CN116026949A

CN116026949A - 全血中四种免疫抑制剂的检测方法

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Publication number: CN116026949A
Application number: CN202211578497.6A
Authority: CN
Inventors: 李宾宾; 蔡克亚; 刘亚娟; 高培丽; 申业明; 孙江彦; 杨雪莹
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2022-12-06
Filing date: 2022-12-06
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明涉及治疗药物监测技术领域，具体涉及全血中四种免疫抑制剂的检测方法。本发明提供一种准确测定全血中四种免疫抑制剂药物浓度的检测方法，本方法操作简单，仅有简单的加样、移样、混匀、磁分离等操作过程，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得干净的处理液，一次样本处理同时完成四种免疫抑制剂药物提取，处理液可直接用于液相色谱串联质谱检测，实现一次进样同时检测四种免疫抑制剂药物浓度，提高了检测通量；同时本方法具有较好的除磷脂、除蛋白效果，可降低本底，提高检测的灵敏度。

Description

全血中四种免疫抑制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及治疗药物监测技术领域，具体涉及全血中四种免疫抑制剂的检测方法。

背景技术

免疫抑制剂是一类抑制与免疫反应相关细胞(主要是T细胞和B细胞)增殖和功能的药物，能降低免疫应答，使免疫应答在合适的强度和时间内，从而防治疾病，维持机体内环境稳定。排异是实体器官移植术后最主要的障碍之一。免疫抑制剂在器官移植抗排斥反应方面具有极重要的作用，除此之外，宿主抗移植物病、超敏反应引起的疾病以及类风湿性关节炎、风湿热、红斑狼疮等自身免疫性疾病也主要运用免疫抑制剂治疗。

他克莫司、环孢霉素A、西罗莫司、依维莫司是目前临床最常用的四种免疫抑制剂药物，其治疗窗窄、药物动力学个体差异大，必须进行治疗药物监测。临床常用不同组合的免疫抑制剂治疗用药方案，因此，一次进样同时检测四种免疫抑制剂药物浓度，极大的帮助临床医生获得更为完整的治疗用药信息，及时地指导临床医生调整个体化用药方案。

全血中免疫抑制剂药物浓度测定方法主要有免疫测定法、色谱法(高效液相色谱法)和质谱法(液相色谱串联质谱法)三类技术。

免疫测定法是基于抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。缺点是通常要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清非常困难且工作量大，测定步骤多，操作繁琐。除此之外，免疫磁珠特异性不高，药物与抗体的非特异性结合常导致免疫测定浓度过大或异常，且每次仅能够测定一种药物，然而针对不同人群的联合用药，因为要监测多个药物浓度，免疫测定法测定成本及效率大打折扣。

色谱法是利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交换等性能上的差异)，先将它们分离，后按一定顺序检测各组分及其含量的方法，本质上是一种分离分析方法。缺点是被分离组分的定性较为困难，分析时间长，所需样本量大。另外，比如液相色谱-紫外光谱法(HPLC-UV)虽然可以测定环孢霉素A、西罗莫司，但对一些血药浓度较低或没有生色基团的药物如他克莫司则难以测定。除此之外，色谱法采用外标法定量，不使用校正因子，虽然准确性也比较高，但是操作条件变化对结果准确性影响较大，对进样量的准确性控制要求较高。

质谱法结合了液相色谱的高分离能力和质谱的高选择性及高灵敏度，二者结合以后可以不再刻意纠结于色谱分离条件，因为质谱信息差异就可以区分很多不同物质。质谱法如液相色谱串联质谱法是通过分析离子化样品的质荷比来实现对被测化合物定性定量分析。样本处理通常涉及简单的蛋白质沉淀，全血样本中加入内标溶液、硫酸锌溶液、甲醇、乙腈中的几种试剂相互搭配，涡旋混合，离心得到上清液，上清液进入质谱分析。如专利CN2018112470947公开的准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法，样本处理方式即为典型的简单蛋白沉淀，此方法虽然简单、快速和方便，但是需要借助离心机离心沉淀蛋白，难以实现自动化，此外，通量受到离心机转子影响，会出现效率低、人为误差等问题，不易实现自动化、大批量操作。专利CN2018112488118公开的用于准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法，简单蛋白沉淀后增加了液液萃取，此方法虽然能进一步净化样本，但操作本身繁琐，耗时长，不易实现自动化操作。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供全血中四种免疫抑制剂的检测方法。

