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CN116036303A - 一种抗体-药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗体-药物偶联物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116036303A CN202310035642.4A CN202310035642A CN116036303A CN 116036303 A CN116036303 A CN 116036303A CN 202310035642 A CN202310035642 A CN 202310035642A CN 116036303 A CN116036303 A CN 116036303A
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Abstract

本发明提供了一种抗体‑药物偶联物及其制备方法和应用。所述抗体‑药物偶联物的结构式为

Description

一种抗体-药物偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物领域，特别涉及一种抗体-药物偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)是将单克隆抗体或者抗体片段通过化学接头与具有生物活性的小分子细胞毒性药物相连。这种基于抗体的新型药物与传统化学疗法相比，将细胞毒性药物有效递送至肿瘤靶细胞，兼具抗体的高特异性和细胞毒性药物对肿瘤的高毒性，故抗体-药物偶联物能更精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常细胞的伤害。
ADC包括抗体、接头和细胞毒性药物三个组成部分。通过靶向特定抗原，ADC能够渗透到肿瘤组织，并被肿瘤细胞吞噬进入酶溶体，释放细胞毒性药物。尽管目前已经有近15种ADC药物陆续上市，但ADC在结构设计方面仍然有待进一步优化。例如，理想的连接子应在循环系统中保持稳定，并在肿瘤中有效释放有效载荷(例如，细胞毒性药物)。然而，现有的连接子通常会非特定地释放有效载荷，并不可避免地导致脱靶毒性。可见，连接子设计在调节ADC在体循环中的稳定性和肿瘤中的有效载荷释放效率方面起着关键作用，大大影响ADC的药代动力学(PK)、疗效和毒性特征。
人表皮生长因子受体2(HER2，也称ERBB2)是表皮生长因子受体家族(EGFR)中的一员。HER2基因定位于染色体17q21，其编码产物是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，分子量约为185kD，又称为p185。HER2通过形成同源二聚体或与其他EGFR受体HER1(EGFR，ErbB-1)、HER3(ErbB-3)、HER4(ErbB-4)形成异源二聚体，而将细胞内酪氨酸残基自磷酸化从而将其活化、从而激活下游信号，促进癌细胞的侵袭和转移。
目前，已上市的抗HER2靶向药物主要包括：1、单克隆抗体，例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)；2、ADC，例如，trastuzumab emtansine(T-DM1)、trastuzumab deruxtecan(T-DXd)。但仍需要一种疗效更好且更能抑制肿瘤生长的抗HER2靶向药物，尤其是ADC药物。
发明内容
根据本说明书的一个方面，提供了一种抗体-药物偶联物，所述偶联物具有式Ia所示的结构：
Figure BDA0004049198190000011
其中，mAb为抗HER2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)；所述偶联物通过所述mAb的链间双硫键经还原后得到的巯基与连接子-依喜替康缀合物LD038
Figure BDA0004049198190000021
发生迈克尔加成得到；n介于1-10之间。
在一些实施例中，所述n介于5-10之间。
在一些实施例中，所述n为8。
在一些实施例中，所述连接子为可裂解的亲水连接子。
根据本说明书的另一个方面，提供了一种上述抗体-药物偶联物的制备方法，所述方法包括：
a)制备所述连接子-依喜替康缀合物LD038
Figure BDA0004049198190000022
b)将曲妥珠单抗还原后，与所述LD038进行偶联反应，得到所述抗体-药物偶联物。
在一些实施例中，所述将曲妥珠单抗还原后，与所述LD038进行偶联反应，得到所述抗体-药物偶联物可以包括：所述曲妥珠单抗的链间双硫键经还原后得到的巯基与所述LD038发生迈克尔加成。
在一些实施例中，所述制备连接子-依喜替康缀合物LD038包括：
i)合成化合物38-6
Figure BDA0004049198190000031
ii)将所述化合物38-6与化合物38-7
Figure BDA0004049198190000032
反应，得到依喜替康的连接物38-9
Figure BDA0004049198190000033
以及
iii)将所述化合物38-9与MC-OSu
Figure BDA0004049198190000034
反应，得到所述LD038。
在一些实施例中，所述化合物38-6通过化合物38-1
Figure BDA0004049198190000035
N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)、化合物38-3
Figure BDA0004049198190000036
和D-葡萄糖反应得到。
在一些实施例中，所述化合物38-1与所述N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)混合，加入二氯甲烷以及EDCl，室温下反应得到化合物38-2
Figure BDA0004049198190000041
将所述化合物38-2、DIPEA和DMF混合，加入所述化合物38-3，室温下反应得到化合物38-4
Figure BDA0004049198190000042
对所述化合物38-4进行脱Fmoc反应，得到化合物38-5
Figure BDA0004049198190000043
