CN116004703A

CN116004703A - 基于酵母双杂交系统验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作的方法

Info

Publication number: CN116004703A
Application number: CN202310019862.8A
Authority: CN
Inventors: 侯典云; 张佳琪; 吕淑芳; 郭菡; 刘浩; 王婷
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2023-01-06
Filing date: 2023-01-06
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明涉及基于酵母双杂交系统验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作的方法，即通过酵母双杂交验证两蛋白互作，过程为：克隆获得连翘FsWRKY4、FsMAPK3基因序列，并通过一步克隆法构建酵母双杂交猎物载体pGADT7‑FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7‑FsMAPK3。随后进行酵母毒性检测和酵母自激活检测，最后通过酵母双杂交验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作，可为中药材连翘提供丰富基因资源，为深入研究WRKY转录因子调控次生代谢物合成途径的分子机制以及分子植物育种提供有益参考。

Description

基于酵母双杂交系统验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作，具体的说是一种用酵母双杂交的方法验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作。

背景技术

连翘 Forsythia suspensa为木犀科连翘属落叶灌木，多见于中国河南、河北、山东、陕西、山西等地区，其干燥果实入药，具有清热解毒，消肿散结，疏散风热等功效，用于风热感冒，温病初起，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛等症治疗。研究表明，连翘中有多种次生代谢产物发挥药理作用，如类黄酮及萜类、酚酸类等。其中，通过苯丙烷途径产生的木脂素类（如连翘苷）和苯乙醇苷类（如连翘脂苷）是连翘的主要活性成分，另外在2015 版《中国药典》中描述连翘苷和连翘酯苷A为指标性成分。

据报道，WRKY转录因子家族在多种植物中参与苯丙烷代谢途径，在次生代谢物质合成中起到重要的调控作用，但在连翘中未见报道。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联普遍存在于真核细胞中，对于植物的生长、发育以及防御生物胁迫和非生物胁迫都很重要。此外，MAPK级联很可能参与次生代谢，包括骆驼蓬蛋白和吲哚硫代葡萄糖苷、尼古丁、花青素、植保素等。

为了提高连翘中特征药用成分的含量，并为中药连翘提供丰富基因资源，可通过研究两基因的关系，进而调控连翘次生代谢物质的含量。在拟南芥中已经证实AtMPK3通过调控AtWRKY33促进次生代谢产物植保素的积累；丹参中也证实SmMPK3可以与 SmARF1 发生互作，并特异性磷酸化SmARF1，抑制 SmARF1的转录抑制活性，促进 SmPAL1 基因的表达，从而调控丹参毛状根中酚酸类化合物的积累。

发明内容

为了验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作，本发明的目的在于提供基于酵母双杂交系统验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作的方法。本发明通过酵母双杂交的方法首次在连翘中验证了FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作。

本发明采用的具体方案为：

第一方面，基于酵母双杂交系统验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作的方法，包括以下步骤：

获得 FsWRKY4、 FsMAPK3基因序列，将所述基因序列分别构建到酵母双杂交猎物载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7，利用一步克隆法构建猎物载体pGADT7- FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7- FsMAPK3，随后进行重组载体酵母毒性检测、酵母自激活检测，最后进行酵母双杂交检测FsWRKY4与FsMAPK3之间的互作关系。

进一步地，酵母双杂交的猎物载体pGADT7- FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7- FsMAPK3构建方法，包括以下步骤：

（1）克隆获得FsWRKY4、FsMAPK3序列：

设计特异性引物如SEQ ID NO：01~ SEQ ID NO：04所示；

PCR扩增，纯化回收后、构建TA克隆载体转入大肠杆菌DH5α，挑选单克隆阳性菌液送公司测序后获得 FsWRKY4和 FsMAPK3基因序列，提取质粒保存备用；

（2）以 FsWRKY4、 FsMAPK3核苷酸序列为模板设计带有同源臂和酶切位点的引物对，其引物对如SEQ ID NO：05~ SEQ ID NO：08所示；

PCR扩增，回收纯化得到含有同源臂和酶切位点的 FsWRKY4、 FsMAPK3核苷酸序列；

（3）将猎物载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7进行酶切处理，纯化回收得到线性化的载体pGADT7、pGBKT7；

