CN115737812A - 近红外光敏剂纳米制剂的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及近红外光敏剂纳米制剂的制备方法及应用。所述纳米制剂分别采用传统药物剂型脂质体和两亲性嵌段聚合物作为药物载体负载近红外双还原含氟卟啉光敏剂(Tetrafluorophenyl bacteriochlorin，FBC)制备而成。在与市售的光敏剂血卟啉(Hematoporphyrin，HP)的对比下，所制得的纳米制剂表现出高效的单线态氧（¹O₂）产生能力，增强了对肿瘤的杀伤作用，显示出良好的光动力治疗效果。同时，该纳米制剂在体内的血液循环时间较长且残留较少，表现出较高的生物利用度和生物相容性。本发明提出的纳米制剂在临床光动力治疗中具有较好的应用前景，为光动力肿瘤治疗提供新的选择。

Description

近红外光敏剂纳米制剂的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及纳米生物医药材料领域，具体涉及负载近红外FBC光敏剂的药物剂型设计，以及该药物的药代动力学研究和细胞、动物水平上的药效学研究。

背景技术

在过去的几十年中，化学药物疗法等在癌症治疗中起着非常重要的作用。但是化疗、放疗等传统肿瘤治疗手段具有选择性低、毒副作用大等明显缺点，导致治疗效果差。近年来，光动力学治疗由于其非侵入性、高空间准确性和可控性、最小耐药性、低生物毒性和免疫刺激性等优点，已成为一种有效且具有前景的癌症治疗模式。尽管光动力疗法有望成为一种治疗肿瘤的有效办法，但是由于传统光敏剂的局限性，其广泛的临床应用受到了限制。现有的光敏剂多为疏水性光敏剂，容易在正常组织里或血管内蓄积，导致只有少量的光敏剂能到达肿瘤部位，影响治疗效果。此外，传统的光敏剂选择性较差、组织穿透性能力较差，这成为光动力治疗深层肿瘤的致命弱点。

近年来纳米药物载体的发展有效地改善了抗癌药物溶解性差的问题，为肿瘤治疗带来了巨大的希望。纳米药物载体通过将疏水的抗癌药物包封在脂溶性区域中，增加了抗癌药物的溶解度和稳定性，从而延长了抗癌药物在体内的血液循环时间。此外，载药纳米粒子还可以通过高通透性和滞留效应（EPR）被动靶向肿瘤部位，有利于在肿瘤组织蓄积，提高抗癌药物的生物利用度。

近红外光敏剂的吸收波长位于700-900纳米之间光谱的红色光区域内，此波段的光能够实现良好的组织穿透和光敏剂的激活，表现出最佳的治疗窗口。近年来，发明人课题组开发了一种近红外光敏剂（FBC），其最大吸收波长位于750纳米，且具有较强的摩尔吸光强调，因此，在更具穿透性的近红外光的照射下，光敏剂药物实现了光动力治疗深层肿瘤的可能性。为了更好地实现该光敏剂光动力治疗效果，该光敏剂通过脂质体或两亲性嵌段聚合物包裹制备成纳米药物制剂，将会有效地提升该近红外光敏剂的利用效率。

发明内容

本发明目的在于改善上述技术的不足而提供近红外光敏剂纳米制剂的制备方法和应用。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案实现：

本发明提供了近红外光敏剂纳米制剂，其具体包含药物载体和疏水性的光敏剂药物FBC，所述FBC具有以下结构：

。

所述药物载体分别为脂质体和两亲性的聚环氧乙烷-聚右旋乳酸嵌段共聚物(PEO-PDLA)，以提高光敏剂的利用效率。

本发明提供了负载FBC光敏剂的脂质体药物的制备方法，包括：采用乙醇注入法，将一定比例的磷脂、胆固醇、FBC混合于一定量的无水乙醇中，超声混匀后用注射器逐滴加入恒温水相中，乳化1 h后，经透析除去无水乙醇，接着将绿色混悬液过0.22 μm水相膜得到均一的脂质体纳米溶液。

