CN116004567A - 极光激酶b基因k202突变及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人极光激酶B的K202突变及其应用。具体而言，人极光激酶B中K202突变导致极光激酶B的K63泛素化修饰降低，从而导致极光激酶B磷酸化水平降低。极光激酶B中K202突变后能够抑制肿瘤发生，并且导致HeLa细胞对极光激酶B抑制剂以及紫杉醇药物增敏。极光激酶B中K202突变可以用于筛选对极光激酶B抑制剂以及其他干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物敏感的肿瘤患者，也可以开发单独或与其他药物一起用作治疗肿瘤的药物。

Description

极光激酶B基因K202突变及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域，具体而言涉及极光激酶B基因中编码氨基酸位点K202的突变以及应用。

背景技术

已有的研究证实极光激酶(Aurora kinase)B在乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、弥漫性大B淋巴瘤、Burkitt’s和Hodgkin’s淋巴瘤等多种不同肿瘤中高频表达，在肿瘤发生、发展、转移和耐药多个环节发挥重要作用，并且与不良预后相关。这些研究突显了极光激酶B在肿瘤转化中的作用，因此极光激酶B成为肿瘤治疗的靶标。国际药商默克、阿斯利康和辉瑞等纷纷致力于靶向Aurora家族药物的研发，多个靶向极光激酶B激酶的小分子化合物已经在全球多中心开展了I期、Ⅱ期或III期临床试验。例如，AZD1152(Barasertib)，一种特异地选择性靶向极光激酶B激酶的小分子药物，针对恶性实体瘤(NCT00497731)和复发/难治性弥漫性大B淋巴瘤(NCT01354392)进行了I/II期临床试验，针对急性髓性白血病(AML)(NCT00497991)(NCT00952588)进行了I/II/III期临床试验。尽管这些药物显示出一定的抗肿瘤效果，但剂量依赖的毒性(中性粒毒性)仍然是它的一个主要问题，目前尚没有批准进入临床应用。但研究者们仍在尝试寻找减毒、增效或与其它治疗药物联合应用的方法，以期促进极光激酶B激酶的抑制剂进入临床市场。

极光激酶B蛋白的翻译后修饰对其在有丝分裂过程中的正确定位及激酶活性有很重要的调节作用。本发明人研究发现，K63-连接的泛素化修饰对极光激酶B的活性有很重要的调节作用。泛素(Ubiquitin,Ub)是一个只有76个氨基酸的小分子。在泛素活化酶E1、泛素偶联酶E2和泛素连接酶E3的作用下，泛素分子C端的Gly残基与靶蛋白上的Lys残基发生共价连接，从而给靶蛋白打上泛素的标签。泛素分子本身含有7个Lys残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)，连同可以用作次级附着点的N末端蛋氨酸(M1)，可以形成具有不同结构和功能的各种泛素链，不同类型的泛素链赋予蛋白质不同的功能及命运。例如，K48连接的多聚泛素链标定蛋白质到蛋白酶体降解，K63连接的多聚泛素链为蛋白-蛋白间的相互作用提供平台，通过改变靶蛋白的稳定性、影响靶蛋白的定位和功能活性等参与蛋白质转运、DNA损伤修复和免疫应答等。本发明人通过蛋白质质谱分析和定点突变等技术证明，极光激酶B的K202突变成精氨酸R后，其泛素化修饰水平降低，并且其磷酸化水平降低，激酶活性降低，影响细胞的有丝分裂，促进细胞凋亡。极光激酶B的K202突变后能够使上述的极光激酶抑制剂减毒、增效。因此，极光激酶B的K202突变后能够作为治疗肿瘤的药物或者能够使上述的极光激酶抑制剂减毒、增效或与其联合应用作为抗肿瘤药物。

发明内容

本发明发现SEQ ID NO.1所示人极光激酶B第202位的赖氨酸发生突变后导致不能够发生K63类型的泛素化，从而使得第232位苏氨酸磷酸化降低，从而出现抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的效果。并且预计其他的人极光激酶蛋白中，经过氨基酸序列比对，对应于与SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸发生突变后也存在相同的效果。

因此，本发明的第一方面涉及人极光激酶突变体蛋白，其是极光激酶B、极光激酶C或极光激酶A的突变体蛋白，其特征在于，SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，或者经过氨基酸序列比对对应于SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代。

在优选的实施方案中，所述人极光激酶突变体蛋白的特征在于，SEQ ID NO.2第161位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.3第203位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.4第162位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.5第170位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.6第168位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.7第149位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.8第134位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者SEQ ID NO.9第258位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代。

在进一步优选的实施方案中，所述人极光激酶突变体蛋白的特征在于，所述被非赖氨酸替代是被精氨酸替代。

本发明的第二方面涉及人极光激酶突变体核酸，其编码所述的人极光激酶突变体蛋白。

本发明的第三方面涉及一种载体，其包含所述人极光激酶突变体核酸。

本发明的第四方面涉及一种鉴定本发明所述突变体蛋白或所述突变体核酸的工具，针对本发明所述人极光激酶突变体蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段、针对本发明所述突变体核酸的引物对或探针。

本发明的第五方面涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括所述的人极光激酶突变体蛋白，或所述的核酸分子或所述的载体。在进一步的实施方案中，所述药物组合物还包括治疗肿瘤的药物。在进一步的实施方案中，所述治疗肿瘤的药物是紫杉醇及其类似物、紫杉特尔、多西他赛、高三尖杉酯碱、长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙碱、角秋水仙碱、异秋水仙碱、鬼臼毒素及其类似物、喜树碱、长春花碱及其类似物、埃博霉素或伊沙匹隆等干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或者CYC-116、极光激酶A抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-IN-2、SCH-1473759、TAK-901、MLN8054、KW-2449、逆转素、TAK-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶A抑制剂1、MK-5108、Tripolin A、AT9283、ZM-447439、酞嗪酮吡唑、Tinengotinib、AMG900、阿立塞替、阿立塞替钠、PF-03814735、极光激酶抑制剂1、NU6140、极光激酶抑制剂3、TC-A 2317盐酸盐、GSK-1070916、AS-703569、LY3295668、极光激酶抑制剂-9、CCT241736、Derrone、达鲁舍替、ABT-348、ABT-348盐酸盐、SNS-314、极光激酶抑制剂-10、ENMD-2076、CD532、Hesperadin、AZD1152、AZD2811、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、Chiauranib、JNJ-7706621、MK-8745、PHA-680632、TC-S 7010、BI-847325、BI-831266、BI-811283、TAS-119、JAB-2000、VIC-1911、JS112或JAB-2485等极光激酶抑制剂，所述肿瘤血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、CD30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌。

本发明的第六方面涉及一种用于预测患有肿瘤的患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)测定所述患者样品中是否表达所述的人极光激酶突变体蛋白；和/或

(b)测定所述患者样品中是否存在所述的人极光激酶突变体核酸；

(b)若(a)中测定结果确定患者样品中表达所述的人极光激酶突变体蛋白和/或(b)中测定结果确定患者样品中存在所述的人极光激酶突变体核酸，则患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物的治疗发生响应。

在优选的实施方案中，所述干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物是紫杉醇及其类似物、紫杉特尔、多西他赛、高三尖杉酯碱、长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙碱、角秋水仙碱、异秋水仙碱、鬼臼毒素及其类似物、喜树碱、长春花碱及其类似物、埃博霉素或伊沙匹隆，所述极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物是CYC-116、极光激酶A抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-IN-2、SCH-1473759、TAK-901、MLN8054、KW-2449、逆转素、TAK-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶A抑制剂1、MK-5108、Tripolin A、AT9283、ZM-447439、酞嗪酮吡唑、Tinengotinib、AMG 900、阿立塞替、阿立塞替钠、PF-03814735、极光激酶抑制剂1、NU6140、极光激酶抑制剂3、TC-A 2317盐酸盐、GSK-1070916、AS-703569、LY3295668、极光激酶抑制剂-9、CCT241736、Derrone、达鲁舍替、ABT-348、ABT-348盐酸盐、SNS-314、极光激酶抑制剂-10、ENMD-2076、CD532、Hesperadin、AZD1152、AZD2811、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、Chiauranib、JNJ-7706621、MK-8745、PHA-680632、TC-S 7010、BI-847325、BI-831266、BI-811283、TAS-119、JAB-2000、VIC-1911、JS112或JAB-2485，所述患有肿瘤的患者是患有血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、CD30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌的患者。

在优选的实施方案中，使用极光激酶B突变体蛋白或突变体核酸预测患者对极光激酶B抑制剂治疗的响应，使用极光激酶C突变体蛋白或突变体核酸预测患者对极光激酶C抑制剂治疗的响应，使用极光激酶A突变体蛋白或突变体核酸预测患者对极光激酶A抑制剂治疗的响应。

本发明的第六方面涉及一种筛选治疗肿瘤的候选药物的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(a)设置对照细胞组和测试细胞组，其中测试细胞组的细胞表达所述的人极光激酶突变体蛋白，或者测试细胞组的细胞包含所述的人极光激酶突变体核酸或所述的载体；

(b)分别向对照细胞组和测试细胞组加入测试药物；

(c)分别检测对照细胞组和测试细胞组的细胞增殖速度；

(d)若测试细胞组的细胞增殖速度小于对照细胞组的细胞增殖速度，则所测试药物选择作为治疗肿瘤的候选药物。

本发明的第七方面涉及所述突变体蛋白或所述突变体核酸用于预测患有肿瘤的患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的用途或用于筛选治疗肿瘤的候选药物的用途。在优选的实施方案中，所述干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物是紫杉醇及其类似物、紫杉特尔、多西他赛、高三尖杉酯碱、长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙碱、角秋水仙碱、异秋水仙碱、鬼臼毒素及其类似物、喜树碱、长春花碱及其类似物、埃博霉素或伊沙匹隆，所述极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物是CYC-116、极光激酶A抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-IN-2、SCH-1473759、TAK-901、MLN8054、KW-2449、逆转素、TAK-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶A抑制剂1、MK-5108、Tripolin A、AT9283、ZM-447439、酞嗪酮吡唑、Tinengotinib、AMG 900、阿立塞替、阿立塞替钠、PF-03814735、极光激酶抑制剂1、NU6140、极光激酶抑制剂3、TC-A 2317盐酸盐、GSK-1070916、AS-703569、LY3295668、极光激酶抑制剂-9、CCT241736、Derrone、达鲁舍替、ABT-348、ABT-348盐酸盐、SNS-314、极光激酶抑制剂-10、ENMD-2076、CD532、Hesperadin、AZD1152、AZD2811、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、Chiauranib、JNJ-7706621、MK-8745、PHA-680632、TC-S 7010、BI-847325、BI-831266、BI-811283、TAS-119、JAB-2000、VIC-1911、JS112或JAB-2485，所述患有肿瘤的患者是患有血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、CD30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌的患者。

本发明第八方面涉及极光激酶抑制剂，其特征在于，极光激酶抑制剂与本发明所述人极光激酶突变体蛋白的结合亲和力高于其与人极光激酶野生型蛋白的结合力高。

附图说明

图1是显示HeLa细胞内源性极光激酶B的Western Blot检测图，显示HeLa细胞内源性极光激酶B在有丝分裂期发生K63类型泛素化修饰。

图2是泛素分子突变体质粒HA-K48-Ub或HA-K63-Ub与极光激酶B的Ni-NTA pulldown实验结果。其中，HA-K48-Ub质粒中，泛素分子除K48外，其余的赖氨酸全部突变成精氨酸，HA-K63-Ub质粒中，泛素分子除K63外，其余的赖氨酸全部突变成精氨酸。显示转染HA-K63-Ub的实验组中极光激酶B的泛素化和磷酸化均显著增强。

图3是泛素分子突变体质粒HA-Ub-K48R或HA-Ub-K63R与极光激酶B的Ni-NTA pulldown实验结果。其中，HA-Ub-K48R质粒中，泛素分子中仅K48突变成精氨酸，HA-Ub-K63R质粒中，泛素分子仅K63突变成精氨酸。显示转染HA-Ub-K63R的实验组中极光激酶B的泛素化和磷酸化均显著降低。

