CN115948453B

CN115948453B - 同时表达3个非融合外源蛋白病毒载体TRVeΔCP的构建法

Info

Publication number: CN115948453B
Application number: CN202211022069.5A
Authority: CN
Inventors: 廖乾生; 郭歌; 赖家良; 夏涛
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2025-07-15
Anticipated expiration: 2042-08-25
Also published as: CN115948453A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体包括基于烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)构建在整个植物中同时快速表达3个非融合外源蛋白的构建方法。本发明公开一种利用TRV基因组RNA2中的3个SGP驱动3外源基因在整个植物中同时表达病毒载体TRVeΔ^CP的构建方法。TRVeΔ^CP在番茄中不产生明显的症状反应，携带3个外源基因的TRVeΔ^CP系统性侵染寄主植物，并同时表达目的蛋白。本发明首次利用缺失替换和病毒亚基因组翻译策略构建在整个寄主植物中同时快速、高含量表达3个非融合蛋白的植物病毒载体TRVeΔ^CP。

Description

同时表达3个非融合外源蛋白病毒载体TRVeΔCP的构建法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体包括基于烟草脆裂病毒(tobacco rattlevirus,TRV)构建在整个植物中同时快速表达3个非融合外源蛋白的构建方法。

背景技术

随着大量植物基因组测序的完成，迫切需要一个好的载体或技术来快速地分析基因组中新基因或预测蛋白的生物学功能。目前，研究功能未知的基因或蛋白是最主要通过转基因技术在植物中表达目的蛋白以证实其功能，但转基因操作繁琐、周期长及物种限制等制约因素，目前利用植物病毒表达载体表征蛋白的生物学功能日益成为一种趋势，在植物功能基因组学的研究中发挥了及其重要的作用。

病毒复制/翻译效率高在植物中产生大量病毒蛋白，并且基因组小易操，大量植物病毒被用作构建外源蛋白表达载体的来源。马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是是目前最常用病毒表达载体，其构建策略为在病毒的基因组中插入相同病毒或同一属病毒不同成员的外壳蛋白(coat protein，CP)亚基因组启动子(subgenomic promotor，SGP)来驱动外源基因的mRNA转录，利用病毒亚基因组翻译策略表达目的蛋白，但PVX和TMV载体只能在整个植物表达单个非融合外源蛋白。目前越来越多的基础和应用植物生物学的研究，如由多种蛋白质组成复合物的功能鉴定、药物抗体或多肽的生产，需要在同一个单细胞内同时过表达多个基因，TMV和PVX表达载体均无法满足这一需求。在PVX和TRV的基因组中插入2个CP SGP而构建的双元表达载体，可以在植物中同时表达2个非融合外源蛋白，由于多个额外的SGP引起序列冗余，很容易造成病毒基因组结构不稳定，随着时间的推移外源插入的基因在植物中逐渐丢失，因此这2个病毒载体不能在植物中长时间稳定表达2个外源蛋白。甜菜坏死黄脉病毒(beet necrotic yellow veinvirus，BNYV)的基因组由5个RNA分子组成，采用肽酶切割病毒融合蛋白策略构建同时表达4个外源蛋白的载体，但该病毒载体只能在植物的接种叶中表达外源蛋白，不能够系统性移动，并且外源的目的蛋白一端还有肽酶的氨基酸残基。基于马铃薯Y病毒属(potyvirus)多聚体蛋白水解翻策略、一个开放阅读框(open reading frame，ORF)翻译成的单个多聚蛋白水解成多个病毒功能蛋白，将外源基因插入P1/HC-Pro、HC-Pro/NIb和NIb/CP之间的马铃薯病毒A(potato virus A，PVA)大豆花叶病毒(soybean mosaic virus，SMV)和芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus，TuMV)等病毒而构建的表达载体，可以在整个寄主植物中同时表达多个外源蛋白，但这些重组病毒携带外源基因后对寄主植物的症状发展起到了意想不到的负面作用、外源序列的插入破坏病毒基因组结构完整性、融合共翻译加工对靶蛋白的内在活性和/或亚细胞定位产生非预期的影响等众多的不足。目前已报到多个基于负链RNA病毒构建多个外源蛋白的表达载体，可以在整个寄主植物中同时产生多个非融合的外源蛋白，但这些表达系统存在一定的缺点：如，异源蛋白的表达需要较长时间、病毒基因组大不利于遗传操作以及病毒接种过程复杂等。目前，国内外还没有较好的病毒载体能够在整个植物中同时快速表达3种非融合外源蛋白。

