CN115894336A - 一种克酮酸双吲哚类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化合物技术领域，提供了一种克酮酸双吲哚类化合物及其制备方法和应用，本发明提供的具有特定结构的克酮酸双吲哚类化合物，结构中含有克酮酸基团、吲哚基团和吗啉基团，克酮酸基团使得化合物结构更加稳定同时还具有更长的紫外吸收，吲哚基团赋予化合物pH值响应，吗啉基团具有良好的溶酶体靶向机制，本发明提供的克酮酸双吲哚类化合物兼具靶向溶酶体、pH值响应性、近红外‑光声双模态成像、光热治疗的特性，而且毒副作用小，可用于肿瘤的成像和治疗研究，尤其是乳腺癌细胞。

Description

一种克酮酸双吲哚类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化合物技术领域，更具体地，涉及一种克酮酸双吲哚类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

癌症的早期诊断是提高癌症患者治愈率的关键，研究特异性强、灵敏度高的检测技术用于肿瘤早期诊断是非常有意义的。光学成像技术，特别是近红外荧光成像技术，因其吸收波长和发射波长均处于生物光学成像窗口，具有组织穿透能力强、生物组织的光吸收及自身荧光干扰小等优势而备受青睐。同时，在成像技术的发展和优化过程中，光声成像(PAI)已成为临床前生物医学诊断和癌症检测的有力工具，PAI探针可以改善造影度，帮助识别致病组织。因此近红外和光声双模态成像技术在肿瘤细胞早期诊断成像领域更具优势。

一直以来，癌症都严重威胁着人类的生命健康，而传统的治疗方法，包括手术、化疗和放疗等都各有不足，因此新型治疗方法例如光热治疗、光动力治疗的优越性便体现出来了。常见的光热剂分为无机材料和有机材料，无机光热剂在体内难以代谢，生物相容性差，而有机小分子光热剂的稳定性好、结构简单、光学性能可调和、生物相容性良好，被认为是用于治疗的理想探针。由此，开发可对肿瘤细胞实现近红外和光声双模态成像及光热治疗的有机小分子，用于制备效果更加显著的诊疗一体化试剂是非常有意义的。

另一方面，肿瘤酸性微环境可作为靶向给药的靶标。合适的pH值在细胞生长、代谢过程中具有重要作用，而异常的pH值会引起细胞的紊乱。细胞内溶酶体的pH值在4.6-5.5内，而其异常可能影响生物的正常生长，并引起一系列相关疾病。因此，实时监测溶酶体pH值对于溶酶体相关的生物学过程和疾病的诊断具有重要意义。克酮酸染料作为一种近红外染料，实际上具有双重性质，在生理条件下，细胞外的pH值约为7.4，使其分子保持碱性结构；由于非特异性胞吞途径，分子的吸收主要通过内吞作用，溶酶体内pH值将达到5.5，这意味着在这种条件下的酸性结构分子在细胞内将具有较高波长吸收。此外，克酮酸染料具有较强的抗光漂白性，具有良好的化学稳定性和热稳定性，是理想的光热转换剂。因此，开发一种兼具pH值响应性、溶酶体靶向性、可联合近红外和光声成像及光热治疗肿瘤的特性的探针，对进行肿瘤成像和治疗研究是非常有意义的。

