CN116036318A - 一种靶向pd-l1的spect分子影像探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核医学分子影像及放射性药物领域，具体涉及一种靶向PD‑L1的SPECT分子影像探针及其制备方法与应用。^99mTc‑KN035是一种单光子核素^99mTc标记的单域抗体Fc融合蛋白KN035的分子影像探针。相对于正电子标记和基于完整单克隆抗体的分子影像探针，该探针在合成方面具有原料易于获取，成本低，标记方法简单，反应条件温和等优点，方便推广普及。在体内显像方面，具有良好的药代动力学和优良的PD‑L1靶向性，通过SPECT显像可无创动态检测肿瘤细胞表面PD‑L1的表达、指导免疫阻断治疗方案的制定、监测治疗效果等。

Description

一种靶向PD-L1的SPECT分子影像探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于核医学分子影像及放射性药物领域，具体涉及一种靶向PD-L1的SPECT分子影像探针及其制备方法与应用。

背景技术

程序性死亡受体1及其配体（PD-1/PD-L1）检查点抑制剂是近年来肿瘤免疫治疗研究的热点之一，其通过阻断PD-1/PD-L1信号通路重新激活T淋巴细胞，增强机体对肿瘤的免疫杀伤能力，已在不同类型的肿瘤中获得良好的疗效，且疗效与PD-L1表达密切相关。研究显示，PD-1/PD-L1抑制治疗的整体有效率为20-40%，在PD-1/PD-L1阳性患者中有效率高达90%。因此，PD-L1阳性被认为是PD-1/PD-L1抑制治疗有效的生物学靶标，对肿瘤PD-L1表达情况的监测具有重要的临床意义。

目前最常用的方法是通过有创的穿刺活检取病理行免疫组织化学（IHC）检测肿瘤PD-L1的表达水平，在临床应用中受到一定的限制，主要因为：（1）肿瘤PD-L1表达存在时间和空间上异质性，即同一患者不同肿瘤部分表达存在差异，且治疗过程中存在动态变化。而基于活检或手术标本的IHC只能提供取材区域的PD-L1表达情况，无法对所有病灶进行穿刺评估，可能出现假阴性结果。研究显示IHC检测PD-L1表达为阴性的患者，约10%对PD-1/PD-L1抑制剂治疗有良好反应。（2）IHC无法对肿瘤进展过程中PD-L1表达水平进行重复、动态检测；（3）IHC检查属于有创操作，在多发转移及体质较差的患者中难以实施；（4）不同IHC试剂盒检测抗体及平台不一致，PD-L1阳性判断标准不同。靶向PD-L1的核医学分子显像可以无创、实时地进行全身肿瘤（原发肿瘤、转移灶等）PD-L1表达水平的活体检测，进而筛选适合免疫治疗的患者、优化治疗方案、监测治疗反应及评估治疗疗效。

虽然目前已开发出多种核素如⁶⁴Cu，⁸⁹Zr、¹¹¹In、¹²⁴I、¹²⁵I、⁶⁸Ga、¹⁸F等标记的抗体用于PD-L1显像，但尚存在一些不足之处。如核素标记的完整单克隆抗体，由于分子量大（约150 kDa）导致肿瘤穿透性差、生物半衰期长、显像所需时间长（通常需要2-7天）。且完整单克隆抗体需要长半衰期核素进行标记，增加了对正常和高血流灌注组织的不必要的照射。PET（正电子发射计算机断层显像）显像虽然具有较高的灵敏度和分辨率，但PET显像所需的正电子放射性核素需要回旋加速器生产，其来源有限，价格昂贵，且PET探针合成条件要求苛刻。此外，很多医院核医学科不具备PET和加速器设备，导致PET显像无法在临床广泛开展和普及。而SPECT（单光子发射计算机断层成像）显像具有应用范围广、装机数量远多于PET及显像成本相对较低的特点。SPECT显像常用的放射性核素为^99mTc, 其由⁹⁹Mo/^99mTc发生器产生，获取方便，成本低，且^99mTc半衰期及射线能量适中，在获得优质显像图像的同时又避免对检查者造成不必要的照射。SPCECT显像探针具有制备简单，反应条件温和，产率高的特点。且随着硬件的升级，SPECT设备的进步及重建算法的不断改进，SPECT可以像PET一样进行定量研究，以上均有利于^99mTc标记的SPCECT显像探针临床的推广应用。因此^99mTc标记的靶向PD-L1的小分子量抗体探针具有非常重要的社会意义和潜在的经济价值。

