CN115806601B - 一种转录调控因子LysG突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明以一种新型的转录调控因子LysG突变体及受其调控的启动子为研究对象，特别涉及所述突变体在代谢工程中调控基因表达和高通量筛选方面的优势及应用，属于代谢工程领域。本发明通过对LysG进行点突变获得lysGE15D , A54D , I164V突变体，在组氨酸的调控下，突变体对下游基因的表达强度相对于野生型提高了7.5倍，即利用组氨酸的浓度可对下游基因进行更高强度的调控，因此可更好用于代谢工程调控以及应用于生产组氨酸菌株的高通量筛选。
Description
技术领域：
本发明以一种新型的转录调控因子LysG突变体及受其调控的启动子为研究对象，特别涉及所述突变体在代谢工程中调控基因表达和高通量筛选方面的优势及应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
生物体内广泛存在转录调控因子，其中一类转录调控因子能够受细胞内特定小分子代谢物的诱导，在不同小分子代谢物浓度下，通过改变自身结构，结合在目标基因启动子部分的特定DNA片段上，来调控目标基因元件转录水平。如果目标基因元件又能够影响生物体特定的性状(例如荧光强度、细胞生长状况以及特定代谢通路的开关等)，那么就可以利用小分子代谢物的浓度来调控生物体特定的性状。如果目标基因是代谢途径中的相关酶或者相关基因，就可以通过转录调控因子表达强弱，来控制代谢途径的强弱，应用于代谢工程改造等方面；如果目标基因是荧光蛋白、抗性基因等，那么就可以将小分子代谢物的浓度与荧光的强度，细胞在抗生素存在下的生长水平相偶联，从而构建出一种可以响应小分子代谢物浓度的生物传感器，筛选小分子代谢物的高产菌株，应用于菌株的高通量筛选等方面。
研究表明，转录调控因子LysG和ArgP都是小分子诱导蛋白，属于LysR型转录调控蛋白家族的同源成员，它们分别来自谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌，其中LysG能够在赖氨酸、精氨酸或组氨酸的诱导下调控LysE的转录。ArgP只能够受精氨酸的诱导，调控下游基因元件ArgO的转录。研究表明，在大肠杆菌中引入LysG及其lysE上游的调控序列后，ArgP和LysG的调控作用互不影响，不能相互调控LysE和ArgO的表达。因此，将谷氨酸棒杆菌来源的LysG及其调控的核酸序列引入到大肠杆菌后，有可能构建出受赖氨酸、精氨酸或组氨酸诱导表达的基因，用于相关大肠杆菌的代谢调控或高通量筛选。
有人在谷氨酸棒杆菌中，以转录调控因子lysG响应赖氨酸、精氨酸和组氨酸的诱导调控目标基因LysE的转录为基础，设计开发了包含LysG、LysE启动子PlysE，以及黄色荧光蛋白的一种适用于细胞内赖氨酸检测的生物传感器，该生物传感器是利用荧光的强弱来偶联赖氨酸的浓度。因此用该生物传感器结合流式细胞仪，对基因组突变文库进行高通量筛选，分离出产量提高的突变体，从而证明了基于转录调控因子LysG的赖氨酸生物传感器在高通量筛选方面的可行性(Binder et al.Genome Biology 2012,13:R40)。lysG受到赖氨酸、精氨酸或组氨酸的调控后，能够诱导PlysE转录的起始，提高PlysE下游基因的表达，在一定赖氨酸、精氨酸或组氨酸诱导物浓度下，其诱导PlysE下游基因表达的水平越高，代表体系内赖氨酸、精氨酸或组氨酸的浓度越高。因此，筛选出能够受到赖氨酸、精氨酸或组氨酸的高效调控的lysG，对于相关代谢工程调控和高通量筛选具有重要意义。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明通过对转录调控因子lysG进行突变，筛选出了一种对组氨酸响应程度更高的lysG突变体，以便于在组氨酸生产菌株高通量筛选方面发挥更加积极的作用。
本发明提供的技术方案之一，是一种转录调控因子lysG的突变体，是在野生型lysG的基础上发生E15D，A54D和I164V突变获得的，具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，命名为lysGE15D,A54D,I164V，相对于野生型lysG，lysGE15D,A54D,I164V受组氨酸诱导后提高PlysE起始转录水平的程度更高，可通过调控组氨酸的浓度，更加高效地调控其下游基因的表达。
本发明提供的技术方案之二，是lysGE15D,A54D,I164V的编码基因，具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
本发明提供的技术方案之三，是转录调控因子lysGE15D,A54D,I164V的应用，特别是在检测组氨酸或筛选组氨酸生产菌株中的应用，更特别地是在构建检测组氨酸的生物传感器中的应用。
本发明提到的技术方案之四，是一种生物传感器，所述生物传感器包含lysGE15D ,A54D,I164V编码基因、LysE的启动子PlysE，以及指示基因；
