CN116026971A

CN116026971A - 一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN116026971A
Application number: CN202310326425.0A
Authority: CN
Inventors: 赵妍; 陈怡昭; 王春燕; 孙美珊; 冯涛; 邹浩
Original assignee: Suzhou Yikun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Yikun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-30
Filing date: 2023-03-30
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2043-03-30
Also published as: CN116026971B

Abstract

本发明提供一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒，包括样本前处理试剂，所述的前处理试剂中包括：水、使用浓度为60%‑80%（V/V）的甲醇水溶液和甲基叔丁基醚。本发明还提供了该试剂盒用于检测血液样本的方法。通过验证血清和血浆基质，确保各方面参数符合要求。试剂盒测试结果批内批间精密度好，准确度高。该试剂盒用于血清和血浆中脂溶性维生素检测，为临床项目准确定量，并且能够满足临床需求。

Description

一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于疾病诊断试剂盒领域，具体涉及一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

维生素是维持人和动物正常生理功能的重要物质，这类物质必须从食物中获得，在人类的生长发育和代谢中发挥着重要的作用。维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类，其中脂溶性维生素主要包括维生素A(VA)、维生素D(VD)、维生素E(VE)和维生素K(VK)等。

维生素A与视力、生长发育、免疫系统相关，缺乏维生素A会引起夜盲症，干眼症，皮肤病，免疫功能低下，儿童生长发育迟缓等；维生素D是一种脂溶性维生素，主要由维生素D2、维生素D3两种活性成分组成，维生素D在肝脏内被转化为25-羟基维生素D，临床上以25-羟基维生素D作为评价体内维生素D营养水平的指标；维生素E是重要的生物氧化剂，缺乏维生素E会引起贫血、免疫低下、神经系统退行性病变。维生素K参与凝血因子的合成和骨骼中钙磷代谢。因此，脂溶性维生素的检测可评估患者体内的脂溶性维生素的营养状况。对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。

脂溶性维生素的传统检测方法有比色法、紫外失活分光光度法、荧光法及微生物法等。这些方法只能测定某一种维生素的含量，操作步骤复杂，血样样本量大，且结果不稳定，干扰因素多，因此需要建立一种灵敏、准确、快速的分析方法。

申请号为CN202110241142.7的中国专利中公开了：一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法。该发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法，通过采用特定的蛋白沉淀剂，并与内标准品工作液混合成内标溶液，从而简单高效地完成样品前处理，无需任何额外的样品富集等操作，即可显著提高血清样品中脂溶性维生素A、E、K1、K2的回收率，降低样品前处理的成本，从而大幅提升血清中脂溶性维生素检测的灵敏度，并能保证检测结果的准确性和稳定性。但是由于前处理方法过于简单，并且K1、K2在血清中浓度很低，该专利中未体现各项目的定量下限，数据不够完整，缺乏可信度。

申请号为CN202011615598.7的中国专利中公开了：用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法，该试剂盒包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及提取液；脂溶性维生素包括维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2；混合内标蛋白沉淀剂包括含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物、维生素E-d6内标物、25-羟基维生素D2-d3内标物、25-羟基维生素D3-d6内标物、维生素K1-d7内标物和维生素K2-d7内标物的混合溶液；流动相添加剂包括含有甲酸的甲醇溶液以及含有甲酸的乙腈溶液。该发明能够同时检测多种脂溶性维生素，但是标准曲线需要结合质控品确定准确性问题，并且需要确定标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内，可行之后再移取上清液进行实验，方法较为复杂，并且耗时较长，容易引起较大实验误差，不利于样本准确检测。