KN035（康宁杰瑞生物制药，苏州/苏州康宁杰瑞生物科技有限公司）是目前全球首个国内研发且已批准上市的皮下注射PD-L1单域抗体Fc融合蛋白，其结构如图1所示，其分子量相对较小（约79.6 kDa），可溶性及稳定性好，肿瘤穿透力强，与PD-L1亲和力高（K_D =3.0 nM），阻断PD-1与PD-L1结合的IC₅₀为5.25 nM。为此，本发明基于KN035构建一种单光子核素^99mTc标记的靶向PD-L1的SPECT分子影像探针^99mTc-KN035。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种靶向PD-L1的SPECT分子影像探针及其制备方法与应用。

为此，本发明基于KN035构建一种单光子核素^99mTc标记的靶向PD-L1的SPECT分子影像探针^99mTc- KN035。

本发明提供了一种靶向PD-L1的SPECT分子影像探针（^99mTc标记的PD-L1靶向的SPECT分子影像探针^99mTc -KN035）的制备方法，具体步骤如下。

（1）Zeba脱盐柱的活化

（1.1）取1支Zeba脱盐柱，去除Zeba脱盐柱顶帽及底塞，放入规格为1.5 mL的EP管中，用离心机以4℃，1500×g离心1 min去除Zeba脱盐柱中的储存液；

（1.2）加300 μL 的10×Modification Buffer缓冲液于所述步骤1.1中的Zeba脱盐柱，用离心机以4℃，1500×g离心1 min，弃掉缓冲液，重复3遍，得到1支活化的Zeba脱盐柱；所述10×Modification Buffer缓冲液为含有1.0 M phosphate, 1.5 M NaCl, pH 8.0的缓冲液；

（1.3）取另1支Zeba脱盐柱，去除Zeba脱盐柱顶帽及底塞，放入规格为1.5 mL的EP管中，用离心机以4℃，1500×g离心1 min去除Zeba脱盐柱中的储存液；

（1.4）加300 μL 的10×Conjugating Buffer缓冲液于所述步骤1.3中的Zeba脱盐柱，用离心机以4℃，1500×g离心1 min，弃掉缓冲液，重复3遍，得到另1支活化的Zeba脱盐柱；所述10×Conjugating Buffer缓冲液为含有1.0 M phosphate, 1.5 M NaCl, pH 6.0的缓冲液。

（2）KN035的纯化

取2 uL的浓度为200 μg/μL的KN035，用超纯水稀释至体积为70 uL，加入至所述步骤1.2中的活化的Zeba脱盐柱中，用离心机以4℃，1500×g离心2 min，得到纯化的KN035。

（3）^99mTc-KN035的制备

（3.1）称取0.2 mg 的螯合剂SHNH粉末溶于20 uL的无水DMSO, 配制成浓度为10 μg/μL 的SHNH溶液；

（3.2）取10 uL 的浓度为10 μg/μL的SHNH溶液与所述纯化的KN035混匀，4℃震荡避光反应12 h；

（3.3）将上述步骤3.2中的反应物加入所述步骤1.4中的活化的Zeba脱盐柱中，用离心机以4℃，1500×g离心2 min去除过量的SHNH，得到SHNH与KN035反应后的产物HYNIC-KN035；

（3.4）将上述HYNIC-KN035与50 μL 浓度为200 mg/mL 的Tricine溶液、2 μL浓度为14 mg/mL的SnCl₂ 溶液及600 μL 放射性活度为25 mCi的Na^99mTcO₄溶液混匀，37℃震荡避光反应30 min；

（3.5）取PD-10脱盐柱，去掉顶帽与底塞，去除储存液；

（3.6）用5 mL的PBS缓冲液加入所述PD-10脱盐柱，待PBS缓冲液流尽后，再次加入5mL的PBS缓冲液于所述PD-10脱盐柱中使PBS缓冲液流尽；重复操作4次，得到活化的PD-10脱盐柱；