图4是Ni-NTA pull-down实验结果图，其中将质粒V5-His-Aurora B、HA-K63-Ub和pEYFP-BRCC36(图中标记为pEYFP-B36)或pEYFP-BRCC36-QSQ(图中标记为pEYFP-B36-QSQ)瞬时转染293T细胞，Nocodazole处理细胞同步化至分裂期，收集细胞在变性条件下进行Ni-NTA pull-down实验，显示BRCC36调节极光激酶B的泛素化水平。

图5是Abro1-KO、BRCC36-KO以及对照细胞中Abro1、BRCC36、极光激酶B的WesternBlot结果图，结果显示Abro1-KO和BRCC36-KO细胞系中极光激酶B的蛋白质水平与对照细胞系相比没有差别。

图6是Abro1-KO、BRCC36-KO以及对照细胞中极光激酶B的T232磷酸化水平柱状图，其中ns表示无统计学差异，***表示p<0.001，显示Abro1-KO、BRCC36-KO有丝分裂前期细胞中，Aurora B-pT232的荧光强度显著强于对照组细胞。

图7是Flag-Aurora B免疫沉淀物的质谱分析图，显示极光激酶B中检测到包含K85、K87、K202以及K211位点的肽片段，说明K85、K87、K202以及K211可能存在K63类型的泛素化修饰。

图8是极光激酶B潜在泛素化位点的保守序列分析结果，显示K202在高等哺乳动物中高度保守。

图9是极光激酶B突变体的Ni-NTApull-down实验结果，结果显示K202R/K211R双突变体以及K202R单突变体的细胞泛素化水平显著降低，并且磷酸化水平也明显降低，但K211R单突变体的泛素化和磷酸化水平未见明显的变化；K85R/K87R双突变体泛素化水平有上升的趋势，并且磷酸化水平也明显升高。

图10是Flag-HA-Aurora B和Flag-HA-Aurora B-K202R纯化蛋白SDS-PAGE银染图。

其中293T细胞中瞬时过表达Flag-HA-Aurora B或Flag-HA-Aurora B-K202R，收集中期细胞用Flag Beads进行纯化，然后进行SDS-PAGE电泳并银染。

图11是纯化Flag-HA-Aurora B或Flag-HA-Aurora B-K202R以H3为底物进行体外磷酸化后的Western Blot检测图。其中分别使用抗Flag抗体、抗H3抗体、抗H3-pS10抗体和抗Aurora B-pT232抗体进行极光激酶B、H3、H3-pS10、Aurora B-pT232检测。结果显示Flag-HA-Aurora B处理组的极光激酶B磷酸化和H3磷酸化水平显著高于Flag-HA-Aurora B-K202R处理组。

图12是稳定表达Flag-HA-Aurora B或Flag-HA-Aurora B-K202R的HeLa细胞系Western Blot图，使用抗Flag抗体检测到转染Flag-HA-Aurora B的HeLa细胞表达Flag-HA-Aurora B野生型蛋白，转染Flag-HA-Aurora B-K202R的HeLa细胞表达Flag-HA-Aurora B-K202R突变体蛋白，转染Flag空载的HeLa细胞不表达外源极光激酶B蛋白。

图13是通过CCK8实验检测HeLa细胞的增殖能力结果图。其中，在24h时，三种细胞的增殖能力无差别，在48h至72h时，转染Aurora B-K202R的HeLa细胞活力呈现下降趋势，在96h时，转染Aurora B-K202R的HeLa细胞虽然呈现出增殖的趋势，但其增殖能力显著低于其他两种细胞。

图14是三种稳定转染HeLa细胞的平板克隆形成实验。其中将三种稳定转染的HeLa细胞种植于直径6cm的培养皿中培养10天左右，用结晶紫染色并拍照。与其他两种细胞相比，转染Aurora B-K202R的HeLa细胞的培养皿中，克隆明显较少。

图15是使用Image J统计图12中克隆形成数目的柱形图。其中***表示p<0.001。与其他两种细胞相比，转染Aurora B-K202R的HeLa细胞的克隆数目显著减少。

图16是三种稳定转染HeLa细胞的流式实验结果图。其中与对照组以及稳定表达Flag-HA-Aurora B的细胞相比，Flag-HA-Aurora B-K202R的凋亡比例显著增加。

图17是三种稳定转染HeLa细胞对紫杉醇的药敏实验结果。其中将三种稳定转染的HeLa细胞种植于96孔板，贴壁后加入不同浓度的紫杉醇处理24小时，开展CCK8实验，测量细胞的存活能力。其中**表示p<0.01，***表示p<0.001。表明Aurora B-K202R突变体增加了HeLa细胞对紫杉醇的敏感性。

图18是三种稳定转染HeLa细胞对AZD1152的药敏实验结果。其中将三种稳定转染的HeLa细胞种植于96孔板，贴壁后加入不同浓度的AZD1152处理24小时，开展CCK8实验，测量细胞的存活能力。其中**表示p<0.01，***表示p<0.001。表明Aurora B-K202R突变体增加了HeLa细胞对AZD1152的敏感性。

图19是极光激酶B与INCENP/VX-680复合物的晶体结构图。其中A图是极光激酶B与INCENP/VX-680复合物的晶体结构，显示K202坐落于极光激酶B的活化环中。B图是A图中活化环区域的放大图，显示K202与活化环的起始氨基酸残基DFG间的距离关系。

图20是三种极光激酶的氨基酸序列对比结果。其中“*”表示所比较氨基酸序列相同，“:”表示氨基酸具有强保守性，“.”氨基酸具有弱保守性，本发明的赖氨酸位点用加框标示，催化区中一致序列用粗体标示，其中的苏氨酸磷酸化位点用粗体和下划线标示。

具体实施方式

细胞有丝分裂过程中遗传物质的均等分配，染色体的精确分离对于基因组的稳定性至关重要，如果染色体分配不均等将会导致非整倍体，促进染色体不稳定性的表型甚至肿瘤的发生。有丝分裂的每一环节都需要精准而细致的调控，这在时间和空间上依赖于一系列复杂精密的调节机制，其中包括PLK(Polo-like kinases)、CDK(Cyclin-dependentkinases)和极光激酶(Aurora kinase)等多个相关激酶的共同协调作用。

极光激酶是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，人极光激酶包括三种亚型，分别为极光激酶A、极光激酶B和极光激酶C，它们在细胞有丝分裂的多个环节发挥重要调控作用。目前发现人极光激酶B和C又存在多种形式的变异体。人极光激酶家族成员的蛋白质一级结构含有两个结构域，即N端的可变区和C端的催化区，并且C端的催化区比较保守。

极光激酶B在有丝分裂中行使功能主要是通过染色体乘客复合物(Chromosomepassenger complex,CPC)来实现的。CPC由极光激酶B、内着丝粒蛋白(Inner centromereprotein,INCENP)、Survivin和Borealin 4个亚基构成。其中，INCENP是CPC复合物的组装平台，它作为一个支架蛋白提供与Survivin、Borealin和极光激酶B相互作用的位点；极光激酶B作为催化亚基发挥着核心作用；而其他3个亚基对极光激酶B的激酶活性和时空动态性分布有着调控作用。极光激酶B的定位随细胞周期的运行发生着特征性的变化，与这种高度时空动态性分布相一致的是，极光激酶B在有丝分裂的多个环节，例如纺锤体组装、动粒微管连接、纺锤体组装检验点和胞质分裂等过程发挥重要作用。因此，极光激酶B是确保染色体精确分离，防止异倍体产生的关键的有丝分裂调控因素。极光激酶B活性的抑制或过度激活都会造成有丝分裂进程的紊乱，导致肿瘤的发生。极光激酶B的激酶活性在有丝分裂前中期调控着染色体的列队过程，促进形成纺锤体检验点，纠正错误的动点－微管连接；在有丝分裂后期开始之后，CPC复合物完成了其在动点上的使命，转运到中心纺锤体。对CPC复合物功能的干扰会引起中期染色体列队、分离和胞质分裂的缺陷。研究表明，极光激酶B的底物可以抑制其激酶活性，而该抑制作用可以被PLK1对这些底物的磷酸化而逆转。

极光激酶C虽然主要在睾丸中表达，但其也是一种染色体乘客蛋白，其亚细胞定位与极光激酶B完全相同。一般认为极光激酶C与B具有表达的组织特异性的差别，其功能是一致的。

极光激酶A自中心体复制到下一次有丝分裂的G1期一直定位在中心体的附近。其在中心体复制和成熟中发挥着重要的作用。

本发明人发现人极光激酶B变异体1的序列(NCBI参考序列NP_001300879.1，SEQID NO.1)所示人极光激酶B第202位的赖氨酸发生突变后导致该位点不能够发生K63类型的泛素化，从而使得第232位苏氨酸磷酸化降低，进而出现抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的效果。

由于以下几方面的原因，据信其他的人极光激酶蛋白中，经过氨基酸序列比对，对应于与SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸发生突变后也产生相同的效果。

首先，经过氨基酸多序列比对分析，NCBI蛋白质序列库中收录的人极光激酶B变异体1(NCBI参考序列NP_001300879.1)、极光激酶B变异体2(NCBI参考序列NP_001243763.1)、极光激酶B变异体3(NCBI参考序列NP_001271455.1)、极光激酶B变异体4(NCBI参考序列NP_001300881.1)、极光激酶B变异体5(NCBI参考序列NP_001300882.1)、极光激酶C变异体1(NCBI参考序列NP_001015878.1)、极光激酶C变异体2(NCBI参考序列NP_001015879.1)、极光激酶C变异体3(NCBI参考序列NP_003151.2)、极光激酶A(NCBI参考序列NP_001310234.1)的催化区序列非常保守，并且在所有上述极光激酶中，对应于SEQ ID NO.1第202位置上的氨基酸均为赖氨酸，并且催化区高度保守一致序列DFGWSxxxxxxxRxTxCGTxDYLPPE(其中的RxT序列中的苏氨酸残基是激酶活化的靶位点)中的一致序列完全相同，所述赖氨酸与所述一致序列之间的间隔氨基酸序列长度完全相同且序列也非常保守。

其次，不同类型的极光激酶的突变能够通过体内其他类型极光激酶进行补偿。例如研究发现极光激酶B的敲除可以被其他极光激酶进行弥补。例如Sasai等研究发现极光激酶C失活突变体的效应是诱导细胞产生多核现象，这与极光激酶B失活突变体产生的表型十分相似，使用RNAi干扰方法单独沉默极光激酶B或C可诱导产生约15％或13％的多核细胞，但同时沉默极光激酶B和C时产生叠加效应，多核细胞占25％。在干扰极光激酶B的细胞中过量表达极光激酶C可以部分挽救由于极光激酶B沉默所引起的多核现象(Sasai K,KatayamaH,Stenoien D L,et al.Aurora-C kinase is a novel chromosomal passenger proteinthat can complement aurora-B kinase function in mitotic cells.Cell MotilCytoskeleton,2004,59(4):249-263)。Yan等发现极光激酶C与极光激酶B一样，也是染色体乘客蛋白，该两者激酶的功能可以相互弥补(Yan X,Wu Y,Li Q,et al.Cloning andcharacterization of a novel human Aurora C splicing variant.Biochemical andbiophysical research communications,2005,328(1):0-361)。因此在有丝分裂过程中，极光激酶B和C可以行使相似的功能，它们之间相互弥补，满足细胞有丝分裂进程的需要(李强等，极光(aurora)激酶在细胞有丝分裂和肿瘤形成中的重要功能，生命科学，2005，424-432)。

再次，实验表明，不同类型极光激酶的抑制剂存在交叉反应。例如陶扎色替、逆转素、AMG 900、达鲁舍替、ABT-348、SNS-314、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、PHA-680632等对于极光激酶A、B和C均显示出抑制作用。