本发明提供了全血中免疫抑制剂的检测方法，其包括对待测全血样品进行前处理后，采用液相色谱串联质谱检测；

本发明中，所述待测全血样品前处理包括将待测样品与内标溶液混匀后依次加入红细胞裂解液、蛋白沉淀剂和磁珠溶液，磁分离后取上清进行液相色谱串联质谱检测定量分析；

进一步的，所述内标为待测物的同位素或者结构类似物，其根据待测目标物的变化而发生改变。本发明的一些具体实施例中，所述内标溶液包括:环孢霉素A-d₁₂、西罗莫司-d₃、依维莫司-d₄和子囊霉素。更进一步的，在一些具体的实施例中，本发明所述的内标溶液为1000ng/ml环孢霉素A-d12、100ng/ml西罗莫司-d₃、100ng/ml依维莫司-d₄和100ng/ml子囊霉素。

本发明中，所述红细胞裂解液为硫酸锌溶液；所述硫酸锌溶液的溶剂为水，其中，硫酸锌的浓度为0.1～0.3mol/L；

所述蛋白沉淀剂为甲醇乙腈溶液，其中，甲醇的体积分数为30％；

所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～10mg/mL。

进一步的，本发明中，所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠；所述的羟基官能团包括1-18烷基、辛基、苯基、环己基等类型官能团。

更进一步的，本发明所述待测全血样品、内标溶液、红细胞裂解液、蛋白沉淀剂与磁珠溶液的添加体积比为10：1：20：30：10。

本发明所述的检测方法中，所述免疫抑制剂包括环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司；

其中，所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：

流动相A：由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的浓度为2mM；

流动相B：由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的浓度为2mM；

洗脱程序为：

第0～0.2min，流动相B的体积分数为50％；

第0.2～1.0min，流动相B的体积分数由50％至100％；

第1.0～2.0min，流动相B的体积分数为100％；

第2.0～2.1min，流动相B的体积分数由100％至50％；

第2.1～3.0min，流动相B的体积分数为50％。

进一步的，所述液相色谱串联质谱的色谱条件为：分析柱为C18或苯基柱；流速：0.5ml/min；柱温：50℃；进样室温度：2～8℃；进样体积：10μl。所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描；所述正离子MRM扫描具体参数为：离子化电压5500(V)、温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7psi、喷雾气50psi、辅助加热气50psi。

在一些具体的实施例中，本发明采用C18柱进行所述的液相色谱分析。

本发明中，所述的液相色谱串联质谱条件用于四种免疫抑制剂的检测，其检测结果准确，能实现检测物质的定量及定性分析；液相色谱串联质谱条件结合特定步骤参数的前处理，如磁珠的选取及特定蛋白沉淀剂的使用，沉淀了杂蛋白和大分子物质，降低了本底，减少了杂质干扰，使检测精确度、精密度和灵敏度进一步提高。并且本发明剔除了部分烦杂的需要手工操作的步骤，仅有简单的加样、移样、混匀、磁分离等操作过程，使检测效率进一步提高，更加利于样本高通量处理。因此，本发明所述的检测方法中的各技术特征对检测效果和检测效率产生影响，因此，应作为一个整体进行保护。

本发明提供了快速检测全血中四种免疫抑制剂的试剂盒，其包括校准品、质控品、内标溶液、红细胞裂解液、蛋白沉淀剂、磁珠溶液、流动相A和流动相B；

所述校准品包括他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢霉素A；

所述质控品包括他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢霉素A；

所述内标溶液包括环孢霉素A-d₁₂、西罗莫司-d₃、依维莫司-d₄和子囊霉素；

所述红细胞裂解液为硫酸锌溶液；

所述蛋白沉淀剂为甲醇乙腈溶液；

流动相A由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵浓度为2mM；

流动相B由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵浓度为2mM。

进一步的，本发明所述试剂盒中，

所述校准品为：2ng/ml～100ng/ml的他克莫司、2ng/ml～100ng/ml西罗莫司、2ng/ml～100ng/ml依维莫司和10ng/ml～2000ng/ml环孢霉素A；

所述质控品为：5ng/ml～30ng/ml的他克莫司、5ng/ml～30ng/ml西罗莫司、5ng/ml～30ng/ml依维莫司和50ng/ml～800ng/ml环孢霉素A；

