[go: up one dir, main page]

CN115820812A - 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒 - Google Patents

一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115820812A
CN115820812A CN202211197375.2A CN202211197375A CN115820812A CN 115820812 A CN115820812 A CN 115820812A CN 202211197375 A CN202211197375 A CN 202211197375A CN 115820812 A CN115820812 A CN 115820812A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
seq
modified
carried
extracellular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211197375.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115820812B (zh
Inventor
郭英姝
吴谛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN202211197375.2A priority Critical patent/CN115820812B/zh
Priority to PCT/CN2022/134415 priority patent/WO2024065995A1/zh
Priority to US18/250,496 priority patent/US20250075262A1/en
Publication of CN115820812A publication Critical patent/CN115820812A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115820812B publication Critical patent/CN115820812B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒。本发明提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，利用红细胞膜囊泡(RVs)与细胞外囊泡(EVs)进行膜融合的创新策略，在不破坏EVs的膜囊泡结构的同时将荧光检测探针递送进去，实现在限域空间中荧光探针局部浓度的明显增加，进而导致探针间碰撞的机率急剧增加，使得对靶标的检测灵敏度升高。本发明检测的荧光强度与miRNA‑21浓度在50pM‑40nM范围内存在良好的的线性关系。

Description

一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒。
背景技术
微小RNA(microRNAs、miRNAs)是一种单链的、短的(大约19～23个核苷酸)、内源性的、非编码的调节性RNA，其在许多生物过程中是至关重要的。作为基因表达过程的一个重要环节，miRNAs已被确定为一种非常有发展前景的的生物标志物，因为其异常表达水平与包括癌症的许多种疾病密切相关，所以miRNAs对癌症的诊断和预后具有强大的预测价值。例如，miRNA-21被验证为一种潜在的新型肿瘤基因，可调节肿瘤细胞周期和肿瘤转移。然而，由于miRNA的一些特性，如体积小、序列相似度高、易降解，尤其是丰度低，因此，高灵敏性和微量miRNA-21检测是一项极具挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒，在不破坏EVs的膜囊泡结构的同时将荧光检测探针递送进去，实现在限域空间中对miRNA-21的原位荧光检测，灵敏度高。
本发明提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，包括以下步骤：利用红细胞膜囊泡与细胞外囊泡发生膜融合，将针对目标miRNA设计的特异性发夹探针递送到细胞外囊泡中完成DNA自组装反应，实现对胞外囊泡携带的miRNA的原位荧光检测。
优选的，所述特异性发夹探针的数量为三条，在三条特异性发夹探针的序列中均存在自身互补序列和互补回文序列，并在其中两条特异性发夹探针中均修饰有荧光基团和淬灭基团。
优选的，所述目标miRNA包括miRNA-21。
优选的，针对miRNA-21设计的特异性发夹探针包括A-Cy5、B和C-Cy5，其中A-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.1所示序列的第11位的T上修饰淬灭基团，在第53位的T上修饰荧光基团；
B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
C-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.3所示序列的第6位的T上修饰荧光基团，在第54位的T上修饰淬灭基团。
优选的，所述荧光基团包括Cy5，所述淬灭基团包括BHQ2。
本发明还提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的体系，包括：miRNA-21标准品、针对miRNA-21设计的特异性发夹探针包括A-Cy5、B和C-Cy5，其中A-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.1所示序列的第11位的T上修饰BHQ2，在第53位的T上修饰Cy5；