现有技术公开的双吲哚化合物，例如式(Ⅳ)化合物(中国专利CN105503831A)和式(Ⅴ)化合物(ACS Sens.2021,6,2141-2146)，具有良好的pH值响应和近红外成像功效，但并无报道其具有靶向溶酶体、光声成像和光热治疗肿瘤功效；式(Ⅵ)双吲哚化合物(中国专利CN105693590A)，为pH值敏感性的光热试剂，但并无靶向溶酶体及近红外-光声双模态成像报道；式(Ⅶ)双吲哚化合物(CN111592482A)，为pH值响应型光热/光动力/荧光一体化试剂，但并无靶向溶酶体及光声成像报道；式(Ⅷ)双吲哚化合物(中国专利CN111592482A)，为pH值响应型光热/光动力/荧光一体化试剂，但并无靶向溶酶体及光声成像报道。现有技术公开的克酮酸双吲哚化合物胶束，其结构式如式(V)所示(Adv.Healthcare Mater.2021,10,2002115)，可用于光声成像和光热治疗，但无pH值响应、靶向溶酶体和近红外成像报道。克酮酸双吲哚化合物胶束，其结构是如式(Ⅸ)所示(Biomaterials 2021,267,120454)，可用于pH值响应、近红外-光声成像及光热治疗，但无靶向溶酶体功效。上述两种克酮酸双吲哚化合物胶束中引入长链的聚醚化合物，以增大其在肿瘤细胞中的聚集浓度，但是像聚醚这类外源性物质的大量引入，有可能引发一些未知的毒副作用。

因此，亟需开发一种兼具pH值响应性、溶酶体靶向性、近红外-光声双模态成像、光热治疗，同时毒副作用小的肿瘤诊疗一体化制剂。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种克酮酸双吲哚类化合物及其制备方法和应用，本发明提供了一种有机克酮酸光热小分子，是一种单纯的有机小分子化合物，在细胞中具有较高的聚集浓度，既具备靶向溶酶体的pH值响应特性，通过对细胞微环境的响应，实现对肿瘤细胞溶酶体的识别，还可以实现近红外-光声双模态成像，在近红外光照下，还可以对肿瘤进行光热治疗，尤其是乳腺癌细胞，对于开发毒副作用更小的肿瘤诊疗一体化制剂的研究具有非常重要的意义。

本发明的第一方面提供一种克酮酸双吲哚类化合物。

具体地，一种克酮酸双吲哚类化合物，具有如下式(Ⅰ)所示分子结构：

本发明提供的克酮酸双吲哚类化合物，是一种克酮酸菁染料，式(Ⅰ)化合物结构中包括克酮酸部分、吲哚部分和吗啉基团，其中克酮酸部分作为一个强吸电子基团，跟两边的供电子基团形成较长的共轭体系，具有更长的紫外吸收，长波长的光在治疗过程穿透性更强；而且克酮酸小分子的中心环状体系的共轭单元，还增大了分子的刚性和空间位阻，不利于单线态氧的进攻，使得本发明的克酮酸菁染料比一般的菁染料更稳定；吗啉基团存在光诱导电子(PET)荧光猝灭机制，含有吗啉基团的染料能够很好地对pH值进行检测，并且吗啉基团具有良好的溶酶体靶向机制，使染料能够有效地对细胞溶酶体中的pH值进行检测；吲哚部分可用于pH值响应；由于克酮酸双吲哚类化合物的紫外和荧光光谱位于近红外区，因此还可用于近红外和光声双模态成像；克酮酸双吲哚类化合物还具备较好的光热转化效果，可用于肿瘤的光热治疗研究。本发明提供的有机小分子，在克酮酸染料上链接吗啉环、吲哚基团，兼具pH值响应、靶向溶酶体、联合可近红外-光声双模态成像及光热治疗肿瘤的特性，对于肿瘤成像和治疗研究非常有意义。

本发明的第二方面提供一种克酮酸双吲哚类化合物的制备方法。

一种克酮酸双吲哚类化合物的制备方法，包括如下步骤：

将式(Ⅱ)化合物和式(Ⅲ)化合物混合分散于溶剂中，在惰性气氛中，发生克脑文盖尔缩合反应，制得所述克酮酸双吲哚类化合物；

所述式(Ⅱ)化合物具有如下分子结构：

所述式(Ⅲ)化合物具有如下分子结构：

    