（3.7）将步骤3.4中的反应物加入所述活化的PD-10脱盐柱，加PBS缓冲液补至总体积为2.5 mL，同时用规格为1.5 mL的EP管接洗脱液，每EP管接约0.5 mL；

（3.8）待上述步骤3.7中的PD-10脱盐柱中无液体流出后，加入0.5 mL的PBS缓冲液进行淋洗，同时用规格为1.5 mL的EP管接洗脱液，每EP管接0.5 mL；重复操作15次；

（3.9）用医用活度计测量每EP管洗脱液的放射性活度，计数最大的即为^99mTc-KN035。

^99mTc价格便宜，易于获取（⁹⁹Mo-^99mTc发生器），半衰期及射线能量适中，在获得优质显像图像的同时又避免对检查者造成不必要的照射。KN035获取方便，分子量相对较小，可溶性及稳定性好，肿瘤穿透力强，与PD-L1亲和力高。^99mTc标记KN035制备简单，反应条件温和，产率高，探针稳定性好，与PD-L1亲和力高、靶向性强。且随着硬件的升级，SPECT设备的进步及重建算法的不断改进，SPECT可以像PET一样进行定量研究，以上均有利于日后^99mTc-KN035 SPECT显像在临床的推广应用。通过SPECT/CT动物活体显像进行临床前验证。该探针显示出良好的肿瘤特异性，有助于筛选免疫治疗优势人群，使治疗个体化、最优化，并最终实现临床转化。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明合成的^99mTc-KN035探针，合成原料易于获取，KN035已经商业化，易于购买；^99mTc由⁹⁹Mo-^99mTc发生器产生，价格便宜，获取方便，任何医院核医学科都可配备。相比于正电子标记和基于完整单克隆抗体的分子影像探针，该探针制备简单，反应条件温和，成本低，产率高，可在任何水平的核医学科进行制备。另外，SPECT设备普及率高，有利于该探针的推广运用；

2.本发明合成的^99mTc-KN035探针中的KN035属于单域抗体Fc融合蛋白，分子量较完整单克隆抗体显著降低，探针在体内具有良好的药代动力学，注射后4 h即可获得可诊断的图像，8–18 h显像效果好，24 h仍可清晰显影。而现有技术基于完整单克隆抗体的PD-L1探针往往在注射后数天才能获得清晰的诊断图像。

附图说明

图1为KN035的序列和结构。

图2为^99mTc-KN035合成过程及显像示意图。

图3为^99mTc-KN035的鉴定及稳定性。其中，A为 ^99mTc-KN035纯化后用PBS作为展开剂，B为 ^99mTc-KN035纯化后用甲醇和1M醋酸铵按体积比为1:1作为展开剂，C为 ^99mTc-KN035在PBS及FBS中不同时间点的稳定性。

图4为H1975和A549细胞表面PD-L1的检测。其中，A为免疫细胞荧光，红色荧光表示细胞表面PD-L1的表达，蓝色荧光为细胞核；B为Western blot检测PD-L1在H1975和A549细胞中的表达。

图5为^99mTc-KN035的体外细胞实验。其中，A为^99mTc-KN035在H1975细胞中的饱和实验，B为H1975及A549细胞摄取实验，C为^99mTc-KN035在H1975细胞中的阻断实验。* p＜0.05,** p＜0.01, *** p＜0.001, ns,  p＞0.05。

图6为荷瘤鼠 H1975、A549及H1975阻断组尾静脉注射^99mTc-KN035探针后不同时间点的SPECT/CT显像，箭头所示为肿瘤部位。

图7为荷瘤鼠 H1975、 A549及H1975阻断组生物分布及肿瘤摄取柱状图。其中，A为H1975荷瘤鼠；B为A549荷瘤鼠；C为H1975荷瘤鼠阻断组；D为不同荷瘤鼠的肿瘤摄取；E为不同荷瘤鼠的肿瘤肌肉比值。* p＜0.05, ** p＜0.01, ns,  p＞0.05。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