TRV是烟草脆裂病毒属(Tobravirus)的典型成员，寄主范围泛，能侵染超过400多种植物，包括模式植物拟南芥、本氏烟和重要农作物番茄、棉花等。TRV为正义单链RNA(+single strand RNA，+ssRNA)病毒，基因组由RNA1和RNA2分子组成。RNA1编码的4个蛋白参与病毒的复制、移动及症状产生；RNA2通过亚基因组策略编码CP、27kDa的2b和18kDa的2c蛋白。TRV中2b和2c基因完全缺失，病毒还能在植物中的复制、系统性移动。目前TRV被应用于构建病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)载体、表达2个外源蛋白载体和转录基因编辑的指导RNA。

发明人所在团队早期申请的发明《利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法》(申请号202110836772.9)告知了：基于TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156，通过基因缺失策略构建含有TRV的2b和2c SGP的载体pTRV2e³，获得通过TRV自身的2个SGP在整个本氏烟中同时表达2个非融合外源蛋白重组病毒TRVe³。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在整个植物、同时快速表达3个非融合外源蛋白的病毒载体TRVeΔ^CP的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时表达3个非融合外源蛋白病毒载体TRVeΔ^CP的构建法(同时表达3个非融合外源蛋白载体pTRV2eΔ^CP的构建法)：在同时表达2个非融合外源蛋白的载体pTRV2e³的基础上，采用基因缺失策略构建包含TRV的CP、2b和2cSGP载体pTRV2eΔ^CP。

即，本发明通过TRV基因组RNA2的3个SGP分别产生外源插入蛋白的mRNA，并利用寄主植物的蛋白翻译系统快速、高含量表达3个目的蛋白，pTRV2eΔ^CP中基因组RNA2的大小为1496bp，序列如SEQ ID NO:1所述。

本发明的同时表达3个非融合外源蛋白载体pTRV2eΔ^CP的构建方法：

利用质粒pTRV2e³，在载体pTRV2e³中缺失TRV基因组RNA2中CP基因ORF序列、并插入多克隆位点，获得含有多克隆位点(multiple clone site，MCS)1、2和3的载体pTRV2eΔ^CP。

即，利用重组质粒pTRV2e³，在pTRV2e³载体中缺少TRV的CP基因的ORF序列，并引入酶切位点，获得在CP、2b和2c SGP下游均含有含有克隆位点的载体pTRV2eΔ^CP。

本发明还同时提供了利用上述pTRV2eΔ^CP制备通过CP、2b和2c SGP在整株番茄中分别表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组TRV，以及能同时表达TMV外壳蛋白(CP)、拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶(GapC)和GFP的病毒TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP，包括以下步骤：

1)、通过3对含有不同酶切位点引物分别PCR扩增GFP，目的产物分别割胶回收，并通过相应双酶切克隆至质粒pTRV2eΔ^CP，获得3个载体pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3和pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP；

2)PCR扩增TMV的CP的ORF，双酶切连接至至质粒pTRV2eΔ^CP中，获得pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3；

3)PCR扩增拟南芥GapC、双酶切克隆至质粒pTRV2eΔ^CP中，获得载体pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3；

4)、将步骤2)所得经双酶切TMV CP的PCR产物，克隆至步骤1)所得载体pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP；获得质粒pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-GFP；

将步骤3)所得经双酶切GapC的PCR产物连接至载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-GFP，获得载体pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP；

5)、将步骤4)所得的pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP转化至农杆菌GV3101中，并与农杆菌pTRV1混和后获得病毒TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP。

说明：

在上述步骤5)中，本发明将pTRV2eΔ^CP、pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP、pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP分别转化至农杆菌GV3101中，并与农杆菌pTRV1按照1∶1混和后，分别浸润接种于番茄的2片子叶；

在病毒TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3和TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP浸润接种番茄的上部系统叶均能观察到绿色荧光表型，并通过蛋白杂交能特异性地检测GFP。

病毒TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP侵染的番茄上部系统叶能观察到绿色荧光表型，并通过蛋白杂交中能同时检测到CP、GapC和GFP。