优选地，所述克脑文盖尔缩合反应(Knoevenagel反应)的反应温度为80-130℃，反应时间为6-12h。

优选地，所述式(Ⅱ)化合物和式(Ⅲ)化合物的摩尔比为1：0.5-2。

优选地，所述溶剂为甲苯和/或正丁醇。

更优选地，所述溶剂为甲苯和正丁醇的混合溶液。

优选地，所述甲苯和正丁醇的混合溶液中，甲苯和正丁醇的体积比为1：1-3。

优选地，所述发生克脑文盖尔缩合反应后，还包括纯化的步骤。

优选地，所述纯化的步骤包括：

除去反应液溶剂，将固体物质进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，除去洗脱液中的有机溶剂后，制得所述克酮酸双吲哚类化合物。

优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和/或甲醇。

更优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂。

进一步优选地，所述有机溶剂为体积比为200：1-15的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂。

优选地，所述收集洗脱液为收集二氯甲烷：甲醇的体积比为200：7的洗脱液。

优选地，所述惰性气氛为氮气、氩气、氦气中的一种或几种。

本发明的第三方面提供一种克酮酸双吲哚类化合物的应用。

一种克酮酸双吲哚类化合物在制备靶向细胞中的溶酶体制剂中的应用。

一种克酮酸双吲哚类化合物在制备对肿瘤细胞pH值响应制剂中的应用。

一种克酮酸双吲哚类化合物在制备肿瘤细胞近红外-光声双模态成像制剂中的应用。

一种克酮酸双吲哚类化合物在制备肿瘤细胞光热治疗制剂中的应用。

一种pH响应型溶酶体靶向的近红外-光声双模态成像和光热治疗一体化诊疗剂，包括所述克酮酸双吲哚类化合物制得。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供了一种具有特定结构的克酮酸双吲哚类化合物，结构中含有克酮酸基团、吲哚基团、吗啉基团，克酮酸基团使得化合物结构更加稳定同时还具有更长的紫外吸收，吲哚基团赋予化合物pH值响应，吗啉基团具有良好的溶酶体靶向机制，本发明提供的克酮酸双吲哚类化合物兼具靶向溶酶体、pH值响应性、近红外-光声双模态成像、光热治疗的特性，而且毒副作用小，可用于肿瘤的成像和治疗研究，尤其是乳腺癌细胞；

(2)本发明提供的克酮酸双吲哚类化合物可用于制备pH响应型的、溶酶体靶向的、可近红外-光声双模态成像且可光热治疗的一体化诊疗剂，用于肿瘤的诊断和治疗中，提高癌症的治愈率。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物在不同pH值的紫外吸收光谱图；

图2为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物在不同pH值的荧光光谱图；

图3为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物的在不同pH值条件下的光声强度变化图；

图4为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物的光热性能图；

图5为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物在4T1细胞中的内吞和近红外成像情况图；

图6为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物对4T1肿瘤细胞靶向溶酶体细胞成像图；

图7为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物对不同pH值的4T1肿瘤细胞在不同激发波长下的细胞成像图；

图8为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物对4T1肿瘤细胞的光声成像图；

图9为本发明实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物在不同浓度不同pH值下非光照或光照下对4T1肿瘤细胞的光热治疗图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

一种克酮酸双吲哚类化合物，具有如下式(Ⅰ)所示分子结构：

上述克酮酸双吲哚类化合物的制备方法，包括如下步骤：

1、将4-肼基苯甲酸和3-甲基-2-丁酮按照摩尔比1：3加入到圆底烧瓶中，加入冰醋酸(AcOH)作为溶剂。110℃下加热回流12小时，然后冷却至室温，并在减压条件去除溶剂；粗产物经柱色谱(二氯甲烷：甲醇的体积比＝40：1)进一步纯化，得到纯的灰黄色固体化合物2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸。在搅拌条件下，将化合物2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(1eq)溶解于冷的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，依次添加2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(1.08eq)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(2.2eq)，搅拌30分钟后，加入4-(2氨基乙基)吗啉(2.2eq)，搅拌反应24h。反应完成后，加入冷蒸馏水，用二氯甲烷(DCM)萃取，收集有机层加入适量无水硫酸钠干燥，浓缩后粗产物经柱色谱(二氯甲烷：甲醇的体积比＝50：3)进一步纯化，得到2,3,3-三甲基-5-[(2-吗啉乙基)氨甲酰]-2H吲哚(式(Ⅱ)化合物)；

