CN115684381A - 艾博韦泰的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及艾博韦泰的检测方法，具体公开了检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，检测艾博韦泰产品中的杂质如多聚体的质控方法，以及确定艾博韦泰产品质量的方法。
Description
1技术领域
本发明公开的内容涉及艾博韦泰的检测方法，具体公开了检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，检测艾博韦泰产品中杂质如多聚体的质控方法，以及确定艾博韦泰产品质量的方法。
2背景技术
人免疫缺陷病毒(HIV)是导致获得性免疫缺损综合症(AIDS)的病毒，已成为世界上最严重的健康问题之一。HIV属于一类称为逆转录病毒的病毒。HIV-1包膜糖蛋白120(Env)复合物由三个结合受体的gp120亚单位和三个融合蛋白gp41亚单位组成，通过融合病毒和细胞膜介导病毒进入，并提供了开发抗病毒药剂的有吸引力的靶点。在融合反应期间，gp41胞外域的N-末端和C-末端七肽重复区(NHR和CHR)重折叠成稳定的六螺旋束状结构(6-HB)，呈现出有融合活性的构象，其可以桥接病毒和细胞膜用以合并。衍生自gp41 CHR的许多肽(C-肽)在低的纳摩尔浓度下特异性地抑制病毒进入，包括艾博韦泰，它是一种马来酰亚胺基丙酸(MPA)修饰的肽类HIV融合抑制剂。艾博韦泰可以与血清白蛋白不可逆地缀合。早先的研究展现了它的长体内半衰期和强力的抗HIV活性。
艾博韦泰为化学合成的由34个氨基酸组成、13位赖氨酸上ε-氨基连接N-{2-[2-(N-(3-顺丁烯二酰亚胺丙酰)氨基)乙氧]乙氧}乙酰基的多肽，其化学名称是：乙酰-色-谷-谷-色-天-精-谷-异亮-天胺-天胺-酪-苏-(N-{2-[2-(N-(3-顺丁烯二酰亚胺丙酰)氨基)乙氧]乙氧}乙酰)赖-亮-异亮-组-谷-亮-异亮-谷-谷-丝-谷胺-天胺-谷胺-谷胺-谷-赖-天胺-谷-谷胺-谷-亮-亮酰胺，分子式为：C204H306N54O72，以及具有4666.93的分子量，并且具有以下的化学结构：
艾博韦泰这类合成多肽药物，含有的有机杂质的杂质谱复杂，包含由起始物料引入的杂质、工艺相关的杂质和降解产生的杂质等。为确保合成多肽药物产品质量可控、安全、有效，需要有效检出各潜在杂质；而且有必要检测多肽药物的长效生物活性。
本发明提供的方法从不同角度对艾博韦泰产品的质量进行检测和评价，形成一个多维质量体系(totality of evidence)，确保艾博韦泰产品质量可控、安全、有效。
3发明概述
本文提供了一种艾博韦泰的检测方法，包括检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，其包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率。在某些实施方式中，所述色谱分析通过液相色谱进行，优选地，所述液相色谱是HPLC、UPLC或SEC。
在某些实施方式中，本文提供了一种艾博韦泰的检测方法，包括检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率；和(vii)基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，所述色谱分析通过液相色谱进行；优选地，所述液相色谱是HPLC、UPLC或SEC。
在某些实施方式中，本文提供了一种艾博韦泰的检测方法，包括检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率；和(vii)基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
在某些实施方式中，本文提供了一种艾博韦泰的检测方法，所述检测艾博韦泰产品的长效活性的方法还包含如下步骤：基于所述的艾博韦泰产品的结合率，确定所述艾博韦泰产品的质量；优选地，所述检测艾博韦泰产品的长效活性的方法基于所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物的结合率，反映所述艾博韦泰产品人血清白蛋白的结合率，从而确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，当所述结合率达到至少85％(优选为至少90％)，则确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。
在某些实施方式中，所述小分子化合物为氨基酸类小分子化合物，较佳地选自下组：包括但不限于半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、丙硫醇、乙酰半胱氨酸或者其二聚或者多聚体。在某些实施方式中，所述氨基酸类小分子化合物为L-半胱氨酸。在某些实施方式中，所述色谱分析通过液相色谱进行，优选地，所述液相色谱是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量。
在某些实施方式中，其中所述艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的二聚体。在某些实施方式中，其中所述艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的三聚体。在某些实施方式中，其中所述艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的四聚体。