由此可见，人极光激酶A、B和C催化区的二级结构应相同或相似，并且本发明的赖氨酸会以同样的作用方式影响ATP的进入以及232位苏氨酸的磷酸化以及出现相同的效果。除了人极光激酶B变异体1之外，其他的人极光激酶蛋白中，经过氨基酸序列比对，对应于与SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸发生突变后也存在相同的效果。

因此，人极光激酶序列SEQ ID NO.2第161位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQID NO.3第203位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.4第162位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.5第170位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.6第168位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ ID NO.7第149位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代，SEQ IDNO.8第134位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者SEQ ID NO.9第258位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代的实施方案也具有本发明的技术效果，因此也处于本发明的保护范围内。

众所周知，组成生物体的氨基酸有20种，根据氨基酸侧链的性质将氨基酸分成4类，①含非极性、疏水性侧链氨基酸，包括丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、甘氨酸(Gly，G)、蛋氨酸(Met，M)、色氨酸(Trp，W)和苯丙氨酸(Phe，F)；②含极性、中性侧链的氨基酸，包括谷氨酰胺(Gln，Q)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、天冬酰胺(Asn，N)和酪氨酸(Tyr，Y)；③含极性、酸性侧链的氨基酸，包括天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)；④含极性、碱性侧链的氨基酸，包括赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)和组氨酸(His，H)。在本发明中，因为本发明位置上的赖氨酸经过突变后导致蛋白质该位点不能够进行K63类型的泛素化而产生本发明的技术效果，因此该位置上的赖氨酸被其他类型的氨基酸替代后均能够出现本发明的技术效果。由于同类氨基酸在结构、电荷、极性、疏水性等方面类似，因此同类氨基酸替代对蛋白质的二级结构影响比最小，因此在优选的实施方案中，所述位置上的赖氨酸被同类氨基酸精氨酸或组氨酸替代。

此外，由于K202位于C端小叶的表面，因此据信K202的缺失对结构的影响非常小，因此会产生相同的效果。人极光激酶序列SEQ ID NO.2第161位置上的赖氨酸缺失，SEQ IDNO.3第203位置上的赖氨酸缺失，SEQ ID NO.4第162位置上的赖氨酸缺失，SEQ ID NO.5第170位置上的赖氨酸缺失，SEQ ID NO.6第168位置上的赖氨酸缺失，SEQ ID NO.7第149位置上的赖氨酸缺失，SEQ ID NO.8第134位置上的赖氨酸缺失或者SEQ ID NO.9第258位置上的赖氨酸缺失以及其他人极光激酶对应于上述位置上的赖氨酸的缺失也处于本发明的保护范围之内。

本领域技术人员众所周知，由于存在基因突变，因此编码所述人极光激酶突变蛋白的内源性核酸序列存在多种。并且由于遗传密码的简并性，能够编码所述人极光激酶突变蛋白的外源性核酸序列无法一一列举。但这些内源性或外源性突变核酸均能够通过编码的突变体蛋白产生本发明的技术效果，因此也处于本发明的保护范围内。

本领域技术人员众所周知，可以使用所述的突变体核酸构建载体，在所述载体导入细胞后能够表达产生本发明所述的突变体蛋白并产生本发明的技术效果，例如作为药物进入细胞内表达所述的突变体蛋白，使细胞发生凋亡，或者导入体外培养细胞中使细胞瞬时或稳定表达突变体蛋白，用于筛选肿瘤药物等，因此所述的载体也处于本发明的保护范围内。能够实施本发明技术方案的具体载体类型、序列、导入细胞的方法、导入试剂、突变体蛋白的检测、细胞增殖检测等均属于本发明的常规技术。

在本领域中，有可能产生检测样本中是否存在本发明人极光激酶突变体蛋白质的方法，例如使用仅识别本发明的突变体蛋白，而不识别非突变体蛋白的抗体，或者使用仅识别非突变体蛋白，而不识别本发明的突变体蛋白的单克隆或多克隆抗体或其抗原结合片段等。因此，本发明所述的针对所述人极光激酶突变体蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段是指仅识别本发明的突变体蛋白，而不识别非突变体蛋白的抗体或其抗原结合片段。检测方法包括提取生物材料的蛋白质，然后进行电泳和杂交的蛋白质印迹法，以及细胞、组织原位杂交法等。抗体及其抗原结合片段的制备、蛋白质提取、电泳、蛋白质印迹杂交、细胞或组织原位杂交技术均是本领域的常规技术。

此外，本领域众所周知，可以针对本发明所述的突变体核酸设计引物对，通过PCR扩增方法确定样本中是否存在本发明的突变体核酸，或者针对本发明所述的突变体核酸设计探针，通过核酸分子杂交确定样本中是否存在本发明的突变体核酸。本发明所述针对本发明所述突变体核酸的引物是指能够通过PCR扩增后鉴定出样本核酸序列是否是本发明的突变体核酸或者是否编码本发明所述突变赖氨酸的引物对。本发明所述针对本发明所述突变体核酸的探针是指能够通过探针杂交后鉴定出样本核酸序列是否是本发明的突变体核酸或者是否编码本发明所述突变赖氨酸的探针。用于实施本发明技术方案的引物对或者探针会根据待检测的突变体核酸的序列进行设计，这些引物对或者探针的序列无法一一列举。并且设计引物对和引物的技术、PCR扩增、核酸杂交等技术也是本领域的常规技术。

本发明人发现，本发明的人极光激酶突变体蛋白或突变体核酸能够抑制细胞增殖并导致细胞凋亡，并且可以导致细胞对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物以及极光激酶抑制剂类的抗肿瘤药物具有增敏的效果。因此可以将本发明的人极光激酶突变体蛋白或突变体核酸单独作为抗肿瘤药物使用，或者与上述抗肿瘤药物配合使用，一方面增强了抗肿瘤药物的治疗效果，同时又降低了抗肿瘤药物的副作用。

因此本发明的突变体蛋白或者突变体核酸可以单独作为治疗肿瘤的药物。此外，本发明的突变体蛋白或者突变体核酸也可以与其他治疗肿瘤的药物一起制成治疗肿瘤的药物。或者，本发明的突变体蛋白或突变体核酸与其他治疗肿瘤的药物作为分别的药物，通过药物联用治疗肿瘤。可以用于该目的的治疗肿瘤的药物可以是任何类型的药物，优选使用与本发明突变体蛋白或突变体核酸具有协同作用的药物，最优选使用干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物。虽然很多极光激酶抑制剂能够对多种极光激酶产生抑制效果，但这些抑制剂通常对某一类极光激酶的抑制效果更大。在本发明中，将这种对人极光激酶B抑制最大的抑制剂称作极光激酶B抑制剂，对人极光激酶C抑制最大的抑制剂称作极光激酶C抑制剂，对人极光激酶A抑制最大的抑制剂称作极光激酶A抑制剂。因此优选使用极光激酶A突变体蛋白或突变体核酸与极光激酶A抑制剂联合使用或者制作成药物，使用极光激酶B突变体蛋白或突变体核酸与极光激酶B抑制剂联合使用或者制作成药物，使用极光激酶C突变体蛋白或突变体核酸与极光激酶C抑制剂联合使用或者制作成药物。本领域众所周知，可以将上述的药物与各种赋形剂组合制备药物组合物。用于制备药物组合物的赋形剂也是本领域众所周知的。

由于本发明的人极光激酶突变体蛋白质可以导致干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物以及极光激酶抑制剂类的抗肿瘤药物具有增敏的效果，因而如果患者存在内源性的本发明人极光激酶突变体蛋白或者突变体核酸，则可以预测该患者干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物和极光激酶抑制剂类的抗肿瘤药物敏感，使用这些药物可以有效治疗所患肿瘤。因此本发明涉及一种用于预测患者干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)测定所述患者样品中是否表达所述的人极光激酶突变体蛋白；和/或

(b)测定所述患者样品中是否存在所述的人极光激酶突变体核酸；

(c)若(a)中测定结果确定患者样品中表达所述的人极光激酶突变体蛋白和/或(b)中测定结果确定患者样品中存在所述的人极光激酶突变体核酸，则患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物的治疗发生响应。因此患者可能对使用干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物进行治疗效果更佳。如上面所述，这些抑制剂通常对某一类极光激酶的抑制效果更大。因此如果患者存在本发明的极光激酶B突变体蛋白或突变体核酸，则患者使用极光激酶B抑制剂抗肿瘤药物的治疗效果更佳；如果患者存在本发明的极光激酶C突变体蛋白或突变体核酸，则患者使用极光激酶C抑制剂抗肿瘤药物的治疗效果更佳，如果患者存在本发明的极光激酶A突变体蛋白或突变体核酸，则患者使用极光激酶A抑制剂抗肿瘤药物的治疗效果更佳。

自发现极光激酶作为抗肿瘤治疗靶点以来，很多研究者着力开发和筛选极光激酶的抑制剂作为抗肿瘤的药物，但由于所开发的极光激酶抑制剂因为高剂量使用带来很大的毒副作用，导致其尚不能够应用于临床。由于本发明的人极光激酶突变体蛋白或突变体核酸能够与极光激酶的抑制剂发生协同效应，因此这些具有毒副作用极光激酶抑制剂有望以较低的剂量与本发明的人极光激酶突变体蛋白或突变体核酸协同使用作为药物或者对携带本发明突变体蛋白或突变体核酸的患者使用低剂量的这些极光激酶抑制剂。

本发明的第六方面涉及一种筛选治疗肿瘤的候选药物的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(a)设置对照细胞组和测试细胞组，其中测试细胞组的细胞表达所述的人极光激酶突变体蛋白，或者测试细胞组的细胞包含所述的人极光激酶突变体核酸或所述的载体；

(b)分别向对照细胞组和测试细胞组加入测试药物；

(c)分别检测对照细胞组和测试细胞组的细胞增殖速度；

(d)若测试细胞组的细胞增殖速度小于对照细胞组的细胞增殖速度，则所测试药物选择用作治疗肿瘤的候选药物。

在优选的实施方案中，使用人极光激酶B突变体蛋白或突变体核酸或载体筛选极光激酶B抑制剂类型的候选药物，使用人极光激酶C突变体蛋白或突变体核酸或载体筛选极光激酶C抑制剂类型的候选药物，使用人极光激酶A突变体蛋白或突变体核酸或载体筛选极光激酶A抑制剂类型的候选药物。

在本领域中，开发的极光激酶抑制剂及其对各种极光激酶的特异性以及治疗的疾病种类包括：

CYC-116，CAS号693228-63-6，是有效的极光激酶A和B的抑制剂，Ki值分别为8和9nM。Cyclacel Pharmaceuticals公司临床试验用于治疗实体瘤。

极光激酶A抑制剂2(Aurora A inhibitor 2)，CAS号2412144-74-0，是一种有效的极光激酶A抑制剂，IC50为21.94nM。其诱导MDA-MB-231细胞caspase依赖性凋亡。

陶扎色替(Tozasertib，VX-680，MK-0457，VX6)，CAS号639089-54-6，是极光激酶A/B/C抑制剂，对极光激酶A、B和C的Ki值分别为0.6、18、4.6nM。对极光激酶A作用最强，而对极光激酶B/C的作用较弱，对极光激酶A选择性比其他55种激酶高100倍。Merck Sharp&Dohme公司临床试验用于治疗白血病、非小细胞肺癌、结直肠癌、慢性髓性白血病。

极光激酶-IN-2(Aurora Kinases-IN-2，化合物12Aj)，CAS号2241914-86-1，是一种有效的极光激酶抑制剂，对极光激酶A和B的IC50值分别为90和152nM。

SCH-1473759，化学名称1-丙醇,2-[乙基[[5-[[6-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基]氨基]-3-异噻唑]甲基]氨基]-2-甲基，CAS号1094069-99-4，是多靶点的极光激酶抑制剂，对极光激酶A和B的IC50值分别为4和13nM。