B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
C-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.3所示序列的第6位的T上修饰Cy5，在第54位的T上修饰BHQ2。
本发明还提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的试剂盒，包括上述体系、红细胞膜囊泡提取试剂和细胞外囊泡提取试剂。
本发明还提供了基于上述体系或上述试剂盒原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的方法，包括以下步骤：利用终浓度相同的A-Cy5、B和C-Cy5与不同浓度的miRNA-21标准品混合，37℃孵育120min后，分别进行荧光光谱分析，绘制标准曲线；
利用红细胞膜囊泡提取试剂提取红细胞膜囊泡，将得到的红细胞膜悬液与A-Cy5、B和C-Cy5混合后共挤出，得RVs；
将RVs与利用细胞外囊泡提取试剂提取得到的细胞外囊泡混合，37℃孵育120min后，进行相同的荧光光谱分析。
优选的，所述A-Cy5、B和C-Cy5的终浓度均为200nM。
优选的，所述RVs的粒径分布在122nm至396nm的范围内。
有益效果：本发明提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，利用红细胞膜囊泡(RVs)与细胞外囊泡进行膜融合的创新策略，在不破坏EVs的膜囊泡结构的同时将荧光检测探针递送进去，实现在限域空间中荧光探针局部浓度的明显增加，导致探针间碰撞的机率急剧增加，使得对靶标的检测灵敏度升高。本发明还设计了对miRNA-21具有高灵敏度和高选择性的荧光探针，利用DNA自组装反应形成DNA纳米球结构，实现荧光检测的目的。经实施例验证，本发明检测的荧光强度与miRNA-21浓度在50pM-40nM范围内存在良好的的线性关系。本发明基于上述膜融合策略，将探针递送到EVs中从而形成一个纳米级的限域空间并在此空间中发生DNA的自组装反应，实现对胞外囊泡中的miRNA-21的原位荧光检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DNA原位自组装反应检测miRNA-21的原理示意图；
图2为DNANS的透射电镜图像(左)和粒径分布图(右)；
图3为DNA自组装反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图中泳道自左到右依次表示：单链miRNA-21；miRNA-21和探针A反应；miRNA-21、探针B和探针C反应；miRNA-21、探针A、探针B和探针C反应；单链探针A；单链探针B；单链探针C；
图4为利用红细胞膜囊泡策略原位检测EV中的miRNA-21的原理示意图；
图5为细胞外囊泡的透射电镜图像(左)和粒径分布图(右)；
图6为红细胞膜囊泡的透射电镜图像(左)和粒径分布图(右)；
图7为EVs、RVs以及二者孵育之后的电位图像；
图8为不同浓度蛋白溶液在562nm处的吸光度的标准回归线；
图9为荧光测量证明基于DNA自组装系统用于miRNA-21检测的可行性；
图10为不同浓度的miRNA-21存在时的荧光光谱；
图11为荧光强度和靶miRNA-21浓度之间的线性关系(左)和标准回归线(右)；
图12为利用红细胞膜囊泡策略对7种不同的miRNA检测的荧光强度图；
图13为DNA自组装反应在8小时内的稳定性检测结果；
图14为荧光探针在溶液中(红)和EV中(黑)检测miRNA-21的动力学曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，包括以下步骤：利用红细胞膜囊泡与细胞外囊泡发生膜融合，将针对目标miRNA设计的特异性发夹探针递送到细胞外囊泡中完成DNA自组装反应，实现对胞外囊泡携带的miRNA的原位荧光检测。
在本发明中，由于红细胞内部没有复杂的细胞器，可以降低提取红细胞膜的难度；红细胞膜的表面存在一种唾液酸，而细胞外囊泡的膜表面存在一种唾液酸受体，这两种膜蛋白特异性的结合使得RVs和EVs之间有一个连接的作用，促进RVs和EVs之间的膜融合过程。本发明基于红细胞膜囊泡与细胞外囊泡发生膜融合，可在不破坏EVs本身的膜囊泡结构，使得其内部分子被固定在一个限域空间中，明显提高反应物之间的相互碰撞几率从而提高反应效率。
本发明所述特异性发夹探针的数量优选为三条，在三条特异性发夹探针的序列中均存在自身互补序列和互补回文序列，并在其中两条特异性发夹探针中均修饰有荧光基团和淬灭基团。本发明对所述目标miRNA的种类并没有特殊限定，实施例中以miRNA-21为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明针对miRNA-21设计的特异性发夹探针，优选包括A-Cy5、B和C-Cy5，其序列信息如表1所示。在本发明表1所示的序列中，带下划线的片段表示发夹探针的自身互补茎部分，斜体的片段是互补回文序列，黑色加粗的为探针上修饰的荧光基团和淬灭基团。本发明对于荧光基团和淬灭基团的选择并没有特殊限定，实施例中以BHQ2作为淬灭基团，以Cy5作为荧光基团，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
表1本发明中所涉及到的序列信息