基于KN035构建的单光子核素^99mTc标记的靶向PD-L1的SPECT分子影像探针^99mTc-KN035的制备方法，具体步骤如下。

（1）Zeba脱盐柱的活化

（1.1）取1支Zeba脱盐柱，去除Zeba脱盐柱顶帽及底塞，放入规格为1.5 mL的EP管中，用离心机以4℃，1500×g离心1 min去除Zeba脱盐柱中的储存液；

（1.2）加300 μL 的10×Modification Buffer缓冲液（1.0 M phosphate, 1.5 MNaCl, pH 8.0）于所述步骤1.1中的Zeba脱盐柱，用离心机以4℃，1500×g离心1 min，弃掉缓冲液，重复3遍，得到1支活化的Zeba脱盐柱；

（1.3）取另1支Zeba脱盐柱，去除Zeba脱盐柱顶帽及底塞，放入规格为1.5 mL的EP管中，用离心机以4℃，1500×g离心1 min去除Zeba脱盐柱中的储存液；

（1.4）加300 μL 的10×Conjugating Buffer缓冲液（1.0 M phosphate, 1.5 MNaCl, pH 6.0）于所述步骤1.3中的Zeba脱盐柱，用离心机以4℃，1500×g离心1 min，弃掉缓冲液，重复3遍，得到另1支活化的Zeba脱盐柱。

（2）KN035的纯化

取2 uL的浓度为200 μg/μL的KN035，用超纯水稀释至体积为70 uL，加入至所述步骤1.2中的活化的Zeba脱盐柱中，用离心机以4℃，1500×g离心2 min，得到纯化的KN035。

（3）^99mTc-KN035的制备

（3.1）称取0.2 mg 的螯合剂SHNH（6-肼基烟酸琥珀酰亚胺酯盐酸盐）粉末溶于20uL的无水DMSO（二甲基亚砜）, 配制成浓度为10 μg/μL 的SHNH溶液；

（3.2）取10 uL 浓度为10 μg/μL的SHNH溶液与所述纯化的KN035混匀，4℃震荡避光反应12 h；

（3.3）将上述步骤3.2中的反应物加入所述步骤1.4中的活化的Zeba脱盐柱中，用离心机以4℃，1500×g离心2 min去除过量的SHNH，得到SHNH与KN035反应后的产物HYNIC-KN035；

（3.4）将上述HYNIC-KN035与50 μL 浓度为200 mg/mL 的Tricine（N-三（ 羟甲基）甲基甘氨酸）溶液、2 μL浓度为14 mg/mL的SnCl₂ （氯化亚锡）溶液及600 μL 放射性活度为25 mCi的Na^99mTcO₄溶液混匀，37℃震荡避光反应30 min；

（3.5）取PD-10脱盐柱，去掉顶帽与底塞，去除储存液；

（3.6）用5 mL的PBS缓冲液加入所述PD-10脱盐柱，待PBS缓冲液流尽后，再次加入5mL的PBS缓冲液于所述PD-10脱盐柱中使PBS缓冲液流尽；重复操作4次，得到活化的PD-10脱盐柱；

（3.7）将步骤3.4中的反应物加入所述活化的PD-10脱盐柱，加PBS缓冲液补至总体积为2.5 mL，同时用规格为1.5 mL的EP管接洗脱液，每EP管接约0.5 mL；

（3.8）待上述步骤3.7中的PD-10脱盐柱中无液体流出后，加入0.5 mL的PBS缓冲液进行淋洗，同时用规格为1.5 mL的EP管接洗脱液，每EP管接0.5 mL；重复操作15次；

（3.9）用医用活度计测量每EP管洗脱液的放射性活度，计数最大的即为^99mTc-KN035。

实施例2

^99mTc-KN035的标记率、比活度、放射化学纯度及稳定性检测。

（1）^99mTc-KN035标记率为75.87 ± 4.60 %，比活度为2.68 MBq/μg。

（2）放射化学纯度：iTLC-SG层析纸测定标记物的放射化学纯度。取4 μL ^99mTc-KN035点样于层析纸边缘1cm处，分别用PBS和甲醇和1M醋酸铵（体积比1:1）为展开剂，结果如图3中的A 为纯化后用PBS作为展开剂，图3中的B为纯化后用甲醇和1M醋酸铵按体积比为1:1作为展开剂，显示纯化后的产物中无游离^99mTc和^99mTc-胶体的存在，放射化学纯度为99.40 ± 0.11%。

