CN115814166A - 纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及生物材料技术领域领域，提供了一种纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括：步骤S1、制备干燥的再生丝素蛋白；步骤S2、将上述再生丝素蛋白和壳聚糖分别溶于六氟异丙醇溶剂，按一定比例混合得到第一混合溶液；步骤S3、将上述第一混合溶液通过静电纺丝、干燥、交联和清洗制得第一纳米纤维；步骤S4、基于上述第一纳米纤维和上述再生丝素蛋白制备纳米纤维丝素蛋白水凝胶。提供了一种新型的纳米纤维丝素蛋白水凝胶支架材料，具有特殊的纤维状微观结构，有利于软骨细胞的黏附和增殖，具有较高的孔隙率，且具备优异的力学性能和生物相容性。
Description
技术领域
本公开涉及生物材料技术领域，特别涉及纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法。
背景技术
由肿瘤、创伤、炎症、发育畸形、骨关节炎和退行性关节病导致的软骨损伤和软骨缺损，给患者带来极大痛苦，影响患者的正常生活，软骨的内源性自我修复能力有限。一方面，由于软骨细胞的高度分化性和低聚集性，使得软骨细胞在受损伤后难以自我增殖;另一方面，由于软骨细胞外基质的致密性、非血管化，使得软骨缺少祖细胞迁移
分化和血管营养。因此，受损的软骨往往遭受不可逆转和持续性的病理过程。目前，关节软骨缺损的临床治疗方法包括软骨下微骨折、关节成形术、自体软骨细胞移植、同种异体软骨移植、异种软骨移植和假关节置换等。然而，这些外科手术方法往往不能为患者提供持久的关节功能，并存在相关的并发症或问题，如供区的继发性病变、关节区进行性结构异常、早期移植物吸收、免疫排斥和疾病传播、假体关节磨损和供体短缺等。
组织工程为软骨缺损提供了一种很有前景的组织修复技术，它将仿生学应用于医学科学，通过生物材料体外模拟体内微环境来制备细胞构建体或在体内控制组织和器官的形成。作为组织工程的关键要素之一，生物支架起着临时ECM的作用，具有支持，营养和形态学诱导功能。
数十年以来，丝素蛋白由于其杰出的生物相容性被广泛用于制备软骨组织工程支架;静电纺丝技术亦被应用于多种纳米多孔支架的制备。然而，单纯的电纺纳米纤维并不适合用作关节软骨缺损修复的支架。
发明内容
（一）发明目的
鉴于上述问题，本申请的目的在于提供一种新型的纳米纤维丝素蛋白水凝胶支架材料，具有特殊的纤维状微观结构，有利于软骨细胞的黏附和增殖，具有较高的孔隙率，且具备优异的力学性能和生物相容性。
（二）技术方案
本公开实施例的第一方面，提供了纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括：
步骤S1、制备干燥的再生丝素蛋白；
步骤S2、将上述再生丝素蛋白和壳聚糖分别溶于六氟异丙醇溶剂，按一定比例混合得到第一混合溶液；
步骤S3、将上述第一混合溶液通过静电纺丝、干燥、交联和清洗制得第一纳米纤维；
步骤S4、基于上述第一纳米纤维和上述再生丝素蛋白制备纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
在一种可能的实施方式中，上述步骤S1、制备干燥的再生丝素蛋白，包括：
将一定质量的蚕茧丝进行脱胶和烘干生成丝素纤维；
将上述丝素纤维溶解于溴化锂溶液中得到丝素蛋白水溶液；
将上述丝素蛋白水溶液进行透析生成再生丝素蛋白溶液；
将上述再生丝素蛋白溶液进行真空干燥生成再生丝素蛋白。
在一种可能的实施方式中，上述真空干燥的时间为40-60h。
在一种可能的实施方式中，上述步骤S2中的第一混合溶液中再生丝素蛋白和壳聚糖质量比为1：0.1-1。
在一种可能的实施方式中，上述交联为乙醇交联。
在一种可能的实施方式中，上述步骤S4、基于上述第一纳米纤维和上述再生丝素蛋白制备纳米纤维丝素蛋白水凝胶，包括：
基于上述再生丝素蛋白制备再生丝素蛋白溶液；
将上述第一纳米纤维加入上述再生丝素蛋白溶液中，混合均匀后加入交联剂进行化学交联得到悬浊液；
将上述悬浊液进行冷冻定形生成纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
在一种可能的实施方式中，上述交联剂包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3-二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。
在一种可能的实施方式中，上述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
本公开实施例的第二方面，提供了一种利用上述制备方法制备的纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
在一种可能的实施方式中，上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶内部包含若干纤维，每根上述纤维的平均直径为130-150mm，且上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶的孔隙率大于90%。