开发操作更简单、效率更高、结果更准确、灵敏度更高的脂溶性维生素检测试剂盒和检测方法十分必要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种从血清/血浆样本中有效提取5项脂溶性维生素类的前处理试剂盒。试剂盒配合使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法测定血清/血浆样本中脂溶性维生素：维生素A（VitaminA, VA）维生素E（VitaminE, V E）、25-羟基维生素D2（25（OH）VD2, VD2）和25-羟基维生素D3（25（OH）VD3, VD3），维生素K1（VitaminK1, VK1），血清/血浆样本使用前处理试剂盒处理后取上清进样。在电喷雾电离模式下，采用多反应监测模式（MRM）检测，最后使用内标法进行准确定量分析。本发明用液相色谱串联质谱技术检测脂溶性维生素，前处理使用SPE板净化的方法，方法简单，效率极高，优势突出。具体地，该试剂盒能够有效的提取脂溶性维生素类，使用液质联用的方法能够提供高分辨率，高特异性以及高灵敏度的检测，前处理方法避免冻干过程，避免衍生化，前处理方法简单，耗时短，可以有效的提高检测通量。

本发明中，“MTBE”指甲基叔丁基醚，是一种有机化合物，化学式为C₅H₁₂O，为无色透明液体，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚。

本发明中，“SPE板”指固相萃取板，是从层析柱发展而来的一种用于萃取、分离、浓缩的样品前处理装置。SPE技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。

本发明中，所涉及用量比时，“V”表示体积，单位为升（L）；“m”表示质量，单位为克（g）；“n”表示物质的量，单位为摩尔（mol）。

本发明中，“淋洗液”的作用在于清洗上样后残留在固相萃取板的杂质，确保洗脱过程更加干净。

本发明中，“洗脱液”的作用在于将目标物从固相萃取板洗脱。

本发明中，“样品”和“样本”具有同样的含义。

一方面，本发明提供了一种血液样本前处理方法。

具体地，所述的前处理方法中包括：依次使用水和60%-80%（V/V）的甲醇水溶液对固相萃取板上的样品进行淋洗；吹干柱床后再用甲基叔丁基醚对样品进行洗脱；洗脱液吹干后使用甲醇复溶。

优选地，所述的甲醇水溶液为70%（V/V）甲醇水溶液。

具体地，所述的水和甲醇的用量比为1：1（V/V）。

优选地，所述的吹干柱床的具体操作为：真空度10-15mmHg吹1-3min；进一步优选为2min。

优选地，所述的洗脱液吹干采用氮吹仪吹干，具体条件为室温吹干，吹干时间以样本干燥状态为准，可以是10-20min，一般为15min。

优选地，所述的甲醇复溶后还包括混匀步骤，可以是高速旋涡混匀；所述的混匀步骤后还可以包括离心步骤，所述的离心为高速离心，高速离心条件为10000-14000rpm离心3-8min，在一些实施例中为5min。

在实际应用时，所述的前处理方法中，在样品进入固相萃取板之前，样品还可以包括其他处理流程，如加入内标工作液、涡旋混合、高速离心、加入乙腈等；所述的固相萃取板还可以包括甲醇和超纯水预处理步骤，所述的甲醇和超纯水的用量比可以是1：1（V/V）。