所述磷脂和胆固醇的质量比为（3-5）：1（优选为3：1），FBC光敏剂药物和脂质体的质量比为1：（5-20）（优选为1：10）。

所述透析过程采用截留分子量为2000-5000（优选为3500）的透析袋。

同样地，根据所述脂质体药物的制备方法，可制得HP-Lips脂质体溶液。

本发明还提供了负载双还原含氟卟啉光敏剂（FBC）的聚合物纳米粒子的制备方法，包括：按一定的比例将PEO-PDLA和FBC混合于一定量的四氢呋喃中，超声混匀后用注射器逐滴加入水相中，搅拌12 h，经透析除去有机溶剂，得到粒径均一的PEO-PDLA@FBC纳米粒子。

所述FBC光敏剂药物和两亲性嵌段聚合物的质量比为1：（5-20）（优选为1：10）。

所述透析过程采用截留分子量为7000-14000（优选为8000-14000）的透析袋。 同样地，根据所述聚合物纳米粒子的制备方法，可制得PEO-PDLA@HP纳米粒子。

本发明提供了两种纳米粒子的单线态氧的产生性能分析，实验结果表明PEO-PDLA@FBC纳米粒子产生单线态氧的速率明显高于PEO-PDLA@HP纳米粒子，具有高效的单线态氧产生能力。

本发明提供了PEO-PDLA@FBC纳米粒子的药代动力学研究，实验结果显示说明PEO-PDLA@FBC纳米粒子在体内分布迅速，清除缓慢，延长了光敏剂在体内的血液循环时间，提高了生物利用度。

本发明提供了PEO-PDLA@FBC纳米粒子的组织分布研究，实验结果显示PEO-PDLA@FBC纳米粒子在正常组织里清除缓慢但残留较少，对组织几乎无毒性影响。

本发明提供了脂质体药物和纳米粒子的体外细胞毒性实验，实验结果显示两种负载FBC的纳米制剂的生物相容性和抑制癌细胞生长率均优于负载HP的纳米制剂。

本发明提供了两种纳米粒子通过不同注射方式的体内抗肿瘤实验，实验结果显示与PEO-PDLA@HP纳米粒子相比，PEO-PDLA@FBC纳米粒子表现出更好的体内抗肿瘤效果。

本发明的有益效果为：与普通光敏剂相比，FBC具有以下特性来克服传统光敏剂所面临的挑战：1）全氟卟啉结构明确且非常稳定；2）皮肤光毒性低，无需严格避光；3）治疗波长为750 nm，对组织穿透深度较为理想，可以显著提升PDT功效。利用药物载体包裹FBC形成近红外纳米制剂，有效地提高了FBC的利用效率。同时，该纳米制剂不仅合成工艺简单，且具有残留较少、毒副作用低、光毒性明显、抑瘤效果显著等特点，因而在光动力治疗中有潜在的应用。

附图说明

图1为FBC-Lips的紫外-可见光吸收光谱。

图2为HP-Lips的紫外-可见光吸收光谱。

图3为PEO-PDLA@FBC的紫外-可见光吸收光谱。

图4为PEO-PDLA@HP的紫外-可见光吸收光谱。

图5为在光照条件下PEO-PDLA@FBC产生的¹O₂对捕获剂DPBF紫外-可见光吸收的影响。

图6为在光照条件下PEO-PDLA@HP产生的¹O₂对捕获剂DPBF紫外-可见光吸收的影响。

图7为PEO-PDLA@FBC血浆样品和空白血浆的荧光发射光谱。

图8为在昆明小鼠中尾静脉注射PEO-PDLA@FBC的药代动力学曲线。

图9为在昆明小鼠中尾静脉注射PEO-PDLA@FBC的生物组织分布。

图10为MTT法测定的FBC-Lips和HP-Lips在不同细胞株下的细胞光毒性。

图11为MTT法测定的FBC-Lips和HP-Lips在不同细胞株下的细胞暗毒性。

图12为MTT法测定的PEO-PDLA@FBC和PEO-PDLA@HP在不同细胞株下的细胞光毒性。

图13为MTT法测定的PEO-PDLA@FBC和PEO-PDLA@HP在不同细胞株下的细胞暗毒性。

图14为尾静脉注射药物时BALB/c裸鼠经不同处理后的肿瘤生长曲线。

图15为瘤内注射药物时BALB/c裸鼠经不同处理后的肿瘤生长曲线。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的优选实施例，证明本发明可以实施，所述实施例可以向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1. FBC-Lips脂质体药物的制备方法