进一步地，所述启动子PlysE，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
进一步地，所述指示基因包括但不限于荧光蛋白编码基因、抗性基因等；
进一步地，所述荧光蛋白包括但不限于黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等；
进一步地，所述抗性基因包括但不限于四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等；
优选地，所述生物传感器包含lysGE15D,A54D,I164V编码基因、LysE的启动子PlysE，以及四环素抗性基因，并将上述基因在质粒pSB4K5上表达；
进一步地，所述四环素抗性基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明提到的技术方案之五，是技术方案四所述生物传感器的应用，特别是在检测组氨酸，或在组氨酸高产菌株筛选中的应用。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用单字母或三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.lysG突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示lysG突变体中突变的氨基酸。如E15D，表示位置15的氨基酸由野生型lysG的E替换成D，位置的编号对应于SEQ ID NO.5中野生型lysG的氨基酸序列编号。具体信息如下表：
有益效果：
本发明通过对LysG进行点突变获得lysGE15D,A54D,I164V突变体，在组氨酸的调控下，突变体对下游基因的表达强度相对于野生型提高了7.5倍，即利用组氨酸的浓度可对下游基因进行更高强度的调控，因此可更好用于代谢工程调控以及应用于生产组氨酸菌株的高通量筛选。
附图说明：
图1质粒P1。
图2质粒P2。
图3固体平板中菌株A的生长水平。
图4固体平板中菌株B的生长水平。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
转录调控因子LysG可受赖氨酸、精氨酸或组氨酸的诱导，本申请对LysG进行点突变，得到突变体lysGE15D,A54D,I164V，调控PlysE转录的起始，并在其下游偶联了四环素抗性基因。将相关基因转化到大肠杆菌菌株后，利用固体平板和液体培养进行测试，发现在添加组氨酸后，含有lysGE15D,A54D,I164V的菌株对四环素抗性明显增强，说明lysGE15D,A54D,I164V响应组氨酸的能力得到了明显的提高。分别利用lysG以及lysGE15D,A54D,I164V构建生物传感器，用于筛选突变株生产组氨酸的能力，发现利用基于lysGE15D,A54D,I164V的传感器筛选对于组氨酸的相应更为灵敏和积极，从而证明了lysGE15D,A54D,I164V在组氨酸生产菌株高通量筛选方面的优越性。
突变体lysGE15D,A54D,I164V具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：
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RWRLESRSLARLTDAVVDAAIEGLRP*
本发明中实施例采用的主要培养及和抗生素如下：
(1)LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，其余为水。
(2)发酵培养基(g/L)：葡萄糖40、七水硫酸镁1、硫酸铵10、磷酸二氢钾3、七水硫酸铁0.01、一水硫酸锰0.01、酵母提取物10、胰蛋白胨10，其余为水，利用NH3·H2O调节pH＝7。
(3)卡那霉素的使用浓度为25mg/L，四环素配制成10mg/mL的母液，根据需要加入不同量。
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：质粒P1的构建
首先以质粒pSB4K5-I52002为模板(GenBank：EU496099.1)以表1中引物carrier-F、carrier-R，PCR扩增出pSB4K5线性载体片段；以谷氨酸棒杆菌13032基因组(NCBIaccession number：CP025533.1)为模板，用引物lysG-F、lysG-R，PCR扩增出含有LysG和LysE的启动子PlysE的基因片段LysG-PlysE(也可根据LysG和PlysE的的序列进行合成)；以pDM1质粒(NCBI accession number：MN128719.1)为模板，用引物tet-F、tet-R，PCR扩增出四环素抗性片段，将上述PCR产物进行纯化回收，再利用无缝克隆酶(pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit(全式金)，将载体pSB4K5线性片段和LysG-PlysE、四环素抗性片段进行同源重组连接，转化到E.coli DH5α感受态中，涂布到含有25mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃，12h，220rpm培养，挑出转化子测序验证，获得含有正确片段的重组质粒pSB4K5-lysG-PlysE-tet，简称质粒P1，质粒图谱如图1所示。