将所述化合物38-5、所述D-葡萄糖、乙酸和甲醇混合并加热到50℃，反应30分钟后加入NaCNBH3，50℃反应16h，得到所述化合物38-6。
根据本说明书的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包括上述抗体-药物偶联物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
根据本说明书的再一个方面，提供了所述抗体-药物偶联物或所述药物组合物在制备用于治疗HER2过表达癌症的药物中的应用。
在一些实施例中，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：
图1是根据本说明书一些实施例所示的采用SEC-HPLC法测定PRO1102含量的色谱图；
图2是根据本说明书一些实施例所示的采用SEC-HPLC法测定trastuzumab-deruxtecan(8)偶联物含量的色谱图；
图3是根据本说明书一些实施例所示的采用SEC-HPLC法测定trastuzumab-vedotin(4)偶联物含量的色谱图；
图4是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物与乳腺导管癌细胞HCC1954的结合活性检测结果图；
图5是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物与人卵巢癌细胞SKOV-3的结合活性检测结果图；
图6是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物与乳腺癌细胞JIMT-1的结合活性检测结果图；
图7是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物与人胰腺癌细胞Capan-1的结合活性检测结果图；
图8是根据本说明书一些实施例所示的trastuzumab在多个肿瘤靶细胞的内化率的检测结果图；
图9是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102在多个肿瘤靶细胞的内化率的检测结果图；
图10是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对乳腺导管癌细胞HCC1954的细胞毒性检测结果图；
图11是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对人卵巢癌细胞SK-OV-3的细胞毒性检测结果图；
图12是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对乳腺癌细胞JIMT-1的细胞毒性检测结果图；
图13是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物对人胰腺癌细胞Capan-1的细胞毒性检测结果图；
图14是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对乳腺导管癌细胞HCC1954皮下移植裸鼠后的肿瘤生长曲线；
图15是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对人卵巢癌细胞SK-OV-3皮下移植裸鼠后的肿瘤生长曲线；
图16是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对乳腺癌细胞JIMT-1皮下移植裸鼠后的肿瘤生长曲线；
图17是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物针对人胰腺癌细胞Capan-1皮下移植裸鼠后的肿瘤生长曲线；
图18是根据本说明书一些实施例所示的PRO1102、trastuzumab和其他trastuzumab偶联物在大鼠体内药物代谢动力学(PK)的曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤、元素和/或物质，而这些步骤、元素和/或物质不构成一个排它性的罗列，也可能包含其它的步骤、元素和/或物质。
本申请中一些常用的缩写及英文单词具有如下含义：
EDCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
HOSu：N-羟基丁二酰亚胺
DCM：二氯甲烷
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
Boc：叔丁氧羰基
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DEA：二乙醇胺
D-glucose：D-葡萄糖
NaCNBH3：氰基硼氢化钠
MeOH：甲醇
THF：四氢呋喃
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TFA：三氟乙酸
DMSO：二甲基亚砜
EDTA：乙二胺四乙酸
TCEP：三(2-羧乙基)膦
LCMS：液质联用仪
SMCC-DM1：由连接子4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和细胞毒性药物美登素(DM1)连接而成的小分子
Mc-vcMMAE：由连接子马来酰亚氨基己酰(Mc)、可裂解的二肽缬氨酸-瓜氨酸(vc)、以及细胞毒性药物一甲基澳瑞他汀E(MMAE)连接而成的小分子
本申请中一些术语的定义：
术语“本说明书化合物/偶联物”、“本发明抗体-药物偶联物”指式Ia所示的化合物。该化合物命名为PRO1102或trastuzumab-LD038。该术语还包括式Ia化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
术语“药学上可接受的盐”指式Ia所示的化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。
术语“药物”是指细胞毒性药物，具体为能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素，细胞毒性药物，化疗药物，抗生素和核溶酶，优选为细胞毒性药物。细胞毒性药物可以为美登素、奥瑞他汀、蒽环类药物和喜树碱类似物等。喜树碱类似物作为拓扑异构酶I(TOP1)抑制剂，抑制生物体内DNA合成，而发挥抗肿瘤作用。示例性的喜树碱类似物包括拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan；CPT-11)、贝洛替康(belotecan)、依喜替康(exatecan)、德鲁替康(deruxtecan)等。在一些实施例中，所述药物为依喜替康，其结构式为