2、将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚与克酮酸按照摩尔比1：1加入到圆底烧瓶中，加入丙酮：水体积比＝1:1的混合溶剂，于50℃下搅拌反应，薄层色谱法(TLC)监测反应；反应完成后过柱分离，得到产物颜色为紫色；洗脱溶剂为体积比＝50:2的二氯甲烷：甲醇，得到产物5-[(1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-2-)亚甲基]-2-羟基-3,4-二氧环戊-1-烯醇化物(式(Ⅲ)化合物)；

3、称取上述制得的76.6mg 5-[(1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-2-)亚甲基]-2-羟基-3,4-二氧环戊-1-烯醇化物(式(III)化合物，0.23mmol)和84mg 2,3,3-三甲基-5-[(2-吗啉乙基)氨甲酰]-2H吲哚(式(II)化合物，0.26mmol)加入到25mL三颈烧瓶中，加入4mL甲苯和8mL正丁醇，连接冷凝管，通氮气，在110℃条件下加热回流搅拌5h，溶液颜色从黄色变成黑褐色，反应结束后，停止加热，将溶液冷却到室温后，减压旋干溶剂，将得到的固体用二氯甲烷和甲醇混合溶剂(二氯甲烷：甲醇体积比＝200：7)作为洗脱剂，200-300目硅胶作为固定相，柱层析洗脱分离提纯后，得到黑褐色固体，制得具有式(Ⅰ)分子结构的克酮酸双吲哚类化合物，是一种克酮酸菁染料，并命名为CR-630(39mg，27％)。

对化合物CR-630的结构进行鉴定，具体数据如下：

核磁氢谱¹H NMR(DMSO,400MHz):δ8.37(s,1H),8.23(d,J＝7.6Hz,1H),8.08(d,J＝6.4Hz,1H),7.96(s,1H),7.89(br,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.67(t,J＝7.2Hz,1H),7.55(t,J＝7.2Hz,1H),7.45(dd,J＝8.0Hz,6.4Hz,1H),6.28(s,1H),5.86(s,1H),3.60(br,6H),3.42(br,4H),2.25(br,2H),1.76(s,6H),1.50(s,6H).

核磁碳谱¹³C NMR(DMSO,100MHz):δ190.8,166.7,166.2,156.3,146.3,131.4,130.7,130.2,128.5,128.0,127.5,123.1,122.4,121.2,119.2,66.4,57.7,53.8,53.6,36.8,22.8,15.7.

质谱ESI-MS:m/z 631.3([M+H]⁺).