（三）有益效果
本公开实施例与现有技术相比存在的有益效果是：提供了一种新型的纳米纤维丝素蛋白水凝胶支架材料，具有特殊的纤维状微观结构，有利于软骨细胞的黏附和增殖，具有较高的孔隙率，且具备优异的力学性能和生物相容性。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是根据本公开的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法的一些实施例的流程图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的实施例。虽然附图中显示了本公开的某些实施例，然而应当理解的是，本公开可以通过各种形式来实现，而且不应该被解释为限于这里阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了更加透彻和完整地理解本公开。应当理解的是，本公开的附图及实施例仅用于示例性作用，并非用于限制本公开的保护范围。
另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要注意，本公开中提及的“第一”、“第二”等概念仅用于对不同的装置、模块或单元进行区分，并非用于限定这些装置、模块或单元所执行的功能的顺序或者相互依存关系。
需要注意，本公开中提及的“一个”、“多个”的修饰是示意性而非限制性的，本领域技术人员应当理解，除非在上下文另有明确指出，否则应该理解为“一个或多个”。
本公开实施方式中的多个装置之间所交互的消息或者信息的名称仅用于说明性的目的，而并不是用于对这些消息或信息的范围进行限制。
下面根据图1详细描述本公开的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、制备干燥的再生丝素蛋白。
上述步骤S1包括:
步骤S11、将一定质量的蚕茧丝进行脱胶和烘干生成丝素纤维.
步骤S12、将上述丝素纤维溶解于溴化锂溶液中得到丝素蛋白水溶液。
步骤S13、将上述丝素蛋白水溶液进行透析生成再生丝素蛋白溶液。
步骤S14、将上述再生丝素蛋白溶液进行真空干燥生成再生丝素蛋白。
上述步骤具体为：将一定质量的蚕茧丝进行脱胶和烘干生成丝素纤维；将上述蚕茧丝放入质量百分数为0.5%-1%的碳酸钠水溶液中，在100℃下加热煮沸30min，重复煮沸三次，每次煮沸后使用去离子水漂洗去除生丝中的丝胶，并将脱胶后的蚕丝置于烘箱中进行烘干，得到丝素纤维。将上述丝素纤维溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，然后进行过滤，去除杂质和LiBr后得到丝素蛋白水溶液。透析是指将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋（溶液占透析袋体积的1/3-2/3）中，在6~12℃的温度下放入去离子水中透析3-5天并进行浓缩得到再生丝素蛋白水溶液，进而将再生丝素蛋白水溶液在-40~-45℃条件下真空干燥40-60h生成干燥的再生丝素蛋白。
步骤S2、将上述再生丝素蛋白和壳聚糖分别溶于六氟异丙醇溶剂，按一定比例混合得到第一混合溶液。
在一些实施例中，上述步骤S2中的第一混合溶液中再生丝素蛋白和壳聚糖质量比为1：0.1-1。
步骤S3、将上述第一混合溶液通过静电纺丝、干燥、交联和清洗制得第一纳米纤维。
在一些实施例中，静电纺丝的条件为电压12-15 KV，流速0.4mL/h-0.6mL/h，铝箔平板接收器与针头距离12cm-15cm, 相对温度和相对湿度分别为25℃和50％，干燥时间为3-5天。
在一些实施例中，交联是使用乙醇进行梯度交联，具体为，100％乙醇浸泡8-12分钟，90％乙醇浸泡8-12分钟，70％乙醇浸泡8-12分钟，纯水清洗3次除去乙醇，制得水不溶性的丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维，即第一纳米纤维。
步骤S4、基于上述第一纳米纤维和上述再生丝素蛋白制备纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
在一些实施例中，上述步骤S4包括：第一步，基于上述再生丝素蛋白制备再生丝素蛋白溶液；第二步，将上述第一纳米纤维加入上述再生丝素蛋白溶液中，混合均匀后加入交联剂进行化学交联得到悬浊液；第三步，将上述悬浊液进行冷冻定形生成纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
具体的，上述制备步骤具体为：