表1构建质粒pSB4K5-lysG-PlysE-tet所用引物
| 引物名称 | 引物序列5'-3' |
| carrier-F | CGGGCCACCTCGACCTGAAACCCTTCTCACCTCGGC |
| carrier-R | TCGAGGGATTGCGGCCTTAGGCCTGGGGTGCCTAATGA |
| lysG-F | CTAAGGCCGCAATCCCTCGA |
| lysG-R | TCAGGTCGAGGTGGCCCG |
| tet-F | ATGAAATCTAACAATGCGCT |
| tet-R | TCAGGTCGAGGTGGCCCG |
实施例2：质粒P2的构建
设计lysG上E15D位点的突变引物DTB1-F、DTB1-R；A54D位点的突变引物DTB2-F、DTB2-R；I164V位点的突变引物DTB3-F、DTB3-R。以质粒P1为模板进行突变，获得表达含有E15D、A54D和I164V三突变位点lysG的质粒。
具体如下：
以上述质粒P1为模板，以表2中引物DTB1-F、DTB1-R，PCR扩增，纯化回收。将上述回收产物通过无缝克隆酶(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(全式金)进行同源重组连接，转化到E.coli DH5α感受态中，涂布到含有25mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃，12h，220rpm培养，获得表达含有E15D突变位点lysG的质粒pSB4K5-lysGE15D-PlysE-tet。以上述突变质粒为模板，继续利用引物DTB2-F、DTB2-R扩增，片段纯化回收、无缝克隆酶连接，转化感受态细胞后挑选正确转化子，获得表达含有E15D和A54D双突变位点lysG的质粒pSB4K5-lysGE15D,A54D-PlysE-tet。再以上述突变质粒为模板，继续利用引物DTB3-F、DTB3-R扩增，片段纯化回收、无缝克隆酶连接，转化感受态细胞后挑选正确转化子，获得表达含有E15D、A54D和I164V三突变位点lysG的质粒pSB4K5-lysGE15D,A54D,I164V-PlysE-tet，简称质粒P2，质粒图谱如图2所示。
表2构建质粒pSB4K5-lysGE15D,A54D,I164V-PlysE-tet所用引物
| 引物名称 | 引物序列5'-3' |
| DTB1-F | GAAGCTGCCATCATCAATGAT |
| DTB1-R | ATCATTGATGATGGCAGCTTC |
| DTB2-F | GTTGCTTTGTCCGGTTGGGT |
| DTB2-R | ACCCAACCGGACAAAGCAAC |
| DTB3-F | GGGTTGCAACGGCCAAGTGG |
| DTB3-R | CCACTTGGCCGTTGCAACCC |
实施例3：利用固体平板测试菌株A的生长水平
将构建的质粒P1导入野生型菌株E.coli MG1655，得到菌株A；将菌株A接种于含有25mg/L卡那霉素的LB试管中，37℃，220rpm培养,待生长到OD600为1.4-1.6之间，稀释10-5，取100μL涂布在含有不同浓度四环素(分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL)，并含有5g/L组氨酸的固体LB培养基平板上。同时，以不含组氨酸的平板培养为对照，培养60h后，观察生长状况。
不含组氨酸平板的生长状况如图3-A所示。由图得知，在5μg/mL四环素浓度下，菌株能够明显生长，四环素浓度高于10μg/mL时，菌株无法生长。
含5g/L组氨酸平板的生长状况如图3-B所示。由图可知，在含有5μg/mL或10μg/mL四环素的平板上，菌株能够明显生长，四环素浓度高于15μg/mL时，菌株无法生长。
说明在所实验的测试条件下，5g/L组氨酸能够诱导菌株A中四环素抗性基因的表达，使菌株对四环素的抗性浓度由5μg/mL提高到10μg/mL。
实施例4：利用固体平板测试菌株B的生长水平
将构建的质粒P2导入野生型菌株MG1655，得到菌株B；利用实施例3中相同的方法测试菌株B受组氨酸诱导表达四环素抗性基因后对四环素的抗性水平变化。
菌株B培养稀释后涂布在分别添加5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL四环素的固体LB培养基平板上，培养60h后观察生长情况。结果如图4-A所示，由图可知，在5μg/mL四环素浓度下，菌株B能够明显生长，四环素浓度高于10μg/mL时，菌株B无法生长。