Figure BDA0003871052070000041
Figure BDA0003871052070000051
本发明还提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的体系，包括：miRNA-21标准品、针对miRNA-21设计的特异性发夹探针包括A-Cy5、B和C-Cy5，其中A-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.1所示序列的第11位的T上修饰BHQ2，在第53位的T上修饰Cy5；
B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
C-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.3所示序列的第6位的T上修饰Cy5，在第54位的T上修饰BHQ2。
本发明所述miRNA-21标准品的序列优选如SEQ ID NO.4所示，并需要将所述miRNA-21标准品利用PBS稀释为不同的工作浓度，以绘制标准曲线，如在本发明实施例中，设定的miRNA-21标准品工作浓度为0、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM、150nM和200nM。
本发明还提供了一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的试剂盒，包括上述体系、红细胞膜囊泡提取试剂和细胞外囊泡提取试剂。
本发明所述红细胞膜囊泡的提取试剂优选包括挤出法制备粒径200nm左右的红细胞膜囊泡时所需要的试剂。本发明所述细胞外囊泡提取试剂优选为本领域中常见的外泌体快速抽提试剂盒，如实施例中试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。
首先，将购买的2％小鼠红细胞悬液中加入5倍体积的去离子水，混匀，并于4℃静置1h，使红细胞吸水张破。然后，通过14000R，10分钟离心去除悬液中的血红蛋白，弃上清，底部沉淀用PBS洗涤三次。获得的淡粉色的红细胞膜沉淀用1mL PBS溶液分散，然后将分散液分别用0.45μm的过滤器和0.22μm的过滤器反复挤出5次和10次，最终得到粒径在200纳米左右的红细胞膜囊泡。另外，制备包裹发夹探针的红细胞膜囊泡则是采用共挤出的方法：先将发夹探针与红细胞膜悬液混匀并同时用过滤器反复挤出，挤出之后的溶液中游离的探针用超滤管去除。
本发明还提供了基于上述体系或上述试剂盒原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的方法，包括以下步骤：利用终浓度相同的A-Cy5、B和C-Cy5与不同浓度的miRNA-21标准品混合，37℃孵育120min后，分别进行荧光光谱分析，绘制标准曲线；
利用红细胞膜囊泡提取试剂提取红细胞膜囊泡，将得到的红细胞膜悬液与A-Cy5、B和C-Cy5混合后共挤出，得RVs；
将RVs与利用细胞外囊泡提取试剂提取得到的细胞外囊泡混合，37℃孵育120min后，进行相同的荧光光谱分析。
本发明所述A-Cy5、B和C-Cy5的终浓度优选均为200nM，且在进行荧光光谱分析前，优选还包括将上述相同浓度的A-Cy5、B和C-Cy5，以及不同给定浓度的靶miRNA-21加入PCR管中并定容至100μL，37℃孵育120min，而后进行荧光光谱分析。本发明优选使用F-4600荧光分光光度计以氙灯作为激发源，以635nm作为激发波长，记录650nm至750nm的荧光光谱。
利用本发明所述检测方法，荧光强度与miRNA-21浓度在50pM～40nM范围内存在良好的的线性关系，线性方程为y＝11.94x+88.895，证明DNA自组装系统具有很高的灵敏度。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用的试剂如无特殊说明，均为本领域的常见市售试剂，如使用的所有寡核苷酸(表1)均由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成，并通过HPLC纯化。溶解所有DNA序列并用PBS缓冲液稀释至10μM的最终浓度并在4℃下储存直至使用。所有参与实验的MCF-7乳腺癌细胞均来自武汉普诺赛生命科技有限公司。所有其他试剂均为分析纯试剂，无需进一步纯化即可直接使用。本实验中使用的所有水都是经过消毒的超纯水。
本发明实施例中，通过透射电镜(JEM-2100,JEOL)对纳米材料进行形态表征。使用Zeta-Size Nano仪器(Zen 3600，Malvern Instruments Ltd.)对材料粒径和Zeta电位进行测量。利用美国BioTek Epoch全波长酶标仪实现BCA蛋白定量实验的吸光度测量。实验中的荧光数据通过F-4600荧光分光光度计(Hitachi)检测并记录。
实施例1
一、实验操作
1.1DNA纳米球的合成
根据实验所需探针浓度，依次将所需的miRNA和三种发夹探针储备液加入到PCR管中，并用PBS缓冲液定容到100μL。在37℃下反应120分钟后，将反应产物储存在4℃下，准备进行后续试验分析。
1.2细胞培养实验
本实验所使用的MCF-7细胞使用的培养基是含10％胎牛血清和1％双抗体(青霉素-链霉素)的DMEM。细胞培养过程中，保持细胞培养箱中的温度为37℃，CO2浓度为5％。
1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
