CN116023499A - 一种针对cd3和cd20的双特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对CD3和CD20的双特异性抗体、包含该抗体编码序列的核酸分子及其在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及双特异性抗体，具体而言涉及一种针对CD3和CD20的双特异性抗体。
背景技术
双特异性抗体是一种新兴的肿瘤免疫治疗技术，它可以同时识别和结合两种不同的抗原表位，根据发挥作用的途径一般可分为两种，一种是通过协同作用同时阻断两种不同的信号通路而发挥作用，另一种是通过激活效应细胞(T细胞，NK细胞等)来发挥药效。
双特异性抗体技术平台按结构区分主要有两大类：含Fc区的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc区的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)；大多数传统抗体为含Fc区的。而BiTE(Bispecific T cell engager，T细胞衔接抗体)是T细胞依赖的双特异性抗体。主要由两条单链抗体(scFv)组成，分子量约50kDa，较传统的IgG型双特异性抗体具有更易于穿透肿瘤组织的优点，此外由于缺乏Fc段，不仅避免了Fc片段与体内表达FcRn细胞相互作用带来的毒副反应，也可避免由于Fc段引起的全身性的免疫副作用，进一步保证了抗体的特异性。
与传统的化疗相比，针对CD20靶点的单抗药物在临床上已经显示较好的临床效果，与肿瘤细胞高表达CD20相对，CD20单抗针对于肿瘤细胞表面CD20表达水平低的肿瘤治疗效果受限；CD3靶点的单抗可以招募T细胞至靶细胞附近，通过激活T细胞直接杀伤靶细胞；CD3/CD20双抗可以同时结合T细胞和肿瘤细胞，招募T细胞至表达CD20的肿瘤细胞处，并激活T细胞分泌颗粒酶、穿孔素等杀伤CD20阳性肿瘤细胞。
目前处于临床或临床前研究的CD3×CD20的双抗平台技术多数都保留抗体的Fc结构，还没有关于小型化CD3×CD20的双抗的报道；因为含有Fc区的技术平台具有纯化方便、稳定性好等优势，但劣势在于有些结构(比如Crossmab/KIH)CMC较为复杂，多半会有较高的聚体、错配、纯化得率低等问题。另外抗体的分子量过大，对肿瘤组织的渗透性会比较差，难以透过血管内皮质及细胞间隙从而到达实体瘤深部的肿瘤细胞，因此对实体瘤的治疗效果不如血液瘤。
本领域中存在对特异性高、副作用小、具有良好药代动力学性质的CD3×CD20双特异性抗体的需要。
发明内容
为了解决上述问题，在第一个方面，本发明的目的在于提供一种双特异性抗体，所述抗体包括第一蛋白序列和第二蛋白序列，其中所述第一蛋白序列包括CD20结合片段，所述第二蛋白序列包括CD3结合片段，所述第一蛋白序列和所述第二蛋白序列之间由柔性连接肽序列2链接。
在优选的实施方案中，柔性连接肽序列2的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
在具体的实施方案中，本发明的所述双特异性抗体依次包括所述第一蛋白序列、所述柔性连接肽序列2和所述第二蛋白序列。
在具体的实施方案中，本发明的所述双特异性抗体中所述第一蛋白序列包括与CD20结合的重链可变区CD20VH和轻链可变区CD20VL，并且重链可变区CD20VH和所述轻链可变区CD20VL之间由柔性连接肽序列1连接。在优选的实施方案中，所述重链可变区CD20VH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示且所述轻链可变区CD20VL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在更优选的实施方案中，所述柔性连接肽序列1的氨基酸序列可以如SEQ ID No.6所示
在具体的实施方案中，本发明的所述双特异性抗体中所述第二蛋白序列包括与CD3结合的重链可变区CD3VH和轻链可变区CD3VL，并且重链可变区CD3VH和所述轻链可变区CD3VL之间由连接序列CD3L连接。在优选的实施方案中，所述重链可变区CD3VH的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示且所述轻链可变区CD3VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。在更优选的实施方案中，所述连接序列Linke 3的氨基酸序列可以如SEQ ID No.7所示
在优选的实施方案中，所述第二蛋白序列依次包括所述重链可变区CD3VH、所述柔性连接肽序列3和所述轻链可变区CD3VL。
在具体的实施方案中，本发明的所述双特异性抗体的C末端可以连接用于蛋白纯化的标签序列，例如组氨酸标签序列。
在第二个方面，本发明的目的在于提供一种核酸分子，其包含编码如第一个方面中的双特异性抗体的核苷酸序列。
在第三个方面，本发明的目的在于提供如第一个方面中的双特异性抗体、如第二个方面中的核酸分子在制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的用途。在优选的实施方案中，所述恶性肿瘤可以是有CD20蛋白表达的恶性肿瘤。
与现有技术相比，本发明的双特异性抗体具有以下优点：
(1)本发明的双特异抗体的制备方法具有抗体组装效率高，不存在抗体轻重链错配的优势。
(2)本发明的双特异性抗体可以高亲和力地靶向结合有CD20蛋白表达的恶性肿瘤；