（3）稳定性：将纯化后的^99mTc-KN035分别于与PBS、胎牛血清（FBS）按体积比为1:1混合，于37℃孵育。分别测定其在2 h、4 h、6 h、12 h、24 h的放射化学纯度，每个时间点重复3次。结果示在PBS和FBS中24 h放射化学纯度均大于95%（图3中的 C所示）。

实施例3

探针^99mTc-KN035亲和力及体外靶向性验证。

（1）肿瘤细胞表面PD-L1的表达

通过细胞免疫荧光和细胞免疫组化分析细胞系H1975和A549的PD-L1表达情况。结果如图4，细胞免疫荧光示H1975细胞有较强的荧光，而A549细胞荧光较弱。细胞免疫组化实验，通过PD-L1与内参β-action条带的灰度值之比进行半定量分析，结果示H1975细胞的比值显著高于A549细胞（11.30%  vs. 96.26%）。因此，H1975细胞高表达PD-L1，A549细胞低表达PD-L1。

（2）细胞饱和实验

（2.1）将高表达PD-L1的H1975细胞系和低表达PD-L1的A549细胞系分别接种于24孔板中，每孔接种1.5×10⁵个细胞，于37℃、5%的CO₂培养箱中培养至细胞贴壁。弃去旧培养基，PBS洗2遍后行以下实验操作；

（2.2）设置5组，4个复孔/组，每组每孔加入含不同剂量^99mTc-KN035（0.37-185kBq）的无血清RPMI 1640培养基，于37℃、5%的CO₂培养箱中孵育1小时；

（2.3）分别收集上清和细胞：收集细胞培养液，并用PBS清洗细胞2次作为上清；1 N的NaOH消化获取细胞悬液，并用PBS清洗细胞2次，作为细胞悬液；

（2.4）用γ计数器分别测定上清和细胞悬液计数，计算细胞饱和及特异性摄取率。

结果如图5中的A所示，随着^99mTc-KN035探针浓度增高，细胞摄取增加，在3.7 kBq/孔时达到饱和，K_D值为31.04 nM。

（3）细胞结合实验

（3.1）将高表达PD-L1的H1975细胞系和低表达PD-L1的A549细胞系分别接种于24孔板中，每孔接种1.5×10⁵个细胞，于37℃、5%的CO₂培养箱中培养至细胞贴壁。弃去旧培养基，PBS洗2遍后行以下实验操作；

（3.2）细胞结合实验中每孔加入3.7 kBq ^99mTc-KN035，于37℃、5%的CO₂培养箱中分别孵育0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h后收集上清液和细胞，用γ计数器分别测定上清和细胞悬液计数，计算细胞摄取率。

结果如图5 中B和表1所示，^99mTc-KN035在PD-L1高表达的H1975细胞中摄取率随时间增加，在6 h时达到平台期。与PD-L1低表达的A549细胞相比，H1975细胞各个时间点的摄取率均明显高于A549细胞，差异有统计学意义（* p＜0.05, ** p＜0.01, *** p＜0.001）。

表1. H1975（高表达PD-L1）及A549（低表达PD-L1）细胞系在不同时间点的细胞摄取率（%，n = 4）。

（4）细胞阻断实验

（4.1）将高表达PD-L1的H1975细胞系接种于24孔板中，每孔接种1.5×10⁵个细胞，于37℃、5%的CO₂培养箱中培养至细胞贴壁。弃去旧培养基，PBS洗2遍后行以下实验操作；

（4.2）设置5组，分别为对照组（不加未标记的KN035）；不同阻断组，即25倍，50倍，100倍和500倍的未标记的KN035。上述5组细胞预处理1 h后再加入3.7 kBq的^99mTc-KN035，孵育1 h后分别收集上清液和细胞，用γ计数器分别测定上清和细胞悬液计数，计算细胞摄取率。

结果如图5中的C和表2所示，^99mTc-KN035能被25倍未标记的KN035特异性阻断（** p＜0.01）。100倍和500倍未标记的KN035的阻断效果无差异（ p＞0.05）。100倍未标记的KN035阻断组的细胞摄取较对照组下降了97.03%左右。以上实验结果说明^99mTc-KN035在PD-L1阳性细胞中为特异性摄取。

