CN115927201A

CN115927201A - 治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115927201A
Application number: CN202211581547.6A
Authority: CN
Inventors: 董磊; 徐金芝; 王珍珍
Original assignee: Xishan Institute Of Applied Biotechnology Nanjing University Wuxi
Current assignee: Xishan Institute Of Applied Biotechnology Nanjing University Wuxi
Priority date: 2022-12-06
Filing date: 2022-12-06
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了一种治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法，所述可移植细胞株为将人干细胞株通过动物体内组织微环境诱导而成。还公开了上述的治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法制得的可移植细胞株，以及可移植细胞株在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。本发明利用体内组织的独特性，使得一类干性细胞最终增殖分化成可移植治疗脊髓损伤的细胞，这种方法可以高效、便捷、安全地获得大量可移植细胞，用于解决以往细胞移植中细胞来源和数量受限的问题，为脊髓和其它神经损伤治疗提供了一种新的可能性。

Description

治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

脊髓损伤是由于车祸、坠落、撞击等外因的作用，导致脊髓病变的中枢神经损伤，而神经系统一旦损伤病变，很难进行再生和修复。长期以来，脊髓损伤主要通过手术来恢复脊髓的稳定性，或通过药物、高压氧等抑制其继发性损伤，但这些方法只能在一定程度上减轻患者症状，在神经功能方面并未得到根本改善。针对这一情况，通过细胞移植来取代受损细胞和促进神经再生修复被认为是非常有效及有前途的方法。

为治疗脊髓损伤，研究领域已试验了不同的治疗策略，包括细胞疗法、生物材料移植、生长因子等，其中细胞移植，是期望通过神经元与轴突再生形成新的神经元电路来促进脊髓再生，从而恢复脊髓功能。目前，已有研究证明细胞移植为包括脊髓损伤在内的多种不同神经疾病的治疗提供了可能性，但如何安全、方便、大量地获取细胞，成为细胞移植治疗脊髓损伤的重点与难点。

目前可用作细胞移植的主要有神经干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、嗅鞘细胞、肌源性干细胞、雪旺细胞等。各种干细胞具备分化潜能，可以分化为神经元和神经胶质替代坏死细胞，恢复脊髓功能。

脊髓损伤是高致残、致死率的一种疾病，且多集中在青年与中年人，会给患者及其家庭带来生活、精神、经济等方面的巨大负担。目前临床上较为有希望的干细胞移植前处理，均需要较高的培养条件以及昂贵的培养添加物，且时间周期长，细胞量很难一次性大量获取。而我们的发明将细胞植入小鼠组织中进行体内增殖诱导培养，时间相对较短，并且可以同时大量获取。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法，所述可移植细胞株为将人干细胞株通过动物体内组织微环境诱导而成。

优选的，所述体内组织微环境诱导是指将人干细胞株注射到动物体内组织，而后继续饲养动物而成。

优选的，体内诱导的时间为2～5天。

优选的，所述人干细胞株是指诱导型多能干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、人胚胎肾上皮细胞HEK-293T或人间充质干细胞。

优选的，所述动物体内组织包括脾脏、脊髓、脑、睾丸、肾脏或肝脏。

本发明还公开了上述的治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法制得的可移植细胞株。

本发明还公开了上述的可移植细胞株在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

优选的，所述脊髓损伤为不完全性脊髓损伤。

本发明还公开了一种治疗脊髓损伤的的组合物，其特征在于包括上述的可移植细胞株、水凝胶、生理盐水。

优选的，可移植细胞的含量在10⁴个/μL以上。

更优选的，可移植细胞的含量为5×10⁴个/μL至5×10⁸个/μL。

本发明利用体内组织的独特性，使得一类干性细胞最终增殖分化成可移植治疗脊髓损伤的类神经前体细胞，这种方法可以高效、便捷、安全地获得大量可移植细胞，用于解决以往细胞移植中细胞来源和数量受限的问题，为脊髓和其它神经损伤治疗提供了一种新的可能性。

附图说明

图1、植入细胞后，对不同时间点体内组织进行石蜡包埋，并切片做苏木精-伊红染色，标尺，25μm。

图2、在植入细胞的2天、5天、7天分别从组织内提取细胞，体外培养2周，绘制各组细胞的细胞生长曲线图。

图3、脊髓损伤模型细胞移植治疗后各组的行为学评分曲线。

具体实施方法：

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。

实施例1：

1.可治疗脊髓损伤的细胞悬液制备：

将人胚胎肾上皮细胞HEK-293T细胞株扩增到合适数量后，离心弃上清，重悬成细胞悬液。

将小鼠麻醉后，用微量注射器将上述细胞悬液注射到小鼠一侧睾丸，随后观察小鼠的状态，待小鼠恢复正常状态后，继续回笼饲养。

随后每隔24小时观察小鼠的状态并收取睾丸组织样，每个时间点收取5只小鼠的睾丸，观察其形态和体积是否有变化，并将组织样固定24小时，石蜡包埋，进行病理切片，做苏木精-伊红染色，睾丸组织内部的病理生理变化。