TAK-901，CAS号934541-31-8，是一种多靶向极光激酶抑制剂，对极光激酶A和B的IC50分别为21和15nM。Millennium Pharmaceuticals,Inc.公司临床试验用于治疗血液系统的恶性肿瘤，包括急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、Waldenstrom's巨球蛋白血症、髓样纤维化、髓样化生、非何杰金氏淋巴瘤等和实体瘤。

MLN8054，化学名称(4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂卓-2-基]氨基]苯甲酸，CAS号869363-13-3，是高效、选择性、有口服活性的极光激酶A抑制剂，IC50值为4nM。作用于极光激酶A比作用于极光激酶B选择性高40倍。MillenniumPharma公司I期临床试验用于治疗乳腺肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、膀胱肿瘤、进展性恶性肿瘤。

KW-2449，化学名称[4-[2-(1H-吲唑-3-基)乙烯基]苯基]-1-哌嗪基甲酮，CAS号1000669-72-6，多靶点激酶抑制剂，对FLT3、ABL、ABLT315I和极光激酶的IC50值分别为6.6、14、4和48nM。Kyowa Kirin公司研发，用于治疗白血病，I期临床。

逆转素(Reversine)，CAS号656820-32-5，是一种ATP竞争性的极光激酶抑制剂，作用于极光激酶A、B和C，IC50分别为400、500和400nM。

TAK-901，化学名称5-[3-(乙基磺酰基)苯基]-3,8-二甲基-N-(1-甲基-4-哌啶基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-7-羧酰胺，CAS号934541-31-8，是多靶点的极光激酶抑制剂，对极光激酶A和B的IC50值分别为21和15nM。

极光激酶抑制剂-2(Aurora kinase inhibitor-2)，CAS号331770-21-9，是一种选择性的ATP竞争性极光激酶抑制剂，对极光激酶A和B的IC50分别为310nM和240nM。

极光激酶A抑制剂1(Aurora A inhibitor 1)，CAS号2677799-04-9，是极光激酶A的一种有效且选择性的抑制物。

MK-5108(VX-689)，CAS号1010085-13-8，是高效和特异性的极光激酶A抑制剂，IC50值为0.064nM。作用于极光激酶A比作用于极光激酶B/C选择性高220和190倍。MerckSharp&Dohme公司临床试验用于治疗肿瘤。

Tripolin A((E)-Tripolin A)，化学名称(3E)-3-[(2,5-二羟基苯基)亚甲基]-1,3-二氢-2H-吲哚-2-酮，CAS号1148118-92-6，是特异性的非ATP竞争性的极光激酶A抑制剂，其对极光激酶A和B的IC50分别为1.5μM和7μM。

AT9283，化学名称1-环丙基-3-(3-(5-(吗啉甲基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-1H-吡唑-4-基)脲，CAS号896466-04-9，是一种多靶点激酶抑制剂，有效抑制极光激酶A、极光激酶B、JAK3、JAK2和Abl，IC50分别为3nM、3nM、1.1nM、1.2nM和4nM。Cancer Research UK临床试验用于治疗血液系统恶性肿瘤：白血病、多发性骨髓瘤、实体瘤、急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、非何杰金氏白血病。

ZM-447439，化学名称N-[4-[[6-甲氧基-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-4-喹唑啉基]氨基]苯基]苯甲酰胺，CAS号331771-20-1，是极光激酶抑制剂，对极光激酶A和B的IC50值分别为110和130nM。

酞嗪酮吡唑(Phthalazinone pyrazole)，CAS号880487-62-7，是一种有效、选择性、口服活性的极光激酶A抑制剂，IC50为0.031μM。

Tinengotinib，CAS号2230490-29-4，是一种或多种蛋白激酶的调节剂，可以调节极光激酶激酶和VEGFR激酶。

AMG 900，CAS号945595-80-2，是一种有效的选择性的泛极光激酶(pan-Aurora)抑制剂，作用于极光激酶A、B和C，IC50分别为5nM、4nM和1nM。Amgen公司临床试验用于治疗血液系统的恶性肿瘤、髓性白血病、实体瘤。

阿立塞替(Alisertib，MLN 8237)，CAS号1028486-01-2，是选择性的极光激酶A抑制剂，IC50为1.2nM，作用于极光激酶A比作用于极光激酶B选择性强200倍以上。MillenniumPharma等公司临床试验用于治疗转移性乳腺癌、儿童实体瘤(除外CNS)、前列腺癌、淋巴瘤、肺癌(转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、间皮瘤、CD30+淋巴瘤、CD30+实体瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、转化的滤泡性淋巴瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤、腹膜癌、Waldenstrom's巨球蛋白血症、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、胰腺肿瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、结肠癌、直肠癌、EGFR基因突变、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤等。

阿立塞替钠(Alisertib sodium，MLN8237钠)，CAS号1028486-06-7，选择性极光激酶A抑制剂(IC50＝1.2nM)，它与极光激酶A结合，导致有丝分裂纺锤体异常、有丝分裂累积。已经进入III期临床阶段，用于外周T细胞淋巴瘤。

PF-03814735，化学名称N-[2-[(1S,4R)-6-[[4-(环丁基氨基)-5-(三氟甲基)-2-嘧啶]氨基]-1,2,3,4-四氢萘-1,4-脒-9-基]-2-氧代乙基]乙酰胺，CAS号942487-16-3，是有效可逆极光激酶A和B的抑制剂，IC50值分别为0.8和5nM。Pfizer公司II期临床试验用于治疗实体瘤。

极光激酶抑制剂1(Aurora inhibitor 1)，CAS号2227019-45-4，是一种有效的极光激酶抑制剂，抑制极光激酶A和B的IC50分别≤4nM和≤13nM。

NU6140，CAS号444723-13-1，具有有效抑制极光激酶A和B的活性，IC50值分别为67和35nM。具有抗肿瘤作用。

极光激酶抑制剂3(Aurora Kinase Inhibitor 3)，CAS号879127-16-9，是一种有效的、选择性极光激酶A抑制剂，IC50为42nM，同时微弱抑制EGFR，IC50>10μM。

TC-A2317盐酸盐，CAS号1245907-03-2，是一种口服活性极光激酶A抑制剂(Ki＝1.2nM)。TC-A2317盐酸盐对极光激酶B的Ki为101nM。

GSK-1070916，化学名称N'-[4-[4-[2-[3-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基]-1-乙基-1H-吡唑-3-基]苯基]-N,N-二甲基脲，CAS号942918-07-2，是选择性ATP竞争型的极光激酶B/C抑制剂，IC50为3.5nM/6.5nM，Ki值分别为0.38/1.5nM，Cancer Research UK公司临床试验用于治疗实体瘤。

AS-703569(Cenisertib，MSC1992371A)，CAS号871357-89-0，是一种多激酶抑制剂，可抑制极光激酶A/B、ABL1、AKT、STAT5、FLT3的活性。Cenisertib通过抑制肿瘤肥大细胞(MC)中几种不同分子靶标的活性抑制其生长。Cenisertib抑制异种移植模型中胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌以及白血病的肿瘤生长。

LY3295668(AK01、Erbumine)，CAS号1919888-06-4，是高度特异性的极光激酶A的抑制剂，其对极光激酶A和极光激酶B的Ki值分别为0.8nM和1038nM。Eli Lilly andCompany公司临床试验用于治疗转移性乳腺癌。

极光激酶抑制剂-9(Aurora kinase inhibitor-9，化合物9d)，CAS号2419107-09-6，是一种有效的极光激酶A/B双抑制剂，对极光激酶A和B的IC50s分别为0.093和0.09μM。极光激酶抑制剂-9具有广谱抗增殖活性。

CCT241736，CAS号1402709-93-6，是一种有效的FLT3和极光激酶双重抑制剂，能够有效抑制极光激酶A(Kd为7.5nM，IC50为38nM)、极光激酶B(Kd为48nM)、FLT3(Kd为6.2nM)以及FLT3突变体FLT3-ITD(Kd为38nM)和FLT3(D835Y)(Kd为14nM)的活性。

Derrone，CAS号76166-59-1，是一种异黄酮异丙酚，是一种极光激酶抑制剂，对极光激酶B和A的IC50值分别为6和22.3μM。具有抗肿瘤活性。

达鲁舍替(Danusertib，PHA-739358)，CAS号827318-97-8，是一种极光激酶抑制剂，能够抑制极光激酶A、B和C的活性，IC50值分别为13、79和61nM。Nerviano医学科学和加州大学洛杉机分校Jonsson综合癌症中心临床试验用于治疗白血病、前列腺癌、多发性骨髓瘤。

ABT-348(Ilorasertib)，CAS号1227939-82-3，是一种ATP竞争性的多靶点抑制剂，能够抑制极光激酶B/C/A、RET酪氨酸激酶、PDGFRβ和Flt1的活性，IC50值分别为7nM、1nM、120nM、7nM、3nM和32nM。

ABT-348盐酸盐(Ilorasertib hydrochloride)，CAS号1847485-91-9，是一种有效、ATP竞争性的多靶点激酶抑制剂，可抑制极光激酶C、B和A的活性，IC50值分别为1nM、7nM和120nM。ABT-348盐酸盐同时抑制RET，PDGFRβ和Flt1的活性，IC50值分别为7nM、3nM和32nM。已经进入II期临床阶段。

SNS-314，化学名称N-(3-氯苯基)-N'-[5-[2-(噻吩并[3,2-D]嘧啶-4-基氨基)乙基]-2-噻唑基]脲，CAS号1057249-41-8，是一种有效的选择性极光激酶抑制剂，对极光激酶A、B和C的IC50分别为9、31和6nM。Sunesis Pharmaceuticals公司临床试验用于治疗实体瘤。

极光激酶抑制剂-10(Aurora kinase inhibitor-10，化合物6c)，CAS号2417228-90-9，是一种口服活性极光激酶B抑制剂，IC50为8nM。极光激酶抑制剂-10显示出抗肿瘤活性。

ENMD-2076，化学名称6-(4-甲基-1-哌嗪基)-N-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-2-[(1E)-2-苯乙烯基]-4-嘧啶胺，CAS号934353-76-1，是多靶点激酶抑制剂，抑制极光激酶A、Flt3、KDR/VEGFR2、Flt4/VEGFR3、FGFR1、FGFR2、Src、PDGFRα的IC50值分别为1.86、14、58.2、15.9、92.7、70.8、20.2和56.4nM。作用于极光激酶A比作用于极光激酶B选择性高25倍。CASIPharmaceuticals公司临床试验用于治疗卵巢癌、软组织肉瘤、肝细胞癌、乳腺癌、输卵管癌、腹膜癌、多发性骨髓瘤。

CD532，CAS号1639009-81-6，是一种有效的极光激酶A抑制剂，IC50为45nM。CD532具有阻断极光激酶A活性和促进MYCN降解的双重作用。

Hesperadin，化学名称N-[(3Z)-2-氧代-3-[苯基-[4-(哌啶-1-甲基)苯胺]亚甲基]-1H-吲哚-5-基]乙烷磺酰胺，CAS号422513-13-1，是ATP竞争型的极光激酶B抑制剂，IC50值为250nM。

AZD1152(巴拉塞替，Barasertib)，化学名称5-[[7-[3-[乙基[2-(磷酰氧基)乙基]氨基]丙氧基]-4-喹唑啉基]氨基]-N-(3-氟苯基)-1H-吡唑-3-乙酰胺，CAS号722543-31-9，是Barasertib-HQPA的前体药物，是高度选择性的极光激酶B抑制剂，IC50值为0.37nM。AstraZeneca公司临床试验用于治疗急性髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、实体瘤和小细胞肺癌。

AZD2811(巴拉塞替-HQPA Barasertib-HQPA)，CAS号722544-51-6，是一种高度选择性的极光激酶B抑制剂，IC50值为0.37nM，对极光激酶B的选择性是极光激酶A的3700倍。可引起癌细胞生长阻滞和凋亡。AstraZeneca公司临床试验用于治疗急性髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、实体瘤和小细胞肺癌。