表2. H1975细胞系在不同阻断倍数的摄取率（%，n=4）。

实施例4

探针^99mTc-KN035体内靶向性验证。

（1）建立荷瘤鼠模型

将1×10⁶个H1975、A549细胞分别悬浮于150 uL的PBS中，分别通过皮下注射接种于5周龄的雌性裸鼠上肢腋窝部，待肿瘤体积长至0.6-0.8 cm时行SPECT/CT显像及生物分布。

（2）荷瘤鼠SPECT/CT显像

（2.1）H1975和A549荷瘤鼠分别尾静脉注射体积为150 μL、放射性剂量为29.6-37MBq的^99mTc-KN035。H1975阻断组提前1h尾静脉注射100倍未标记的KN035后，再尾静脉注射体积为150 μL、放射性剂量为29.6-37 MBq的^99mTc-KN035；

（2.2）于注射后4 h、8 h、12 h、18 h 和24 h 行小动物SPECT/CT显像（永新小动物PET/SPECT/CT多模态成像系统）；1.5%的异氟烷-氧气诱导麻醉，1.0%的异氟烷-氧气维持麻醉；SPECT参数：采集时间，4、8 h为10秒/帧，12、18 h为12秒/帧，24 h为15秒/帧；矩阵256×512；CT参数：球管电压45 kVp，电流0.15 mA，曝光时间300 ms/帧；

（2.3）显像结束后，在后处理工作站（NMSoft-AIWS Version 1.7）处理数据，获得SPECT/CT图像。

结果如图6所示，箭头所示为肿瘤部位，高表达PD-L1的H1975肿瘤4 h肿瘤显影清晰，随后肿瘤部位显像剂进一步浓聚，其他组织器官放射性逐渐降低，至24 h时肿瘤仍清晰可见。而A549荷瘤鼠及H1975阻断组肿瘤在各个时间点显影均浅淡。说明该探针可特异性聚集于高表达PD-L1的肿瘤，具有优良的靶向性。

（3）荷瘤鼠生物分布

（3.1）H1975和A549荷瘤鼠尾静脉注射体积为150 μL、放射性剂量为29.6-37 MBq的^99mTc-KN035。H1975阻断组提前1 h尾静脉注射100倍未标记的KN035后，再尾静脉注射体积为150 μL、放射性剂量为29.6-37 MBq的^99mTc-KN035；

（3.2）分别于注射后4 h、12 h和24 h处死小鼠，阻断组至注射后24 h处死小鼠。取感兴趣的组织，如血液、脑、心脏、肺、肝、脾、肾、胰腺、胃、小肠、大肠、肌肉、骨、肿瘤，超纯水冲洗后晾干、称重；

（3.3）γ计数器测量放射性计数，经放射性衰减校正后计算每克组织的百分注射剂量比（%ID/g）和肿瘤/肌肉比值。

结果如图7及表3所示，注射后4 h、12 h和24 h时H1975肿瘤摄取分别高达9.68 ±0.91%ID/g，11.97 ± 2.05 %ID/g和13.31 ± 2.23%ID/g，显著高于A549肿瘤相应时间点的摄取，分别为4.59 ± 0.76 %ID/g，5.43 ± 0.58 %ID/g和5.54 ± 0.28 %ID/g（** p＜0.01）；H1975肿瘤阻断组24h肿瘤摄取明显低于非阻断组（5.64 ± 1.11% ID/g  vs 13.31± 2.23% ID/g, ** p＜0.01）。与SPECT显像结果有很好的一致性。肿瘤和肌肉比值显示，H1975肿瘤具有优良的靶本比，注射后4 h、12 h和24 h时H1975肿瘤和肌肉比值分别为6.38±1.54，7.11±0.66，8.85±0.20，明显高于H1975阻断组和相应时间点的A549肿瘤和肌肉的比值，且差异具有统计学意义（* p＜0.05）。