在某些实施方式中，本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质(多聚体)的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量；和基于艾博韦泰多聚体的量，确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质(多聚体)的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量；和基于艾博韦泰多聚体的量，确定所述艾博韦泰产品是否适合用于治疗HIV-1感染对象。
在某些实施方式中，本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质(多聚体)的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量；和基于艾博韦泰多聚体的量，确定所述艾博韦泰产品是否适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。
在某些实施方式中，本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质(多聚体)的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量；和基于艾博韦泰多聚体的量，确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质(多聚体)的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量；和基于艾博韦泰多聚体的量，确定所述艾博韦泰产品是否适合用于治疗HIV-1感染对象。
在某些实施方式中，本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括检测艾博韦泰产品中杂质(多聚体)的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量；和基于艾博韦泰多聚体的量，确定所述艾博韦泰产品是否适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。
在某些实施方式中，所述的艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的二聚体。在某些实施方式中，所述的艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的三聚体。在某些实施方式中，所述的艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的二聚体和艾博韦泰的三聚体。
在某些实施方式中，其中当艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.5％)时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1感染对象。
在某些实施方式中，其中当艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.5％)时，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品的质量的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品结合率；(ii)当所述结合率达到至少85％(优选为至少90％)，则确定艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法的方法，包括如下步骤：(1)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品结合率；(2)当所述结合率达到至少85％(优选为至少90％)，则确定艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
在某些实施方式中，本文公开了本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品的质量的方法，包括如下步骤：(1)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品结合率；(2)当所述结合率达到至少85％(优选为至少90％)，则确定艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，所述艾博韦泰产品结合率通过如下步骤确定：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，以确定所述艾博韦泰产品的结合率。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法的方法，包括如下步骤：(1)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品结合率；(2)当所述结合率达到至少85％，则确定艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。