对DNA反应样品进行10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，固定电位为90V，使用1×TAE缓冲液作为电泳缓冲液。样品前处理阶段，DNA溶液和loading buffer的比例为5:1。电泳结束后，使用SuperRed染料对电泳胶染色1小时，然后在凝胶成像仪上进行成像。
1.4细胞外囊泡的提取
细胞外囊泡的是通过细胞培养上清外泌体快速抽提试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)在MCF-7细胞培养上清液中提取分离出来的。在进行提取细胞外囊泡之前，细胞培养基中的普通胎牛血清更换为不含外泌体的胎牛血清并连续传代3次后，再进行提取实验。
1.5红细胞膜囊泡的制备
采用挤出法制备粒径200纳米左右的红细胞膜囊泡。首先，将购买的2％小鼠红细胞悬液中加入5倍体积的去离子水，混匀，并于4℃静置1h，使红细胞吸水张破。然后，通过14000R，10分钟离心去除悬液中的血红蛋白，弃上清，底部沉淀用PBS洗涤三次。获得的淡粉色的红细胞膜沉淀用1mLPBS溶液分散，然后将分散液分别用0.45μm的过滤器和0.22μm的过滤器反复挤出5次和10次，最终得到粒径在200纳米左右的红细胞膜囊泡。另外，制备包裹发夹探针的红细胞膜囊泡则是采用共挤出的方法：先将发夹探针与红细胞膜悬液混匀并同时用过滤器反复挤出，挤出之后的溶液中游离的探针用超滤管去除。
1.6荧光测量
对DNA自组装反应的样品进行荧光测量以研究基于DNA纳米球的miRNA-21检测的可行性和特异性。所有的DNA样品的合成，都根据之前提到的步骤制备，每份待检测样品都用PBS缓冲液分别稀释至100μL以备后续检测。然后，使用F-4600荧光分光光度计以氙灯作为激发源，以635nm作为激发波长，记录650nm至750nm的荧光光谱。在进行荧光测量实验之前，将相同浓度的A-Cy5、B、C-Cy5，以及不同给定浓度的靶miRNA-21加入PCR管中并定容至100μL。在37℃孵育120分钟后，然后分别进行荧光光谱分析。A-Cy5、B、C-Cy5的最终浓度都为200nM，而目标miRNA-21的最终浓度依次为0、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM、150nM和200nM。
二、结果与分析
2.1DNA自组装反应检测miRNA-21
2.1.1信号放大机理和DNA纳米球粒径测定
本发明表1中设计得到的三条DNA发夹探针A、B和C，三个发夹探针的序列彼此两两互补以便形成Y型DNA结构单元。为了观察DNA的自组装过程达到荧光检测的目的，在探针A和探针C上分别修饰了Cy5荧光基团和BQH-2淬灭基团，得到荧光探针A-Cy5和C-Cy5。另外，每个发夹探针的3’端都被添加了一段回文互补序列，这使得探针之间能首尾相连。这些Y型DNA结构单元之间也能通过这段互补序列相互连接进而形成更大的DNA结构，而且这些连接并不是固定在同一平面的而是一个三维空间内的组装过程，最终形成了一个三维的DNA纳米球。如图1所示，将miRNA-21和三种探针在37℃下共同孵育使其发生反应，目标检测物miRNA-21只能打开探针A而不能打开探针B和探针C，并且当探针A被打开之后才能发生接下来的DNA自组装反应。具体来说，首先，miRNA-21将发夹探针A-Cy5打开之后形成21-A-Cy5结构。然后，A-Cy5与探针B杂交，产生含有更多粘性末端的21-A-Cy5-B三链结构。接下来，C-Cy5继续被打开并与21-A-Cy5-B杂交，形成21-A-Cy5-B-C-Cy5的四链结构。但这条RNA链会在C-Cy5的作用下被置换并释放，从而可以重新参与到下一个组装反应里。这样一来，A-Cy5-B-C-Cy5的Y型结构单元就形成了。最后，大量Y型结构单元通过粘性末端的互补而交联，装配成最终的DNANS产物。在这整个反应过程中，A-Cy5探针的打开会发出荧光信号，而C-Cy5的打开会增强荧光信号，实现信号的放大。
对制备的DNANS拍摄透射电子显微镜图像(图2中左图)，得到的图像可以显示出这种利用DNA自组装的合成方法成功合成出了DND NS。图像中显示，DNANS的粒径在200纳米左右，呈现出球形的状态。
对DNANS的粒径进行测量，粒径分布图(图2中右图)中显示DNANS的粒径在194.5纳米左右，和透射电镜结果类似，证实合成的DNANS的尺寸在200nm左右。
2.1.2验证DNA自组装过程的可行性
为了验证验证DNA自组装过程的可行性，还设计了7组不同的寡核苷酸链(表1)进行反应，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对7种产物进行验证。电泳结果如图3所示，从左到右第三个泳道，从上到下则分别对应探针B、探针C和miRNA-21，说明在没有探针A存在的情况下，发夹探针B、C是无法被打开；第四个泳道是将探针A、B、C和miRNA-21共同孵育反应之后的结果，最上面一条条带代表这四个核苷酸链的自组装反应的成功。
2.2红细胞膜囊泡策略检测EVs中miRNA-21
如图4所示，将红细胞膜和设计好的三种发夹探针通过共挤出的方法制备出粒度均匀并且包裹荧光检测探针的RVs，并将其和MCF-7细胞来源的EVs混合孵育。在唾液酸和唾液酸受体之间的连接作用下，RVs和EVs就会发生接触，进而这二者的磷脂双分子层之间互相融合，最终形成一个较大的膜囊泡。RVs中的荧光探针就会和EVs中的生物分子就会在这个较大的囊泡中移动发生DNA的自组装反应，设计的发夹探针被打开之后发出荧光(具体反应机理见图1)。最终实现对EVs内部的miRNA-21进行原位的荧光检测。
2.3EVs和RVs的合成与表征