本实施例用一种磷脂、胆固醇等原料将光敏剂药物包裹成纳米脂质体剂型。采用的制备方法为乙醇注入法，将磷脂：胆固醇按3:1的比例溶于无水乙醇中，超声一定的时间使其充分溶解在溶剂中，然后再加入一定量的FBC光敏剂药物（药脂比为1:10），超声使三者在无水乙醇中溶解完全，用注射器将有机溶剂逐滴加入到高速搅拌的水相中，乳化一个小时后成纳米混悬液，然后用透析袋（MWCO = 3500）在去离子水中透析，透析完过220 nm水相膜得到泛着乳光的FBC纳米脂质体。图1显示了FBC脂质体的紫外-可见光吸收光谱，说明脂质体成功负载FBC。仪器型号为Evolution 220UV-Vis，光谱扫描范围从300 nm到800 nm。

按实施例1的脂质体药物制备方法制备出HP-Lips脂质体药物，如图2。

实施例2. PEO-PDLA@FBC纳米粒子的制备方法

本实施例用PEO-PDLA嵌段共聚物包裹光敏剂FBC形成纳米粒子，解决了FBC脂溶性问题。将聚合物和光敏剂按10:1的比例溶于到1 mL四氢呋喃中，超声使其溶解均匀，用注射器将有机溶剂逐滴加入到5 mL水相中，搅拌12 h，形成均一的纳米溶液。将溶液装入透析袋（MWCO = 8000-14000）中，用去离子水透析除去有机溶液。按此方法得到了PEO-PDLA@FBC纳米粒子。图3显示了PEO-PDLA@FBC的紫外-可见光吸收光谱，说明了PEO-PDLA@FBC纳米粒子被成功制备。仪器型号为Evolution 220UV-Vis，光谱扫描范围从300 nm到800 nm。

按实施例2的纳米粒子方法制备出PEO-PDLA@HP纳米粒子，如图4。

实施例3.纳米粒子中单线态氧的产生能力

在本实施例中，以1,3-二苯异苯并呋喃（DPBF）作为单态氧捕获剂，来验证纳米颗粒经光照后能否产生单线态氧。将含有固定浓度的PEO-PDLA@FBC纳米粒子和DPBF的溶液加入石英试管中，750 nm激光照射15 s。由于纳米粒子单线态氧的产生与紫外可见光谱中DPBF吸光度的降低直接相关，据此，每3 s测定一次DPBF在420 nm处的吸光度，即可对所制备的PEO-PDLA@FBC纳米粒子在水溶液中单线态氧的产生效率进行评估。

同样地，用650 nm激光照射含PEO-PDLA@HP纳米粒子的DPBF水溶液15 s，每3 s测定一次DPBF水溶液在420 nm处的吸光度，得到一组吸光度下降的曲线。如图5和图6所示，PEO-PDLA@FBC纳米粒子吸光度的下降幅度大于PEO-PDLA@HP纳米粒子，表明PEO-PDLA@FBC纳米粒子产生单线态氧的速率高于PEO-PDLA@HP纳米粒子，能够有效地增强对肿瘤的杀伤效果。

实施例4.荧光方法的验证

本实施例显示了在生物样品中用荧光法检测光敏剂FBC含量的可行性。在室温条件下，用Lumina荧光光度计扫描空白血浆样品和含PEO-PDLA@FBC纳米粒子的血浆样品。激发波长为510 nm，发射波长为600-900 nm，激发和发射狭缝均为20 nm。图7的荧光光谱图表明血浆对PEO-PDLA@FBC纳米粒子的荧光测定无影响。

实施例5. PEO-PDLA@FBC纳米粒子的药代动力学研究

在本实施例中，将三种不同剂量的PEO-PDLA@FBC纳米粒子尾静脉注射到小鼠体内，在注射后的不同时间点用荧光检测药物在体内的含量，以说明药物在体内分布速度较快，而清除缓慢。

在昆明小鼠体内，尾静脉分别给予高（5 mg/kg）、中（2 mg/kg）、低剂量（1 mg/kg）的PEO-PDLA@FBC纳米溶液，分别于静脉注射给药后0.083、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h进行小鼠眼眶取血，血液置于1.5 mL含肝素钠的离心管中并混合均匀，以3000 r/min条件下低温离心15 min，取上层血浆样品0.2 mL于含1.8 mL生理盐水的离心管中，混匀测荧光。在510 nm下激发样品，并在600-900 nm的范围内记录荧光光谱。用测得的荧光标曲算出药物含量，得出三种药物剂量下的药代动力学曲线。如图8所示，药物在体内分布迅速，且清除缓慢，延长了光敏剂在体内的血液循环时间，从而提高了生物利用度。