Figure BDA0004049198190000061
术语“连接子”是指一端与抗体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他连接子后再与药物相连。
术语“抗体”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。例如，抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL通常由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本说明书中抗体-药物偶联物中的抗体指的是抗HER2抗体。在一些实施例中，所述抗HER2抗体为曲妥珠单抗(trastuzumab)。
术语“DAR值”是指式(Ia)分子中每个抗体上连接的药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值。在本申请的一些实施例中，DAR值表示为n。示例性地，n可以为1-10之间的任意整数或小数值，例如，1、3、5、7、8、9、10等。可用常规方法如UV/可见光光谱法、质谱、ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的DAR值。
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
术语“约”和“左右”可描述在某个值的一定取值范围内，例如加上或减去该值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％等。例如，术语“约150mm3”可以包括135mm3至165mm3。
“介于a-b之间”表示在a到b之间的任意数值，包括小数或整数。介于a-b之间包括边界值数值a和数值b。例如，“介于1-10之间”表示在1到10之间的任意数值，例如，1、5、6.5、8、10等。
本说明书的一个方面提供了一种抗体-药物偶联物。其结构如式Ia所示
Figure BDA0004049198190000071
其中，mAb为抗HER2抗体曲妥珠单抗；偶联物通过所述mAb的链间双硫键经还原后生成的巯基与连接子-依喜替康缀合物LD038
Figure BDA0004049198190000072
发生迈克尔加成得到；n介于1-10之间。
在一些实施例中，n的取值介于5-10之间。在一些实施例中，n的取值介于6-9之间。在一些实施例中，n的取值介于7-9之间。在一些实施例中，n的取值为8。
在一些实施例中，式Ia所示抗体-药物偶联物(ADC)由连接子、DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂依喜替康与HER2抗体曲妥珠单抗组成。
在ADC药物设计中，合适的连接子能充分平衡抗体和小分子之间的相互作用力，生产的ADC具备更好的稳定性可以达到ADC药物预期的效果。在本说明书的一些实施例中，连接依喜替康和曲妥珠单抗的连接子为可裂解的亲水连接子，由于该连接子中含有较多羟基，能提高抗体-药物偶联物的亲水性，从而控制ADC的聚集，使得高负载载荷的ADC药物(DAR＝8)具备良好的物理化学性质。该连接子中包含缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)二肽结构
Figure BDA0004049198190000081
该二肽结构可以避免小分子药物被过早释放，增加抗体-药物偶联物在体内循环系统中的稳定性。该二肽结构对多种组织蛋白酶表现出广泛的敏感性，包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L等。组织蛋白酶B在肿瘤细胞特异性高表达，因此，可裂解的亲水连接子中的二肽结构可以在肿瘤内部释放依喜替康。
在一些实施例中，可裂解的亲水连接子中还包含通过酰胺连接基团连接的长链聚乙醇结构，该类连接基团在反应后形成酰胺键，通过酰胺键形成的偶联物比较稳定，不易在体循环中断裂，能够提高ADC的稳定性，进而扩大治疗窗口并提高机体对药物的耐受性。
依喜替康是一种DNA拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ)抑制剂。拓扑异构酶抑制剂作用于拓扑异构酶，对很多肿瘤发挥抑制活性。DNA拓扑异构酶是DNA复制的关键酶，在细胞转录、重组和修复中发挥重要作用。相比于正常细胞，肿瘤细胞中拓扑异构酶的含量及活性均显著提高，因此，拓扑异构酶是抗肿瘤药物优良的作用靶点，如喜树碱类、鬼臼毒素类、阿霉素等都是以拓扑异构酶为靶点，干扰DNA复制而发挥抗肿瘤作用。作为水溶性的喜树碱衍生物，依喜替康具有优良的抗肿瘤功能。
曲妥珠单抗是针对细胞核HER2基因调控细胞表达的P185糖蛋白而研制的重组DNA衍生的人源化IgG1型单克隆抗体，其轻链可变区由鼠源部分组成，可以识别P185糖蛋白，而重链固定区和大部轻链区均是人源部分。曲妥珠单抗进入人体后能选择性地与P185糖蛋白结合，抑制HER2阳性肿瘤细胞生长。曲妥珠单抗是抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的潜在介质，本身具有抗肿瘤作用，此外还可以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性，从而提高化疗的疗效。
本说明书的抗体-药物偶联物以单抗为载体将小分子细胞毒性药物以靶向方式高效地运输至目标肿瘤细胞中，从而起到抗肿瘤作用。本说明书的抗体-药物偶联物可以用于治疗HER2过表达癌症，HER2过表达癌症可以包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、子宫内膜癌大肠癌等。所述癌症优选为乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
本说明书的另一个方面提供了一种上述抗体-药物偶联物的制备方法。所述方法可以包括以下步骤：
a)制备所述连接子-依喜替康缀合物LD038