即，设定了pTRV2相关载体的农杆菌转化，并各自与农杆菌pTRV1混和浸润接种于番茄；记录缺失CP的重组病毒TRVeΔ^CP在番茄中侵染活性、重组病毒TRVeΔ^CP中各个SGP分别表达GFP情形、及在寄主系统叶中同时表达非融合的CP、GapC和GFP的分子检测结果。

在本发明中：

提取TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP侵染植株系统叶中总蛋白用于Western blot分析，在病毒侵染的番茄中能特异性同时检测到CP、GapC和GFP。

本发明还同时提供了上述方法构建所得外源蛋白表达载体TRVeΔ^CP的用途：TRVeΔ^CP在寄主植物中引起轻花叶的症状反应，携带3个外源基因的TRVeΔ^CP-CP-RFP-GFP在整个植株同时表达CP、GapC和GFP；

所述TRVeΔ^CP由pTRV1和pTRV2eΔ^CP组成；

所述TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3组成；

所述TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3组成；

所述TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP组成；

所述TRVeΔ^CP-CP-MCS2-MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3组成；

所述TRVeΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3组成；

所述TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP组成。

本发明以申请号202110836772.9专利中载体pTRV2e³为材料，通过缺失CP基因的ORF，构建含有CP、2b和2c SGP的载体pTRV2eΔ^CP；重组病毒TRVeΔ^CP接种寄主植物后，通过3个亚基因组启动子分别系统性地表达不同的非融合外源蛋白。

本发明以质粒pTRV2e³为材料，采用基因缺失策略构建包含TRV的CP、2b和2c亚基因组启动子载体pTRV2eΔ^CP；在载体pTRV2eΔ^CP的各个SGP下游分别插入3不同外源基因，并构建在番茄中整个植株中同时表达3个非融合蛋白的病毒载体TRVeΔ^CP。

本发明以载体pYL156、Ppk20、pTRV2e¹和TRV2e²的TRV基因组RNA2作为对照，详细信息分别见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF406991、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/Z36974和申请号为202110836772.9的专利。

TRV基因组RNA2所编码CP、2b和2c是由3条病毒亚基因组RNA分子所翻译而来，且RNA2中缺失2b和2c，病毒还是系统性侵染众多寄主植物。本发明将载体pTRV2e³中的CP的ORF缺失，并引入多克隆位点，获得质粒pTRV2eΔ^CP。在载体pTRV2eΔ^CP中TRV基因组RNA2中完全缺失了CP、2b和CP的ORF，只保留了各个的亚基因组启动子。重组病毒TRVeΔ^CP侵染植物后由基因组RNA2复制后产生4条RNA分子，即基因组RNA2、由CP SGP产生的亚基因组RNA，由2b SGP产生亚基因组RNA和2c SGP亚基因组RNA。本发明通过病毒TRVeΔ^CP的RNA2中3个SGP来产生外源蛋白的mRNA，并利用植物蛋白翻译系统表达3个目的非融合蛋白。

本发明的技术方案具体如下：

1、在pTRV2e³载体缺失CP的ORF，并引入多克隆位点获得pTRV2eΔ^CP载体；

说明：pTRV2e¹和pTRV2e³制备方法在专利202110836772.9中有明确告知。

2、将质粒pTRV2eΔ^CP转入到农杆菌GV3101后，并与农杆菌pTRV1按照1∶1比例混合共同浸润接种于2片子叶期番茄，TRVeΔ^CP在寄主植物中不引起明显的症状；以TRV、TRVe¹、和TRVe³为对照，观察寄主植物接种后表型变化。

3、在载体pTRV2eΔ^CP中MCS1、MCS2和MCS3位点中分别插入GFP获得载体pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3和pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP。

4、构建载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP，其中CP为为TMV外壳蛋白基因，GapC为拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶基因。

5、pTRV2相关质粒的农杆菌转化，并分别与TRV1混和共同浸润番茄；接种10d，观察并记录番茄的症状反应、GFP荧光表型和病毒基因组的RNA杂交检测，结果表明：重组病毒TRVeΔ^CP系统性侵染番茄，CP、2b和2c SGP均能驱动GFP在整个番茄植株中表达。

6、番茄总蛋白提取，蛋白电泳、转膜与杂交检测，重组病毒TRVeΔ^CP在植株中表达外源蛋白情形，蛋白杂交显示：TRVeΔ^CP载体在整个番茄植株中能同时表达CP、GapC和GFP。