如图1所示，植入的HEK-293T细胞在睾丸间质中不断生长增殖，随后会破坏并占据睾丸本身的结构。在植入2天或者5天后，细胞仍能增殖，且能保持HEK-293T细胞的一些特征；细胞至植入7天时，细胞几乎遍布整个睾丸，且形态发生明显变化，表现出神经细胞的特征；从细胞植入10天到14天，睾丸结构遭到进一步破坏，出现免疫细胞的浸润，植入细胞的数量也不断减少。

取植入HEK-293T细胞后各个时间点的睾丸组织样进行组织匀浆，得到的匀浆液进行分离纯化，获得诱导后的可移植细胞株，对其进行纯化培养，每24小时换液，并进行增殖曲线的绘制，待细胞纯净后，观察其形态。

如图2所示，对照组细胞在这一培养条件下，细胞数量逐渐减少，在培养至14天时，几乎没有细胞存活。2天与5天提取的细胞则符合HEK-293T细胞的生长曲线，经历了潜伏期、指数生长期、平稳期和衰亡期，说明2天与5天提取出的细胞并未完全分化，仍可以增殖。相对地，7天时提取的细胞数量基本维持在一个稳定的水平，表明此时的细胞已经完全分化，不再具备增殖能力。因此，我们选取在体内诱导2-5天的细胞用于细胞移植。将HEK-293T植入小鼠睾丸2-5天后，将组织样剥离，匀浆，分离纯化后，获得可用于脊髓损伤治疗的细胞悬液。

此外，我们对体内诱导增殖2或者5天提取的细胞进行增殖率计算，如表1-2所示，因小鼠个体差异较大，得到约20％-50％的增殖率。

增殖率计算方法如下：

增殖率＝(增殖后的细胞-植入的细胞数)/植入细胞数

2天细胞的增殖率如下表1所示：

表1体内诱导增殖2天的细胞增殖率(以植入2x10⁶个细胞计算)

5天细胞的增殖率如下表2所示：

表2体内诱导增殖5天的细胞增值率

本实施例确定了HEK-293T细胞可在睾丸中进行增殖分化，能直接获得增殖诱导过后的细胞，用于治疗脊髓损伤。且只用到小鼠的一只睾丸，对小鼠的机体伤害不大。

2.上述所制备的细胞悬液在脊髓损伤模型中的应用

制作脊髓损伤大鼠模型(T10半横断模型)，配制2％戊巴比妥钠溶液，按照大鼠体重40mg/kg腹腔注射进行麻醉，俯卧位固定，背部脱毛。准确定位大鼠脊髓T9-T11部位。依次剪开大鼠背部皮肤、脂肪、粘膜，剥离肌肉，暴露棘突与椎板。利用椎板咬骨钳小心咬除T9-T10棘突与椎板，暴露脊髓。以脊髓中间静脉为分界点，用手术刀横断右侧脊髓。明胶海绵与纱布止血，依次缝合。

取SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠40只，体重200-250g，将大鼠随机分为四组，实验分组如表3，设正常对照组，假手术组，脊髓损伤组，细胞治疗组，每组10只大鼠。正常对照组不做处理，假手术组用咬骨钳将大鼠脊椎T10部位椎板咬除，脊髓损伤组将大鼠脊椎T10部位椎板咬除后，横断右侧脊髓，细胞治疗组将制备好的适量细胞悬液，移植到脊髓损伤大鼠的脊髓右侧损伤处。观察各组大鼠的状态，并进行行为学评分，确定其恢复情况。

表3大鼠模型实验分组：

	正常对照组	假手术对照组	脊髓损伤对照组	细胞治疗组
					暴露脊髓	否	是	是	是
不完全损伤	否	否	是	是
					立即植入细胞	否	否	否	是

如图3所示，正常对照组大鼠6周时间内后肢运动功能保持稳定，躯干稳定，步态协调，无运动障碍表现。假手术组大鼠在前两周运动功能逐渐恢复，2周后趋于稳定，运动功能基本恢复到接近正常水平，活动过程中偶有躯干不稳定。不完全脊髓损伤后1周，细胞治疗组与脊髓损伤组都无可见后肢运动，1周后运动功能开始恢复。前4周，细胞治疗组与脊髓损伤组大鼠后肢运动功能均有所恢复，且两组差别不大。脊髓损伤组大鼠在第四周时后肢功能不再恢复，出现损伤侧掌面的承重移动，但无前后肢协调动作，之后基本保持稳定。细胞治疗组大鼠后肢运动功能持续恢复，在第5周恢复到接近正常水平并保持稳定。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法，其特征在于将人干细胞株通过动物体内组织微环境诱导而成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述体内组织微环境诱导是指将人干细胞株注射到动物体内组织，而后继续饲养动物而成。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于体内诱导的时间为2～5天。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述人干细胞株是指诱导型多能干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、人胚胎肾上皮细胞HEK-293T或人间充质干细胞。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述动物体内组织包括脾脏、脊髓、脑、睾丸、肾脏或肝脏。

6.权利要求1-5中任一项所述的治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法制得的可移植细胞株。

7.权利要求6所述的可移植细胞株在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述脊髓损伤为不完全性脊髓损伤。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于可移植细胞株与水凝胶、生理盐水混合制成细胞悬液。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于细胞悬液中可移植细胞的含量在10⁵个/μL以上。