所述内标溶液为：1000ng/ml环孢霉素A-d₁₂、100ng/ml西罗莫司-d₃、100ng/ml依维莫司-d₄和100ng/ml子囊霉素；

所述红细胞裂解液为硫酸锌溶液，所述硫酸锌溶液的溶剂水，其中，硫酸锌的浓度为0.1～0.3mol/L；

所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～10mg/mL；所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠。

所述待测全血样品、内标溶液、红细胞裂解液、蛋白沉淀剂与磁珠溶液的体积比为10：1：20：30：10。

本发明提供了所述的试剂盒在四种免疫抑制剂检测中的应用，所述四种免疫抑制剂为环孢霉素A、他克莫司、依维莫司和西罗莫司。

本发明提供一种准确测定全血中四种免疫抑制剂的检测方法，本方法操作简单，仅有简单的加样、移样、混匀、磁分离等操作过程，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得干净的处理液，一次样本处理同时完成四种免疫抑制剂药物提取，处理液可直接用于液相色谱串联质谱检测，实现一次进样同时检测四种免疫抑制剂药物浓度，提高了检测通量；同时本方法具有较好的除磷脂、除蛋白效果，可降低本底，提高检测的灵敏度。

附图说明

图1示甲醇：乙腈的蛋白沉淀体系；

图2示四种免疫抑制剂类药物的总离子流色谱图；

图3示环孢霉素A校准曲线，线性范围：10ng/ml～2000ng/ml；

图4示西罗莫司校准曲线，线性范围：2ng/ml～100ng/ml；

图5示他克莫司校准曲线，线性范围：2ng/ml～100ng/ml；

图6示依维莫司校准曲线，线性范围：2ng/ml～100ng/ml；

图7示环孢霉素A定量离子色谱图；

图8示环孢霉素A定性离子色谱图；

图9示西罗莫司定量离子色谱图；

图10示西罗莫司定性离子色谱图；

图11示他克莫司定量离子色谱图；

图12示他克莫司定性离子色谱图；

图13示依维莫司定量离子色谱图；

图14示依维莫司定性离子色谱图。

具体实施方式

本发明提供了全血中四种免疫抑制剂的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1溶液的配制及样品的处理

1.试剂盒组成如表1所示：

表1试剂盒组成

2.样本处理：

2.1概述：

待测全血样本分别加入内标溶液、红细胞裂解液、蛋白沉淀剂、磁珠溶液震荡，之后进行磁分离，磁分离后得到上清液，完成样本处理过程。最后，上清液进入液相色谱串联质谱，完成最终检测。

2.2详细操作步骤：

吸取全血校准品/质控品/临床样本100μL至1.5mL离心管中，加入内标溶液10μL，涡旋混匀1min，加入0.1mol/L硫酸锌溶液200μL，涡旋混匀1min，加入甲醇乙腈溶液300μL，涡旋混匀1min，加入磁珠溶液100μL，磁吸2min，取上清液100μL至进样小瓶/96孔进样板中用于液相色谱串联质谱检测。具体步骤分解如下：

第一步：100μL校准品/质控样本/待测全血样本至1.5mL离心管中；

第二步：加入10μL内标溶液，2500rpm振荡器涡旋混合1min，使内标充分混合；

第三步：加入200μL硫酸锌溶液，2500rpm振荡器涡旋混合1min，使全血中红细胞破碎，待测药物释放出来；

第四步：加入300μL甲醇乙腈溶液，2500rpm振荡器涡旋混合1min，形成稳定的体系，便于磁吸过程

第五步：加入100μL磁珠溶液，2500rpm振荡器涡旋混合1min，使磁珠充分结合杂质；

第六步：放置于磁力架上，进行磁分离2min，移液枪吸取100μL至进样小瓶/96孔进样板中用于液相色谱串联质谱检测。

2.3溶液配制

2.3.1全血校准品/全血质控品：

全血系列浓度校准品为6个浓度水平，其中，他克莫司、西罗莫司、依维莫司为：2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml；环孢霉素A为：10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml。

全血质控品为低中高3个浓度水平，其中，他克莫司、西罗莫司、依维莫司为：5ng/ml、15ng/ml、30ng/ml；环孢霉素A为50ng/ml、400ng/ml、800ng/ml。

全血校准品具体配制方法：

2.3.1.1配制校准品系列中间工作液，浓度如表2所示：

表2校准品系列中间工作液浓度

	1	2	3	4	5	6
							他克莫司(ng/mL)	40	100	200	400	1000	2000
西罗莫司(ng/mL)	40	100	200	400	1000	2000
							依维莫司(ng/mL)	40	100	200	400	1000	2000
环孢霉素A(ng/mL)	200	1000	4000	10000	20000	40000