在某些实施方式中，所述艾博韦泰产品结合率通过如下步骤确定：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，以确定所述艾博韦泰产品的结合率。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品的质量的方法，包括如下步骤：(1)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰多聚体的量；(2)满足如下条件时，则确定艾博韦泰产品的质量：(a)所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.10％)，或(b)所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品是否适用于治疗HIV-1感染对象的方法，包括如下步骤：(1)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰多聚体的量；(2)满足如下条件时，则确定艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1感染对象：(a)所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.10％)，或(b)所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品是否适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物的方法，包括如下步骤：(1)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰多聚体的量；(2)满足如下条件时，则确定艾博韦泰产品适用于制备治疗HIV-1感染对象的药物：所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.10％)，或(b)所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％。在某些实施方式中，所述色谱分析是HPLC、UPLC或SEC。
本文公开了一种艾博韦泰的检测方法，还包括确定艾博韦泰产品质量的方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，分别检测艾博韦泰单体主峰、艾博韦泰的二聚体、和艾博韦泰的三聚体的峰的面积，选择符合以下条件的艾博韦泰产品：艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。
4附图说明
图1是艾博韦泰有关物质Ⅱ系统适用性溶液典型色谱图。
图2是HSA、艾博韦泰-HSA结合物质谱图，其中，A为Cys-HSA结合物的质谱图；B为HSA的质谱图；C为ABT-HSA结合物的质谱图(即色谱图3中的C、色谱峰RT 15.8min)。
图3是HSA、艾博韦泰(即FB006M)、艾博韦泰与HSA混合物高效液相色谱图，其中，A为HSA色谱图；B为艾博韦泰色谱图；C为艾博韦泰与HSA于37℃反应15min时的色谱图；D为艾博韦泰与HSA于37℃反应8h的色谱图。
图4是大鼠血浆、艾博韦泰(即FB006M)、艾博韦泰与血浆混合物的高效液相色谱图，其中A为大鼠血浆色谱图；B为艾博韦泰色谱图；C为艾博韦泰与大鼠血浆于37℃反应85min后的色谱图。
图5是人血清白蛋白与艾博韦泰反应混合物的高效液相色谱图(全图)，其中最上方曲线为ABT-HSA结合物色谱图，中间曲线为HSA色谱图，最下方曲线为2％ABT自身对照色谱图。
图6是人血清白蛋白与艾博韦泰反应混合物的高效液相色谱图(局部放大最上方曲线为ABT-HSA结合物色谱图，中间曲线为HSA色谱图，最下方曲线为2％ABT自身对照色谱图。
图7是半胱氨酸∶艾博韦泰比率与结合率的关系曲线图。
5发明详述
5.1定义
要理解的是，公开内容不局限于本文阐述的特定实施方式，还要理解的是，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，而不意图是限制性的。
如本文使用的，词语“一”和“所述”是指一个或超过一个的所述词语的语法对象。举例来说，一试剂是指一个试剂或两个或更多个试剂。
如本文使用的，术语“对象”是指哺乳动物。对象可以是人类或非人类哺乳动物，例如，狗、猫、牛、马、小鼠、大鼠、兔或其转基因物种。对象可以是人类。
如本文使用的，“艾博韦泰产品”是指艾博韦泰的原料药、含有艾博韦泰的制剂、或含有艾博韦泰的药物组合物。
如本文使用的，“艾博韦泰产品结合率”或“艾博韦泰结合率”或“结合率”是指与化合物形成化学键或发生化学反应(例如：加成反应)艾博韦泰的量，相对于与化合物接触之前的艾博韦泰的量的比率。所小分子述化合物包括能够与艾博韦泰中的马来酰亚胺基团发生反应，包括但不限于含有硫醇基团的小分子化合物(其中含有一个自由巯基的稳定的试剂或化合物，包括但不限于半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、丙硫醇、乙酰半胱氨酸或者其二聚或者多聚体等)。艾博韦泰与本发明的化合物的结合率可以模拟艾博韦泰与人血清白蛋白的结合，定量地反映在体内发挥艾博韦泰长效作用的马来酰亚胺基团，从而评估艾博韦泰与白蛋白的结合能力，评价艾博韦泰产品中艾博韦泰的长效活性。