具体地，以上所述试剂在过固相萃取板时，需要保证3-5s滴一滴，不能太快，这是固相萃取板常规操作方法中所需要注意的。

优选地，所述的前处理方法中包括以下步骤：

（1）吸取300µL血液样品至EP管中；

（2）加入60-80µL混合内标工作液；涡旋混合1min后并高速离心分离20s；

（3）然后分别在（2）的样本中加入750-900µL乙腈，涡旋5min；高速离心5min；

（4）依次使用甲醇和超纯水预处理固相萃取板；

（5）从（3）离心好的样本中取0.8-1.0 mL上清液至（4）预处理后的固相萃取板中；

（6）依次使用超纯水和60-80%甲醇水溶液对固相萃取板进行清洗；真空度10-15mmHg吹2min左右吹干为止；

（7）最后使用0.9-1.1mL MTBE将目标物从固相萃取板上洗脱到离心管中；

（8）将洗脱液用氮吹仪吹干，在氮吹干的样本中加入70-90µL甲醇复溶，混匀，高速离心5 min。

进一步优选地，所述的高速离心的条件可以是10000-14000rpm。

进一步优选地，所述的步骤（1）血液样品为血浆或血清。

进一步优选地，所述的步骤（2）中混合内标工作液与血液样品的用量比可以是1：4或其他。

进一步优选地，所述的步骤（3）乙腈与血液样品的用量比可以是11：4。

进一步优选地，所述的步骤（4）中，甲醇和超纯水的用量分别是1mL（V/V）。

进一步优选地，所述的步骤（6）中甲醇和超纯水的用量比可以是1：1（V/V）。

进一步优选地，所述的步骤（8）离心后的样本中取上清液于进样瓶中或96孔板中用于液相色谱串联质谱上样分析。

根据以上方法，本发明同时提供甲醇和甲基叔丁基醚在制备人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒中的应用。

另一方面，本发明提供了一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒。

所述的试剂盒为液相色谱串联质谱用试剂盒。

所述的脂溶性维生素至少包括：VA、VE、VD2、VD3、VK1中的一种或多种。

所述的试剂盒中包括前处理试剂，所述的前处理试剂中包括：水、使用浓度为60%-80%（V/V）的甲醇水溶液和甲基叔丁基醚。

所述的前处理试剂中还可以包括混合内标工作液、乙腈。

所述的试剂盒中还包括色谱流动相，所述的色谱流动相包括流动相A和流动相B。

具体地，所述的流动相A为包括氟化铵和甲酸的水溶液。

优选地，所述的流动相A中氟化铵与超纯水的比例为1：1600-1：2400（n/V）；所述的流动相A的配制方法为：按比例依次加入超纯水、氟化铵至试剂瓶中；混匀。所述的混匀可以采用超声。

具体地，所述的流动相B为氟化铵甲醇溶液。

优选地，所述的流动相B中氟化铵和甲醇的用量比为1：2500-1：7500（n/V）。

优选地，所述的试剂盒中还包括其他用于色谱或质谱的试剂。

所述的其他用于色谱或质谱的试剂包括但不限于：标准品、质控品、洗针液。

再一方面，本发明提供了前述试剂盒的使用方法。

所述的使用方法中包括样品前处理步骤、色谱串联质谱步骤。

所述的样品前处理步骤参照前述的血液样本前处理方法。

优选地，所述的色谱串联质谱步骤中，色谱流动相条件如下：

在一些实施例中，液相梯度洗脱参数可以是：

在一些实施例中，的质谱源参数可以是：

本发明的有益效果：

本发明试剂盒试用的基质包括血清和血浆，样本基质种类较多。通过验证血清和血浆基质，确保各方面参数符合要求。试剂盒测试结果批内批间精密度好，准确度高。该试剂盒用于血清和血浆中脂溶性维生素检测，为临床项目准确定量，并且能够满足临床需求。

附图说明

图1为VA检测标准曲线。

图2为VA色谱图。

图3为VE检测标准曲线。

图4为VE色谱图。

图5为VD2检测标准曲线。

图6为VD2色谱图。

图7为VD3检测标准曲线。

图8为VD3色谱图。

图9为VK检测标准曲线。

图10为VK色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中所使用的仪器如下：

三重四极杆质谱检测系统（QSight 420MD，苏州颐坤生物科技有限公司）；ThermoScientific Fresco21高速冷冻离心机（美国）；多管涡旋混合仪（Vortex Genie2，美国）；正压装置（Biotage，瑞典）；可调移液器（Eppendorf 0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）；玻璃仪器、量筒等。

以下实施例中所使用的试剂耗材如下：

HLB-SPE板（Waters，美国）、超纯水（Milli-Q IQ7000，美国）；甲醇（Merk，美国）；乙腈（Fisher，美国）；异丙醇（Fisher，美国）；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Sigma，德国）；牛血清白蛋白（Sigma，德国）；ProClin™ 300（Sigma，德国）；抗坏血酸（Sigma，德国）。