AAPK-25，CAS号2247919-28-2，是一种有效选择性的极光激酶/PLK激酶双重抑制剂，具有抗肿瘤活性。AAPK-25靶向极光激酶A、B和C的Kd值为23nM-289nM，靶向PLK-1,-2,-3的Kd值为55-456nM。

CCT129202，CAS号942947-93-5，是极光激酶抑制剂，对极光激酶A、B和C的IC50值分别为42、198和227nM。

CCT-137690，CAS号1095382-05-0，是有效的，有口服活性的极光激酶抑制剂，对极光激酶A、B和C的IC50值分别为15、25和19nM。

Chiauranib，靶向极光激酶B、VEGFR/PDGFR/c-Kit、CSF-1R，深圳微芯生物科技股份有限公司临床试验用于治疗非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、小细胞肺癌和肝细胞癌。

JNJ-7706621，CAS号443797-96-4，是一种有效的极光激酶抑制剂，同时能有效抑制CDK1和CDK2，对CDK1，CDK2，极光激酶A和B的IC50值分别为9nM、3nM、11nM和15nM。

MK-8745，CAS号885325-71-3，是极光激酶A的抑制剂，IC50值为0.6nM。

PHA-680632，CAS号398493-79-3，是极光激酶抑制剂，对极光激酶A、B和C的IC50值分别为27、135和120nM。

TC-S 7010，CAS号1158838-45-9，是有效且高度选择的极光激酶A抑制剂，IC50值为3.4nM。

BI-847325，CAS号1207293-36-4，是MEK和极光激酶A/B/C的ATP竞争性双重抑制剂，对人类MEK2和极光激酶C的IC50值分别为4和15nM。Boehringer Ingelheim公司临床试验用于治疗实体瘤。

BI-831266，CAS号958227-46-8，是极光激酶B的有效选择性抑制剂，IC50为42nM，抑制人非小细胞肺癌(NSCLC)，胰腺癌和前列腺癌细胞系的增殖(H460)肿瘤细胞增殖抑制IC50＝11nM)，在鼠异种移植肿瘤模型(HCT 116结肠癌，BxPC3胰腺癌和NCI-H460 NSCLC)中引起肿瘤消退和生长抑制。临床试验用于治疗实体瘤。

BI-811283，极光激酶B抑制剂，IC50为9nM，已经进入II期临床阶段。

TAS-119，是一种有效的、选择性的、具有口服活性的极光激酶A抑制剂，IC50为1.0nM。TAS-119对极光激酶A的选择性高于其他蛋白激酶，包括极光激酶B(IC50为95nM)。TAS-119具有有效的抗肿瘤活性。

JAB-2000，选择性极光激酶A抑制剂，处于临床前评估阶段，拟开发用于治疗各种RB1缺失的晚期实体瘤患者。

VIC-1911，捷思英达医药技术有限公司的极光激酶A抑制剂，适应症为晚期非小细胞肺癌。

JS112(WJS05129)，苏州君境生物医药科技有限公司的极光激酶A抑制剂，临床用于治疗实体瘤。

JAB-2485，北京加科思新药研发有限公司研发的一种高选择性小分子极光激酶A抑制剂，对极光激酶A的抑制活性比对极光激酶B的抑制活性高一千多倍。JAB-2485在细胞水平可以抑制极光激酶A活性，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长，具有良好的抗肿瘤活性。2022年1月17日，JAB-2485在美国获批新药临床试验申请，将在美国开展针对多种晚期实体瘤的I/IIa期临床试验。

此外，已有研究表明，极光激酶的表达与多种癌症的发展有关，如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌。因此，极光激酶家族被视为抗癌治疗有吸引力的靶点。极光激酶B在乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、弥漫性大B淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤等多种不同肿瘤中高频表达，在肿瘤发生、发展、转移和耐药多个环节发挥重要作用。极光激酶A在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌屮均检测出有较高的表达，极光激酶A的异常可能与恶性肿瘤的病理特点，临床分期及预后有一定相关性。

因此，上述极光激酶抑制剂以及肿瘤类型可以用于实施或适用于本发明的技术方案。具体而言，极光激酶抑制剂包括CYC-116、极光激酶A抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-IN-2、SCH-1473759、TAK-901、MLN8054、KW-2449、逆转素、TAK-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶A抑制剂1、MK-5108、Tripolin A、AT9283、ZM-447439、酞嗪酮吡唑、Tinengotinib、AMG900、阿立塞替、阿立塞替钠、PF-03814735、极光激酶抑制剂1、NU6140、极光激酶抑制剂3、TC-A 2317盐酸盐、GSK-1070916、AS-703569、LY3295668、极光激酶抑制剂-9、CCT241736、Derrone、达鲁舍替、ABT-348、ABT-348盐酸盐、SNS-314、极光激酶抑制剂-10、ENMD-2076、CD532、Hesperadin、AZD1152、AZD2811、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、Chiauranib、JNJ-7706621、MK-8745、PHA-680632、TC-S 7010、BI-847325、BI-831266、BI-811283、TAS-119、JAB-2000、VIC-1911、JS112、JAB-2485。肿瘤类型包括血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、CD30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、胃癌。

本领域中，通过干扰微管聚合或解聚实现抗肿瘤的药物包括但不限于下列药物：

紫杉醇(Paclitaxel、Taxo1、PTX)及其类似物是抑制微管解聚的药物，对微管蛋白稳定化作用而抑制其分解，同时将细胞周期阻断在G2/M期，导致细胞死亡，从而抑制肿瘤生长；

紫杉特尔(多烯紫杉醇、脱乙酰紫杉醇、Taxotere、Docetaxel、泰索帝)是保持了紫杉醇2'R，3'S构型的另一个半合成的紫杉醇类抗肿瘤药物，其作用于聚合态的微管，促进微管的装配，抑制微管的解聚，导致纺锤丝和纺锤体不能形成，抑制细胞增殖，是第二个进入临床应用的紫杉类药物；

多西他赛(Docetaxel、多烯紫杉醇)作用与紫杉醇相同，为M期周期特异性药物，促进小管聚合成稳定的微管并抑制其聚解，从而使小管的数量显著减少，并可破坏微管网状结构；

高三尖杉酯碱，作用于有丝分裂M期干扰微管蛋白合成，是抗肿瘤药物；

长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨，为细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用机制为与纺锤丝微管蛋白结合并使其变性，使有丝分裂停止于M期；

秋水仙碱(Colchicine)、角秋水仙碱、异秋水仙碱能通过抑制微管蛋白的聚合而抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，起到抗肿瘤的作用；

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)及其类似物，抑制微管组装，使细胞周期阻滞在有丝分裂期，起到抗肿瘤的作用；

长春花碱(Vinblastine)及其类似物，抑制微管聚合和解聚；

埃博霉素(Epothilone，EPO)是纤维素堆囊菌Sorangium cellulosum分泌的一类16元环的内酯类化合物。作用机制与紫杉醇类似，但结构简单、易于合成且水溶性好；

伊沙匹隆(Ixabepilone)，埃博霉素的内酰胺类似物，2007年10月16日美国FDA批准在美上市，用于治疗乳腺癌。

由于本发明所述的极光激酶突变最终会通过微管的聚合或解聚产生抑制细胞增殖等效应，因此会与抑制微管聚合或解聚的其他抗肿瘤药物产生协同增效的效应，本发明人也已经通过紫杉醇开展试验得以验证。因此上述干扰微管聚合或解聚的药物可以用于实施或适用于本发明的技术方案。具体而言，干扰微管聚合或解聚的药物包括但不限于紫杉醇及其类似物、紫杉特尔、多西他赛、高三尖杉酯碱、长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙碱、角秋水仙碱、异秋水仙碱、鬼臼毒素及其类似物、喜树碱、长春花碱及其类似物、埃博霉素、伊沙匹隆。由于极光激酶抑制剂也是通过干扰微管的聚合或解聚影响纺锤体组装而产生抗肿瘤效果，在本发明中，仅为了便于区分两者的目的，将干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物定位为除了极光激酶抑制剂之外的上述药物。

此外，由于本发明的突变位点K202有可能因为不能进行泛素化，导致位阻消失，以及突变位点可能涉及与极光激酶抑制剂结合，因此本发明还涉及一种基于本发明的突变位点K202设计或者筛选出来的极光激酶抑制剂。如此设计或者筛选的极光激酶抑制剂的特征在于，其与本发明所述人极光激酶突变体蛋白的结合亲和力高于其与相应人极光激酶野生型蛋白的结合力，例如其与本发明极光激酶B突变体蛋白的结合力高于其与极光激酶B野生型蛋白的结合力，其与本发明极光激酶C突变体蛋白的结合力高于其与极光激酶C野生型蛋白的结合力，其与本发明极光激酶A突变体蛋白的结合力高于其与极光激酶A野生型蛋白的结合力。在本申请中，所述的野生型蛋白是指K202位点未发生突变的蛋白。结合力测定方法是本领域众所周知的，包括但不限于亲和层析、化学探针技术、药物-靶蛋白复合物稳定性检测技术和计算机模拟技术等。

下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述，这些实施例是示例性的，不构成对所要求保护的本发明技术方案的限制。

实施例1：极光激酶B的K63泛素化修饰

K63连接类型的泛素化是一类常见的非降解型泛素化修饰，通过改变靶蛋白的稳定性、影响靶蛋白的定位和活性等参与DNA损伤修复、蛋白质转运和免疫应答等细胞的多种生理过程。K63类型泛素化修饰在有丝分裂中也发挥着重要的作用。为了探索K63连接类型的泛素化修饰对极光激酶B功能的影响，本发明人利用免疫共沉淀技术在HeLa细胞中验证极光激酶B是否在细胞内存在K63连接类型的泛素化修饰。

由于极光激酶B在M期特异性高表达，实验中对细胞进行了细胞周期同步化处理。首先将HeLa细胞种植16h后，采用30ng/mL的Nocodazole(购自Sigma)处理HeLa细胞14h，将细胞同步化至有丝分裂期，然后洗脱释放20min，收集中期的细胞。之后用极光激酶B的抗体(购自Cell Signaling Technology，货号3094S)进行内源性IP实验，然后用特异性识别K63泛素链的抗体(购自Cell Signaling Technology，货号5621S)对免疫共沉淀物进行Western Blot检测，结果示于图1。如图所示，在极光激酶B抗体的免疫沉淀物中能检测到明显的泛素化条带，提示细胞内源性的极光激酶B在有丝分裂期存在K63类型的泛素化修饰。

为了进行进一步验证，本发明人利用两套不同类型的泛素分子的突变体质粒HA-K48-Ub或HA-K63-Ub以及HA-Ub-K48R或HA-Ub-K63R，在变性条件下检测极光激酶B在有丝分裂期的泛素化修饰类型。HA-K48-Ub质粒中，泛素分子只保留了第48位赖氨酸，其他赖氨酸残基全部突变成精氨酸。HA-K63-Ub质粒中，泛素分子只保留了第63位赖氨酸，其他赖氨酸残基全部突变成精氨酸。HA-Ub-K48R质粒中，泛素分子第48位的赖氨酸突变成精氨酸，其它的赖氨酸位点都保留。HA-Ub-K63R质粒中，泛素分子第63位的赖氨酸突变成精氨酸，其它的赖氨酸位点都保留。

泛素分子Ub的基因序列参考Pubmed基因库的基因序列，利用软件Oligo 7.0进行引物的设计。PCR扩增的全长cDNA亚克隆到质粒pcDNA3.1-HA中。HA-K48-Ub、HA-K63-Ub、HA-Ub-K48R、HA-Ub-K63R的构建中应用定点突变技术对相应的K位点进行突变。PCR中使用的Phusion DNA聚合酶及分子克隆中使用的T4DNA连接酶购买于日本TOYOBO公司。下面以V5-His-Aurora B为例详细描述质粒的构建过程。