在MCF-7细胞培养上清液中提取出的EVs并通过透射电镜图像对其进行形貌表征，如图5中左侧图所示EVs呈现均匀分散的球形，直径大概在200纳米左右；其粒径分布图如图5中右侧图所示，EVs的粒径分布在211.6纳米左右，证明提取出的EVs粒度均匀且分散性良好。
为了对每批次提取的细胞外囊泡进行定量，本发明采用BCA蛋白定量法对EVs上的蛋白进行定量，从而实现对EVs的标准定量，以便后续的实验可以标准化EVs的使用量。分别测量5个不同蛋白浓度(0、400μg/mL、1000μg/mL、1400μg/mL、2000μg/mL)的溶液在562nm处的吸光度并且做出一条标准回归线(图8)，得到蛋白浓度和吸光度的关系方程式y＝0.0008x+0.1581，R2＝0.9979。
后续实验中对每一批新提取的细胞外囊泡测量吸光度，就会得到对应的蛋白量含，也就对应了细胞外囊泡的量。另外，为了得到粒径在200纳米左右的RVs，利用用相应规格的过滤器反复挤出的手段来实现这一目的。通过透射电镜图像(图6中左图)可以证明最终得到的RVs的粒径符合预期。而粒径分布图(图6中右图)显示RVs的粒径均匀分布在222纳米左右，再次证明成功制备出粒度均匀的RVs。
将EVs和RVs在室温下孵育2小时并测量其前后的zeta电位，用以验证EVs和RVs之间是否进行膜融合。结果如图7所示，在进行孵育之前，EVs和RVs的zeta电位分别为-6.923mV和-12.43mV，经过孵育之后的电位则变成了-9.99mV，膜电位处于未孵育前的二者之间，证明EVs和RVs孵育之后发生了膜融合反应。
2.4DNA自组装反应的体外荧光检测能力
设计四组对照荧光检测实验来评估DNA自组装利用三个探针对miRNA-21进行荧光检测的信号放大能力。如图9所示，对于不存在靶miRNA-21的空白组(红)和不含A-Cy5实验组(黑)，没有观察到明显的荧光变化，这就表明没有发生基于DNA自组装反应的信号过程，这与之前的电泳分析结果保持一致。另外，三个探针都存在时(绿)产生的荧光信号明显高于只添加了A-Cy5一个探针(蓝)的荧光信号，证明探针A-Cy5和探针C-Cy5在发生自组装反应过程中荧光强度被叠加，这种信号放大的能力使得检测灵敏度得到提高。
DNA自组装系统定量检测溶液中miRNA-21的能力如图10所示。图中由下到上的荧光光谱是DNA自组装反应过程中miRNA-21的浓度从0nM递增至200nM的荧光光谱曲线。可以看到，随着目标物miRNA-21浓度的增加，荧光曲线在672nm处的荧光强度值也增加。
将不同浓度miRNA-21与固定浓度的三个探针反应后的溶液在672nm处的荧光强度记录下来并绘制出图11(左)，图中的内嵌图是由黑色虚线框部分放大而来的。这个趋势线可以更直观的看到目标检测物浓度与荧光强度的关系；右侧的图片则是对红色虚线框中的数据绘制的标准回归线。显示荧光强度与miRNA-21浓度在50pM～40nM范围内存在良好的的线性关系，线性方程为y＝11.94x+88.895。这些荧光测量结果就证明了DNA自组装系统具有很高的灵敏度。
为了探究针对miRNA-21设计的三种发夹探针引发的DNA自组装反应对其他不同类型的检测物miRNA的特异性，选择六种不同的miRNA和miRNA-21分别与三种探针反应并检测各组的荧光强度(图12)。如图所示，这六个对照组分别为miRNA-21的单碱基错配序列、miRNA-21的双碱基错配序列、miRNA-21的三碱基错配序列、miR-27、miR-155和miR-373。在这些针对miRNA-21的探针的测试中，只有miRNA-21有效地触发反应，并显示出较强的荧光，而所有其他miRNA的荧光反应强度都远远达不到这个强度。证明本发明设计的三种发夹探针的DNA自组装反应对其针对的目标检测物具有很高的特异性。
同时，还对DNA自组装反应结束形成的产物，在4℃下的荧光信号稳定性进行检测，结果如图13所示，从自组装反应结束的那一刻(0h)到第8h所测得的荧光强度几乎没有明显的变化，这就能证明DNA自组装产物在4℃下具有优秀的稳定性。
为了验证在EVs这个限域空间中发生的荧光反应比溶液中发生的荧光反应更加高效，本发明还分别用相同浓度的三种探针检测EVs中的miRNA-21和溶液中的miRNA-21的荧光强度，并且记录这两组在80分钟内的荧光强度变化(图14)。图中可以明显看到，溶液组(红)大约在50分钟时荧光值达到最大且趋于平衡。而EVs组(黑)的反应则在30分钟左右就达到了平衡且荧光值趋于稳定，最重要的是，EVs组的荧光强度比溶液组的荧光强度增加了1/3左右，这说明DNA自组装反应的效率被提高，原因在于当反应的DNA被限制在EVs的纳米级的限域空间中，增加了探针与检测目标的碰撞几率，所以在反应动力学方面变得更快速，且DNA自组装检测的荧光信号在EVs的限域空间中得到了放大。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用红细胞膜囊泡与细胞外囊泡发生膜融合，将针对目标miRNA设计的特异性发夹探针递送到细胞外囊泡中完成DNA自组装反应，实现对胞外囊泡携带的miRNA的原位荧光检测。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述特异性发夹探针的数量为三条，在三条特异性发夹探针的序列中均存在自身互补序列和互补回文序列，并在其中两条特异性发夹探针中均修饰有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述目标miRNA包括miRNA-21。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，针对miRNA-21设计的特异性发夹探针包括A-Cy5、B和C-Cy5，其中A-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQ IDNO.1所示序列的第11位的T上修饰淬灭基团，在第53位的T上修饰荧光基团；