如本文使用的，艾博韦泰的“多聚体杂质”或“多聚体”是指，超过一个艾博韦泰分子形成的聚合物，包括但不限于，艾博韦泰分子的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等，单独或其任意组合。在某些实施方式中，所述二聚体是由一个艾博韦泰分子中的马来酰亚胺与另一个艾博韦泰分子中的侧链基团发生反应形成。
如本文使用的，艾博韦泰的“多聚体杂质”或“多聚体”的量是基于在本文所述的色谱分析中测定的曲线下面积(AUC)确定的。在某些实施方式中，分别测定：对应待测多聚体的峰的AUC、以及对应艾博韦泰的峰的AUC，通过两者的比率或者调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品中“多聚体杂质”或“多聚体”的量。在某些实施方式中，分别测定：对应待测多聚体的峰的AUC、以及对应艾博韦泰有关物质的峰的AUC，通过它们的比率或者调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品中“多聚体杂质”或“多聚体”的量。
如本文使用的，艾博韦泰的“长效维持疗法”或“长效作用”或“长效性”是指，当施用艾博韦泰产品后，药效在施用对象中持续时间至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少20天、或至少30天，优选为15天；或者当施用艾博韦泰产品后，艾博韦泰在体内具有大于5小时、大于10小时、大于15小时、大于20小时、大于25小时、大于30小时、大于35小时、大于40小时、大于45小时、大于50小时、大于55小时、或大于60小时的半衰期，优选为在人体内具有15天的半衰期。
如本文使用的，“确定艾博韦泰产品质量”或“确定质量”是指，所述艾博韦泰产品质量合格，可以申报放行、可以申报货架期、和/或可以上市等。艾博韦泰产品质量合格是符合下列任一项的单独或其组合：
(1)艾博韦泰产品具有以下任一项或其结合的抗病毒活性：
(a)在体外试验中评价了艾博韦泰-白蛋白结合物的抗病毒活性。艾博韦泰在PBMCs中对8种HIV-1亚型病毒(A、B、C、EA和G重组子)的IC50为0.5～4.8nM。艾博韦泰对中国28个流行株CRF07-BC、CRF01-AE、和B’亚型的平均IC50值为5.2nM、6.9nM和9.5nM；和/或
(b)采用免疫缺陷小鼠移植人体胚胎胸腺与肝细胞后再感染HIV-1病毒的体内药效学模型(SCID-hu Thy/Liv小鼠)评价了艾博韦泰皮下注射给药的体内抗病毒活性，10mg/kg艾博韦泰每日和隔日皮下给药1次(大致相当于小鼠白蛋白的2个和4个半衰期间隔)，均显示了明显的抗病毒活性；和/或
(2)艾博韦泰产品具有以下任一项或其结合的高耐药障碍：
(a)体外诱导耐药试验显示艾博韦泰的耐药障碍较高，病毒传代至第9代产生了对艾博韦泰的耐药性，敏感性降低159倍，并与恩夫韦肽有交叉耐药，主要突变位点是Q40K、N126K和K144I；
(b)HIV-1感染者接受艾博韦泰和LPV/r联合治疗24～48周后HIV-RNA>400copies/ml，其HIV病毒的gp41序列未发现与融合抑制剂相关的耐药突变；和/或
(c)体外试验显示，在第36、38、42、43蛋白位点有基因突变的对恩夫韦肽耐药的实验室HIV-1病毒株对艾博韦泰产品敏感；和/或
(3)艾博韦泰产品符合下列任一项或其结合的药代动力学：
(a)在成人HIV-1感染者中进行单次和多次静脉给药的艾博韦泰产品的药代动力学研究。受试者单次静脉滴注320mg艾博韦泰，药代动力学参数AUC0-∞为3012.6±373.0mg·h/L、Cmax 61.9±5.6mg/L。AUC0-∞与剂量之间呈良好的线性关系，艾博韦泰符合线性消除规律；
(b)HIV-1感染者每周一次静脉滴注320mg艾博韦泰产品，稳态药代动力学参数AUC0-∞为4946.3±407.1mg·h/L、Cmax为57.0±7.9mg/L、谷浓度Ctrough为6.9mg/L；
(c)大鼠分布、排泄试验表明，艾博韦泰可较好的分布到体内各个组织器官，在全血中的含量最高，其次是肾和卵巢组织，其余组织药物含量较少，以脑、体脂和睾丸最少。其体内主要消除途径为经肾脏排泄；和/或
(d)体外试验显示，艾博韦泰产品对人肝微粒体中六种主要P450代谢酶(CYP1A2、2C8、2C9、2C19、2D6和3A4)的体外活性没有明显影响；和/或
(4)艾博韦泰产品没有遗传毒性，即艾博韦泰的Ames试验、体外CHL细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验结果均为阴性；和/或
(5)艾博韦泰产品没有生殖毒性，即
(a)在大鼠生育力和早期胚胎发育毒性试验中，Wistar大鼠分别静脉给予艾博韦泰30、60、120mg/kg，各组雄鼠从交配前4周至解剖给药，雌鼠从交配前2周至妊娠第8天给药，每2天1次。结果未见艾博韦泰对雌、雄大鼠生育力及胚胎形成发育有干扰或毒性作用，对亲代大鼠的生殖功能毒性、胚胎形成及发育的未见明显毒性剂量(NOAEL)均为120mg/kg，以体表面积计，为成人剂量的4倍；