将混丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维用球磨机球磨成短纤维，液氮迅速冷冻，然后-40℃真空环境下连续冻干25-30小时，制得丝素蛋白/ 壳聚糖纳米短纤维；按再生丝素蛋白：短纤维＝3-5:1的比例称取再生丝素蛋白和短纤维，并加入配制好的交联剂，上述交联剂可以为1,4-丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3-二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。作为优选，选取1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为交联剂，涡旋充分混匀 ,注入模具中。立即放入-25℃~-30℃冷冻20-25h，室温下解冻后，加入等体积无水乙醇静置一段时间，将支架取出，即可得到纳米纤维丝素蛋白水凝胶，获取的纳米纤维丝素蛋白水凝胶每根纤维的平均直径为130-150mm，且上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶的孔隙率大于90%。
下面详细说明按照上述制备方法制得的纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
在一些实施例中，上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶内部包含若干纤维，每根上述纤维的平均直径为130-150mm，且上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶的孔隙率大于90%。
下面通过具体实施例说明本公开制备得的纳米纤维丝素蛋白水凝胶及其制备方法。
实施例1
将一定质量的蚕茧丝进行脱胶和烘干生成丝素纤维；将上述蚕茧丝放入质量百分数为0.5%的碳酸钠水溶液中，在100℃下加热煮沸30min，重复煮沸三次，每次煮沸后使用去离子水漂洗去除生丝中的丝胶，并将脱胶后的蚕丝置于烘箱中进行烘干，得到丝素纤维。将上述丝素纤维溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，然后进行过滤，去除杂质和LiBr后得到丝素蛋白水溶液。将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋（溶液占透析袋体积的1/3）中，在6℃的温度下放入去离子水中透析3天并进行浓缩得到再生丝素蛋白水溶液，将再生丝素蛋白溶液进行在-40℃下真空干燥40h生成再生丝素蛋白。
将与再生丝素蛋白质量比为0.1：1的壳聚糖和再生丝素蛋白分别溶于六氟异丙醇溶剂，并进行混合得到第一混合溶液。
将第一混合溶液在电压12KV,流速0.4mL/h，铝箔平板接收器与针头距离12cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和50％，所得混纺纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥3天，。经乙醇梯度交联后增加其水不溶性，梯度乙醇交联条件为：100％乙醇浸泡8分钟，90％乙醇浸泡8分钟，70％乙醇浸泡8分钟。纯水清洗3次除去乙醇，制得水不溶性的丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维。
将混丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维用球磨机球磨成短纤维，液氮迅速冷冻，然后-40℃真空环境下连续冻干30小时，制得丝素蛋白/ 壳聚糖纳米短纤维。
按再生丝素蛋白：短纤维＝3:1的比例称取再生丝素蛋白和短纤维，即称取提取的丝素蛋白30mg配制成丝素蛋白溶液，加入冻干的纳米短纤维10mg，并加入配制好的1mmol/mL1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。涡旋充分混匀 ,注入模具中。立即放入-30℃冷冻20h，室温下解冻后，加入等体积无水乙醇静置10min，将支架取出，即可得到纳米纤维丝素蛋白水凝胶，获取的纳米纤维丝素蛋白水凝胶每根纤维的平均直径为130mm，且上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶的孔隙率为92.5%。
实施例2
①制备干燥的再生丝素蛋白；
将一定质量的蚕茧丝进行脱胶和烘干生成丝素纤维；将上述蚕茧丝放入质量百分数为0.5%的碳酸钠水溶液中，在100℃下加热煮沸30min，重复煮沸三次，每次煮沸后使用去离子水漂洗去除生丝中的丝胶，并将脱胶后的蚕丝置于烘箱中进行烘干，得到丝素纤维。将上述丝素纤维溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，然后进行过滤，去除杂质和LiBr后得到丝素蛋白水溶液。将冷却后的丝素蛋白溶液倒入透析袋（溶液占透析袋体积的2/3）中，在6℃的温度下放入去离子水中透析3天并进行浓缩得到再生丝素蛋白水溶液，将再生丝素蛋白溶液进行在-45℃下真空干燥60h生成再生丝素蛋白。
将与再生丝素蛋白质量比为1：1的壳聚糖和再生丝素蛋白分别溶于六氟异丙醇溶剂，并进行混合得到第一混合溶液。