本发明基于TRV构建在番茄整个植株中同时快速表达3个非融合外源蛋白的病毒载体TRVeΔ^CP。在重组病毒TRVeΔ^CP基因组RNA2中CP、2b和2c的ORF完全缺失，均保留3个SGP顺式作用元件序列，缺失区域用不同外源基因代替而不其结构完整性。所具有的技术优势是：基于病毒繁殖效率高，并能够系统性移动的特点，TRVeΔ^CP在整个寄主植物中快速高含量表达3个非融合的外蛋白。

综上所述，本发明采用植物病毒表达载体中的缺失替换和病毒亚基因组翻译策略，利用TRV构建在整个植株中同时快速、高含量表达3个非融合的外源蛋白的病毒载体。

本发明公开一种利用TRV基因组RNA2中的3个SGP驱动3外源基因在整个植物中同时表达病毒载体TRVeΔ^CP的构建方法。TRVeΔ^CP在番茄中不产生明显的症状反应，携带3个外源基因的TRVeΔ^CP系统性侵染寄主植物，并同时表达目的蛋白。本发明首次利用缺失替换和病毒亚基因组翻译策略构建在整个寄主植物中同时快速、高含量表达3个非融合蛋白的植物病毒载体TRVeΔ^CP。

本发明具有如下有益效果：1)本发明采用植物病毒表达载体的缺失置换构建策略；完全缺失TRV基因组RNA2中的CP、2b和2c基因的ORF，并用3个外源基因替代，从而不影响病毒基因组结构完整性；2)TRVeΔ^CP在番茄不引起明显的症状，携带3个外源基因后能系统性扩展至整个植株，在寄主植物表达外源蛋白具有表达量高和表达时间快特点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为pTRV2相关载体中TRV基因组RNA2结构示意图；

图2为TRV、TRVe¹、TRVe³和TRVeΔ^CP浸润接种番茄10d引起的症状反应对比图；

图3为TRV、TRVe¹、TRVe³和TRVeΔ^CP基因组RNA2的Northern blot照片图；

图3中，rRNA为28s RNA，用于确定总RNA的上样量；

图4为TRVeΔ^CP各个SGP驱动GFP表达的示意图；

图5为浸润接种10d，利用TRVeΔ^CP中CP、2b和2c SGP分别表达GFP后在番茄植株的荧光照片图；

图6为浸润接种10d，蛋白杂交检测TRVeΔ^CP各个SGP驱动GFP表达的照片图；

图6中，Rubisco为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose bisphosphatecarboxylase oxygenase，Rubisco)的大亚基，用于确定植物总蛋白的上样量；

图7为重组病毒TRVeΔ^CP在寄主植物同时表达CP、GapC和GFP的载体示意图；

图8为Western blot检测TRVeΔ^CP在整个番茄中同时表达CP、GapC和GFP的照片图；

图8中，Rubisco为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose bisphosphatecarboxylase oxygenase，Rubisco)的大亚基，用于确定植物总蛋白的上样量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、pTRV2eΔ^CP载体构建

以质粒pTRV2e³材料，其制备方法在专利202110836772.9中有明确告知。通过PCR缺失质粒pTRV2e³中RNA2的CP，获得pTRV2eΔ^CP载体。

以质粒pTRV2e³为模板，通过引物对P1/P2进行PCR扩增获得f1，通过引物对P3/P4进行PCR扩增获得f2，2个PCR扩增片段割胶回收，HindⅢ/XbaⅠ双酶切载体pTRV2e³并割胶。按照产物使用说明书，PCR产物1、2和HindⅢ/XbaⅠ酶切pTRV2e³载体通过Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme)连接在一起，并转化至大肠杆菌中，获得载体pTRV2eΔ^CP。

PCR扩增片段1的反应体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P1/P2(10μmol/L)各2μL，pTRV2e³模板10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，58℃45s，72℃45s，35个循环，72℃5min。

PCR扩增片段2的反应体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P3/P4(10μmol/L)各2μL，pTRV2e³模板10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，60℃45s，72℃10s，35个循环，72℃5min。