（4）将线性化的载体pGADT7、pGBKT7和含有同源臂的 FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列进行同源重组，筛选阳性克隆送公司测序后提取质粒保存备用，命名为pGADT7- FsWRKY4、pGBKT7- FsMAPK3。

进一步地，所述酵母毒性检测，包括以下步骤：

（1）将构建好的诱饵载体 pGBKT7-FsMAPK3 和 pGBKT7 空载分别转化到 Y2HGlod 酵母感受态中；

（2）涂菌于 DDO（-Trp色氨酸）培养基上29℃倒置黑暗培养48-96h。

进一步地，所述酵母重组质粒自激活检测，包括以下步骤：

（1）将空载体质粒组合pGADT7×pGBKT7，及重组质粒与空载体质粒组合pGADT7-FsWRKY4×pGBKT7和pGADT7×pGBKT7-FsMAPK3，同时设置阳性pGADT7-T×pGBKT7-53、阴性pGADT7-T×pGBKT7-lam对照组合，共转酵母菌株Y2H Gold，涂布于YPDA培养基，29℃倒置黑暗培养48-96h；

（2）挑取3mm左右菌落于10μL无菌水中，涡旋混匀后取2μL于30μL 20mM NaOH中PCR：98℃ 5 min，12℃ 1 min，五个循环，再吸取1~2μL破壁后的菌液进行PCR扩增；

（3）菌检正确后将菌液稀释1、10、100、1000倍分别涂布再缺陷培养基DDO（SD/-Leu-Trp）、DDO/X-α-gal、QDO（SD/-Leu-Trp-His-Ade）、QDO/X-α-gal /AbA上，其中X-α-gal浓度为130 μg/mL，AbA浓度为130 μg/mL，29℃倒置黑暗培养48-96h。

所述酵母双杂交是将猎物载体pGADT7- FsWRKY4和诱饵载体pGBKT7- FsMAPK3共转酵母菌株Y2H Gold。

第二方面，一种酵母双杂交系统，采用以下方法构建所得：获取 FsWRKY4、 FsMAPK3基因序列，将所述基因序列分别构建到酵母双杂交猎物载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7，利用一步克隆法构建猎物载体pGADT7- FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7- FsMAPK3，随后通过重组载体酵母毒性检测、酵母自激活检测后，将猎物载体pGADT7- FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7- FsMAPK3共转酵母菌株Y2H Gold。

第三方面，上述酵母双杂交系统在检测蛋白互作方面的应用。

有益效果：本发明通过酵母双杂交的方法首次在连翘中验证了FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作，为有效提高作为药效指标的连翘苷的提取率提供建议，为中药材连翘提供丰富基因资源，为深入研究 WRKY 转录因子调控次生代谢物合成途径的分子机制以及分子植物育种提供有益参考。

附图说明

图1是实施例1中pGADT7- FsWRKY4猎物载体构建示意图。

图2是实施例1中pGBKT7- FsMAPK3诱饵载体构建示意图。

图3是实施例1酵母毒性检测结果图。

图4是实施例1酵母自激活检测结果图；其中， AD-T7 × BD-53：Y2H[pGADT7-T×pGBKT7-53]阳性对照；AD × BD：Y2H[pGADT7×pGBKT7]；AD-T7 × BD-lam：Y2H[pGADT7-T×pGBKT7-lam]阴性对照；AD-WRKY4 × BD：Y2H[pGADT7-WRKY4×pGBKT]；AD × BD-MAKP3：Y2H[pGADT7×pGBKT-MAPK3]；X-α-gal：130μg/mL；AbA：130μg/mL。