以上结果证明所制得的克酮酸双吲哚类化合物确实具有式(Ⅰ)所示分子结构。其中DMSO为二甲基亚砜。

应用例

一种pH响应型溶酶体靶向的近红外-光声双模态成像和光热治疗一体化诊疗剂，采用实施例1制得的克酮酸双吲哚类化合物作为原料制得。

产品效果测试

一、CR-630溶液对pH值的响应性

1、配制不同pH值(分别为2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的伯瑞坦-罗宾森(Britton–Robinson)缓冲液，CR-630用DMSO配制成浓度为100μM的母液，取100μL母液和900L不同pH值的缓冲液配制成1mL的CR-630溶液。利用紫外可见光分度计测量pH值从2.0-9.0变化时其紫外吸收光谱的变化，其结果图1所示。其中，图1a小分子溶液在不同pH值下的紫外吸收光谱图，从图1a中可以看出，随着pH值从2.0-9.0不断增大，CR-630的吸收光谱产生变化，其位于697nm和768nm处的峰不断减弱，而在610-629nm处出现了一个新的峰且强度不断增强。进一步分析小分子溶液的吸光度值比值A768nm/A610 nm随pH值的变化图，如图1b所示，图1b为小分子溶液的吸光度值比值A768nm/A610 nm随pH值的变化图，由图可以看出，吸光度值比值在4.0-6.5的pH值范围内发生明显变化，说明CR-630溶液在pH值为4.0-6.5范围内具有良好的pH值响应能力，而肿瘤细胞具有弱酸环境，染料CR-630对于肿瘤细胞内的pH值响应具有良好的应用前景。其中图1中Absorbance为吸光度，Wavelength为波长。

2、配制不同pH值(分别为2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的Britton–Robinson缓冲液，CR-630用DMSO配制成浓度为100μM的化合物溶液，取100μL化合物溶液和900L不同pH值的缓冲液配制成1mL的CR-630溶液。利用荧光光谱仪测量pH值从2.0-9.0变化时分别在激发波长750nm和600nm时的荧光光谱图，如图2所示，其中，图2a为CR-630溶液激发波长为750nm时，在不同pH值下的荧光光谱图；图2b为CR-630溶液激发波长为600nm时，在不同pH值下的荧光光谱图；图2c为CR-630溶液的荧光强度比值I790 nm/I710nm随pH值的变化图。从图2a可以看出，以750nm作为激发波长，随着pH值的不断增大，其荧光强度不断减弱；从图2b可以看出，以600nm作为激发波长，随着pH值的增大，其荧光强度逐渐增大。进一步地，从图2c可以看出，荧光强度比值I790 nm/I710nm在4.0-6.5的pH值范围内发生明显变化，说明CR-630溶液的pH值响应在4.0-6.5的酸性范围内。综合上述结果可知，CR-630在pH值4.0-6.5的范围内的紫外和荧光都有明显的变化。其中图2中Wavelength为波长，Fluorescence intensity为荧光强度。

二、CR-630溶液的光声强度和影响因素

将CR-630化合物在PBS中配制成不同浓度(0-160μM)的溶液，然后使用多光谱光声断层成像系统中评估化合物的光声成像效果，如图3a所示，图3a为小分子溶液在不同浓度下pH值6.0的光声谱图，由图可以看出，随着CR-630浓度的不断增大，其光声强度逐渐增大。然后，评估CR-630在不同pH值溶液中的光声效果，取不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)的Britton–Robinson缓冲液加入化合物后配制成80μM的溶液，测试其光声效果，测试范围680-860nm，结果如图3b所示。图3b为小分子溶液在80μM下不同pH值的光声强度柱状图，由图可以看出，在5.0-7.0的酸性环境中，CR-630显示出更高的光声强度，说明CR-630对光声强度也具有pH值敏感性。

三、CR-630的光热性能

通过改变CR-630溶液浓度、激光功率及溶液pH值来检测溶液的温度变化。CR-630用DMSO配制成浓度为1mM的母液，用Britton–Robinson缓冲液配制所需浓度的CR-630溶液，使用808nm激光器照射使温度上升，使用近红外成像仪来检测温度实时变化。结果如图4所示，图4a为CR-630溶液在不同浓度下pH值6.0和1.0W/cm²的808nm激光照射下的溶液温度随时间的变化图，图4b为CR-630溶液在25μM和pH值6.0时不同激光照射功率下的溶液温度随时间的变化图；图4c为CR-630溶液在25μM和1.0W/cm²的808nm激光照射下不同pH值的溶液温度变化随时间的变化图。如图4a所示，当激光功率为1.0W/cm²时，随着溶液中化合物浓度由0到50μM，其所能达到的温度也逐渐升高并稳定，说明CR-630具有浓度依赖性光热转换效应。同时也能看出，对于中等浓度25μM激光功率为1.0W/cm²照射2min，溶液温度可以达到45℃，照射6min，溶液温度可以达到60℃，显示了优异的光热转换效果。如图4b所示，固定CR-630溶液浓度，改变激光器的功率，随着功率的增大，化合物所能达到的温度也增加。如图4c所示，当固定溶液浓度为25μM和功率为1.0W/cm²时，改变溶液的pH值，从图可以看出，当化合物处于酸性条件下时其光热转化效率最佳。其中图4中Temperature为温度，Time为时间。