以下实施例中，所使用的标准品如下：

维生素A（VA）（TRC，加拿大）；维生素A内标(VA-d5)（TRC，加拿大）；25-羟基维生素D2（VD2）（TRC，加拿大）； 25-羟基维生素D2内标（VD2-d3）（IsoScience，美国）；25-羟基维生素D3（VD3）（TRC，加拿大）；25-羟基维生素D3内标（VD3-d6）（TRC，加拿大）；维生素E（VE）（TRC，加拿大）；维生素E内标（VE-d6）（TRC，加拿大）；维生素K1(TRC，加拿大)；维生素K1 内标(VK1-d7) (TRC，加拿大)。

如无特别说明，以下实施例中部分试剂的配制方法如下：

流动相A为0.5 mM氟化铵水溶液，配制方法：依次加入500 mL超纯水、0.5 mL 500mM氟化铵至试剂瓶中；混合均匀，超声10分钟。标签为FV流动相A-并储存在室温（有效期：7天）。

流动相B为0.2 mM氟化铵甲醇溶液，配制方法：依次加入500 mL甲醇、0.2 mL 500mM氟化铵至试剂瓶中；混合均匀，超声10分钟。标签为FV流动相B-并储存在室温（有效期：30天）。

灌注注射器1/灌注进样针1为乙腈/超纯水，1/1（V/V），配制方法：依次加入250 mL乙腈、250 mL超纯水至试剂瓶中；混合均匀，超声10分钟。标签为FV 灌注注射器1-并储存在室温（有效期：1个月）。

灌注注射器2/灌注进样针2为异丙醇，配制方法：加入500 mL异丙醇至试剂瓶中；标签为灌注注射器2-并储存在室温（有效期：1个月）。

灌注柱塞杆密封清洗为异丙醇/ 超纯水，1/4（V/V），配制方法：依次加入100 mL异丙醇、400 mL超纯水至试剂瓶中；混合均匀，超声10分钟。标签为灌注柱塞杆密封清洗-并储存在室温（有效期：1个月）。

传输液为甲醇/超纯水，7/3（V/V），配制方法：依次加入350 mL甲醇、150 mL超纯水至试剂瓶中；混合均匀，超声10分钟。标签为传输液-并储存在室温（有效期：1个月）。

以下实施例中，如无特别说明，色谱选用如下表1条件：

表1

以下实施例中，液相梯度洗脱参数如下表2：

表2

以下实施例中，质谱方法中的质谱源参数列表如下表3：

表3

以下实施例中，目标化合物及内标采集参数列表如下表4：

表4

备注：时间窗口的两端可根据实际情况微调。VA-d5、VD2-d3 VD3-d3、VE-d6和VK1-d7为内标。

本发明中，“LOD”指检测限，又称为检出限，指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量，或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。是灵敏度体现的重要指标之一。

本发明中，“LLMI”指定量下限，是指在限定误差能满足预定要求的前提下，用特定方法能够准确定量测定被测物质的最低浓度或含量。

本发明中，“CV”指变异系数，是标准差与平均值之比，用百分数（%）表示。

本发明中，“LQC”指低浓度质控品，在实施例中，低浓度指在一定范围内相对较低的浓度，其没有固定范围，针对不同检测对象，其指代的范围不同。

本发明中，“HQC”指高浓度质控品，在实施例中，高浓度指在一定范围内相对较高的浓度，其没有固定范围，针对不同检测对象，其指代的范围不同。

实施例1一种血浆/血清样品的前处理方法

包括以下流程：

（1）吸取300µL血浆/血清样品至1.5 mL EP管中；血浆样品：采用采血管（抗凝管）采静脉血，将全血离心分离（3000 rpm，10 min），处理为血浆，样本采集处理后立即置于冰箱中2-8℃避光冷藏，并尽快送至实验室检测，不可室温下长时间存放。如果不能立即检测须将样本置于-20℃或置于-80℃避光保存。血清样品：用真空负压采血管（促凝管）采静脉血，将全血离心分离（3000 rpm，10 min），处理为血清，样本采集处理后立即置于冰箱中2-8℃避光冷藏，并尽快送至实验室检测，不可室温下长时间存放。如果不能立即检测须将样本置于-20℃或置于-80℃避光保存。