图5是实施例1酵母双杂交实验组菌落生长情况结果图；其中，注：AD- WRKY3× BD- MAPK3：Y2H[pGADT7- WRKY4×pGBKT7- MAPK3]；X-α-gal：130μg/mL；AbA：130μg/mL。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

利用酵母双杂交的方法验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作，包括以下步骤：

（1）克隆获得 FsWRKY4、FsMAPK3序列

基于前期连翘转录组的数据，筛选出 FsWRKY4和 FsMAPK3基因序列，根据基因序列设计特异性引物如下：

PCR-FsWRKY4-F（SEQ ID NO：01）：AATTCACATTCATGGCCACTAC，

PCR-FsWRKY4-R（SEQ ID NO：02）：CAAAACAGAAAGCTCGCTCTCT；

PCR-FsMAPK3-F（SEQ ID NO：03）：TAAGATTGCTGATTTTGGCCTT

PCR-FsMAPK3-R（SEQ ID NO：04）：TTGAACATGATTACGATTCGAG；

（2）以FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列为模板设计带有同源臂和酶切位点（BamHⅠ和NdeⅠ）的引物对，其引物对如SEQ ID NO：05~ SEQ ID NO：08所示，具体如下：

AD- FsWRKY4-F:gtaccagattacgctcatatgATGGCTGAGAACCAACCTCCT

AD- FsWRKY4-R:cagctcgagctcgatggatccTCAAGAAAGTTGTGTTACCTGTTCTTC；

BD- FsMAPK3-F:tcagaggaggacctgcatatgATGACAGAGTATGTTGTCACCAGATG

BD- FsMAPK3-R:ccgctgcaggtcgacggatccTTAGATATTTAGTGCCAAAGCCTCC；

PCR扩增，回收纯化得到含有同源臂和酶切位点的FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列；

（3）将猎物载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7用BamHⅠ和NdeⅠ进行酶切处理，纯化回收得到线性化的载体pGADT7、pGBKT7；

（4）将线性化的载体pGADT7、pGBKT7和上述含有同源臂的 FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列进行同源重组，筛选阳性克隆送公司测序后提取质粒保存备用，命名为pGADT7- FsWRKY4、pGBKT7- FsMAPK3；

（5）将构建好的诱饵载体 pGBKT7-FsMAPK3 和 pGBKT7 空载分别转化到 Y2HGlod 酵母感受态中，涂菌于 DDO（-Trp色氨酸）培养基上29℃倒置黑暗培养48-96h；

（6）将空载体质粒组合（pGADT7×pGBKT7）及重组质粒和空载体质粒组合（pGADT7-FsWRKY4×pGBKT7、pGADT7×pGBKT7-FsMAPK3），同时设置阳性（pGADT7-T×pGBKT7-53）、阴性（pGADT7-T×pGBKT7-lam）对照组合，共转酵母菌株Y2H Gold，涂布于YPDA培养基，29℃倒置黑暗培养48-96h；

（7）挑取3mm左右菌落于10μL无菌水中，涡旋混匀后取2μL于30μL 20mM NaOH中PCR：98℃ 5 min，12℃ 1 min，五个循环，再吸取1~2μL破壁后的菌液进行PCR扩增；

（8）菌检正确后将菌液稀释1、10、100、1000倍分别涂布再缺陷培养基DDO（SD/-Leu-Trp）、DDO/X-α-gal、QDO（SD/-Leu-Trp-His-Ade）、QDO/X-α-gal /AbA上，其中X-α-gal浓度为130 μg/mL，AbA浓度为130 μg/mL，29℃倒置黑暗培养48-96h。

上述方案中，所述步骤（1）中，PCR扩增体系：

PCR仪程序：[98℃10s→56℃5s→72℃60s/90s]×32→72℃5m→16℃2h

所述步骤（2）中，PCR扩增体系：

PCR仪程序：[98℃10s→58℃5s→72℃60s/90s]×32→72℃5m→16℃2h

所述步骤（3）中，酶切体系：

37℃金属浴 4h

所述步骤（4）中，同源重组体系：

37℃金属浴30min

所述步骤（7）中，PCR扩增体系：

PCR仪程序：[98℃10s→58℃5s→72℃60s/90s]×32→72℃5m→16℃2h

实验结果：

通过PCR扩增获得 FsWRKY4、FsMAPK3基因序列，并通过一步克隆法构建酵母双杂交猎物载体pGADT7- FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7- FsMAPK3。