四、CR-630在小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)中的内吞和近红外成像情况

将4T1细胞(8×10⁴个)接种在共聚焦皿中后培养24h，与化合物(10μM)孵育不同时间(0、0.5、1、3、6、9h)，除去带有药物的培养基，加入PBS后在共聚焦激光扫描显微镜(型号为LSM 880with Airyscan)上，选用激发波长633nm，发射波长范围650-800nm下对4T1细胞进行共聚焦成像，结果如图5所示。从图可以看出，当孵育0.5h后，4T1细胞就呈现出明显的红色荧光(图5中CR-630使细胞染色为红色)，随着孵育时间的逐渐延长，荧光强度逐渐增大，当孵育时间达到6h时，荧光强度值达到最大。这些结果说明CR-630具有良好的细胞内吞能力，可用于细胞快速染色和孵育6h的高质量近红外成像。

五、CR-630对细胞中酸性细胞器溶酶体的靶向性

4T1细胞(8×10⁴个)接种在共聚焦皿中后培养24h，与化合物(10μM)孵育6h，然后将靶向细胞核、溶酶体和线粒体分别用赫斯特荧光染料3334(Hoechst 33342)、溶酶体绿色荧光探针(Lyso-Tracker Green)、线粒体绿色荧光探针(Mito-Tracker Green)不同的商业染料分别孵育20min，用共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像，选用激发波长：蓝光405nm、绿光488nm和红光633nm，实验结果如图6所示(其中细胞核染色是蓝色，溶酶体和线粒体染色是绿色，CR-630化合物染色是红色)。从图可以看出，CR-630对细胞核的皮尔森系数(R)无法计算(No positive correlations found)，对线粒体和溶酶体的皮尔森系数分别为0.43和0.84。这个结果说明CR-630对细胞中的酸性细胞器溶酶体具备明显的靶向识别性。其中，图6中，Nucleus为细胞核，Lysosomes为溶酶体，Mitochondria为线粒体，Tracker为追踪，Merged为混合。

六、CR-630对肿瘤细胞的pH值响应性

将4T1细胞与化合物(10μM)在不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的培养液中孵育6h，加入Hoechst 33342孵育20min，处理后分别用561nm和633nm的激发波长在共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像，实验结果如图7所示。图7a为CR-630对不同pH值下的4T1肿瘤细胞在λ_ex＝405nm和λ_ex＝633nm激发波长下的细胞成像图；图7b为CR-630对不同pH值下的4T1肿瘤细胞在λ_ex＝405nm和λ_ex＝561nm激发波长下的细胞成像图。由图7a可以看出，在λ_ex＝633nm下，随着pH值的逐渐增大，红色荧光逐渐减弱；由图7b可以看出，在λ_ex＝561nm下，随着pH值的逐渐增大，红色荧光逐渐增强。这些结果说明CR-630对4T1细胞具有pH值敏感性。其中图7中，Control为控制组，Merged为混合，Nucleus为细胞核。

七、CR-630对肿瘤细胞的光声成像能力

将4T1细胞接种在六孔板中，培养24h，将培养基除去，用含CR-630(20μM)的新鲜培养基跟细胞共孵育6h后，除去培养基，PBS洗涤，胰酶消化分离后离心，用热琼脂糖溶液(2％)0.5mL重悬到离心管中，冷却后进行光声成像，实验结果如图8所示，由图可以看出，CR-630在4T1细胞中比琼脂糖、单独的细胞产生更强的光声强度(PA Intensity)。其中图8中，Agarose为琼脂糖，cells为细胞，max为最大，min为最小。