Figure BDA0004049198190000082
b)将曲妥珠单抗还原后，与所述LD038进行偶联反应，得到所述抗体-药物偶联物。
在一些实施例中，所述将曲妥珠单抗还原后，与所述LD038进行偶联反应，得到所述抗体-药物偶联物可以包括：曲妥珠单抗的链间双硫键经还原后得到的巯基与LD038发生迈克尔加成。在一些实施例中，双硫键经还原后的巯基中的一个巯基与LD038发生迈克尔加成反应。
在一些实施例中，所述制备连接子-依喜替康缀合物LD038包括如下步骤：
i)合成化合物38-6
Figure BDA0004049198190000091
ii)将所述化合物38-6与化合物38-7
Figure BDA0004049198190000092
反应，得到依喜替康的连接物38-9
Figure BDA0004049198190000093
以及
iii)将所述化合物38-9与MC-OSu
Figure BDA0004049198190000094
反应，得到所述LD038。
在一些实施例中，所述化合物38-6通过化合物38-1
Figure BDA0004049198190000095
N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)、化合物38-3
Figure BDA0004049198190000096
和D-葡萄糖反应得到。
在一些实施例中，所述化合物38-1与所述N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)混合，加入二氯甲烷以及EDCl，室温下反应得到化合物38-2
Figure BDA0004049198190000101
将所述化合物38-2、DIPEA和DMF混合，加入所述化合物38-3，室温下反应得到化合物38-4
Figure BDA0004049198190000102
对所述化合物38-4进行脱Fmoc反应，得到化合物38-5
Figure BDA0004049198190000103
将所述化合物38-5、所述D-葡萄糖、乙酸和甲醇混合并加热到50℃，反应30分钟后加入NaCNBH3，50℃反应16h，得到所述化合物38-6。在一些实施例中，加入NaCNBH3在50℃反应4h后，可以补加NaCNBH3和D-葡萄糖继续反应12h。
根据上述制备方法将曲妥珠单抗与依喜替康通过连接子偶联后，得到的ADC产物对肿瘤靶细胞的结合活性、内化活性不受影响；与同类型的曲妥珠单抗的药物偶联物相比，例如，曲妥珠单抗-德鲁替康偶联物(trastuzumab-deruxtecan(8)，具体制备方式见实施例2，曲妥珠单抗-一甲基澳瑞他汀E偶联物(trastuzumab-vedotin(4)，具体制备方式见实施例4和曲妥珠单抗-美登素偶联物(trastuzumab-emtansine(4)，具体制备方式见实施例3)，本说明书抗体-药物偶联物的制备方法所合成的trastuzumab-LD038(PRO1102)在对肿瘤细胞的体外细胞毒性、大鼠体内抗肿瘤活性、体内药物代谢动力学方面均表现出一定优势。
关于制备方法的更多内容可以参考实施例1的内容。应当注意的是，本领域技术人员可以根据本发明的制备方法进行扩大化或缩小化生产，例如，若需要大量生产抗体-药物偶联物，可以将各试剂的量增加，并适应性修改各个反应条件，对于方法中的各种试剂的替换或其浓度和比例的修改或替换均在本发明的保护范围内。
根据本说明书的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包括上述式Ia所示的抗体-药物偶联物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
所述药物组合物包括安全有效量的所述抗体-药物偶联物。有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以根据各种因素(例如，患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径、药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等)来确定(例如通过临床试验)。
在一些实施例中，赋形剂为药物组合物中除主药以外的附加物，也可称为辅料。赋形剂可以包括但不限于如粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等。
稀释剂用于增加药物组合物(例如，片剂形式)的重量和体积。稀释剂可以包括但不限于如淀粉、乳糖、钙的无机盐、微晶纤维素等。
药理上可接受的载体可以包括包衣层、胶囊、微胶囊、纳米胶囊等或其任何组合。在一些实施例中，载体可以保护组合物中的关键成分而减少或避免在一些负面条件(例如氧化、强酸或强碱引起的变性等)下关键成分发生失活或分解的现象。例如，胃液中的酶或相对较低的pH值可能会导致关键成分分解或失活。载体可以通过保护组合物中的关键成分来帮助维持或提高药物组合物的功效。
在一些实施例中，载体可以用于关键成分(例如，依喜替康)的控制释放。控制释放可包括但不限于缓慢释放、持续释放、靶向释放等。例如，载体可包括由胶原、明胶、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、淀粉、交联淀粉等或其任何组合制成的水凝胶胶囊、微胶囊或纳米胶囊。
在一些实施例中，药学上可接受的载体可以包括分散介质(例如溶剂)、包衣、缓冲剂、稳定制剂、等渗剂和吸收延迟剂等。示例性药理上可接受的载体可以包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液、凝胶、可生物吸附基质材料等，或其他适合的材料，或其任意组合。
该药物组合物可以施用于患有HER2过表达癌症的对象，例如，人或动物。药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入患者的血液中。在一些实施例中，组合物可以在适合的温度下储存，温度可以包括室温(约20℃)、4℃、-20℃、-80℃等。组合物还可以被制成各种利于储存和运输的形式，例如粉剂。粉剂可以是无菌粉末，在使用前可以向无菌粉末添加溶剂并混合均匀，来制备用于注射或局部施用的溶液。