引物P1：TTGGGCCCGGCGCGCCAAGCTTG

引物P2：TGATTGATCGTACAAATCTCCCTTGTTGATTAGCGCAAGTGATTCAGTAAC

引物P3：

GATAGGTACGATGAATCAactagtCTCGAGgagctcGGTCCGATACGTCCTAATCCCTAG

引物P3中带下划线的依次为SpeⅠ、Xho I和SacⅠ酶切位点；

引物P 4：TAACGCGTGAATTCTCTAGAAAGC；

pTRV2eΔ^CP制备过程中所涉及的载体pYL156、pTRV2e¹、pTRV2e³在专利202110836772.9中有明确告知，本发明制备所得的pTRV2eΔ^CP及相关载体中TRV基因组RNA2结构示意图见图1。

实施例2、表达外源蛋白的pTRV2eΔ^CP相关载体构建

2.1构建CP、2b和2c SGP分别表达GFP的载体

通过3对含有不同酶切位点引物PCR扩增GFP，目的片段分别割胶回收，并分别通过SpeⅠ/SacⅠ、XbaⅠ/MluⅠ和BamHⅠ/SmaⅠ克隆至载体pTRV2eΔ^CP中，获得载体pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3和pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP，(见载体示意图4)。GFP大小为717bp，序列如SEQ ID NO:2。

PCR扩增GFP反应体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，引物对P5/P6、P7/P8或P9/P10(10μmol/L)各2μL，GFP模板10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，58℃25s，72℃30s，35个循环，72℃5min。

载体pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3对应的引物：

引物P5：GactagtATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG

引物P6：GCgagctcCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCAT；

pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3对应的引物：

引物P7：GCtctagaATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG

引物P8：CGacgcgtCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCAT

pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP对应的引物：

引物P9：CGggatccATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG

引物P10：TCCcccgggCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCAT

上述引物中的小写字母代表酶切位点，以下类同。

2.2同时表达3个外源蛋白相关载体的构建

构建CP SGP驱动TMV的CP克隆表达的载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、2b SGP驱动三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GapC)表达载体pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和同时表达3个外源蛋白的载体pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP，载体示意图见图7。

2.2.1载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3载体的构建

TMV的CP大小为480bp，序列如SEQ ID NO:3。

PCR扩增TMV的CP反应体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，引物对P11/12(10μmol/L)各2μL，TMV的CP模板10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，60℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。PCR产物割胶回收，通过SpeⅠ/SacⅠ双酶切克隆至载体pTRV2eΔ^CP，获得载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3。

引物P11：GactagtATGCCTTATACAATCAACTCTCCGAG；

引物P12：GCgagctcCTAAGTAGCCGGAGTTGTGGTCC。

2.2.2载体pTRV2eΔ^CP-MCS2-GapC-MCS3的构建

拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GapC)的序列大小为1017bp，序列如SEQ ID NO:4。

PCR扩增拟南芥的GapC反应体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，引物对P13/14(10μmol/L)各2μL，拟南芥GapC模板10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH₂O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min。PCR产物割胶回收，通过XbaⅠ/MluⅠ双酶切克隆至载体pTRV2eΔ^CP，获得载体pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3。

引物P13：GCtctagaATGGCTGACAAGAAGATCAGAATC

引物P14：cgACGCGTctaagcgtaatctggaacatcgtatgggtaGGCCTTTGACATGTGAACG”，

引物P14中带下划线的为HA标签序列。

2.2.3 pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP载体构建

将2.2.1所得经SpeⅠ/SacⅠ酶切TMV CP的PCR产物连接至2.1所得的质粒pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP，获得载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-GFP；

将2.2.2中XbaⅠ/MluⅠ双酶切的拟南芥GapC的PCR产物克隆至pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-GFP，获得pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP载体。

实施例3、pTRV2相关载体的农杆菌转化和培养

质粒pTRV2eΔ^CP、pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP、pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP转化农杆菌GV3101分别获得农杆菌pTRV2eΔ^CP、pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP、pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP。其中农杆菌pTRV1、pYL156、pTRV2e¹和pTRV2e³及其活化、扩大培养和菌体收集的具体方法参照发明专利201810261990.2。所有过夜扩大培农杆菌培养液通过5000r/min离心5min收集菌体；5mL浸润接种缓冲液(10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES和200mmol/L acetosyringone)悬浮菌体，5000r/min离心5min，弃上清；最后用浸润接种缓冲液将各个菌体浓度调至OD₆₀₀为0.2。因此，此实施例3最终所得产物分别为农杆菌pTRV2eΔ^CP、pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP、pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP。

