是一名中年50岁的男性吸烟者，其SARS-CoV-2感染细胞的减少更为显著。未处理的细胞显示约25％的被感染细胞(图2E)，而处理的细胞几乎没有感染(图2F)。

通过定量荧光成像计数感染细胞。两名患者的两次独立测量中感染细胞的平均百分比如下表所示。

因此，这些体外结果表明，无论患者年龄和吸烟史如何，奎宁都能有效降低鼻窦ALI患者的SARS-CoV-2感染。此外，尽管病毒在整个细胞温育过程中都保留在培养基中，但这种效应仍然存在，这是一种有利于病毒生长的实验条件。

人类ALI感染MERS-CoV-2：

人类鼻窦ALI感染了中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。成熟的纤毛ALI用SARS-CoV-2感染1小时，细胞保持72小时。MERS-CoV核衣壳蛋白(N)的染色显示为，在图3A至3C中分别显示粘蛋白(MUC5AC)或β-微管蛋白的对照染色。

奎宁预处理或后处理对预防MERS-CoV感染以防止上皮细胞死亡的效果将在ALI中进行为期3天的感染期评估。在一个实验中，细胞将用1mg/ml的奎宁预处理1小时，用PBS洗涤，然后以1的MOI感染1小时。细胞将与每天通过qPCR在根尖液中取样的病毒温育3天，并在第3天收获细胞以如上所述检测细胞内病毒。在另一个实验中，将细胞用MERS-CoV感染1小时，用PBS洗涤，然后用奎宁处理半小时，每天以1mg/ml再次处理。将细胞温育三天。病毒复制将通过qPCR从根尖液中测定，在第3天收获细胞，并且如上所述通过免疫组织化学在细胞中检测病毒。

SARS-CoV-2感染人类ALI：

人类鼻窦ALI感染SARS-CoV2(COVID-19)。成熟的纤毛ALI用SARS-CoV-2感染1小时，细胞保持72小时。SARS-CoV2核衣壳蛋白(N)的染色如图4A至图4D所示。

如绿色染色所示，该试验显示SARS-CoV2在人鼻窦细胞中首次成功感染。

SARS-CoV-2白鼬挑战模型中的奎宁保护：

白鼬是少数易受SARS-CoV-2感染并患病的动物之一。鼻滴注0.1％(1mg/mL)硫酸奎宁二水合物在0.9％盐水(生理盐水，NS)中的溶液诱导一氧化氮(NO)的释放，并可保护白鼬免受SARS-CoV-2感染。6-8周龄的雌性白鼬在鼻滴注1mg/mL硫酸奎宁二水合物在0.9％氯化钠中的溶液后刺激鼻上皮细胞后，进行NO产生评估。12只白鼬被分为四组。

用异氟醚诱导麻醉后，用1mL的盐水冲洗鼻孔。盐水洗涤后，将200μL的奎宁或磷酸盐缓冲盐水(PBS)滴入9只接受奎宁和3次PBS的动物。处理后，在5分钟对用PBS处理的动物进行鼻洗，收集流出物用于NO测量。九只奎宁处理的动物被分为三组，每组三只。一组在处理后5分钟、第二组在10分钟、第三组在15分钟进行鼻洗，收集流出物用于NO测量。NO评估对治疗是盲目的。流出物立即冷冻，然后在University of Pennsylvania检测NO水平。PBS处理动物中NO的定量评估为5.58ng/mL，而奎宁处理动物中的NO在5分钟时为6.64ng/mL、10分钟时为6.42ng/mL并且在15分钟时为6.52ng/mL，证明在所有动物中NO产生增加高于基线，并且在治疗后至少15分钟内持续升高。

在3天的洗脱期后，同样的12只白鼬被SARS-CoV-2(毒株名称为SARS-CoV-2/Canada/ON/VIDO-01/2020/Vero’76/p.2)挑战。四组中(每组三只白鼬)中的两组在一个鼻孔中注入200μL的奎宁，另两组用PBS处理。治疗后5分钟，用每鼻孔25μL的SARS-CoV-2挑战动物。对于两组(PBS和奎宁治疗)，挑战剂量为10*4TCID50，而两组用剂量为10*5TCID50挑战。根据最初的治疗分配，每只动物在挑战后24小时用PBS或奎宁进行第二次治疗。在第1天(治疗前)和第3天(挑战后)收集鼻冲洗液。在第3天处死动物，收集鼻甲组织用于通过rtPCR定量测量病毒载量。

在感染后两天，鼻冲洗显示治疗动物的病毒载量减少，在挑战后第3天观察到最显著的差异。病毒载量测量在下表中显示此外，在用奎宁治疗并用SARS-CoV-2进行低或高挑战病毒挑战的6只动物中，只有1只(16.7％)的动物在挑战后第1天检测到病毒，而对照组的6只(33％)中有2只(50％)并且在第3天分别为50％与67％检测到病毒。