2.3.1.2配制质控品系列中间工作液，浓度如表3所示：

表3质控品系列中间工作液浓度

	1	2	3
				他克莫司(ng/mL)	100	300	600
西罗莫司(ng/mL)	100	300	600
				依维莫司(ng/mL)	100	300	600
环孢霉素A(ng/mL)	1000	8000	16000

2.3.1.3配制全血系列浓度校准品

分别吸取950μL全血至6个1.5ml离心管中，再分别加入50μL校准品中间工作液点，涡旋混匀10min，即为他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度为：2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml；环孢霉素A浓度为：10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml的全血系列浓度校准品，如表4所示

表4全血系列浓度校准品

	校准品1	校准品2	校准品3	校准品4	校准品5	校准品6
							他克莫司(ng/mL)	2	5	10	20	50	100
西罗莫司(ng/mL)	2	5	10	20	50	100
							依维莫司(ng/mL)	2	5	10	20	50	100
环孢霉素A(ng/mL)	10	50	200	500	1000	2000

2.3.1.4配制全血质控品

分别吸取950μL全血至3个1.5ml离心管中，分别加入50μL质控品中间工作液点，涡旋混匀10分钟，即为他克莫司、西罗莫司、依维莫司浓度为：5ng/ml、15ng/ml、30ng/ml；环孢霉素A浓度为：50ng/ml、400ng/ml、800ng/ml的全血质控品，如表5所示

表5全血系列浓度质控品

2.3.2内标溶液

内标溶液是含有环孢霉素A-d₁₂、西罗莫司-d₃、依维莫司-d₄、子囊霉素的甲醇溶液。

内标溶液配制方法：吸取100μL环孢霉素A-d₁₂母液(10μg/mL)、100μL罗莫司-d₃母液(1μg/mL)、100μL依维莫司-d₄母液(1μg/mL)、100μL子囊霉素母液(1μg/mL)至1.5mL样品瓶中，加入600μL甲醇，混匀1～3分钟，即配制成环孢霉素A-d₁₂浓度为1000ng/ml、西罗莫司-d₃浓度为100ng/ml、依维莫司-d₄浓度为100ng/ml、子囊霉素浓度为100ng/ml的内标溶液。

2.3.3磁珠溶液：浓度为3mg/ml

磁珠溶液配制方法：吸取300μL磁珠母液(100mg/mL)至15mL玻璃瓶或者离心管中，放到磁力架上进行磁分离(无磁力架情况下可用磁性物质将玻璃瓶或者离心管中的磁珠吸附到侧壁上)，弃去上清液，加入10mL含5％甲醇的水溶液，涡旋混匀1～3分钟，即为浓度为3mg/ml磁珠溶液(备注：磁珠母液为羧基磁珠，粒径1μm，生产厂家：Merck)。

2.3.4甲醇乙腈溶液

吸取甲醇15mL至50mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，即得甲醇乙腈溶液。2.3.5硫酸锌溶液(0.1mol/L)

使用电子天平(万分之一)称取1.4378g硫酸锌置于50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，超声，配成浓度为0.1mol/L硫酸锌溶液。

3.液相色谱方法：

液相系统：AB SCIEX

HPLC

分析柱：C18色谱柱

流动相：A：2mM乙酸铵+0.1％甲酸+水；B：2mM乙酸铵+0.1％甲酸+甲醇

流速：0.5ml/min

柱温：50℃

进样室温度：2～8℃

进样体积：10μl

梯度洗脱程序如表6所示：

表6梯度洗脱程序

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A	流动相B
				0.00	0.5	50	50
0.20	0.5	50	50
				1.00	0.5	0	100
2.00	0.5	0	100
				2.10	0.5	50	50
3.00	0.5	50	50

4.质谱方法：

采用电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描分析，包括离子源参数和MRM离子通道。离子源参数包括离子化电压及温度、气帘气、碰撞气、喷雾气、辅助加热气，具体信息如表7所示：