实施例4、农杆菌浸润接种

分别取实施例3所得的OD₆₀₀为0.2的pYL156、pTRV2e¹、pTRV2e³、pTRV2eΔ^CP、pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP、pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP农杆菌菌液5mL分别与5mL浓度为0.2OD₆₀₀的pTRV1农杆菌混和；农杆菌混和物在室温黑暗预处理4h，通过无针头1mL灭菌注射器浸润2片子叶番茄的叶片背部，所有接种植物置于25℃、光照期16h黑暗8h植物生长室培养。

其中，

pTRV1与pYL156农杆菌混和物为病毒TRV，

pTRV1与pTRV2e¹农杆菌混和物为病毒TRVe¹，

pTRV1与pTRV2e³农杆菌混和物为TRVe³，

pTRV1与pTRV2eΔ^CP农杆菌混和物为病毒TRVeΔ^CP，

其它病毒的命名以此类推；即：

pTRV1与pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3农杆菌混和物为TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3；

pTRV1与pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3农杆菌混和物为TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3；

pTRV1与pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP农杆菌混和物为TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP；

pTRV1与pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3农杆菌混和物为TRVeΔ^CP-CP-MCS2-MCS3；

pTRV1与pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3农杆菌混和物为TRVeΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3；pTRV1与pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP农杆菌混和物为TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP。

实施例5、重组TRV在番茄症状反应

病毒TRV、TRVe¹、TRVe³和TRVeΔ^CP分别浸润接种于2片子叶期番茄的子叶，以浸润缓冲液接种作为对照Mock；10d后寄主植物的症状反应为：在TRVe¹、TRVe³和TRVeΔ^CP引起轻花叶表型，而TRV则引起番茄顶端的系统叶产生坏死症状(见图2)，本发明所构建的重组病毒TRVeΔ^CP在番茄中未引起明显的症状，有利于其在植物中高效表达外源目的蛋白。

实施例6、寄主中TRV基因组RNA的Northern blot检测

农杆菌浸润接种10d，分别取病毒TRV、TRVe¹、TRVe³和TRVeΔ^CP侵染番茄上部系统叶0.1g，用Trizol提取植物总RNA，方法参考Trizol产品说明书进行。TRV基因组转膜和杂交方法参考地高辛标记检测试剂盒II(Roche,Switzerland)的产品使用说明书，杂交探针为互补于RNA2的3'端一段核苷酸(5'-CTTCAGACACGGATCTACTTAAAGAACCGTAGTTTAATGTCTTCGGGAC-DIG-3')，由上海生物工程有限公司合成。

RNA杂交检测结果显示：

对照Mock接种寄主植物中检测不到病毒基因组RNA，TRV、TRVe¹、TRVe³和TRVeΔ^CP侵染植物系统叶均检测到病毒基因组RNA，并且4个病毒基因组含量没有明显的差别；在TRV与TRVe¹侵染的植物产生3条RNA分子(基因组RNA2、CP亚基因组RNA和2b亚基因组RNA)，TRVe³和TRVeΔ^CP侵染寄主植物后产生基因组RNA2、CP亚基因组RNA、2b亚基因组RNA和2c亚基因组RNA(见图3)。以上结果证实了TRVeΔ^CP能系统性侵染番茄，并且产生3个亚基因组RNA分子。

实施例7、在番茄中TRVeΔ^CP各个SGP驱动GFP表达呈现的荧光表型观察

TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3和TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP接种番茄10d，在暗室中用长波型手提便携式紫外灯(Black Ray model B 100AP/R,Upland,USA)观察各个病毒接种植株的系统叶中荧光表型，结果如图5所示。图5显示：3个携带GFP的在TRVeΔ^CP番茄中产生绿色荧光表型，而对照TRVeΔ^CP接种和Mock的植株观察不到GFP表型。以上结果表明病毒TRVeΔ^CP中CP、2b和2c SGP均能驱动GFP的表达。