（2）加入75µL混合内标工作液（参照表4，稀释液为甲醇）；涡旋混合1min后并高速离心分离（10000-14000 rpm，20s）；

（3）然后分别在（2）的样本中加入825µL乙腈，涡旋5min；高速（10000-14000rpm）离心5min；

（4）依次使用1mL甲醇和1mL超纯水预处理SPE板（SPE板要保持湿润）；

（5）从（3）离心好的样本中取0.9 mL上清液至（4）预处理后的SPE板中；

（6）依次使用1mL超纯水和1mL 70%甲醇水对SPE小管进行清洗；真空度10-15mmHg吹2min（最后柱床不能留有水分，要吹干柱床）；

（7）最后使用1mL MTBE将目标物从SPE小管上洗脱到1.5mL离心管中；

（8）将洗脱液用氮吹仪吹干（室温，15 min左右），在氮吹干的样本中加入70-90µL甲醇复溶，高速漩涡混匀，震荡5min，高速（10000-14000 rpm）离心5 min。取上清，即完成样品前处理步骤。

备注：过SPE时液滴要保证3-5s滴一滴，不能太快。

实施例2检测血浆/血清中的脂溶性维生素的方法

在实施例1的基础上增加后续步骤：

（9）从（8）离心后的样本中取上清液（60-70µL）于进样瓶（带有内衬管）中或96孔板中用于液相色谱串联质谱上样分析。

实施例3一种血液样品前处理试剂盒

包括实施例1中所使用的全部试剂。

实施例4一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒

包括实施例2中所使用的全部试剂。

还包括标准品S1-S5，其为5种检测目的物的标准品，具体为VA、VE、VD2、VD3、VK1的标准品。

还包括高浓度质控品HQC和低浓度质控品LQC。

具体如下：

实施例5

参照实施例4设置实施例5，区别在于：甲醇为80%甲醇。该甲醇实际检测时参照实施例1中步骤（6）。

实施例6

参照实施例4设置实施例5，区别在于：甲醇为60%甲醇。该甲醇实际检测时参照实施例1中步骤（6）。

实验例1试剂盒性能检测

对实施例4的试剂盒进行性能检测，具体如下：

1、检测限（LOD）

评估标准：每个样本的信噪比可以在Simplicity软件中得到。其中平均信噪比≥3:1的样本浓度为LOD。同时LOD的平均信噪比应高于空白样本的本底信噪比。

（1）筛选低浓度的血清/血浆样本，选择适合的样本；

（2）实验方法：每个样本重复检测1次。待测样本的进样顺序：随机进样。

本实验测定的LOD如下，均满足评估要求。

LOD样本的单次检测结果的信噪比计算如下：

2、定量下限（LLMI）

评估标准：本试剂盒的LLMI的检测浓度的平均值和理论值偏倚≤±20%且CV≤15%。筛选低浓度的血清/血浆样本，无偏倚数据，仅检测CV。

定量下限的理论结果汇总如下：

实验方法：每个样本重复检测5次。待测样本的进样顺序：随机进样。

分析物VA的5次检测结果如下：

满足评估标准的VA的LLMI浓度为6.616 ng/mL。

分析物VD3的5次检测结果如下：

满足评估标准的VD3的LLMI浓度为1.416ng/mL。

分析物VD2的5次检测结果如下：

满足评估标准的VD2的LLMI浓度为1.170 ng/mL。

分析物VE的5次检测结果如下：

满足评估标准的VE的LLMI浓度为0.337 μg/mL。

分析物VK1的5次检测结果如下：

满足评估标准的VK1的LLMI浓度为0.098 ng/mL。

3、批内精密度

评估标准：CV≤15%。

血清质控的理论浓度如下：

实验方法：每个样本重复检测5次。待测样本的进样顺序：从低到高，低浓度样本在前，高浓度样本在后。

实验结果：

所有项目血清样本批内精密度CV≤15%，均满足评估标准。

4、批间精密度

评估标准：CV≤15%。

血清质控的理论浓度如下：

实验方法：三批次标曲，分析检测血清LQC和HQC样本（1st：2个重复样本；2^nd：4个重复样本；3^rd：5个重复样本）。待测样本的进样顺序：从低到高，低浓度样本在前，高浓度样本在后。