(b)在大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验中，妊娠Wistar大鼠于妊娠第6～16天每2天1次经静脉给予艾博韦泰30、60、120mg/kg，艾博韦泰对孕鼠、胚胎及胎仔外观、骨骼及内脏指标均未见明显异常改变，对亲代孕鼠、胚胎及胎仔发育的未见明显毒性剂量(NOAEL)均为120mg/kg，以体表面积计，为成人剂量的4倍。毒代动力学显示，艾博韦泰在孕鼠体内未见明显蓄积；和/或
(c)在兔胚胎-胎仔发育毒性试验中，妊娠兔于妊娠第6～18天每3天1次经静脉给予艾博韦泰15、30、60mg/kg，除60mg/kg组孕兔有1只(1/13)动物早产，舌骨骨化不全百分率较对照组有升高趋势之外，其余孕兔及胎兔的外观、骨骼及内脏指标均未见明显异常改变。艾博韦泰对亲代孕兔、胚胎及胎仔发育的未见明显毒性剂量(NOAEL)均为30mg/kg，以暴露量计，为成人剂量的3.9倍。毒代动力学显示，艾博韦泰在孕兔体内未见明显蓄积。
5.2检测艾博韦泰长效活性的定量方法和质控方法
艾博韦泰通过与白蛋白结合发挥其长效作用(艾博韦泰侧链上的马来酰亚胺基团与白蛋白34位半胱氨酸上的自由巯基结合)。但是，定量检测艾博韦泰与白蛋白的结合率有技术难度。首先，白蛋白试剂分子量高，而且是一种组分、结构复杂的混合物，结合率检测中需用到高质量浓度的人血清白蛋白(HSA)，使得HSA试剂导致的本底响应处于高水平；同时，不管是血液来源的白蛋白，或生物发酵来源的白蛋白，其生产工艺的特点均易导致较多干扰未结合物检测的本底物质，而且这些本底物质的批次间重复性较差，故HSA仅适用于作为定性考察和机制研究用试剂，不适合作为定量用质控试剂，需寻找更合适的结合试剂。
本发明人令人意外的发现，艾博韦泰与小分子化合物(包括但不限于含有硫醇基团的小分子化合物)的结合，可以模拟其与人血清白蛋白的结合，定量地反映艾博韦泰在体内发挥其长效作用的马来酰亚胺基团，从而可确定所述艾博韦泰产品的质量；具备质控方法所需要的快速、准确、可重现的特点。
当使用化合物(包括但不限于含有硫醇基团的小分子化合物)与艾博韦泰反应时，该化合物(包括但不限于含有硫醇基团的小分子化合物)与艾博韦泰结合后，结合物色谱保留时间发生变化，采用色谱分析进行分离，根据结合后对应主峰保留时间下的曲线下面积，经计算求得主峰中发生结合的百分比，即能定量测定艾博韦泰中结合的3-马来酰亚胺基丙酸(MPA)，作为艾博韦泰长效结合活性的定量指证。在某些实施方式中，所述含有硫醇基团的化合物为含有一个自由巯基的稳定的试剂或化合物，优选为氨基酸类小分子化合物，包括但不限于半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、丙硫醇、乙酰半胱氨酸或者其二聚或者多聚体；所述氨基酸类小分子化合物优选为L-半胱氨酸。
在某些实施方式中，本文公开了一种检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与小分子化合物反应得到反应液；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率。
在某些实施方式中，公开了一种检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与小分子化合物反应得到反应液；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率；和(vii)基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，公开了一种检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与小分子化合物反应得到反应液；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率；和(vii)基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。
在某些实施方式中，可用的化合物可以是含有硫醇基团的化合物，其优选为氨基酸类小分子化合物包括但不限于：半胱氨酸(包括L-半胱氨酸、D-半胱氨酸)、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、和/或乙酰半胱氨酸。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是半胱氨酸。在某些实施方式中，所述氨基酸类小分子化合物优选为L-半胱氨酸。
在某些实施方式中，公开了一种检测艾博韦泰产品长的效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是半胱氨酸。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是L-半胱氨酸。
在某些实施方式中，公开了一种检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率；和(vii)基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是半胱氨酸。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是L-半胱氨酸。
在某些实施方式中，公开了一种检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液，其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率；和(vii)基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是半胱氨酸。在某些实施方式中，含有硫醇基团的化合物是L-半胱氨酸。