表3. ^99mTc-KN035在荷瘤鼠体内的生物分布(%ID/g ± SD, n = 4)。

本发明所述的SPECT分子影像探针^99mTc-KN035合成方法简单，反应条件温和，产率高，成本低，探针与PD-L1亲和力高，可在任何水平的核医学科开展。该探针与PD-L1优良的亲和力及其较小的单域抗体Fc融合蛋白结构使其在体内具备良好的体内药代动力学，在探针注射后4h肿瘤显影清晰，随时间显影进一步增强，24h肿瘤仍清晰可见，靶/本比高，有利于高表达PD-L1的肿瘤转移灶的探测。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (2)

1.一种靶向PD-L1的SPECT分子影像探针，其特征在于，所述探针为单光子核素^99mTc标记KN035得到的^99mTc-KN035。

2.一种靶向PD-L1的SPECT分子影像探针的制备方法，所述探针为单光子核素^99mTc标记KN035得到的^99mTc-KN035，其特征在于，包括以下步骤：

（1）Zeba脱盐柱的活化

（1.1）取1支Zeba脱盐柱，去除Zeba脱盐柱顶帽及底塞，放入规格为1.5 ml的EP管中，用离心机以4℃，1500×g离心1 min去除Zeba脱盐柱中的储存液；

（1.2）加300 μl 的10×Modification Buffer缓冲液于所述步骤1.1中的Zeba脱盐柱，用离心机以4℃，1500×g离心1 min，弃掉缓冲液，重复3遍，得到1支活化的Zeba脱盐柱；所述10×Modification Buffer缓冲液为含有1.0 M phosphate, 1.5 M NaCl, pH 8.0的缓冲液；

（1.3）取另1支Zeba脱盐柱，去除Zeba脱盐柱顶帽及底塞，放入规格为1.5 ml的EP管中，用离心机以4℃，1500×g离心1 min去除Zeba脱盐柱中的储存液；

（1.4）加300 μl 的10×Conjugating Buffer缓冲液于所述步骤1.3中的Zeba脱盐柱，用离心机以4℃，1500×g离心1min，弃掉缓冲液，重复3遍，得到另1支活化的Zeba脱盐柱；所述10×Conjugating Buffer缓冲液为含有1.0 M phosphate, 1.5 M NaCl, pH 6.0的缓冲液；

（2）KN035的纯化

取2 uL的浓度为200 μg/μL的KN035，用超纯水稀释至体积为70 uL，加入至所述步骤1.2中的活化的Zeba脱盐柱中，用离心机以4℃，1500×g离心2 min，得到纯化的KN035；

（3）^99mTc-KN035的制备

（3.1）称取0.2 mg 的螯合剂SHNH粉末溶于20 uL的无水DMSO, 配制成浓度为10 μg/μL的SHNH溶液；

（3.2）取10 uL 的浓度为10 μg/μL的SHNH溶液与所述纯化的KN035混匀，4℃震荡避光反应12 h；

（3.3）将上述步骤3.2中的反应物加入所述步骤1.4中的活化的Zeba脱盐柱中，用离心机以4℃，1500×g离心2 min去除过量的SHNH，得到SHNH与KN035反应后的产物HYNIC-KN035；

（3.4）将上述HYNIC-KN035与50 μL 浓度为200 mg/mL 的Tricine溶液、2 μL浓度为14mg/mL的SnCl₂ 溶液及600 μL 放射性活度为25 mCi的Na^99mTcO₄溶液混匀，37℃震荡避光反应30 min；

（3.5）取PD-10脱盐柱，去掉顶帽与底塞，去除储存液；

（3.6）用5 mL的PBS缓冲液加入所述PD-10脱盐柱，待PBS缓冲液流尽后，再次加入5 mL的PBS缓冲液于所述PD-10脱盐柱中使PBS缓冲液流尽；重复操作4次，得到活化的PD-10脱盐柱；

（3.7）将步骤3.4中的反应物加入所述活化的PD-10脱盐柱，加PBS缓冲液补至总体积为2.5 mL，同时用规格为1.5 mL的EP管接洗脱液，每EP管接约0.5 mL；

（3.8）待上述步骤3.7中的PD-10脱盐柱中无液体流出后，加入0.5 mL的PBS缓冲液进行淋洗，同时用规格为1.5 mL的EP管接洗脱液，每EP管接0.5 mL；重复操作15次；

（3.9）用医用活度计测量每EP管洗脱液的放射性活度，计数最大的即为^99mTc-KN035。

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