B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
C-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.3所示序列的第6位的T上修饰荧光基团，在第54位的T上修饰淬灭基团。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述荧光基团包括Cy5，所述淬灭基团包括BHQ2。
6.一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的体系，其特征在于，包括：miRNA-21标准品、针对miRNA-21设计的特异性发夹探针包括A-Cy5、B和C-Cy5，其中A-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.1所示序列的第11位的T上修饰BHQ2，在第53位的T上修饰Cy5；
B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
C-Cy5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，从5’端至3’端计算，在SEQ ID NO.3所示序列的第6位的T上修饰Cy5，在第54位的T上修饰BHQ2。
7.一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述体系、红细胞膜囊泡提取试剂和细胞外囊泡提取试剂。
8.基于权利要求6所述体系或权利要求7所述试剂盒原位检测细胞外囊泡携带miRNA-21的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用终浓度相同的A-Cy5、B和C-Cy5与不同浓度的miRNA-21标准品混合，37℃孵育120min后，分别进行荧光光谱分析，绘制标准曲线；
利用红细胞膜囊泡提取试剂提取红细胞膜囊泡，将得到的红细胞膜悬液与A-Cy5、B和C-Cy5混合后共挤出，得RVs；
将RVs与利用细胞外囊泡提取试剂提取得到的细胞外囊泡混合，37℃孵育120min后，进行相同的荧光光谱分析。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述A-Cy5、B和C-Cy5的终浓度均为200nM。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述RVs的粒径分布在122nm至396nm的范围内。
CN202211197375.2A 2022-09-29 2022-09-29 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒 Active CN115820812B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211197375.2A CN115820812B (zh) 2022-09-29 2022-09-29 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒
PCT/CN2022/134415 WO2024065995A1 (zh) 2022-09-29 2022-11-25 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒
US18/250,496 US20250075262A1 (en) 2022-09-29 2022-11-25 METHOD, SYSTEM, AND KIT FOR IN SITU DETECTION OF MICRO RIBONUCLEIC ACID (miRNA) CARRIED BY EXTRACELLULAR VESICLES (EVs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211197375.2A CN115820812B (zh) 2022-09-29 2022-09-29 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115820812A true CN115820812A (zh) 2023-03-21
CN115820812B CN115820812B (zh) 2025-10-28

Family

ID=85524205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211197375.2A Active CN115820812B (zh) 2022-09-29 2022-09-29 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20250075262A1 (zh)
CN (1) CN115820812B (zh)