八、CR-630对肿瘤细胞的光热治疗效果

将两组处于指数生长期的4T1细胞接种于96孔板(5000个细胞/100μL/每孔)，在37℃、5％CO₂的恒温培养箱中孵育24h，弃去培养基，分别加入含CR-630浓度梯度(0-10μM之间)及不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)培养基100μL，每个浓度做3个复孔，黑暗组继续在培养箱孵育24h；光照组在加入药物12h后用808nm细胞光毒性照射仪用1.0W/cm²的功率照射10min后放入培养箱继续培养12h，然后两组均用标准MTT法测定细胞活力，实验结果如图9所示。图9a为CR-630在不同浓度不同pH值下非光照下对4T1肿瘤细胞的光热治疗图；图9b为CR-630在不同浓度不同pH值下光照下对4T1肿瘤细胞的光热治疗图。由图9a可以看出，在0-10μM的浓度范围，以及不同的pH值下，如果没有激光照射，4T1仍保持高的细胞活性，说明CR-630具备低的暗毒性。由图9b可以看出，在激光照射下，CR-630光热杀死肿瘤存在明显的浓度和pH值依赖性，在pH值5.5-6.5范围内，CR-630显示出更高的肿瘤杀伤效果，当[CR-630]≈4μM时，有75％的肿瘤细胞被杀伤。这些结果说明CR-630在具备优良的光热杀死肿瘤的同时，也具有一定的pH值敏感性。肿瘤细胞环境是弱酸性的，而正常细胞是弱碱性的，而体外溶液光热实验也证明此染料相对于碱性环境来说，其在酸性环境中具有更好的升温效果，所以对于肿瘤细胞具有更好的杀伤效果。其中图9中，Cell viability为细胞活力，[CR-630]为CR-630的浓度。

综上，本发明通过考察CR-630溶液在不同pH值下的紫外吸收光谱、荧光光谱、光声图谱和光热转化情况，以及研究了CR-630在细胞中的近红外成像情况、靶向溶酶体情况、不同pH值下的近红外成像图和光声成像图，最后通过对肿瘤细胞的pH值识别进行光热治疗，发现CR-630暗毒性低，在近红外光808nm激光激发照射下可实现光热治疗。证明本发明提供的CR-630是一种靶向溶酶体的、pH值响应型的、近红外-光声双模态成像的、还可实现光热治疗的克酮酸双吲哚类化合物。

Claims (10)

1.一种克酮酸双吲哚类化合物，其特征在于，具有如下式(Ⅰ)所示分子结构：

2.权利要求1所述克酮酸双吲哚类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将式(Ⅱ)化合物和式(Ⅲ)化合物混合分散于溶剂中，在惰性气氛中，发生克脑文盖尔缩合反应，制得所述克酮酸双吲哚类化合物；

所述式(Ⅱ)化合物具有如下分子结构：

所述式(Ⅲ)化合物具有如下分子结构：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述克脑文盖尔缩合反应的反应温度为80-130℃，反应时间为6-12h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅱ)化合物和式(Ⅲ)化合物的摩尔比为1：0.5-2。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发生克脑文盖尔缩合反应后，还包括纯化的步骤。

6.权利要求1所述克酮酸双吲哚类化合物在制备肿瘤细胞溶酶体靶向制剂中的应用。

7.权利要求1所述克酮酸双吲哚类化合物在制备对肿瘤细胞pH值响应制剂中的应用。

8.权利要求1所述克酮酸双吲哚类化合物在制备肿瘤细胞近红外-光声双模态成像制剂中的应用。

9.权利要求1所述克酮酸双吲哚类化合物在制备肿瘤细胞光热治疗制剂中的应用。

10.一种pH值响应型溶酶体靶向的近红外-光声双模态成像和光热治疗一体化诊疗剂，其特征在于，包括权利要求1所述克酮酸双吲哚类化合物制得。

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