实验结果：

所有项目血清样本批间精密度CV≤15%，均满足评估标准。

5、准确性

评估标准：回收率在85-115%。

血清样本的理论加标浓度如下：

实验方法：用标曲分析检测血清样本。待测样本的进样顺序：从低到高，低浓度样本在前，高浓度样本在后。

VA、VE、VD2、VD3、VK1的标准曲线和色谱图见图1-图10。

实验结果：

所有项目血清样本回收率在85-115%以内，均满足评估标准。

6、抗干扰能力

检测试剂盒抗干扰能力，结果表明，当临床样本发生溶血，血红蛋白：≤50 mg/dL不影响检测结果的准确性、当病人有胆红素血症，胆红素：≤20 mg/dL不影响检测结果的准确性、当临床样本甘油三酯：≤10 mg/dL不影响检测结果的准确性，具体结果如下：

血红蛋白：

胆红素：

甘油三酯：

实验例2人群样本检测效果

选取15例疾病患者的血样进行检测，检测结果见下表：

结果表明本发明的试剂盒对于血液中VA、VE、VD2、VD3、VK1的检测结果能够在一定程度上用于疾病诊断。

实验例3

参照实施例1中的方法，调节实施例4的试剂盒的检测步骤，具体为：步骤（3）中的乙腈加入量为880μL。

检测HQC的批内精密度，结果如下：

实验例4

参照实施例1中的方法，调节实施例4的试剂盒的检测步骤，具体为：步骤（5）中的上清液加入量为1mL。

检测HQC的批内精密度，结果如下：

实验例5

参照实施例1中的方法，调节实施例4的试剂盒的检测步骤，具体为：步骤（8）中的复溶甲醇量为70µL。

检测HQC的批内精密度，结果如下：

Claims

1.一种血液样本前处理方法，其特征在于，包括：依次使用水和60%-80%V/V的甲醇水溶液对SPE板上的样品进行淋洗；吹干柱床后再用甲基叔丁基醚对样品进行洗脱；洗脱液吹干后使用甲醇复溶。

2.根据权利要求1所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的水和甲醇的用量体积比为1：1。

3.根据权利要求1所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的吹干柱床的具体操作为：真空度10-15mmHg吹1-3min。

4.根据权利要求1所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的固相萃取板包括甲醇和超纯水预处理步骤，所述的甲醇和超纯水的用量体积比1：1。

5.根据权利要求1-4任一项所述的血液样本前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）吸取300µL血液样品至EP管中；

（4）依次使用甲醇和超纯水预处理固相萃取板；

6.根据权利要求5所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的步骤（1）血液样品为血浆或血清；所述的步骤（2）中混合内标工作液与血液样品的用量比为1：4；所述的步骤（3）乙腈与血液样品的用量比为11：4。

7.甲醇和甲基叔丁基醚作为样本前处理试剂在制备用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒中的应用。

8.一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒，包括样本前处理试剂，其特征在于，所述的前处理试剂中包括：水、使用浓度为60%-80%V/V的甲醇水溶液和甲基叔丁基醚。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括色谱流动相A；所述的流动相A为包括氟化铵的水溶液；所述的流动相A中氟化铵与超纯水的比例为1：1600-1：2400n/V。

10.根据权利要求8-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准品或质控品。