实施例8、Western blot分析TRVeΔ^CP在寄主中表达外源蛋白

农杆菌浸润接种10d，分别取病毒TRVeΔ^CP、TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP、TRVeΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3和TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP接种番茄系统叶0.1g，液氮研磨志粉末状，加入含2％的β-巯基乙醇的PBS缓冲液研磨至均一状液体，离心后取上清并加入2×loading buffer，95℃水浴煮10min，10000r/min 5min，取上清备用。蛋白转膜、抗体杂交和底物显色的方法参考精编分子生物学实验指南(第三版)，所用抗体为特异性针对GFP、TMV CP和HA标签的多克隆抗体。

在TRVeΔ^CP、TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP侵染寄主植物的系统叶样品中，GFP抗体可特异性检测到目的条带，而对照接种TRVeΔ^CP番茄中检测不到GFP信号(见图6)，进一步说明CP、2b和2c SGP均能驱动GFP在整个寄主中表达。

为了确定重组病毒TRVeΔ^CP能否在番茄中同时表达3个外源蛋白，TRVeΔ^CP-CP-MCS2-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3、TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP和TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP浸润接种番茄10d，分别提取各个病毒侵染的系统叶总蛋白用于Western blot检测，结果图8所示。图8显示：TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP侵染的番茄系统叶能同时检测到CP、GapC和GFP，携带单个外源基因的TRVeΔ^CP侵染只能够检测到一个目的蛋白，表明重组病毒TRVeΔ^CP在寄主植物中能同时快速表达3个非融合的外源蛋白。

需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.同时表达3个非融合外源蛋白病毒载体pTRVeΔ^CP的构建法，其特征是：以同时表达2个非融合外源蛋白的载体pTRV2e³为材料，采用基因缺失策略构建包含TRV的CP、2b和2c亚基因组启动子载体pTRV2eΔ^CP；

pTRV2eΔ^CP中基因组RNA2的大小为1496 bp，序列如SEQ ID NO:1所述；

利用重组质粒 pTRV2e³，在pTRV2e³载体中缺少TRV的CP基因的ORF序列，并引入酶切位点，获得在CP、2b和2c SGP下游均含有克隆位点的载体pTRV2eΔ^CP。

2.利用如权利要求1所述的载体pTRV2eΔ^CP制备能同时表达烟草花叶病毒（TMV）CP蛋白、拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶GapC和GFP的病毒TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP的方法，其特征是包括以下步骤：

1）、PCR通过扩增3对含不同酶切位点的引物，PCR扩增GFP，PCR产物经不同的双酶切后分别克隆至载体pTRV2eΔ^CP中，获得pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3、pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3和pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP；

2）、PCR扩增TMV的CP的ORF，双酶切连接至质粒pTRV2eΔ^CP中，获得pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-MCS3；

3）、PCR扩增拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GapC）、双酶切克隆至质粒pTRV2eΔ^CP中，获得载体pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC-MCS3；

4）、将步骤2）所得经双酶切CP的PCR产物克隆至步骤1）所得的载体pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP中，获得pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-GFP；

将步骤3）所得经双酶切GapC的PCR产物克隆至载体pTRV2eΔ^CP-CP-MCS2-GFP，得到载体pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP；

5）、将步骤4）所得的pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP转化至农杆菌GV3101中，并与农杆菌pTRV1混和后获得病毒TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP。

3.如权利要求1所述方法构建所得的外源蛋白病毒载体pTRVeΔ^CP的用途，其特征是：TRVeΔ^CP在寄主植物中引起轻花叶的症状反应，携带3个外源基因的TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP在整个植株同时表达烟草花叶病毒（TMV）CP蛋白、拟南芥三磷酸甘油醛脱氢酶GapC和GFP。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征是：

所述TRVeΔ^CP由pTRV1和pTRV2eΔ^CP组成；

TRVeΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3由pTRV1和 pTRV2eΔ^CP-GFP-MCS2-MCS3组成；

TRVeΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3由pTRV1和 pTRV2eΔ^CP-MCS1-GFP-MCS3组成；

TRVeΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP由pTRV1和 pTRV2eΔ^CP-MCS1-MCS2-GFP组成；

TRVeΔ^CP-CP-MCS2-MCS3由pTRV1和 pTRV2eΔ^CP- CP-MCS2-MCS3组成；

TRVeΔ^CP-MCS1-GapC- MCS3由pTRV1和 pTRV2eΔ^CP-MCS1-GapC- MCS3组成；

TRVeΔ^CP-CP-GapC-GFP由pTRV1和pTRV2eΔ^CP-CP-GapC-GFP组成。