表7离子源参数

离子化电压(V)	5500
		温度(℃)	550
气帘气(psi)	35
		碰撞气	7
喷雾气(psi)	50
		辅助加热气(psi)	50

MRM离子通道：均采用氨加合离子，具体离子对信息如表8所示：

表8MRM定量和定性离子对信息

注：*为定量离子，其余为定性离子。对应离子色谱图如图7～图14所示。

5.结果计算：

采用液相色谱串联质谱仪数据分析软件，按照校准品峰面积/内标峰面积的比值作为纵坐标，对应校准品浓度作为横坐标，建立线性回归，待测全血样本中的四种免疫抑制剂按照数据分析软件设定的方法自动计算。

6.结果分析：

6.1不同磁珠所适应的实验和体系是不同的，轻微的改变就会导致磁珠碰撞效率变低，进而不能保证杂质吸附效率，丧失样本处理的初衷，使与目标物无关的物质，如蛋白质，细胞，盐类等，直接进到质谱。一方面，影响离子化效率，导致检测结果不准确，另外一方面，会在色谱柱柱头析出导致色谱柱柱效迅速降低，甚至造成系统堵塞，产生昂贵的仪器维修费用。本发明检测方法及试剂盒对试剂盒关键反应体系进行了深入研究，如蛋白沉淀剂。常用的有机溶剂甲醇，不能保证一定时间内磁珠碰撞效率，进而影响到磁珠吸附杂质的效率，使处理后的样本上清液浑浊，无法上机检测。有机溶剂乙腈虽然能保证磁珠碰撞效率，但成分单一，价格昂贵，不能兼容各种物质，造成提取物质不充分及蛋白沉淀不完全。而采用甲醇：乙腈(3：7)的蛋白沉淀体系不但确保磁珠的碰撞效率，而且价格相对乙腈低廉，兼容各种物质，能确保提取物质充分及蛋白沉淀完全，如图1所示。

6.2本发明检测方法及试剂盒考察了基质效应、校准曲线线性、精密度、准确度四大主要性能指标，均满足预期性能指标要求。全血样本纯化、检测方法如上所述。线性关系到检测样本的浓度范围宽窄，精密度反映在规定条件下，独立测量结果之间的一致性，准确度是测定结果是否准确可靠的指标。6.3基质效应采用混合实验考察

具体方法为向空白全血中加入标准品，测定3次，均值响应为A；病人全血(6份不同病人样本)，测定3次，均值响应为B；将加入标准品的空白全血样本与等量病人样本混合成1：1的混合物，测定3次，均值响应为C。则基质效应＝C/((A+B)/2)×100％，若差异<20％，则基质效应可忽略。基质效应结果显示他克莫司介于86.87％～104.00％，西罗莫司介于83.50％～100.61％，依维莫司介于86.46％～106.43％，环孢霉素A介于89.30％～96.15％，基质效应可忽略，详细数据如表9所示，四种免疫抑制剂类药物的总离子流色谱图如图2所示。

表9基质效应

6.4校准曲线线性考察

具体方法为，平行处理4套校准曲线，以第一套作标准，其余3套均代入第一套得出对应的浓度值，计算每个浓度点三个值的平均值与理论值的偏差和CV，要求最低点偏差＜20％，其余点偏差＜15％；最低点CV＜20％，其余点CV＜15％。考察结果如下：环孢霉素A线性方程为Y＝0.01385x+0.04211，R²＝0.994488，在10～2000ng/mL内线性满足检测要求，如图3所示。西罗莫司线性方程为Y＝0.12960x+0.04962，R²＝0.998501，在2～100ng/mL内线性满足检测要求，如图4所示。他可莫司线性方程为Y＝0.12081x+0.02702，R²＝0.99942，在2～100ng/mL内线性满足检测要求，如图5所示。依维莫司线性方程为Y＝0.09942x+0.02920，R²＝0.997302，在2～100ng/mL内线性满足检测要求，如图6所示。线性情况如表10、表11、表12、表13所示

表10环孢霉素A线性情况

表11西罗莫司线性情况

表12他克莫司线性情况

表13依维莫司线性情况

6.5准确度要求均值应在质控品标示值±15％之内，做法为在临床空白样本内，添加已知浓度的标准品，制备3个浓度的加标样本，每个浓度至少检测6次，考察结果如表14所示：

表14准确度结果

6.6精密度要求CV在±15％之内，做法为在临床空白样本内，添加已知浓度的标准品，制备3个浓度的加标样本，每个浓度至少检测6次，考察结果如表15所示：

表15精密度结果

从上述结果可知，本发明的液相色谱串联质谱检测方法及其试剂盒具有良好的线性、准确度、精密度，完全满足临床检验要求。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。