WO (1) WO2024065995A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757937A (zh) * 2023-12-27 2024-03-26 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针及其使用办法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005020784A2 (en) * 2003-05-23 2005-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Surrogate cell gene expression signatures for evaluating the physical state of a subject
CN108642162A (zh) * 2018-03-30 2018-10-12 重庆大学 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用
CN115025246A (zh) * 2022-06-23 2022-09-09 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 一种双重靶向血管修复的多功能囊泡及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789373B (zh) * 2021-08-24 2023-09-05 中山大学 一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用
CN114686592B (zh) * 2022-05-30 2022-09-09 广东忠信生物科技有限公司 一种多类型靶标联合检测的试剂盒及制备方法、使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005020784A2 (en) * 2003-05-23 2005-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Surrogate cell gene expression signatures for evaluating the physical state of a subject
CN108642162A (zh) * 2018-03-30 2018-10-12 重庆大学 一种用于原位无损检测胞外囊泡内核酸分子的探针及其制备方法和应用
CN115025246A (zh) * 2022-06-23 2022-09-09 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 一种双重靶向血管修复的多功能囊泡及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIAO XIE ET AL.: "DNA Zipper Mediated Membrane Fusion for Rapid Exosomal MiRNA Detection", 《ANAL. CHEM.》, vol. 94, 16 September 2022 (2022-09-16), pages 1 *
SAHIL MALHOTRA ET AL: "Red blood cells mem brane-der ived nanoparticles: Applicati ons and key challenges in their clinical translat ion", 《WIRES NANOMED NANOBIOTECHNOL》, vol. 14, no. 3, 1 February 2022 (2022-02-01), pages 4 *
SHUZH EN YUE ET AL.: "An enzyme-free molecular catalytic device: dynamically self-assembled DNA dendrimers for in situ imaging of microRNAs in live cells", 《CHEM. SCI.》, vol. 10, 4 December 2018 (2018-12-04), pages 1 *
吴谛等: "基于适体识别及杂交链式反应放大信号检测细胞外囊泡", 《分析试验室》, vol. 43, no. 2, 29 February 2024 (2024-02-29), pages 266 - 273 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117757937A (zh) * 2023-12-27 2024-03-26 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种细胞外囊泡生物标志物原位检测的核酸探针及其使用办法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024065995A1 (zh) 2024-04-04
US20250075262A1 (en) 2025-03-06
CN115820812B (zh) 2025-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yin et al. Aptamer recognition-trigged label-free homogeneous electrochemical strategy for an ultrasensitive cancer-derived exosome assay
CN107574227B (zh) 一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法