根据本说明书的再一个方面，提供了所述抗体-药物偶联物或所述药物组合物在制备用于治疗HER2过表达癌症的药物中的应用。在一些实施例中，HER2过表达癌症可以包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、子宫内膜癌大肠癌等。在一些实施例中，所述癌症优选为乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1PRO1102(trastuzumab-LD038)抗体药物偶联物的制备
(1)LD038的合成
Figure BDA0004049198190000111
步骤1，将化合物38-1(650mg，0.774mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)(177.98mg，1.548mmol)加入反应瓶中，加入干燥的二氯甲烷(8mL)，室温搅拌，加入EDCl(296.69mg，1.548mmol)，室温搅拌直到反应完全，加入水洗涤，用DCM反复萃取两次(10mL*2).合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干得到38-2(552mg，0.589mmol，收率为76.12％)，直接用于下一步反应，LCMS:m/z＝959.4(M+Na)+。
Figure BDA0004049198190000112
步骤2，将化合物38-2(300mg，0.357mmol)和DIPEA(138.22mg，1.071mmol)加入到反应瓶中，加入干燥的DMF(2mL)，室温搅拌，将化合物38-3(87.97mg，0.357mmol)加入反应瓶中，室温搅拌反应直到反应完全，反应液直接用反相制备法纯化(40g C18柱，流动相为乙腈和0.01％TFA水溶液)，合并纯化后的制备液，浓缩后冻干得到化合物38-4(260mg，0.243mmol，收率为68.14％)，LCMS((M-100)/2+H)+＝484.9。
Figure BDA0004049198190000121
步骤3，将化合物38-4(260mg，0.243mmol)、二乙胺和乙腈加到反应瓶中，室温搅拌反应2小时，反应液直接用反相制备法纯化(12g C18柱，流动相为乙腈和0.01％TFA水溶液)，合并纯化后的制备液，浓缩后冻干得到化合物38-5(170mg，0.201mmol，收率为82.54％)。LCMS，ESI m/z＝846.6(M+H)+。
Figure BDA0004049198190000122
步骤4，将化合物38-5(170mg，0.201mmol)、D-葡萄糖(217.08mg，1.206mmol)、乙酸(1.21mg，0.020mmol)及甲醇(5mL)加到反应瓶中，加热至50摄氏度，并在这个温度下反应30分钟，加入NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)，继续在这个温度下反应4小时。补加NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)和D-葡萄糖(217.08mg，1.206mmol)，50摄氏度反应过夜。浓度去除甲醇，配成水溶液后用反相制备法纯化得到化合物38-6(106mg，0.090mmol，收率为44.92％)。LCMS，ESI m/z＝537.9((M-100)/2+H)+。
Figure BDA0004049198190000123
步骤5，将化合物38-6(250mg，0.213mmol)、HATU(121.45mg，0.319mmol)、DIPEA(82.41mg，0.639mmol)和DMF(2mL)加入反应瓶中，室温搅拌反应5分钟，加入化合物38-7(178.88mg，0.213mmol)，室温搅拌反应2小时，反应完全，反应液直接用反相制备法纯化(40g C18柱，乙腈和0.01％TFA水溶液作为流动相)得到化合物38-8(270mg，0.135mmol，收率为63.48％)。LCMS，ESI m/z＝666.6(M/3+H)+，999.2(M/2+H)+。
Figure BDA0004049198190000131
步骤6，将化合物38-8(120mg，0.060mmol)、二氯甲烷和TFA(2mL)加入到反应瓶中，室温反应1小时，原料消失，加入碳酸氢钠水溶液，继续室温搅拌反应1小时，三氟乙酸酯均被破坏，浓缩去除二氯甲烷后的水相，用反相制备法纯化(C18柱，流动相为乙腈和0.01％TFA水溶液)得到化合物38-9(80mg，0.042mmol，收率为70.19％)。LCMS，ESI m/z＝633.2(M/3+H)+，949.2(M/2+H)。
Figure BDA0004049198190000132
步骤7，将化合物38-9(20mg，0.011mmol)、DIPEA(4.08mg，0.032mmol)和干燥DMF(1mL)加入反应瓶中，室温搅拌反应，化合物38-10(4.88mg，0.016mmol)的DMF(1mL)溶液缓慢滴加到反应液中，室温反应过夜，反应完全，反应液直接用反相制备法纯化(C18柱，流动相为乙腈和0.01％TFA水溶液)得到化合物LD038(PB038)(11mg，0.005mmol，收率为49.91％)，白色固体，LCMS，m/z＝697.7(M/3+H)+。LD038的核磁数据如下：
1HNMR(400MHz，DMSO-d6):δ10.03(s，1H)，8.19-8.11(m，2H)，8.07(d，J＝8.8Hz，1H)，7.96(d，J＝7.6Hz，1H)，7.82-7.77(m，2H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(s，2H)，6.53(s，1H)，5.99(t，J＝5.6Hz，1H)，5.45-5.43(m，6H)，5.30-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.84-4.74(m，2H)，4.65-4.49(m，4H)，4.45-4.35(m，3H)，4.27-4.17(m，2H)，4.04-3.95(m，2H)，3.80-3.77(m，2H)，3.71-3.67(m，2H)，3.62-3.55(m，9H)，3.53-3.43(m，44H)，3.27-3.21(m，2H)，3.16-3.07(m，2H)，3.07-2.93(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.13(m，2H)，2.13-2.08(m，2H)，2.00-1.82(m，4H)，1.73-1.54(m，4H)，1.54-1.40(m，7H)，1.40-1.30(m，4H)，1.30-1.14(m，5H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