V5-His-Aurora B质粒的构建：参考NM_001313950.2的Aurora B的核酸序列，利用软件Oligo 7.0进行引物的设计，引物序列如下：

His-Aurora B-F CCCAAGCTTGCCACCATGGCCCAGAAGGAGAACT CCTACC

His-Aurora B-R CGGGATCCGGCGACAGATTGAAGGGCAGAG

目的片段的获取：模板量：cDNA≤200ng，Plasmid DNA≤50ng，反应体系如下：

反应程序如下：

取适量产物进行电泳验证。用PCR清洁试剂盒对目的片段产物进行清洁并测定回收产物的浓度。

载体酶切：选取相应的核酸内切酶切割载体，反应体系如下：

对酶切载体进行电泳验证，用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，测定浓度。

连接：使用无缝克隆试剂盒对目的片段和酶切载体进行连接，反应体系如下：

转化：将连接产物与感受态细胞混合均匀，冰敷30min，42℃热激90s，冰上静置5min。转化后的感受态细胞加入1mL LB液体培养基，于37℃恒温摇床，180rpm活化45分钟。活化后的感受态细胞3000g，离心3min，弃上清，重悬菌液后涂布至LA固体培养板，于37℃恒温培养箱培养。14h后，挑取单克隆，扩大培养。质粒小提后送测序并鉴定。

在293T细胞中过表达V5-His-Aurora B质粒和野生型HA-Ub或突变体质粒HA-K48-Ub或HA-K63-Ub，收集中期细胞，在变性条件下进行Ni-NTA pull-down实验，具体的Ni-NTApull-down实验步骤如下：

用8mol/L尿素Lysis Buffer B(8M尿素,100mM NaH2PO4,10mM Tris-Cl pH 8.0,25mM咪唑，补充蛋白酶抑制剂(P8340)和磷酸酶抑制剂(Selleck))对转染带有His标签质粒的细胞冰上超声裂解。取1mg左右的蛋白，加入20μL Ni-NTA agarose，4℃结合约4h。离心去上清，加入8mol/L尿素Lysis Buffer C(8M尿素,100mM NaH2PO4,10mM Tris-Cl(pH 6.3),25mM咪唑)清洗agarose。吸净残液，加入8mol/L尿素Lysis Buffer E(8M尿素,100mMNaH2PO4,10mM Tris-Cl(pH 4.0),250mM咪唑)，轻柔地拨动管壁，离心取上清，重复洗脱1次。所得样品通过SDS-PAGE进行分离，Western blotting检测相应蛋白。

Ni-NTA pull-down实验结果示于图2。结果显示，在转染HA-K63-Ub的实验组中，极光激酶B的泛素化修饰显著增强，表明极光激酶B在有丝分裂中期可以发生K63连接类型的多聚泛素化修饰。此外，值得注意的是，当极光激酶B的K63连接的泛素化修饰增强时，极光激酶B的磷酸化(Aurora B-pT232，其中T232是以极光激酶B变异体1序列参考号NP_001300879.1所示序列中为参考的第232苏氨酸)水平也显著增强。而在转染HA-K48-Ub的实验组中，极光激酶B的泛素化修饰没有显著增强。已有的研究表明，有丝分裂期介导极光激酶B降解的泛素化修饰类型主要是由APC/C^Cdh1催化发生的K11连接类型的多聚泛素化修饰，这解释了为何泛素分子中仅保留K48位赖氨酸导致泛素化增强不显著这一现象。

然后利用HA-Ub-K48R或HA-Ub-K48R进行类似的变性实验，在293T细胞中过表达V5-His-Aurora B和野生型HA-Ub或HA-Ub-K48R突变体或HA-Ub-K63R突变体，经Nocodazole处理后，收集分裂期细胞在变性条件下进行Ni-NTA pull-down实验，具体实验步骤如上所述。实验结果示于图3。结果表明，转染HA-Ub-K63R的细胞中，极光激酶B在有丝分裂期的泛素化水平显著下降，而转染HA-Ub-K48R的细胞中，极光激酶B的泛素化修饰没有显著变化。并且，与野生型对照组(HA-Ub)相比，当极光激酶B的K63连接类型的泛素化修饰降低时，极光激酶B的磷酸化水平也显著降低。

综上这些实验结果表明，极光激酶B在有丝分裂期能够发生K63连接类型的泛素化修饰，且极光激酶B的K63连接的泛素化修饰与其磷酸化水平正有关。

实施例2BRISC复合物调节极光激酶B的K63连接泛素化水平

BRCC36是一个去泛素化酶，能够特异性地水解靶蛋白上的K63泛素链。单独的BRCC36不具备酶活性，细胞质内，BRCC36常通过其MPN+结构域与具有MPN-结构域的Abor1结合形成BRISC(BRCC36 isopeptidase complex)复合物发挥酶活性功能。由于本发明人的前期工作结果发现BRISC复合物与极光激酶B存在相互作用并且极光激酶B和BRISC复合物的成员BRCC36和Abro1在着丝粒、中央纺锤体和中间体都有共定位。因此本发明人认为极光激酶B可能是BRISC复合物的底物，BRISC复合物可能会调控极光激酶B的K63连接的泛素化修饰水平。

为此，本发明人利用变性IP实验验证了BRISC复合物是否能够水解极光激酶B的K63泛素化链。首先构建如下质粒：V5-His-Aurora B、HA-K63-Ub和pEYFP-BRCC36(简称pEYFP-B36)或pEYFP-BRCC36-QSQ(简称pEYFP-B36-QSQ)。

质粒V5-His-Aurora B及HA-K63-Ub的构建如实施例1所述。

质粒pEYFP-B36的构建：BRCC36的基因序列参考Pubmed基因库的基因序列，利用软件Oligo 7.0进行引物的设计。pEYFP-B36-QSQ的构建：采用定点突变技术对第H122和H124两个位点的组氨酸替换成谷氨酰胺。PCR扩增及克隆条件参见实施例1。

质粒pEYFP-B36-QSQ表达的是BRCC36的酶活性突变体，其中第H122和H124两个位点的组氨酸替换成谷氨酰胺，即H122Q和H124Q，该两个位点突变后破坏了BRCC36与Zn²⁺结合的能力，因此BRCC36的酶活性大大降低。

将上述构建的质粒V5-His-Aurora B、HA-K63-Ub和pEYFP-B36或pEYFP-B36-QSQ瞬时转染293T细胞，使其在293T细胞中过表达所编码的蛋白。用30ng/mL的Nocodazole处理细胞同步化至分裂期，收集分裂期细胞在变性条件下进行Ni-NTApull-down实验，结果示于图4。如图4所示，同时转染HA-K63-Ub和V5-His-Aurora B的细胞内，极光激酶B能够发生很强的K63连接类型的泛素化修饰；当共转pEYFP-B36后，极光激酶B的K63泛素化水平显著降低；而共转BRCC36酶活突变体pEYFP-B36-QSQ时，极光激酶B的K63泛素化水平只有部分降低，明显高于pEYFP-B36组，表明去泛素化酶BRCC36能够水解极光激酶B的K63连接泛素链，调节其泛素化水平。极光激酶B是BRISC复合物的底物。

实施例3BRISC复合物调节极光激酶B的激酶活性

文献表明极光激酶B的激酶活性与极光激酶B自激活有关，即极光激酶B的第232位苏氨酸的磷酸化。本发明人设计实验研究了BRISC复合物的敲除是否会影响极光激酶B的蛋白质水平和激酶活性。

首选利用CRISPR/Cas9技术，在HeLa细胞中构建筛选出了稳定敲除Abro1(Abro1-KO)或BRCC36(BRCC36-KO)的细胞系。设计Abro1的两个sgRNA，并构建LentiCRISPRv2-Abro1-sg1/2慢病毒质粒，包装病毒，感染HeLa细胞，用无限稀释的方法筛选Abro1-KO的纯合克隆鉴定，使用同样的方法构建筛选BRCC36-KO的细胞系。

LentiCRISPRv2-Abro1-sg1/2慢病毒质粒的构建：

sgRNA引物设计：参考https://chopchop.cbu.uib.no/网站设计，引物如下：

       

用相应的限制性核酸内切酶对LentiCRISPRv2载体进行酶切。酶切体系如下：

37℃，30min；对酶切后的载体进行琼脂糖凝胶电泳，使用试剂盒回收酶切片段，进行浓度测定。

引物磷酸化及退火

37℃，30min，95℃，5min，最后以5℃/min的速度，梯度降温至25℃。使用T4 DNA连接酶对酶切后胶回收的载体和Oligos进行连接，连接条件为16℃，16h，连接体系如下：

取10μL连接产物进行转化Stbl3感受态细胞。挑取单菌，进行测序。

慢病毒包装：用细胞密度达到80％～90％的HEK-293T细胞进行转染。500μloptiMEM buffer中加入10μg总量质粒(目的基因质粒：5μg，pCMV-VSVG：3μg，psPAX2：2μg)配制成Ⅰ液，30μl Lipofectamine2000+500μl optiMEM配制成Ⅱ液，室温静置5min后，将Ⅰ液与Ⅱ液混匀，室温静置20min，加入到细胞中，培养箱中培养。转染72h后，收集培养液上清，即为含有病毒颗粒的培养液上清，放置于-80℃保存。

Abro1-KO/BRCC36-KO的纯合克隆的筛选：向HeLa细胞中滴加含有LentiCRISPRv2Abro1或LentiCRISPRv2 BRCC36或LentiCRISPRv2对照病毒颗粒的上清，并用含有10mmol/L puromycin的培养基进行筛选和稀释，10～15个细胞/10mm平皿。待每个克隆株长到约30个左右细胞时，用滤纸片吸附细胞放入含puromycin培养液的96孔板中，继续培养。最后通过Western Blot鉴定KO效果。

使用Abro1-KO和BRCC36-KO细胞系以及对照细胞CT(Control，即仅包含空载体的细胞系)并如上开展Western Blot，结果示于图5。结果显示，两株Abro1-KO细胞系中均未检测到Abro1，并且BRCC36蛋白水平也显著降低，BRCC36-KO细胞系中未检测到BRCC36蛋白，并且Abro1的蛋白水平也显著降低，这表明两个细胞系敲除成功，并且Abro1或BRCC36蛋白的敲除会影响到BRISC复合物其他蛋白质的稳定。但是Abro1-KO和BRCC36-KO细胞系中极光激酶B的蛋白质水平与对照细胞系相比没有差别，说明Abro1或BRCC36的缺失并不会影响极光激酶B的蛋白质水平。

接着，本发明人通过免疫荧光技术检测了Abro1-KO、BRCC36-KO以及对照细胞CT有丝分裂期时极光激酶B的磷酸化水平。将上述三种细胞种植于玻片上并生长后，加入30ng/mL的Nocodazole处理4h，洗脱释放25min进行Aurora B-pT232免疫荧光实验。对于每一种细胞系，随机选取20个细胞，每个细胞随机选取三个区域，用蔡司880分析荧光强度，然后制作柱状图，结果示于图6，其中ns表示无统计学差异；***表示p<0.001。结果表明，Abro1-KO或BRCC36-KO有丝分裂前期细胞中，Aurora B-pT232的荧光强度显著强于对照组细胞，说明BRISC复合物的缺失促进了极光激酶B的活化，因此BRISC复合物调节极光激酶B的激酶活性。

实施例4极光激酶B的K63连接泛素化位点的鉴定

为深入研究极光激酶B的K63连接的泛素化修饰发生的位点，本发明人开展了极光激酶B的K63连接的泛素化修饰位点的鉴定。以下使用的极光激酶B序列为极光激酶B变异体1序列参考号NP_001300879.1所示序列，位置K85、K87、K202、K211及其他位置均是指序列参考号NP_001300879.1所示序列的位置。

首先构建质粒Flag-Aurora B，具体构建方法如下：参考NM_001313950.2的AuroraB的核酸序列，利用软件Oligo 7.0进行引物的设计，引物序列如下。PCR扩增的全长cDNA亚克隆到质粒pcDNA3.1-Flag中。