治疗	第1天	第1天	第3天	第3天
					挑战剂量>	10^4	10^5	10^4	10^5
奎宁(0.1％的NS溶液)	1	5	19	5
					PBS	31	42	594	84,350

尸检时对鼻甲组织中病毒的测量同样表明，无论挑战剂量如何，经处理的动物的病毒平均载量显著降低(见下表)。

治疗	第3天	第3天
			挑战剂量>	10^4	10^5
奎宁(0.1％的NS溶液)	1	5,000
			PBS	440,000	220,000

这些数据表明，在0.9％盐水中以1mg/mL溶液鼻内滴注奎宁有效降低白鼬鼻甲中SARS-CoV-2感染。值得注意的是，在病毒挑战前5分钟对动物进行预处理，24小时后只进行一次挑战后处理。由于在没有抗病毒作用的情况下，任何残留病毒都会在治疗后迅速生长，因此即使进行一次治疗，病毒也会显著减少，这种治疗作为预防和治疗减少鼻定植和感染的潜在价值。

人类临床试验

硫酸奎宁二水合物的使用也正在进行II期临床试验，作为预防SARS-CoV-2感染事件的预防措施。本临床试验(NCT 04408183)是一项通过鼻雾化器施用的硫酸奎宁(1mg/mL,pH 6)配制溶液的随机、安慰剂对照、双盲研究。研究参与者分别以2:1随机接受奎宁或安慰剂治疗，并自行服用研究药物，共28天。迄今为止，研究药物耐受性良好，无严重不良反应。将在基线和第2、4和6周收集鼻咽拭子，以通过PCR确定SARS-CoV-2的存在。

Claims (14)

1.一种治疗具有上呼吸道感染的受试者中的病毒感染的方法，包括：

将苦味受体激动剂的制剂作为微粒分散；

将分散制剂施用到所述受试者的上呼吸道腔的粘膜表面上；以及

通过刺激苦味受体生成NO产生或刺激抗微生物肽产生，或两者。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述苦味受体激动剂是引起导致NO产生或刺激抗微生物肽产生或它们的组合的苦味受体信号传导的激动剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述苦味受体激动剂选自以下项组成的组：苯甲地那铵、苯硫脲(PTC)、高丝氨酸内酯、硫氰酸钠(NaSCN)、6-正丙基硫脲嘧啶(PROP或PTU)、小白菊内酯、苦杏苷、五月茶(包括其提取物)、秋水仙碱、氨苯砜、水杨苷、白杨素、芹菜素、奎宁和奎宁盐。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒感染是由选自以下项组成的组的病毒引起的感染：SARS；SARS-CoV-2；MERS-CoV；SARS-CoV；甲型流感、乙型流感；副流感病毒；鼻病毒；腺病毒；

人类偏肺病毒；呼吸道合胞体病毒；以及非致病性冠状病毒。

5.根据权利要求1所述的方法，其中使用鼻递送装置每天重复三次分散步骤和施用步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述鼻递送装置是定量雾化吸入器、干粉吸入器，滴管、喷雾器、雾化器或灌洗器。

7.根据权利要求5所述的方法，其中每天重复雾化和施用步骤三次，持续四周。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述奎宁盐是硫酸奎宁二水合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述奎宁在无菌盐水中以0.5mg/ml与1mg/ml之间的浓度配制。

10.一种使用气液界面检测鼻上皮病毒感染的方法，包括：

在培养瓶中建立生长至融合的未分化的人鼻窦上皮细胞的细胞培养物；

用已知感染哺乳动物上呼吸道的病毒毒株感染顶端表面上的上皮细胞；

用苦味受体激动剂处理所述鼻窦上皮细胞；

温育所述鼻窦上皮细胞；以及

分析鼻窦上皮细胞培养物释放的病毒水平。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括的步骤：

分化所述鼻窦上皮细胞。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述苦味受体激动剂是引起导致NO产生或刺激抗微生物肽产生或它们的组合的苦味受体信号传导的激动剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述苦味受体激动剂选自由苯甲地那铵、苯硫脲(PTC)、高丝氨酸内酯、硫氰酸钠(NaSCN)、6-正丙基硫脲嘧啶(PROP或PTU)、小白菊内酯、苦杏苷、五月茶(包括其提取物)、秋水仙碱、氨苯砜、水杨苷、白杨素、芹菜素、奎宁和奎宁盐组成的激动剂。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒毒株选自由以下项组成的组：

SARS；SARS-CoV-2；MERS-CoV；SARS-CoV；甲型流感、乙型流感；副流感病毒；鼻病毒；腺病毒；人类偏肺病毒；呼吸道合胞体病毒；以及非致病性冠状病毒。

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