实施例6. PEO-PDLA@FBC纳米粒子的生物组织分布分析

在本实施例中，将5 mg/kg剂量的PEO-PDLA@FBC纳米粒子尾静脉注射到小鼠体内，在注射后的不同时间点处死小鼠，解剖出小鼠组织，用荧光检测药物在不同组织里的含量。

尾静脉注射5 mg/kg的PEO-PDLA@FBC载药纳米溶液，分别于静脉注射给药后0.083、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h处死小鼠，迅速解剖取出心、肝、脾、肺、肾组织，用生理盐水洗去污渍，滤纸吸干后称重，加入20倍的生理盐水组织匀浆。组织匀浆4 ℃，3000 r/min离心15 min，取上清测荧光。用测得的荧光标曲算出药物含量，以研究药物在不同组织里随时间的分布变化。如图9所示，PEO-PDLA@FBC纳米粒子在正常组织里清除缓慢但残留较少，对组织几乎无毒性影响。

实施例7.体外细胞实验

为了进一步研究本发明所述卟啉光敏剂在光动力治疗中的应用，发明人还进行了体外细胞的实验。以多种癌细胞株为研究对象，采用MTT法测试细胞毒性，通过分光光度酶标仪测定吸光度。

以多种癌细胞为研究对象，用MTT法分别测定FBC-Lips和HP-Lips在无光照条件和光照条件下的细胞毒性，获得了图10和图11的细胞光毒性和暗毒性的数据图。实验表明：在不光照的情况下，FBC-Lips对细胞的生物相容性要好于HP-Lips，表明光敏剂FBC比血卟啉HP的毒性要小，在低浓度下对细胞基本没有杀伤作用。而在光照情况下，随着卟啉浓度的增加，细胞活性逐渐降低，即光毒性逐渐增强。且FBC-Lips对细胞的毒性要高于HP-Lips，说明经过激光照射后，FBC能产生足够的单线态氧，有效杀死肿瘤细胞。

同样地，以多种癌细胞为研究对象，用MTT法分别测定PEO-PDLA@FBC和PEO-PDLA@HP在无光照条件和光照条件下的细胞毒性，获得了图12和图13的细胞光毒性和暗毒性的数据图，实验结果与脂质体药物的研究相一致。

实施例8.尾静脉注射PEO-PDLA@FBC纳米粒子进行小鼠乳腺癌的PDT

本实施例表明，当暴露于适当波长的光时PEO-PDLA@FBC纳米粒子产生肿瘤退化/坏死作用。

肿瘤模型是4T1小鼠乳腺癌，在包含5％胎牛血清且补充有抗生素的RPMI培养基中培养。细胞在37 ℃和包含5％CO₂的潮湿大气中生长。将该癌细胞（1×10⁶）摄取到磷酸盐缓冲盐水中，并皮下移植到BALB/c小鼠的右侧腹。待肿瘤体积长到120-150 mm³左右时开始治疗。

将BALB/c裸鼠分为以下实验组：

（1）4只动物接受尾静脉注射2 mg/kg PEO-PDLA@HP；

（2）4只动物接受尾静脉注射2 mg/kg PEO-PDLA@FBC；

（3）4只动物接受尾静脉注射2 mg/kg PEO-PDLA@HP，650 nm光照7 min；

（4）4只动物接受尾静脉注射2 mg/kg PEO-PDLA@FBC，750 nm光照5 min；

（5）4只动物接受尾静脉注射PBS，作为对照组。

注射当天记为第0天，用游标卡尺测量肿瘤长度（L）和宽度（W）。后隔天测量小鼠肿瘤大小，用式V = 0.5 × L × W²计算体积并记录。然后用相对肿瘤体积的计算公式绘制14天内肿瘤生长曲线。相对肿瘤体积（RTV）= V/V₀（V₀为起始肿瘤体积）。