菌株B培养稀释后涂布在分别添加25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL四环素，并含有5g/L组氨酸固体LB培养基平板上，培养60h后观察生长情况。结果如图4-B所示，由图可知，在含有25μg/mL、50μg/mL或75μg/mL四环素的平板上，菌株能够明显生长，四环素浓度高于100μg/mL时，菌株无法生长。
上述结果说明，在所实验的测试条件下，5g/L组氨酸能够诱导菌株B四环素抗性基因的表达，使菌株对四环素的抗性浓度由5μg/mL提高到75μg/mL。相比A菌株，菌株B抵抗四环素浓度提高了7.5倍。
由实验结果可以获知，lysG突变为lysGE15D,A54D,I164V以后，在组氨酸诱导下，其下游基因表达水平提高程度显著增强。在代谢工程中，更有利于调控下游基因的更高强度表达；在高通量筛选中，通过抗性等信号的巨大差异，更容易区分不同生产水平的菌株，提高高通量筛选的效率。
实施例5：利用液体深孔板测试菌株A、B的生长水平
为对菌株A、B进行二次验证，因此利用液体深孔板方法，通过酶标分析仪进行OD600检测分析，测试在液体发酵中菌株A、B受组氨酸诱导表达四环素抗性基因后对四环素的抗性水平变化。
将菌株A、B培养后分别接种于添加20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL四环素，同时添加或不添加5g/L组氨酸的液体LB培养基中，培养24h后生长情况如表3所示。可知，不添加组氨酸时，液体LB培养基四环素浓度高于20μg/mL时，菌株A、B均无法生长；添加组氨酸时，四环素浓度高于20μg/mL时，菌株A仍然无法生长，但在含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的四环素时，菌株B能够明显生长。
实验证实，在所测试条件下，在5g/L组氨酸的诱导下，表达lysGE15D,A54D,I164V的菌株B比表达野生型lysG的菌株A能够表达更多的抗生素基因，从而有更明显的生长。这将为组氨酸生产菌株的筛选提供极大的便利。
表3液体深孔板中菌株A、B的生长水平
本申请中的使用的四环素抗性基因，只是用作验证lysG及其突变体lysGE15D ,A54D,I164V受组氨酸诱导表达的一个例子，具有相关知识背景的研究人员很容易知道，这种诱导与所测试的基因无关，因此，在代谢工程，高通量筛选等实际应用中，可以根据具体需求，将四环素抗性基因替换为其它基因后，例如氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等，也具有同样的效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (8)
1.一种转录调控因子lysG的突变体，其特征在于，是在野生型lysG的基础上发生E15D，A54D和I164V突变获得的，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，命名为转录调控因子lysGE15D,A54D,I164V。
2.权利要求1所述转录调控因子lysGE15D,A54D,I164V的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述转录调控因子lysGE15D,A54D,I164V或权利要求2所述编码基因的应用，其特征在于，是在检测组氨酸或筛选组氨酸生产菌株中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，是在构建检测组氨酸的生物传感器中的应用。
6.一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包含权利要求2所述的lysGE15D ,A54D,I164V编码基因、LysE的启动子PlysE，以及指示基因；
所述指示基因为荧光蛋白编码基因或抗性基因；
所述荧光蛋白为黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白；
所述抗性基因为四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因。
7.如权利要求6所述的一种生物传感器，其特征在于，所述所述生物传感器包含lysGE15D,A54D,I164V编码基因、LysE的启动子PlysE，以及四环素抗性基因，并将上述基因在质粒pSB4K5上表达所得；
所述启动子PlysE，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述四环素抗性基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
8.权利要求6-7任意一项所述生物传感器的应用，其特征在于，是在检测组氨酸，或在组氨酸高产菌株筛选中的应用。
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