(2)PRO1102(trastuzumab-LD038)偶联物的制备
向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入10当量的TCEP-HCl水溶液，缓冲液是50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9。在25℃的条件下，反应2小时。过量的TCEP需用50mM磷酸盐5mM的EDTA pH＝6.9的缓冲液超滤去除。9.5当量的20mg/mL的LD038的水溶液加入还原的抗体中，偶联反应在25℃反应2小时。多余的LD038及其副产物用50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9的缓冲液超滤去除，超滤后的trastuzumab-LD038偶联物储存在含有6％蔗糖，0.02％吐温20的pH＝5.6的20mM组氨酸溶液中。最终采用SEC-HPLC测得trastuzumab-LD038偶联物的纯度是98％，采用LCMS测得DAR值是8.0。将得到的trastuzumab-LD038偶联物命名为PRO1102。
实施例2trastuzumab-deruxtecan(8)偶联物的制备
向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入10当量的TCEP-HCl水溶液，缓冲液是50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9。在25℃的条件下，反应2小时。过量的TCEP需用50mM磷酸盐5mM的EDTA，pH＝6.9的缓冲液超滤去除。9.5当量的20mg/mL的deruxtecan的DMSO溶液加入还原的抗体中，偶联反应在25℃反应8小时。多余的deruxtecan及其副产物用50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9的缓冲液超滤去除，超滤后的trastuzumab-deruxtecan(8)偶联物储存在含6％蔗糖，0.02％吐温20 的pH＝5.6的20mM组氨酸溶液中，最终采用SEC-HPLC测得trastuzumab-deruxtecan(8)偶联物的纯度是96％，采用LCMS测得DAR值是6.5。
实施例3trastuzumab-emtansine(4)的制备
向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入12当量的SMCC-DM1的DMSO溶液，缓冲液是50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝7.5。在25℃的条件下，反应5小时。过量的SMCC-DM1以及其他副产物需用50mM磷酸盐、5mM的EDTA、以及pH＝6.9的缓冲液超滤去除。将超滤得到的trastuzumab-emtansine(4)储存在含6％蔗糖，0.02％吐温20的pH＝5.6的20mM组氨酸溶液中。最终采用SEC-HPLC法测得trastuzumab-emtansine(4)的纯度是98％，采用LCMS测得DAR值是4.1。
实施例4trastuzumab-vedotin(4)偶联物的制备
向20mg的trastuzumab抗体缓冲液中加入2.2当量的TCEP-HCl水溶液，缓冲液为50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9。在25℃的条件下，反应2小时。5.0当量的20mg/mL的Mc-vcMMAE的DMSO溶液加入还原的抗体中，偶联反应在25℃反应2小时。多余的Mc-vcMMAE及其副产物用50mM的磷酸盐和5mM的EDTA，pH＝6.9的缓冲液超滤去除，将超滤得到的trastuzumab-vedotin(4)偶联物储存在含6％蔗糖，0.02％吐温20的pH＝5.6的20mM组氨酸溶液中。最终采用SEC-HPLC测得trastuzumab-vedotin(4)偶联物的纯度是97％，采用LCMS测得DAR值是3.7。
实施例5抗体-药物偶联物与HER2阳性肿瘤细胞株体外结合活性
(1)细胞培养
HCC1954(科佰，商品目录号CBP60374)为人乳腺癌细胞、SK-OV-3(科佰，商品目录号CBP60291)为人卵巢癌细胞、JIMT-1(科佰，商品目录号CBP60378)为人乳腺癌细胞，这些细胞均购买自科佰生物。Raji(ATCC，商品目录号CCL-86)为淋巴瘤细胞，购买自ATCC，Capan-1为人胰腺癌细胞，为朋友馈赠。使用CO2恒温培养箱，在37℃、5％CO2条件下培养这些细胞系。用含10％FBS(Cell max，商品目录号SA211.02)的RPMI1640(Gibco，商品目录号11875093)培养基培养HCC1954和Raji，用含有10％FBS(Cell max，商品目录号SA211.02)的McCoy's5a Modified(Gibco，商品目录号16600082)培养基培养SK-OV-3，用含10％FBS(Cell max，商品目录号SA211.02)的DMEM(Gibco，商品目录号C11995500BT)培养基培养JIMT-1，用含有20％FBS(Cell max，商品目录号SA211.02)的IMDM(Gibco，商品目录号12440053)培养基培养Capan-1。每1～2天对细胞进行一次传代培养，传代时使用0.25％胰蛋白酶消化细胞并确保合理的传代密度。当细胞处于对数生长期且数量满足试验需求时，收集细胞并计数，用于后续的细胞试验。
(2)测定的肿瘤细胞系拷贝数
通过QIFKIT(DAKO，K0078)检测目标拷贝数，用靶向目标抗原的小鼠单克隆抗体标记细胞，用荧光素偶联的抗小鼠抗体对细胞和试剂盒中的设置微球和校准微球进行平行标记。荧光素与在细胞和微球上结合的小鼠单克隆抗体分子的数量相关，在流式细胞仪上对样品进行分析，并根据标准曲线公式计算拷贝数。HER2分子在所检测的肿瘤细胞系表面的拷贝数见表1。