图14为尾静脉注射药物14天内，小鼠的肿瘤相对体积增长曲线。光照治疗组的动物肿瘤大小都要比未治疗组的小，说明光照FBC和HP都会产生单线态氧使癌细胞死亡，但是FBC的治疗效果要优于HP，FBC治疗后显示出更高的抑瘤效果。

实施例9.瘤内注射PEO-PDLA@FBC纳米粒子进行小鼠乳腺癌的PDT

本实施例表明，当暴露于适当波长的光时PEO-PDLA@FBC纳米粒子产生肿瘤退化/坏死作用。

肿瘤模型是4T1小鼠乳腺癌，在包含5％胎牛血清且补充有抗生素的RPMI培养基中培养。细胞在37 ℃和包含5％CO₂的潮湿大气中生长。将该癌细胞（1 × 10⁶）摄取到磷酸盐缓冲盐水中，并皮下移植到BALB/c小鼠的右侧腹。待肿瘤体积长到120-150 mm³左右时开始治疗。

将BALB/c裸鼠分为以下实验组：

（1）4只动物接受瘤内注射2 mg/kg PEO-PDLA@HP；

（2）4只动物接受瘤内注射2 mg/kg PEO-PDLA@FBC；

（3）4只动物接受瘤内注射2 mg/kg PEO-PDLA@HP，650 nm光照7 min；

（4）4只动物接受瘤内注射2 mg/kg PEO-PDLA@FBC，750 nm光照5 min；

（5）4只动物接受瘤内注射PBS，作为对照组。

注射当天记为第0天，用游标卡尺测量肿瘤长度（L）和宽度（W）。后隔天测量小鼠肿瘤大小，用式V = 0.5 × L × W²计算体积并记录。然后用相对肿瘤体积的计算公式绘制14天内肿瘤生长曲线。相对肿瘤体积（RTV）= V/V₀（V₀为起始肿瘤体积）。

图15为瘤内注射药物14天内，小鼠的肿瘤相对体积增长曲线，实验结果与尾静脉注射研究相一致。但相比于尾静脉注射，瘤内注射的PDT效果更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.近红外光敏剂纳米制剂，其特征在于，包含药物载体和最大吸收波长为750 nm的近红外疏水光敏剂药物（FBC），所示FBC具有以下结构：

。

2.根据权利要求1所述的近红外光敏剂纳米制剂，其特征在于，所述药物载体分别为脂质体和两亲性的聚环氧乙烷-聚右旋乳酸嵌段共聚物(PEO-PDLA)。

3.负载FBC光敏剂的脂质体药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将一定比例的FBC光敏剂药物、磷脂、胆固醇溶于无水乙醇中，超声使其溶解均匀；

（2）将均匀混合的有机相溶液用注射器缓慢滴注到高速搅拌恒温45 ℃的水相中，溶液逐渐由无色透明变为绿色混悬液，继续恒温乳化一个小时；

（3）将乳化后的纳米混悬液经透析后，再过220 nm水相膜得到泛着乳光的FBC-脂质体溶液（FBC-Lips）。

4.根据权利要求3所述的脂质体药物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，磷脂和胆固醇的质量比为（3-5）：1，FBC光敏剂药物和脂质体的质量比为1：（5-20）。

5.根据权利要求3所述的脂质体药物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述透析过程采用截留分子量为2000-5000的透析袋。

6.根据权利要求3所述的脂质体药物的制备方法，同样制备出负载血卟啉（HP）光敏剂的脂质体溶液（HP-Lips）。

7.负载FBC光敏剂的聚合物纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将一定量的近红外FBC光敏剂和PEO-PDLA嵌段共聚物溶于四氢呋喃中，超声使溶液混合均匀；

（2）将混匀的聚合物溶液逐滴缓慢的滴加到搅拌条件下的水相中，水溶液逐渐由无色透明变为绿色澄清溶液；

（3）纳米溶液经透析后，最终得到包裹成功的聚合物纳米溶液(PEO-PDLA@FBC)。

8.根据权利要求7所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，FBC光敏剂药物和两亲性嵌段聚合物的质量比为1：（5-20）。

9.根据权利要求7所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述透析过程采用截留分子量为7000-14000的透析袋。

10.根据权利要求7所述的纳米粒子的制备方法，同样的制备出负载血卟啉（HP）光敏剂的聚合物纳米粒子(PEO-PDLA@HP)。

11.一种如权利要求1-10任一项所述的脂质体药物和聚合物纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

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