将第一混合溶液在电压15KV,流速0.6mL/h，铝箔平板接收器与针头距离15cm，相对温度和相对湿度分别为25℃和50％，所得混纺纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥5天，。经乙醇梯度交联后增加其水不溶性，梯度乙醇交联条件为：100％乙醇浸泡12分钟，90％乙醇浸泡12分钟，70％乙醇浸泡12分钟。纯水清洗3次除去乙醇，制得水不溶性的丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维。
将混丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维用球磨机球磨成短纤维，液氮迅速冷冻，然后-40℃真空环境下连续冻干25小时，制得丝素蛋白/ 壳聚糖纳米短纤维。
按再生丝素蛋白：短纤维＝5:1的比例称取再生丝素蛋白和短纤维，即称取提取的丝素蛋白50mg配制成丝素蛋白溶液，加入冻干的纳米短纤维10mg，并加入配制好的1mmol/mL1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液。涡旋充分混匀 ,注入模具中。立即放入-25℃冷冻25h，室温下解冻后，加入等体积无水乙醇静置12min，将支架取出，即可得到纳米纤维丝素蛋白水凝胶，获取的纳米纤维丝素蛋白水凝胶每根纤维的平均直径为150mm，且上述纳米纤维丝素蛋白水凝胶的孔隙率为95%。
以上描述仅为本公开的一些较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开的实施例中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离上述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开的实施例中公开的（但不限于）具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
Claims (10)
1.一种纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、制备干燥的再生丝素蛋白；
步骤S2、将所述再生丝素蛋白和壳聚糖分别溶于六氟异丙醇溶剂，按一定比例混合得到第一混合溶液；
步骤S3、将所述第一混合溶液通过静电纺丝、干燥、交联和清洗制得第一纳米纤维；
步骤S4、基于所述第一纳米纤维和所述再生丝素蛋白制备纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
2.如权利要求1所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1、制备干燥的再生丝素蛋白，包括：
将一定质量的蚕茧丝进行脱胶和烘干生成丝素纤维；
将所述丝素纤维溶解于溴化锂溶液中得到丝素蛋白水溶液；
将所述丝素蛋白水溶液进行透析生成再生丝素蛋白溶液；
将所述再生丝素蛋白溶液进行真空干燥生成再生丝素蛋白。
3.如权利要求2所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述真空干燥的时间为40-60h。
4.如权利要求1所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的第一混合溶液中再生丝素蛋白和壳聚糖质量比为1：0.1-1。
5.如权利要求1所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联为乙醇交联。
6.如权利要求1所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S4、基于所述第一纳米纤维和所述再生丝素蛋白制备纳米纤维丝素蛋白水凝胶，包括：
基于所述再生丝素蛋白制备再生丝素蛋白溶液；
将所述第一纳米纤维加入所述再生丝素蛋白溶液中，混合均匀后加入交联剂进行化学交联得到悬浊液；
将所述悬浊液进行冷冻定形生成纳米纤维丝素蛋白水凝胶。
7.如权利要求6所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚，二环氧甘油醚，1,3-二环氧甘油醚甘油，双酚A二缩水甘油醚，双酚A二缩水甘油醚衍生物，间苯二酚二缩水甘油醚，3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚，新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。
8.如权利要求6所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
9.一种纳米纤维丝素蛋白水凝胶，其特征在于，所述纳米纤维丝素蛋白水凝胶利用权利要求1-8任一项所述的制备方法制得。
10.如权利要求9所述的纳米纤维丝素蛋白水凝胶，其特征在于，所述纳米纤维丝素蛋白水凝胶内部包含若干纤维，每根所述纤维的平均直径为130-150mm，且所述纳米纤维丝素蛋白水凝胶的孔隙率大于90%。
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