表1肿瘤细胞系中的目标拷贝数
细胞系 肿瘤类型 HER2的拷贝数(×103per cell)
HCC1954 乳腺癌 365
SK-OV-3 卵巢癌 467
JIMT-1 乳腺癌 70
Capan-1 胰腺癌 33
Raji 淋巴癌 0.18
从表1中可知，SK-OV-3细胞的拷贝数最大，HCC1954细胞的拷贝数次之，Raji拷贝数较低。因此，将HCC1954、SKOV-3HER2、JIMT-1、以及Capan-1作为HER2阳性肿瘤细胞株(肿瘤靶细胞)，用于后续的细胞试验。
(3)通过流式细胞分析评估结合活性
通过流式细胞分析(Beckman，Cytoflex)，评估抗体trastuzumab或实施例1-4制备的抗体-药物偶联物(ADC)与HER2阳性肿瘤细胞系HCC1954、SK-OV-3、JIMT-1、Capan-1的结合活性。在V形底96孔板上以3×105个细胞/孔接种细胞，然后与100μL的trastuzumab或trastuzumab偶联物进行梯度稀释孵育。在4℃下孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞两次，在FACS缓冲液(含1％BSA的1×PBS)中用100μL 1:200稀释的PE-抗人Fc进行染色，然后在4℃下孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤细胞两次，并进行流式细胞分析。
结果见图4-图7和表2，PRO1102及其他trastuzumab偶联物在多个肿瘤靶细胞的结合活性与trastuzumab类似，可以表明偶联后的这些trastuzumab偶联物均并未改变trastuzumab的结合活性。
表2trastuzumab及其抗体-药物偶联物对多种肿瘤细胞株的EC50
Figure BDA0004049198190000151
实施例6抗体-药物偶联物PRO1102在HER2阳性肿瘤细胞株的内化速率研究
使用流式细胞仪对trastuzumab及其偶联物PRO1102在HER2阳性肿瘤细胞株的内化能力检测。细胞培养如上述实施例5中(1)所述，使用含10μg/mL trastuzumab或trastuzumab偶联物PRO1102的FACS缓冲液(1×PBS，含0.1％的BSA)，将3×105个细胞于4℃下培养30分钟。然后在4℃下清洗细胞以去除未结合物质，并根据需要将其置于冰上或转移至37℃的条件下放置。在4℃下用PE-抗人Fc按渐进时间点(0h、0.5h、1h、2h、3h、4h)将细胞染色30分钟，并使用流式细胞仪对其进行分析。
内化率的计算方法如下：用4℃下0时间点细胞表面结合抗体的平均荧光强度(MFI)减去37℃下各时间点细胞表面结合抗体的MFI，然后除以4℃下0时间点细胞表面结合抗体的MFI。
结果见图8-图9，PRO1102在多个肿瘤靶细胞的内化能力与trastuzumab类似，可以表明偶联后并未改变trastuzumab的内化活性。
实施例7本发明抗体-药物偶联物对HER2阳性肿瘤细胞株的细胞毒性研究
细胞培养如上述实施例5中(1)所述。在添加trastuzumab或实施例1-4的trastuzumab偶联物的前一天，收获细胞并将其接种至96孔纯白色平底培养板上。第二天，将细胞暴露于trastuzumab或trastuzumab偶联物范围为100μg/mL～0.05μg/mL(3倍梯度稀释)试品中。将培养板于37℃下培养96～120小时。随后，向培养板各孔中加入40μL Cell-titer Glo(CTG)，孵育5分钟后，并使用酶标仪读取荧光素酶进行分析。根据未处理对照孔中的活细胞百分比对所有读数进行归一化，并通过Prism软件计算IC50值。
结果见图10-图13和表3。通过表3中的IC50数据可以看出，以TOP1抑制剂为药效分子的PRO1102与trastuzumab-deruxtecan(8)的细胞活性数据相当，以微管蛋白抑制剂为药效分子的trastuzumab-emtansine(4)和trastuzumab-vedotin(4)均具备较强的活性，这与ADC药物所应用的药效分子的活性相关。
表3trastuzumab及其抗体-药物偶联物对多种肿瘤细胞株的IC50
Figure BDA0004049198190000152
Figure BDA0004049198190000161
实施例8抗体-药物偶联物对HER2阳性肿瘤细胞株在小鼠异种移植模型中体内抗肿瘤活性研究
针对肿瘤细胞系HCC1954(乳腺癌)、SK-OV-3(卵巢癌)、JIMT-1(乳腺癌)和Capan-1(胰腺癌)皮下移植裸鼠，评价了trastuzumab偶联物(trastuzumab-deruxtecan(8)、trastuzumab-emtansine(4)、trastuzumab-vedotin(4)和PRO1102的体内抗肿瘤活性。
注射悬浮于0.1mL培养基肿瘤细胞建立肿瘤模型(见表4)。肿瘤接种后每天观察肿瘤生长情况，选择平均肿瘤大小约为150mm3的小鼠，根据肿瘤体积，采用分层随机化分为组。随机化后当天开始给药(随机化日定义为D0)，小鼠接受单次(第0天)静脉注射如表5所列剂量。
表4肿瘤模型实验参数表
Figure BDA0004049198190000162
根据实验动物护理和使用委员会(IACUC)批准的研究方案进行本研究。在常规监测时，检查肿瘤生长和给药对动物行为的所有影响，例如，活动性、摄食量和饮水量(通过目视检查)、体重升高/下降(每周测量2次或3次体重)、眼/毛发无光感以及任何其他异常影响。记录死亡和观察到的临床体征。将观察到处于病情持续恶化状态或肿瘤大小超过3000mm3的动物处以安乐死。
主要终点是观察能否延迟肿瘤生长或治愈小鼠。使用卡尺在两个方向测量肿瘤大小，并使用以下公式计算体积(mm3)：V＝0.5×a×b2，式中a和b分别为肿瘤的长径和短径。
使用单因素ANOVA分析各组间肿瘤体积。使用Tukey事后检验与溶媒组进行比较。
所有数据均使用软件GraphPadPrism8.4.2作图和分析。认为P＜0.05具有统计学意义。
表5trastuzumab偶联物在4种小鼠人肿瘤异种移植模型给药方案
Figure BDA0004049198190000163
Figure BDA0004049198190000171