在293T细胞中转染Flag-Aurora B和His-K63-Ub，然后利用anti-Flag-M2 beads进行免疫共沉淀，并对Flag-Aurora B的免疫沉淀物进行了质谱分析，结果发现位置K85、K87、K202以及K211是其潜在的K63类型泛素化修饰位点，结果示于图7。对这些位点进行了保守序列分析，发现K202在高等哺乳动物中高度保守，结果示于图8。上述结果表明K202可能是极光激酶B的主要的泛素化位点。

为了进一步验证K85、K87、K202和K211是否为K63类型泛素化修饰位点，本发明人开展了Ni-NTA pull-down实验。首先构建V5-His-Aurora B质粒以及V5-His-Aurora B-K85R、V5-His-Aurora B-K87R、V5-His-Aurora B-K202R、V5-His-Aurora B-K211R单突变体以及V5-His-Aurora B-K85/87R、V5-His-Aurora B-K202/211R双突变体质粒。V5-His-Aurora B质粒的构建如前文所述，各突变质粒的构建以V5-His-Aurora B模板、采用定点突变技术进行，构建中所应用的引物如下：

将所构建野生型质粒或各种突变体质粒分别与HA-K63-Ub共同转染293T细胞进行瞬时过表达，用30ng/mL的Nocodazole处理细胞至中期，收集细胞，进行Ni-NTA pull-down，对产物进行Western Blot检测，其中使用HA抗体检测K63-Ub，使用V5抗体检测转染表达的极光激酶B蛋白或单、双突变体。如上面实施例2和3中所证明，BRISC复合物缺失后，极光激酶B的K63连接类型的泛素化修饰显著增高，极光激酶B激酶高度活化，提示极光激酶B的K63连接的泛素化修饰可能影响极光激酶B的激酶活性。因此在该实验中，还同时检测了极光激酶B的磷酸化情况，即用抗T232磷酸化的抗体检测Aurora B-pT232。结果示于图9，其中WCL为全细胞裂解液，Ni-NTA为使用Ni-NTA pull-down的产物。

由图9可见，K202单位点以及K202/211双位点突变后细胞的泛素化水平显著降低，而单个K211位点的突变并不影响极光激酶B的K63泛素化水平，说明K202是极光激酶B的主要泛素化位点。下列实施例9中对极光激酶A、B和C的多序列比对分析后也发现，K211(以极光激酶B变异体1中位置)位点不是保守位置，在极光激酶B中是赖氨酸，而在极光激酶C中为氨基酸精氨酸R，在极光激酶A中为氨基酸丙氨酸A，这也从另一个方面证明极光激酶K211不是K63泛素化位点。从立体结构上看，K211(以极光激酶B变异体1中位置)位点恰恰处于铰链中，这也合理解释了为何K211不是K63泛素化位点。

当极光激酶B的K63连接泛素化水平降低(如K202R或者K202/211R突变体)时，极光激酶B的T232磷酸化水平也显著降低，并且出现上述情况时细胞内极光激酶B的总蛋白质水平(通过V5显示)并没有显著变化。这些结果表明极光激酶B的K202位置的K63泛素化促进极光激酶B激酶的活化。如上述实施例1所证明的那样，该实施例再次证明了极光激酶B的K63连接的泛素化修饰与其磷酸化水平正有关。

实施例5：Aurora B-K202对极光激酶B激酶活性的影响实验

为进一步验证极光激酶B的K202位点的K63连接泛素化影响极光激酶B的激酶活性，本发明人通过Flag-IP从HeLa细胞中纯化了Flag-HA-Aurora B以及Flag-HA-Aurora B-K202R蛋白，并将纯化的蛋白以组蛋白H3为底物，进行了体外磷酸化实验。

Flag-HA-Aurora B质粒的构建如实施例4所述，Flag-HA-Aurora B-K202R质粒在Flag-HA-Aurora B的基础上进行定点突变，定点突变时应用的引物序列如下：

K202R-F GGTGATTCACAGAGACATAAGGCCAGAAAATCTGC

K202R-R AGCAGATTTTCTGGCCTTATGTCTCTGTGAATCACC

如下纯化Flag-HA-Aurora B以及Flag-HA-Aurora B-K202R蛋白。293T细胞中瞬时过表达Flag-HA-Aurora B或Flag-HA-Aurora B-K202R，用30ng/mL Nocodazole处理细胞至中期，收集细胞用Flag Beads进行纯化，取部分纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，银染，结果示于图10。

然后将纯化的Flag-HA-Aurora B或Flag-HA-Aurora B-K202R蛋白与0.5μg H3蛋白进行体外磷酸化反应，反应条件为37℃下45min，然后分别使用抗Flag抗体、抗H3抗体、抗H3-pS10抗体和抗Aurora B-pT232抗体进行Western Blot检测极光激酶B、H3、H3-pS10、Aurora B-pT232。结果示于图11。

图10表明该实验成功纯化了Flag-HA-Aurora B以及Flag-HA-Aurora B-K202R蛋白，图11表明，经Flag-HA-Aurora B处理组的极光激酶B的磷酸化(以Aurora B-pT232标示)和H3的磷酸化(以H3-pS10标示)水平显著高于Flag-HA-Aurora B-K202R处理组，表明突变体Flag-HA-Aurora B-K202R的激酶活性显著低于野生型Flag-HA-Aurora B，极光激酶B的激酶活性依赖于其第202位的赖氨酸残基。

实施例6：极光激酶B的K202对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响实验

为了研究极光激酶B的K202对细胞的增殖、凋亡是否存在影响，本发明人开展了下述实验。

将质粒Flag-HA-Aurora B、Flag-HA-Aurora B-K202R或空载质粒Flag-HA-CT转染HeLa细胞系，消化细胞后按照30％的比例重新种植于培养皿，用含有10mmol/L Puromycin药物的培养液培养两周进行筛选，待细胞不再出现死亡后得到稳定的细胞系。经过鉴定，所得到的HeLa细胞系稳定表达Flag-HA-Aurora B野生型或Flag-HA-Aurora B-K202R突变型蛋白，Flag-HA-CT空载的稳定转染HeLa细胞系不表达外源极光激酶B，结果示于图12。

然后通过CCK8实验检测HeLa细胞的增殖能力。实验过程如下：将稳定转染的HeLa细胞以1000个/孔种植于96孔板内，每个样品设置5个复孔，16h后吸去培养基，加入100μL含CCK8的培养液(1:10)，继续培养1h。将96孔板放入酶标仪中，在450nm波长下测量吸光值，作为时间点0h的吸光值。此后四天在每一天的同一时刻进行吸去培养基和加入CCK8培养液的操作，并再培养1h后进行吸光值检测。将测定的吸光值进行统计学分析，实验结果示于图13。结果表明，24h时，表达Aurora B-K202R突变体的细胞与表达野生型极光激酶B的细胞和对照组细胞间的增殖能力无大差别；而在48h至72h时，表达Aurora B-K202R的细胞活力呈现下降趋势，此时显微镜下观察时发现细胞呈多核，许多细胞出现凋亡；在96h时，AuroraB-K202R有呈现出增殖的趋势，但其增殖能力显著低于表达野生型极光激酶B的细胞和对照组，表明Aurora B-K202R抑制细胞的增殖。

为进一步证实极光激酶B对肿瘤细胞增殖的影响，本发明人进行了平板克隆形成实验。将三种稳定转染的HeLa细胞以2500个细胞/皿种植于直径6cm的培养皿中，每组细胞设四个平行样，3天更换一次新鲜培养基，培养两周。然后弃培养基，PBS清洗1次，4％多聚甲醛室温固定20min。再用PBS清洗1次，用0.5％结晶紫染色5min，然后用超纯水清洗直至无背景。对三种细胞进行拍照，结果示于图14。结果显示，与对照组Flag-CT相比，过表达Flag-HA-Aurora B时，培养皿中细胞克隆显著增多，而过表达Flag-HA-Aurora B-K202R时，培养皿中形成的克隆显著减少。

使用Image J对图14中的细胞克隆数目进行统计并作图，结果示于图15。与对照组相比，过表达Flag-HA-Aurora B时，细胞克隆形成数目显著增多，而过表达Flag-HA-AuroraB-K202R时，形成的克隆数目显著减少。综合图14和图15的结果表明，表达Aurora B-K202R的HeLa细胞克隆形成能力降低，Aurora B-K202R抑制了细胞增殖。

同时，本发明人还通过流式分析检测了Aurora B-K202R对细胞凋亡的影响。将稳定转染三种HeLa细胞系按照40％密度种植于大培养皿中，培养36h，胰酶消化收集细胞，1000rpm/min离心5min，弃上清。用1mL预冷PBS重悬细胞沉淀，再离心5min，弃上清并收集细胞沉淀。用1mL预冷PBS重悬细胞沉淀，逐滴加入3mL预冷的乙醇-20℃固定过夜。离心收集细胞沉淀，用预冷PBS洗涤一次。用500μL预冷的PBS重悬细胞沉淀，然后加入5μL RNAase酶，37℃水浴1h。然后加入20μL PI染液混合均匀，上机检测。检测结果示于图16。结果显示，与对照组以及稳定表达Flag-HA-Aurora B的细胞相比，Flag-HA-Aurora B-K202R的凋亡比例显著增加。本实施例的实验结果表明极光激酶B第202位赖氨酸突变后，抑制肿瘤细胞的增殖，并促进细胞的凋亡。

实施例7：Aurora B-K202R对HeLa细胞药物敏感性的影响

紫杉醇(Taxol)能干扰细胞微管的解聚，其通过干扰微管的组装动态从而能够抑制包括肿瘤细胞在内的细胞的分裂，因此紫杉醇类是一种肿瘤抑制剂，可以作为药物用于肿瘤的治疗。

小分子AZD1152是一种高选择性的极光激酶抑制剂，作用于极光激酶A和极光激酶B的IC 50值分别为1.37μM和0.37nM。AZD1152是HQPA的二氢磷酸盐前药，是一种高度有效的和特异性的丝氨酸/苏氨酸激酶极光激酶抑制剂。

当极光激酶B第202位的赖氨酸发生突变时，其自身的激酶活性降低，影响细胞的有丝分裂，促进细胞凋亡。因此本发明人进一步设计实验以验证极光激酶B第202位的赖氨酸突变时与紫杉醇、AZD1152联用，是否能够导致这些药物对HeLa细胞的杀伤性增强，即Aurora B-K202R造成的极光激酶B激酶活性下降是否会出现使HeLa细胞对紫杉醇、AZD1152敏感性增加。

使用上述实施例中所述三种稳定转染HeLa细胞开展药物敏感性实验。分别将稳定表达Flag空载、Flag-HA-Aurora B或Flag-HA-Aurora B-K202R的HeLa细胞种植于96孔板，5000个细胞/孔，对于每个紫杉醇浓度设置5个复孔，细胞贴壁后加入0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6或0.8μg/mL浓度的紫杉醇处理24小时，然后如上述实施例6所述开展CCK8实验，测量细胞的存活能力。结果示于图17，随着紫杉醇浓度的升高，细胞的活力逐渐下降，在紫杉醇浓度为0.2μg/mL时，表达突变体K202R的HeLa细胞的存活能力与对照组和野生型出现显著差异。当浓度为0.4μg/mL时，表达突变体K202R的细胞的存活能力急剧下降，显著低于对照组和野生型，表明极光激酶B第202位赖氨酸突变时，增强了肿瘤细胞对肿瘤治疗药物紫杉醇的敏感性。

使用AZD1152开展相同的实验，分别将稳定表达Flag-HA-CT空载、Flag-HA-AuroraB或Flag-HA-Aurora B-K202R的HeLa细胞种植于96孔板，5000个细胞/孔，每个浓度设置5个复孔，细胞贴壁后加入0、0.2、0.4、0.6μg/mL浓度的AZD1152处理24小时，然后如上述实施例6所述开展CCK8实验，测量细胞的存活能力。结果示于图18，随着AZD1152浓度的升高，细胞的活力逐渐下降，在AZD1152浓度为0.4μg/mL时，表达突变体K202R的HeLa细胞的存活能力与对照组和野生型出现降低，表明极光激酶B第202位赖氨酸突变时，增强了肿瘤细胞对肿瘤治疗药物紫杉醇的敏感性。