(3)本发明的双特异性抗体与CD3具有结合作用，亲和力较低，可以较好地活化T细胞的同时又不会持续活化T细胞而导致细胞因子风暴；可提高CD3端双特异性分子的安全性；
(4)本发明的双特异性抗体缺乏Fc段，可避免由于Fc段引起的全身性的免疫副作用，进一步保证了抗体的特异性，同时保留了BiTE形式易于穿透肿瘤的优点，具有良好的药代动力学性质；
(5)本发明的双特异性抗体能有效的介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，杀伤作用显著。
附图说明
图1是本发明示例性双特异性抗体A和B以及对照抗体C的结构示意图。
图2是本发明示例性双特异性抗体以及对照抗体与CD20蛋白的结合/解离拟合曲线；其中图2a是抗体A与CD20蛋白的结合/解离拟合曲线，图2b是抗体B与CD20蛋白的结合/解离拟合曲线，图2c是对照抗体C与CD20蛋白的结合/解离拟合曲线，以及图2d是美罗华抗体与CD20蛋白的结合/解离拟合曲线。
图3是本发明示例性双特异性抗体与CD3蛋白的结合/解离拟合曲线；其中图3a是抗体A与CD3蛋白的结合/解离拟合曲线，图3b是抗体B与CD3蛋白的结合/解离拟合曲线。
图4是本发明示例性双特异性抗体A和B介导的T细胞对靶细胞的杀伤作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：表达载体的构建
(1)双特异性抗体CD3xCD20以及对照抗体的分子设计
作为示例的双特异性抗体A和B的氨基酸序列如SEQ ID No.8和SEQ IDNo.9所示，其中序列SEQ ID No.8依次包含如下氨基酸序列：SEQ ID No.2(轻链可变区CD20VL)、SEQID No.6(柔性连接肽序列1)、SEQ ID No.1(重链可变区CD20VH)、SEQ ID No.5(柔性连接肽序列2)、SEQ ID No.3(重链可变区CD3VH)、SEQ ID No.7(柔性连接肽序列3)、SEQ ID No.4(轻链可变区CD3VL)以及组氨酸标签(6His)；序列SEQ ID No.9依次包含如下氨基酸序列：SEQ ID No.1(重链可变区CD20VH)、SEQ ID No.6(柔性连接肽序列1)、SEQ ID No.2(轻链可变区CD20VL)、SEQ ID No.5(柔性连接肽序列2)、SEQ ID No.3(重链可变区CD3VH)、SEQ IDNo.7(柔性连接肽序列3)、SEQ ID No.4(轻链可变区CD3VL)以及组氨酸标签(6His)。
上述双特异性抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。
此外，设计了对照抗体C，其氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，依次包含如下氨基酸序列：SEQ ID No.3(重链可变区CD3VH)、SEQ ID No.7(柔性连接肽序列3序列)、SEQ IDNo.4(轻链可变区CD3VL)、SEQ ID No.5(柔性连接肽序列2)SEQ ID No.2(轻链可变区CD20VL)、SEQ ID No.6(柔性连接肽序列1)、SEQ ID No.1(重链可变区CD20VH)、以及组氨酸标签(6His)。该对照抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
(2)抗体表达质粒的构建
本发明通过基因合成技术得到如SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ IDNo.13所示的编码核苷酸序列，三个编码序列都使用人IL-2分泌信号肽，以便能够在CHO细胞中分泌表达；将克隆得到的这个融合读码框插入到p2U-dhfr载体上(购自美国Vega Biolab LLC公司)获得质粒A(双特异性抗体)、质粒B(双特异性抗体)和质粒C(对照抗体)，并进行基因测序，将测序结果与设计序列进行比对，确认构建的质粒A、质粒B和质粒C正确。
实施例2：抗体的瞬时转染和表达
通过脂质体(试剂盒购自gibco)转染的方法将实施例1中构建得到的质粒A、质粒B和质粒C分别转染到ExpiCHO-S宿主内；用ExpiCHO Expression Medium培养基调整CHO-S细胞密度至7-10e6/ml，按照脂质体试剂盒说明书要求进行转染，转染后的细胞悬浮液放置在36.5℃6％CO2 100RPM的摇床种培养，培养第1天降温至32℃，并分别在培养第1天和第5天添加补料，当细胞活率<70％时，结束培养，收集细胞上清。
实施例3：抗体的纯化
通过离心收集细胞上清，用0.22μm滤膜过滤细胞上清，然后用蛋白L亲和层析填料(购自GE)捕获双特异性抗体，通过100mM醋酸-醋酸钠pH3.5缓冲液洗脱目标蛋白，并用2MTris-HCl缓冲液调节样品pH至6.5左右。经纯度(SEC-HPLC)分析进一步纯化至纯度达90％以上，获得抗体样品A(双特异性抗体)、样品B(双特性抗体)和样品C(对照抗体)。
实施例4：分别与抗原CD20蛋白和抗原CD3蛋白的亲和力检测
(1)与抗原CD20蛋白的亲和力检测
首先将样品A、样品B、美罗华(购自罗氏)和样品C分别用生物素标记，随后用SA探针(Streptavidin购自gator)捕获；捕获高度1-1.3nm；CD20蛋白(购自ACRO)作为分析物，以200nM浓度为起始浓度，并按照2倍稀释共稀释7个浓度点；运行实验程序，拟合结合与解离曲线(参见图2)，计算亲和力KD值；结果见表1：
表1：样品与CD20靶蛋白的结合