图14-图17分别是HCC1954、SK-OV-3、JIMT-1、以及Capan-1皮下移植裸鼠后的肿瘤生长曲线。相比于trastuzumab-deruxtecan(8)、trastuzumab-emtansine(4)、trastuzumab-vedotin(4)，PRO1102在多个肿瘤模型中显示出更强的肿瘤抑制效果。针对JIMT-1和Capan-1，trastuzumab-emtansine(4)未显示显著肿瘤生长抑制作用，而PRO1102对肿瘤生长的抑制显著强于trastuzumab-deruxtecan(8)。针对Capan-1，PRO1102对肿瘤生长的抑制显著强于其他偶联物和trastuzumab。
通过本说明书实施例提供的抗体-药物偶联物制备方法，得到连接子-依喜替康缀合物LD038，并将LD038偶联到靶向HER2抗体上，得到抗体-药物偶联物PRO1102，在不改变抗体亲和性的基础上，提高了抗体-药物偶联物对肿瘤靶细胞的杀伤力。
实施例9抗体-药物偶联物对在大鼠体内药物代谢动力学(PK)研究
雄性Sprague Dawley大鼠(n＝3只/组)接受3mg/kg trastuzumab及其偶联物(trastuzumab-deruxtecan(8)、trastuzumab-vedotin(4)，PRO1102)静脉给药。在给药后10分钟、4小时、1天、4天、7天、10天、14天和21天从每只大鼠交叉采集眶血。通过内部开发的检测方法检测血浆中的总抗浓度并使用Winnonlin8.2软件计算。
结果见图18。PRO1102表现出与未偶联亲代trastuzumab相当的极佳PK特征。
本说明书实施例中的抗体-药物偶联物PRO1102具有良好的靶向功能和良好的血浆稳定性，不会被血浆快速清楚，能够有效地将小分子药物递送到肿瘤靶细胞中，所应用的可裂解的亲水性连接子可使制备的抗体-药物偶联物PRO1102与裸抗trastuzumab的PK行为相近，具有相似的消除半衰期和清除率，疗效较好，可进一步用于后期临床研究。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种抗体-药物偶联物，其特征在于，所述偶联物具有式Ia所示的结构，
Figure FDA0004049198180000011
其中，
mAb为抗HER2抗体曲妥珠单抗；
所述偶联物通过所述mAb的链间双硫键经还原后得到的巯基与连接子-依喜替康缀合物LD038
Figure FDA0004049198180000012
发生迈克尔加成得到；
n介于1-10之间。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述n介于5-10之间。
3.根据权利要求5所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述n为8。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述连接子为可裂解的亲水连接子。
5.一种权利要求1所示的抗体-药物偶联物的制备方法，包括如下步骤：
a)制备连接子-依喜替康缀合物LD038
Figure FDA0004049198180000021
b)将曲妥珠单抗还原后，与所述LD038进行偶联反应，得到所述抗体-药物偶联物。
6.根据权利要求5所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述将曲妥珠单抗还原后，与所述LD038进行偶联反应，得到所述抗体-药物偶联物包括：
所述曲妥珠单抗的链间双硫键经还原后得到的巯基与所述LD038发生迈克尔加成。
7.根据权利要求5所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述制备连接子-依喜替康缀合物LD038包括：
i)合成化合物38-6
Figure FDA0004049198180000022
ii)将所述化合物38-6与化合物38-7
Figure FDA0004049198180000023
反应，得到依喜替康的连接物38-9
Figure FDA0004049198180000031
以及
iii)将所述化合物38-9与MC-OSu
Figure FDA0004049198180000032
反应，得到所述LD038。
8.根据权利要求7所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述化合物38-6通过化合物38-1
Figure FDA0004049198180000033
N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)、化合物38-3
Figure FDA0004049198180000034
和D-葡萄糖反应得到。
9.根据权利要求8所述的抗体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，
所述化合物38-1与所述N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)混合，加入二氯甲烷以及EDCl，室温下反应得到化合物38-2
Figure FDA0004049198180000035
将所述化合物38-2、DIPEA和DMF混合，加入所述化合物38-3，室温下反应得到化合物38-4
Figure FDA0004049198180000036
对所述化合物38-4进行脱Fmoc反应，得到化合物38-5
Figure FDA0004049198180000041
以及
将所述化合物38-5、所述D-葡萄糖、乙酸和甲醇混合并加热到50℃，反应30分钟后加入NaCNBH3，50℃反应16h，得到所述化合物38-6。
10.一种药物组合物，包括根据权利要求1-4中任一项所述的抗体-药物偶联物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
11.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体-药物偶联物或根据权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗HER2过表达癌症的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。
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