实施例8：Aurora B-K202R突变影响激酶活化的作用机制

从蛋白质的结构上讲，蛋白激酶的活性状态主要由三个因素决定，即激活环(activation loop)、DFG基序(Asp-Phe-Gly motif)和αC-helix。DFG基序在“in”和“out”之间的构象转变是激酶活化或抑制的关键。即当DFG基序取“in”构象，即DFG-in时为活性构象，此时天冬氨酸向内旋转，ATP结合位点得以暴露，允许ATP结合进而活化激酶。当DFG基序取“out”构象，即DFG-out时为非活性构象，此时天冬氨酸从ATP结合口袋旋转出来，同时与之相连的苯丙氨酸旋转后暴露出一个疏水口袋，该口袋可以被一些抑制剂占据，从而抑制激酶的活化。

激活环交换(activation segment exchange)也是激酶自激活的机制之一。2012年，Elkins JM等(Elkins J M,Santaguida S,Musacchio A and Knapp S.Crystalstructure of human aurora B in complex with INCENP and VX-680.Journal ofmedicinal chemistry.2012,55(17):7841-7848)解析了极光激酶B和INCENP以及激酶抑制剂VX-680形成的晶体结构指出了其激酶晶体结构的交换环和DFG基序。本发明人利用在线工具(https://www.rcsb.org/3d-view/4AF3/1)，分析了K202在该复合物晶体结构中所处的位置，发现K202位点坐落于极光激酶B的激活环结构内，邻近位于激活环起始区域的DFG基序(图19)。因此，Aurora B-K202的K63连接的泛素化修饰促进极光激酶B活化的机制有两种：一，极光激酶B K202的K63泛素化链引起DFG基序构象改变，有利于极光激酶B的自激活，继而部分活化的极光激酶B对INCENP的TSS motif进行磷酸化，促进CPC复合物的形成及极光激酶B的全部活化；二，极光激酶B K202的K63泛素化链可为极光激酶B与INCENP的结合提供一个分子平台，促进二者的结合，促进其自磷酸化。

实施例9：三种极光激酶蛋白质序列比对

从NCBI蛋白质数据库中下载三种极光激酶的蛋白质序列，分别为极光激酶B变异体1(NCBI参考序列NP_001300879.1)、极光激酶B变异体2(NCBI参考序列NP_001243763.1)、极光激酶B变异体3(NCBI参考序列NP_001271455.1)、极光激酶B变异体4(NCBI参考序列NP_001300881.1)、极光激酶B变异体5(NCBI参考序列NP_001300882.1)、极光激酶C变异体1(NCBI参考序列NP_001015878.1)、极光激酶C变异体2(NCBI参考序列NP_001015879.1)、极光激酶C变异体3(NCBI参考序列NP_003151.2)、极光激酶A(NCBI参考序列NP_001310234.1)。然后使用NCBI的在线ClustalW工具(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)对这些极光激酶的蛋白质序列进行多序列比对，结果示于图20中，其中“*”表示所比较氨基酸序列相同，“:”表示氨基酸具有强保守性，“.”氨基酸具有弱保守性，本发明的赖氨酸位点用加框标示，催化区中一致序列DFGWSxxxxxxxRxTxCGTxDYLPPE用粗体标示，其中RxT中的苏氨酸磷酸化位点用粗体和下划线标示。

根据图20中比对结果分别对三种极光激酶的催化区进行同一性计算，催化区分别为极光激酶B变异体1第76-344位氨基酸、极光激酶B变异体2第35-303位氨基酸、极光激酶B变异体3第77-345位氨基酸、极光激酶B变异体4第36-304位氨基酸、极光激酶B变异体5第76-312位氨基酸、极光激酶A第132-403位氨基酸、极光激酶C变异体1第42-309位氨基酸、极光激酶C变异体2第23-290位氨基酸、极光激酶C变异体3第8-275位氨基酸。由于极光激酶B变异体5催化区第76-101位氨基酸比较特殊，因此计算时将极光激酶B变异体5排除在外。经计算发现催化区272个氨基酸(以极光激酶A催化区计算)中有178个氨基酸完全相同，同一性为65.44％，序列比较保守。重要的是，在所比较的序列中本发明的赖氨酸完全保守，催化区一致序列完全相同，其中间隔序列中仅4个氨基酸不同，并且本发明的赖氨酸位点与催化区一致序列之间的氨基酸间隔相同，且间隔序列也非常保守。因此可以推测出所比较的三种极光激酶的催化区能够形成相同或类似的二级结构，并且本发明的赖氨酸位点在所有极光激酶中以相同的方式影响一致序列中苏氨酸的磷酸化以及下游一系列效应。

Claims (16)

1.人极光激酶突变体蛋白，其是极光激酶B、极光激酶C或极光激酶A的突变体蛋白，其特征在于，SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，或者经过氨基酸序列比对对应于SEQ ID NO.1第202位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失。

2.权利要求1所述的人极光激酶突变体蛋白，其特征在于，SEQ ID NO.2第161位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，SEQ ID NO.3第203位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，SEQ ID NO.4第162位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，SEQ ID NO.5第170位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，SEQ ID NO.6第168位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，SEQ ID NO.7第149位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失，SEQ ID NO.8第134位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失或者SEQ ID NO.9第258位置上的赖氨酸被非赖氨酸替代或者缺失。

3.权利要求1或2所述的人极光激酶突变体蛋白，其特征在于，所述被非赖氨酸替代是被精氨酸或组氨酸替代。

4.一种突变体核酸，其编码权利要求1至3任一项所述的人极光激酶突变体蛋白。

5.一种载体，其包含权利要求4所述的突变体核酸。

6.一种鉴定权利要求1至3所述突变体蛋白或权利要求4所述突变体核酸的工具，包括针对权利要求1至3任一项所述人极光激酶突变体蛋白的特异性抗体或其抗原结合片段、针对权利要求4所述突变体核酸的引物对或探针。

7.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的人极光激酶突变体蛋白，或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体。

8.权利要求7所述的药物组合物，其还包括治疗肿瘤的药物。

9.权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述治疗肿瘤的药物是干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或极光激酶抑制剂。

10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物是紫杉醇及其类似物、紫杉特尔、多西他赛、高三尖杉酯碱、长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙碱、角秋水仙碱、异秋水仙碱、鬼臼毒素及其类似物、喜树碱、长春花碱及其类似物、埃博霉素或伊沙匹隆，所述极光激酶抑制剂是CYC-116、极光激酶A抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-IN-2、SCH-1473759、TAK-901、MLN8054、KW-2449、逆转素、TAK-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶A抑制剂1、MK-5108、Tripolin A、AT9283、ZM-447439、酞嗪酮吡唑、Tinengotinib、AMG 900、阿立塞替、阿立塞替钠、PF-03814735、极光激酶抑制剂1、NU6140、极光激酶抑制剂3、TC-A2317盐酸盐、GSK-1070916、AS-703569、LY3295668、极光激酶抑制剂-9、CCT241736、Derrone、达鲁舍替、ABT-348、ABT-348盐酸盐、SNS-314、极光激酶抑制剂-10、ENMD-2076、CD532、Hesperadin、AZD1152、AZD2811、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、Chiauranib、JNJ-7706621、MK-8745、PHA-680632、TC-S 7010、BI-847325、BI-831266、BI-811283、TAS-119、JAB-2000、VIC-1911、JS112、JAB-2485。

11.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤是血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、CD30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌。

12.一种用于预测患有肿瘤的患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)测定所述患者样品中是否表达如权利要求1至3的突变体蛋白；和/或

(b)测定所述患者样品中是否存在如权利要求4的突变体核酸；

(b)若(a)中测定结果确定患者样品中表达如权利要求1至3的突变体蛋白和/或(b)中测定结果确定患者样品中存在如权利要求4的突变体核酸，则患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物的治疗发生响应。

13.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物是紫杉醇及其类似物、紫杉特尔、多西他赛、高三尖杉酯碱、长春碱类如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、秋水仙碱、角秋水仙碱、异秋水仙碱、鬼臼毒素及其类似物、喜树碱、长春花碱及其类似物、埃博霉素或伊沙匹隆，所述极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物是CYC-116、极光激酶A抑制剂2、陶扎色替、极光激酶-IN-2、SCH-1473759、TAK-901、MLN8054、KW-2449、逆转素、TAK-901、极光激酶抑制剂-2、极光激酶A抑制剂1、MK-5108、Tripolin A、AT9283、ZM-447439、酞嗪酮吡唑、Tinengotinib、AMG900、阿立塞替、阿立塞替钠、PF-03814735、极光激酶抑制剂1、NU6140、极光激酶抑制剂3、TC-A 2317盐酸盐、GSK-1070916、AS-703569、LY3295668、极光激酶抑制剂-9、CCT241736、Derrone、达鲁舍替、ABT-348、ABT-348盐酸盐、SNS-314、极光激酶抑制剂-10、ENMD-2076、CD532、Hesperadin、AZD1152、AZD2811、AAPK-25、CCT129202、CCT-137690、Chiauranib、JNJ-7706621、MK-8745、PHA-680632、TC-S 7010、BI-847325、BI-831266、BI-811283、TAS-119、JAB-2000、VIC-1911、JS112、JAB-2485，所述患有肿瘤的患者是患有血液系统的恶性肿瘤(包括白血病、髓性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓样纤维化、髓样化生、霍奇金淋巴瘤、非何杰金氏白血病、非何杰金氏淋巴瘤、CD30+淋巴瘤、复发/难治性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、、转化的滤泡性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、Waldenstrom's巨球蛋白血症)、实体瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌)、结肠肿瘤(包括但不限于结肠癌、结直肠癌、直肠癌)、胰腺肿瘤(包括但不限于胰腺癌)、膀胱肿瘤(包括但不限于膀胱癌)、前列腺癌、肺癌(包括但不限于非小细胞肺癌、转移性和复发性非小细胞肺癌、小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、输卵管肿瘤(包括但不限于输卵管癌)、肝细胞癌、腹膜癌、头颈部鳞状细胞癌、胃食管腺癌、骨髓纤维化、黑色素瘤、神经母细胞瘤、成人间质性星形细胞瘤、成人巨细胞胶质母细胞瘤、粘液纤维肉瘤、平滑肌瘤、脂肉瘤、软组织肉瘤、恶性周围神经鞘肿瘤、未分化的多形性肉瘤、子宫肉瘤、结肠粘液腺瘤、直肠粘液腺瘤、肝母细胞瘤、儿童的横纹肌瘤、儿童肾肿瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌或胃癌的患者。

14.一种筛选治疗肿瘤的候选药物的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(a)设置对照细胞组和测试细胞组，其中测试细胞组的细胞表达权利要求1至3所述的人极光激酶突变体蛋白，或者测试细胞组的细胞包含权利要求书4所述的人极光激酶突变体核酸或权利要求5所述的载体；

(b)分别向对照细胞组和测试细胞组加入测试药物；

(c)分别检测对照细胞组和测试细胞组的细胞增殖速度；

(d)若测试细胞组的细胞增殖速度小于对照细胞组的细胞增殖速度，则所测试药物选择作为用于治疗肿瘤的候选药物。

15.权利要求1至3所述突变体蛋白或权利要求4所述突变体核酸用于预测患有肿瘤的患者对干扰微管聚合或解聚的抗肿瘤药物或人极光激酶抑制剂类抗肿瘤药物治疗响应的用途或用于筛选治疗肿瘤的候选药物的用途。

16.极光激酶抑制剂，其特征在于，其与权利要求1-3的人极光激酶突变体蛋白的结合亲和力高于其与人极光激酶野生型蛋白的结合力。

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