Wang et al. Label-free microRNA detection based on fluorescence quenching of gold nanoparticles with a competitive hybridization
CN109837326B (zh) 基于多价捕获并放大输出信号的生物靶标分子检测方法
CN110455764A (zh) 肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法
Zhang et al. Plasmonic biosensor for the highly sensitive detection of microRNA-21 via the chemical etching of gold nanorods under a dark-field microscope
CN116536240A (zh) 一种基于双适配体识别分离并检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用
Wu et al. In situ detection of miRNA-21 in MCF-7 cell-derived extracellular vesicles using the red blood cell membrane vesicle strategy
CN112961907A (zh) 一种同时检测两种rna的荧光生物传感器及其制备和使用方法
CN114739976A (zh) 一种sers探针生物传感器及其制备方法和使用方法
CN115820812A (zh) 一种原位检测细胞外囊泡携带miRNA的方法、体系和试剂盒
CN117402939A (zh) 基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种miRNAs的方法及应用
CN113789363B (zh) 一种dtns介导的检测8-og dna糖基化酶活性的方法
Wei et al. Self-feeding multistage catalytic hairpin assembly programming supramolecular DNA nanoarchitecture for spatiotemporal molecular imaging of microRNA in living cells
CN114813682A (zh) 一种复合荧光纳米探针及其制备方法与应用
Hu et al. Amplification-free microRNA profiling with femtomolar sensitivity on a plasmonic enhanced fluorescence nano-chip
Gao et al. In situ detection of piRNA‐651 in exosomes and cells for cancer diagnosis by a new gold nanoparticle nucleic acid probe
Zhao et al. CRISPR/Cas9-based coronal nanostructures for targeted mitochondria single molecule imaging
Zhao et al. Lanthanide-Complex-Enhanced Bioorthogonal Branched DNA Amplification
Liu et al. Simultaneous detection of multiple microRNAs based on fluorescence resonance energy transfer under a single excitation wavelength
CN116334091A (zh) 一种识别并捕获细胞外囊泡的试剂、定量检测试剂和方法及应用
CN114942223A (zh) 循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒及其制备方法和应用
CN113774055B (zh) 核酸纳米凝胶及其制备方法和应用
CN116555425B (zh) 一种生物纳米传感器
Sun et al. Electrochemical detection of cancer cell-derived small extracellular vesicles based on three aptamer recognition and dual signal amplification

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Country or region after: China

Address after: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501

Applicant after: Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)

Address before: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501

Applicant before: Qilu University of Technology

Country or region before: China

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant