CN116036011A - 一种用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备与应用 - Google Patents
一种用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备与应用。本发明使用仿生可融合脂质体纳米载体(FLNP)装载尿素通道蛋白B(UT‑B)和质子化壳寡糖(COS)压缩的用于降解尿素的尿素酶和靶向氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)的小干扰RNA(siRNA)。本发明设计使用仿贻贝的水凝胶体系，具有良好的生物粘附性和可注射性，可成为纳米药物载体在膀胱内的贮存器。该单元可在37℃下短时间自组装形成水凝胶。该仿生杂合纳米水凝胶具有可注射性并可作为药物储库进行膀胱灌注，使所载的药物以稳定可控的速率，合适的浓度在膀胱内的肿瘤局部缓慢释放，充分发挥药物对肿瘤细胞的杀伤作用，从而避免全身用药带来的毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种可灌注纳米药物水凝胶的制备方法及其在膀胱肿瘤治疗中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
恶性肿瘤是当今世界严重威胁人民健康的社会公共问题，其发病率逐渐上升，疾病进展快，5年生存率低，患者死亡率高。目前针对恶性肿瘤的治疗方法是以手术切除为主，辅以放化疗和靶向免疫治疗等综合疗法，从而达到减少肿瘤负荷，缓解患者临床症状的目的。
膀胱癌(Bladder Cancer)是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，约70％为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)。尽管在经尿道肿瘤切除术后进行了膀胱内灌注化疗药物和根治性膀胱切除术的强化治疗，但三分之二的NMIBC患者将面临复发，甚至进展为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的结局，其中超过55％的患者在5年内死亡。因此迫切需要制定有效的治疗策略来靶向难治性膀胱癌，改善患者的生存预后。目前临床常用的抗肿瘤药物多通过口服或者静脉注射来进行全身给药，仅有少部分药物可通过循环到达肿瘤局部发挥作用，而大部分药物会在到达肿瘤之前被正常组织摄取吸收。全身给药的方式使得药物利用率低，对正常组织会产生毒副作用，且频繁给药易导致耐药性产生。
目前利用纳米技术进行恶性肿瘤的诊断和治疗是目前生物医学技术领域中的前沿研究方向之一，纳米载药系统可以改善药物的水溶性和药物在体内的动力学特征，增强化疗药物的靶向性，减少药物的毒副作用，降低肿瘤耐药性的产生。自组装纳米水凝胶主要由生物体内的天然物质组成，不含有毒化学物质，具有生物可降解性，不会对宿主细胞产生毒性作用，是生物医学的理想材料，被广泛应用到各个领域。肿瘤细胞的精准靶向是药物精准递送领域的关键问题，仍有待进一步研究，以寻求更优的解决方案。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的之一是提供了一种仿生可灌注纳米水凝胶的制备方法。
本发明的目的之二是提供了膀胱腔内可灌注纳米载体水凝胶在膀胱肿瘤局部递送药物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，包括：
将壳寡糖溶液与尿素酶溶液混合均匀，得到壳寡糖化尿素酶溶液；
将所述壳寡糖化尿素酶与CPS1-siRNA混合均匀，得到纳米载体NP；
在所述纳米载体NP外包裹修饰有UT-B和DSPE-PEG-NHS-Bld-1的仿生融合脂质体，得到具有膀胱癌靶向功能的FLNP；
将所述FLNP与透明质酸-多巴胺水凝胶HA-DA混合，得到仿生可灌注纳米水凝胶杂合体系FLNP@HA-DA，即得。
本发明使用已被报道的Bld-1肽作为纳米药物靶向膀胱癌细胞的靶向肽。
本发明所提出的仿生可灌注纳米水凝胶杂合体系可应用于临床膀胱癌患者的治疗干预，具有多重潜在优势：(1)利用膀胱空腔脏器的生理解剖特点进行膀胱内灌注给药，操作方便无创，患者顺应性强；(2)在膀胱腔内一次性给予水凝胶共载药贮库，通过水凝胶系统的缓释作用实现对于膀胱肿瘤的持久抑制作用；(3)贻贝是一种生长在沿海地区的软体动物，通过分泌粘性蛋白与潮湿的环境表面形成强相互作用，本发明使用仿生贻贝的水凝胶体系，具有丰富的儿茶酚胺基团，可增加水凝胶的湿粘附性，制造方法简单，生物分子材料常规可获得，具有良好的生物相容性；(4)尿素通道蛋白UT-B是一种主要表达在红细胞和一些上皮及内皮细胞膜上，能够高效介导尿素跨膜转运的通道蛋白，本发明在脂质体膜上插入UT-B，脂质体与膀胱癌细胞膜融合后，UT-B位于膀胱癌细胞膜，从而实现尿液中的尿素快速向膀胱癌细胞中转运，升高膀胱癌细胞中尿素的浓度；(5)膀胱癌起源于尿路上皮，直接暴露于含有高浓度尿素的尿液环境中。尿素作为机体的一种代谢产物，可以被尿素酶催化形成具有细胞毒性的铵，是机体的一项重要代谢途径。本发明利用水凝胶载药系统在膀胱腔内共递送尿素酶和CPS1-siRNA，显著促进了肿瘤细胞中的氨积累，实现肿瘤细胞凋亡。
本发明的第二个方面，提供了上述的方法制备的仿生杂合可注射纳米水凝胶。
本发明的第三个方面，提供了上述的仿生杂合可注射纳米水凝胶在制备用于膀胱肿瘤治疗的药物或术后局部递药系统中的应用。
本发明的有益效果
(1)本发明的仿生可灌注纳米水凝胶具有可注射性能且可作为药物储库进行膀胱灌注，使所载药物以稳定可控的速率、合适的浓度在膀胱肿瘤局部缓慢释放，实现精准给药，从而充分发挥药效，杀伤肿瘤细胞，避免全身用药引起的毒副作用。
(2)本发明制备方法简单、实用性强，易于推广。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的FLNP的透射电镜图片，标尺：100nm。
图2为本发明实施例1制备仿生可灌注纳米水凝胶扫描电镜图，标尺：20μm，箭头指示的为FLNP。
图3为本发明实施例2制备仿生可灌注纳米水凝胶可注射性能表征图。
图4为本发明实施例3制备的FLNP对于膀胱癌细胞的杀伤作用检测。
图5为本发明实施例4制备仿生可灌注纳米水凝胶在MB49膀胱癌小鼠模型中的抗肿瘤效果验证。标尺：1cm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
仿生可灌注纳米水凝胶制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳寡糖溶液与尿素酶溶液混合，得到壳寡糖化尿素酶溶液；
(2)将壳寡糖化尿素酶与CPS1-siRNA按照一定质量比进行混合，得到纳米载体(NP)；
(3)在NP外包裹修饰有UT-B和DSPE-PEG-NHS-Bld-1的仿生融合脂质体，从而得到FLNP；
(4)将FLNP与透明质酸-多巴胺水凝胶(HA-DA)混合得到仿生可灌注纳米水凝胶杂合体系(FLNP@HA-DA)。
本发明所述壳寡糖(chitin oligosaccharides)为壳聚糖的降解产物，分子量在300-3000不等。发明人发现壳寡糖具有良好的生物相容性，其正电荷的特性使其极易被细胞摄取，且壳寡糖链上的氨基可被修饰以改善其理化性质。
本发明中壳寡糖化尿素酶体系制备是使用0.2～0.3g/ml的壳寡糖和0.1～0.2mg/ml的尿素酶在室温下涡旋搅拌30～40分钟得到。
本发明中壳寡糖化尿素酶与CPS1-siRNA质量比为8：1～1.5。
本发明中使用的UT-B是从红细胞膜中分离纯化得到的，将1～1.5mg UT-B与FLNP在1～1.5mL HEPES缓冲溶液中混合至均匀后，将悬浮液在液氮中快速冷冻5～10分钟，随后在超声仪中超声30～40秒，将悬浮液以2000～2500rpm离心并洗涤三次以除去游离UT-B，得到FLNP体系。
本发明中仿生可融合脂质体的制备方法是将DMPC、DSPE-PEG-NHS-Bld-1和DOTAP以65:3:17的摩尔比进行混合，通过蒸发有机溶剂制备脂质膜，然后用纳米药物溶液进行水合，在恒定磁力搅拌下将水合脂质加热至40～50℃维持10～15分钟，后将混合物通过200nm聚碳酸酯膜挤出20次以上。
本发明中DSPE-PEG-NHS-Bld-1的制备方法是将5～10mg Bld-1和20～40mg DSPE-PEG-NHS室温下溶于DMF中形成聚合物，在缓慢搅拌下加入三乙胺并将pH调节至7-8，避光条件下搅拌3～5天后将混合物在去离子水中透析48～72小时，将得到的溶液进行冷冻干燥并储存在-20～-25℃。
本发明中仿生水凝胶的制备方法是将0.5～0.8g透明质酸(HA)以1～1.5％(w/v)的浓度溶解在0.5～0.8M MES缓冲液中。然后向HA溶液中加入0.25～0.5g EDC和0.15～0.3g NHS，并在pH 5.0～5.5下搅拌30～40分钟。向所得溶液中加入盐酸多巴胺(DOPA·HCl)，并在室温下以5.0～5.5的pH搅拌过夜。用PBS透析三次，以去除未反应的DOPA·HCl。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：仿生可灌注纳米水凝胶制备方法
(1)取一个洁净干燥的小烧杯，加入一定量壳寡糖溶液(0.2g/ml)和尿素酶溶液(0.1mg/ml)室温下涡旋搅拌30分钟，得到壳寡糖化尿素酶溶液；
(2)将带正电荷的壳寡糖化尿素酶与带负电荷的CPS1-siRNA以8：1的质量比进行浓缩，得到纳米载体(NP)；
(3)将从红细胞膜中分离纯化得到的1mg UT-B与FLNP在1mL HEPES缓冲溶液中混合至均匀后，将悬浮液在液氮中快速冷冻5分钟，随后在超声仪中超声30秒，将悬浮液以2000rpm离心并洗涤三次以除去游离UT-B，得到FLNP体系；
(4)将5mg Bld-1和20mg DSPE-PEG-NHS室温下溶于DMF中形成聚合物，在缓慢搅拌下加入三乙胺并将pH调节至7-8，避光条件下搅拌3天后将混合物在去离子水中透析48小时，将得到的溶液进行冷冻干燥并储存在-20℃，得到DSPE-PEG-NHS-Bld-1；
(5)将DMPC、DSPE-PEG-NHS-Bld-1和DOTAP以65:3:17的摩尔比进行混合，通过蒸发有机溶剂制备脂质膜，然后用纳米药物溶液进行水合，在恒定磁力搅拌下将水合脂质加热至40℃维持10分钟，后将混合物通过200nm聚碳酸酯膜挤出20次，得到本发明中仿生可融合脂质体；
(6)将0.5g透明质酸(HA)以1％(w/v)的浓度溶解在0.5M MES缓冲液中。然后向HA溶液中加入0.25g EDC和0.15g NHS，并在pH 5.0下搅拌30分钟。向所得溶液中加入盐酸多巴胺(DOPA·HCl)，并在室温下以5.0的pH搅拌过夜。用PBS透析三次，以去除未反应的DOPA·HCl，最终得到仿生水凝胶组分。
(7)本实施例制备的仿生可灌注纳米药物的透射电镜图片如图1所示，纳米水凝胶体系的扫描电镜图片如图2所示。
实施例2：仿生可灌注纳米水凝胶可注射性能考察
将水凝胶制备成胶后吸入注射器，通过18号注射器针头可以塑造成各种形状，如图3所示，本发明仿生水凝胶具有良好的可注射性能。
实施例3：纳米药物对于膀胱癌细胞体外杀伤作用验证
将制备得到的FLNP加入含有100mM尿素的完全培养基中，将MB49膀胱癌细胞处理24小时后显微镜下拍照，如图4中a所示，本发明的FLNP纳米药物能够明显杀伤膀胱癌细胞；使用FITC-Annexin V和PI染色细胞，检测FLNP诱导的MB49膀胱癌细胞凋亡情况，如图4中b所示，本发明的FLNP纳米药物能够明显诱导膀胱癌细胞凋亡。
实施例4：仿生可灌注纳米药物水凝胶体系抑制膀胱癌效果考察
使用MB49膀胱癌荷瘤小鼠模型，对本发明所开发的纳米药物水凝胶体系抑制膀胱癌效果进行验证，将制备得到的各组纳米药物水凝胶体系使用超声引导的方法灌注进入膀胱，使用小动物成像系统跟踪监测肿瘤的生长情况，实验终点时，将肿瘤取出拍照称重，如图5所示，本发明所开发的纳米药物水凝胶体系抑制能够显著抑制膀胱癌的生长。
G1:模型对照组；G2:水凝胶荷载COS压缩的尿素酶组；G3:水凝胶荷载NP组；G4:水凝胶荷载包裹NP的脂质体组；G5:水凝胶荷载包裹NP同时表面插入UT-B的脂质体组；G6:水凝胶荷载包裹NP同时表面插入UT-B并修饰Bld-1靶向肽的脂质体(FLNP)组。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，包括：
将壳寡糖溶液与尿素酶溶液混合均匀，得到壳寡糖化尿素酶溶液；
将所述壳寡糖化尿素酶与CPS1-siRNA混合均匀，得到纳米载体NP；
在所述纳米载体NP外包裹修饰有UT-B和DSPE-PEG-NHS-Bld-1的仿生融合脂质体，得到具有膀胱癌靶向功能的FLNP；
将所述FLNP与透明质酸-多巴胺水凝胶HA-DA混合，得到仿生可灌注纳米水凝胶杂合体系FLNP@HA-DA，即得。
2.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述壳寡糖溶液的浓度为0.2～0.3g/ml；
或，所述尿素酶溶液的浓度为0.1～0.2mg/ml。
3.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述壳寡糖溶液与尿素酶溶液的混合方式采用涡旋搅拌，涡旋时间为30～40分钟。
4.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述壳寡糖化尿素酶与CPS1-siRNA质量比为8：1～1.5。
5.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述UT-B是从红细胞膜中分离纯化得到的，将UT-B与FLNP在HEPES缓冲溶液中混合至均匀后，将悬浮液在液氮中快速冷冻5～10分钟，随后超声30～40秒，将悬浮液以2000～2500rpm离心并洗涤多次以除去游离UT-B，从而得到装载UT-B的FLNP。
6.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述DSPE-PEG-NHS-Bld-1的制备方法是将Bld-1和DSPE-PEG-NHS室温下溶于溶剂中，形成聚合物，在加入三乙胺并将pH调节至7-8，避光条件下搅拌3～4天后，将混合物在去离子水中透析48～72小时，将得到的溶液进行冷冻干燥并储存在-20～-25℃。
7.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述仿生融合脂质体的制备方法是将DMPC、DSPE-PEG-NHS-Bld-1和DOTAP进行混合，通过蒸发有机溶剂制备脂质膜，然后用纳米药物溶液进行水合，在恒定磁力搅拌下将水合脂质加热至40℃维持10分钟，后将混合物通过200nm聚碳酸酯膜挤出20次以上。
8.如权利要求1所述的用于膀胱癌治疗的仿生可膀胱灌注纳米药物水凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述仿生水凝胶的制备方法是将透明质酸HA溶解在MES缓冲液中，然后向HA溶液中加入EDC和NHS，并在pH 5.0～5.5下搅拌30～40分钟；向所得溶液中加入DOPA·HCl，并在室温下以5.0～5.5的pH搅拌过夜，用PBS透析三次，以去除未反应的DOPA·HCl。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备的仿生杂合可注射纳米水凝胶。
10.权利要求9所述的仿生杂合可注射纳米水凝胶在制备用于膀胱肿瘤治疗的药物或术后局部递药系统中的应用。
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