酵母毒性检测结果显示菌落密度及大小均无明显差异，表明其无毒可用于后续试验。

酵母自激活检测结果显示阳性对照组合在四种培养基上能够长出蓝色菌落，而阴性对照及空载组合和重组质粒和空载体质粒组合菌只能在DDO、DDO/X上长出菌落，且在DDO/X上长处的菌落不能变蓝，说明在AbA浓度为130μg/mL时能够抑制重组质粒自激活功能。

酵母双杂交结果表明其能在DDO、DDO/X、QDO/X、QDO/X/A上生长，且在DDO/X、QDO/X/A上生长的菌落能够变蓝，表明Y2H Gold酵母中的3个GAL4启动子被激活，表达了4种选择标记基因金弹子素抗性筛选、His组氨酸营养筛选、腺嘌呤营养筛选、蓝白斑筛选，这说明两蛋白存在互作。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims

1.基于酵母双杂交系统验证连翘FsWRKY4/FsMAPK3蛋白互作的方法，其特征在于：包括以下步骤：

获得FsWRKY4、FsMAPK3基因序列，将所述基因序列分别构建到酵母双杂交猎物载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7，利用一步克隆法构建猎物载体pGADT7-FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7-FsMAPK3，随后进行重组载体酵母毒性检测、酵母自激活检测，最后进行酵母双杂交检测FsWRKY4与FsMAPK3之间的互作关系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：酵母双杂交的猎物载体pGADT7-FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7-FsMAPK3构建方法，包括以下步骤：

（1）克隆获得FsWRKY4、FsMAPK3序列：

设计特异性引物如SEQ ID NO：01~ SEQ ID NO：04所示；

PCR扩增，纯化回收后、构建TA克隆载体转入大肠杆菌DH5α，挑选单克隆阳性菌液送公司测序后获得FsWRKY4和FsMAPK3基因序列，提取质粒保存备用；

（2）以FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列为模板设计带有同源臂和酶切位点的引物对，其引物对如SEQ ID NO：05~ SEQ ID NO：08所示；

PCR扩增，回收纯化得到含有同源臂和酶切位点的FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列；

（4）将线性化的载体pGADT7、pGBKT7和含有同源臂的FsWRKY4、FsMAPK3核苷酸序列进行同源重组，筛选阳性克隆送公司测序后提取质粒保存备用，命名为pGADT7-FsWRKY4、pGBKT7-FsMAPK3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酵母毒性检测，包括以下步骤：

（1）将构建好的诱饵载体 pGBKT7-FsMAPK3 和 pGBKT7 空载分别转化到 Y2H Glod 酵母感受态中；

涂菌于 DDO（-Trp色氨酸）培养基上29℃倒置黑暗培养48-96h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酵母重组质粒自激活检测，包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酵母双杂交是将猎物载体pGADT7-FsWRKY4和诱饵载体pGBKT7-FsMAPK3共转酵母菌株Y2H Gold。

6.一种酵母双杂交系统，其特征在于：采用以下方法构建所得：获取FsWRKY4、FsMAPK3基因序列，将所述基因序列分别构建到酵母双杂交猎物载体pGADT7和诱饵载体pGBKT7，利用一步克隆法构建猎物载体pGADT7-FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7-FsMAPK3，随后通过重组载体酵母毒性检测、酵母自激活检测后，将猎物载体pGADT7-FsWRKY4、诱饵载体pGBKT7-FsMAPK3共转酵母菌株Y2H Gold。

7.根据权利要求6所述的酵母双杂交系统在检测蛋白互作方面的应用。