Kon反映样品与CD20靶蛋白的结合速率，数值越大，结合速率越强，除样品C与靶蛋白无结合信号外(如图2c)，结合步骤没有上升信号值(纵坐标)，样品A、样品B和美罗华与CD20靶蛋白的结合速率差异不大，Kon值在同一个数量级。Koff反映样品与靶蛋白的解离速率，数值越大，解离越快；KD值(为Koff/Kon的比值)反映样品与靶蛋白结合能力的强弱。
表1数据显示：样品A和美罗华与靶蛋白结合强度相似，KD值在同一个数量级；样品B的结合强度略低于美罗华，样品C与CD20蛋白没有结合信号。
(2)与抗原CD3蛋白的亲和力检测
首先用Human Fc探针(购自Gator)捕获CD3蛋白(购自ACRO)，样品A和样品B分别作为分析物，以1500nM浓度为起始浓度，并按照2倍稀释，每个样品均稀释5个浓度点；运行实验程序，拟合结合与解离曲线(参见图3)，计算亲和力KD值，结果见表2。
表2：样品与CD3蛋白的结合
| 样品名 | KD(M) | 特征图谱 |
| 样品A | 1.89E-07 | 参见图3a |
| 样品B | 8.62E-08 | 参见图3b |
表2中的结果显示：样品A和样品B均与CD3蛋白有结合作用，均可以较好地活化T细胞并且持续活化T细胞而导致细胞因子风暴的风险较低；提高CD3端双特异性分子的安全性。
实施例5：双特异性抗体对肿瘤细胞的杀伤活性检测
为了进一步验证样品A和B在细胞水平上对肿瘤细胞的杀伤作用，我们选用荧光素标记的Raji细胞(Raji-luc)为靶细胞，HUT78-CRM细胞(T细胞)作为效应细胞，验证样品A和B可以在两种细胞间起到桥接作用，介导T细胞对靶细胞的杀伤作用；其中通过测定荧光信号的减弱来反映靶细胞细胞死亡情况。
具体实验方法如下：采用对数期的HUT78-CRM细胞(效应细胞)和Raji-Luc细胞(靶细胞)，调整细胞密度，控制效靶比为10：1，样品起始浓度为6000ng/ml，按照四倍稀释方法，稀释至11个浓度点，HUT78-CRM细胞、Raji-Luc细胞和不同浓度的样品，在培养箱共同孵育24h后，取出96孔板，恢复至室温，然后每孔加200μl Steady-
Luciferase AssaySystem试剂，置于96孔板混匀仪上室温避光孵育15min，最后酶标仪检测荧光值，采用Magellan软件作四参数拟合，分析结果。
实验结果如图4所示，样品A和样品B能有效介导HUT-78细胞(T细胞)杀伤Raji细胞(肿瘤细胞)，杀伤作用显著，最大杀伤率可达到75％左右；样品A的EC50为15.330ng/ml，样品B的EC50为24.357ng/ml。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应当了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体包括第一蛋白序列和第二蛋白序列，其中所述第一蛋白序列包括CD20结合片段，所述第二蛋白序列包括CD3结合片段，所述第一蛋白序列和所述第二蛋白序列之间由柔性连接肽序列2连接；优选地，所述柔性连接肽序列2的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体依次包括所述第一蛋白序列、所述柔性连接肽序列2和所述第二蛋白序列。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白序列包括与CD20结合的重链可变区CD20VH和轻链可变区CD20VL，并且重链可变区CD20VH和所述轻链可变区CD20VL之间由柔性连接肽序列1连接；优选地，所述重链可变区CD20VH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示且所述轻链可变区CD20VL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；更优选地所述柔性连接肽序列1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
4.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二蛋白序列包括与CD3结合的重链可变区CD3VH和轻链可变区CD3VL，并且重链可变区CD3VH和所述轻链可变区CD3VL之间由柔性连接肽序列3连接；优选地，所述重链可变区CD3VH的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示且所述轻链可变区CD3VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；更优选地所述柔性连接肽序列3的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
5.根据权利要求4中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二蛋白序列依次包括所述重链可变区CD3VH、所述柔性连接肽序列3和所述轻链可变区CD3VL。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体的核苷酸序列。
7.如权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体、如权利要求6所述的核酸分子在用于制备诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤为有CD20表达的恶性肿瘤。
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