在某些实施方式中，可用于检测艾博韦泰产品结合率的色谱分析包括：高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、尺寸排阻色谱(SEC)、动态光散射测试(DLS)、差示扫描量热计(差示扫描量热计)、iso-asp定量、效价、UV/Vis光谱和傅里叶变换红外光谱(FTIR)。
在某些实施方式中，用于检测艾博韦泰产品结合率的色谱分析是HPLC。在某些实施方式中，用于检测艾博韦泰产品结合率的色谱分析是UPLC。在某些实施方式中，用于检测艾博韦泰产品结合率的色谱分析是SEC。
在某些实施方式中，用于检测艾博韦泰产品结合率的色谱分析是HPLC。对于色谱分析的条件，本领域技术人员可以容易的、根据有关物质的化学性质和经验来确定，包括但不限于：合适的色谱柱、流动相和稀释剂的组成、检测波长、柱温、流速、进样量、稀释剂的比例、梯度洗脱的时间等。在某些实施方式中，使用反向色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用硅胶色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用基质粒径为0.5-10μm的色谱柱进行分析，或者0.5-9μm、0.5-8μm、0.5-7μm、0.5-6μm、0.5-5μm、0.5-4.5μm、0.5-4μm、0.5-3.5μm、0.5-3μm、0.5-2μm、0.5-1.7μm、0.5-1.5μm、0.5-1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、1.7μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm的色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用基质孔径为
的色谱柱，或者基质孔径为
的色谱柱。在某些实施方式中，可用于色谱分析的流动相和稀释剂的溶剂包括但不限于：水、三氟乙酸(TFA)、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇，单独或其任意组合。在某些实施方式中，使用水、TFA、乙腈，单独或其组合来作为流动相或稀释剂。在某些实施方式中，流动相是含有水和TFA的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈和TFA的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有水、TFA和乙腈的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有水、TFA和乙腈的溶液。在某些实施方式中，使用214nm的检测波长。在某些实施方式中，使用柱温20-50℃，或者20-40℃，或者20-30℃，或者30-50℃，或者30-50℃，或者40-50℃，或者20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃的柱温。在某些实施方式中，使用流速0.05–2.0ml/min，或者0.05–1.75ml/min，或者0.05–1.5ml/min，或者0.05–1.25ml/min，或者0.05–1.0ml/min，或者0.05–0.75ml/min，或者0.05–0.5ml/min，或者0.05–0.4ml/min，或者0.05–0.3ml/min，或者0.05–0.2ml/min，或者0.05–0.1ml/min，或者0.05ml/min、0.1ml/min、0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.25ml/min、1.5ml/min、1.75ml/min、2.0ml/min的流速。在某些实施方式中，进样量为10-200μL、10-150μL、10-100μL、10-90μL、10-80μL、10-70μL、10-60μL、10-50μL、10-40μL、10-30μL、10-20μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、150μL、200μL。在某些实施方式中，梯度洗脱的时间为15-120分钟，或者15-100分钟，或者15-90分钟，或者15-80分钟，或者15-70分钟，或者15-60分钟，或者15-50分钟，或者15-40分钟，或者15-30分钟，或者15-20分钟，或者15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120分钟。在某些实施方式中，使用的色谱柱是Welch Ultimate XB-C18,4.6*250mm,5μm。
当化合物与艾博韦泰产品结合后，采用相同的色谱条件，测定艾博韦泰产品与化合物结合前的主峰的曲线下面积以及结合后的主峰的曲线下面积，该主峰对应艾博韦泰活性成分，从而计算艾博韦泰活性成分与所述化合物发生结合的百分比，从而反映在体内与白蛋白结合的艾博韦泰活性成分的百分比，以此评价艾博韦泰产品的长效作用(即，作为HIV-1感染对象的长效维持疗法)。
在某些实施方式中，提供了一种确定艾博韦泰产品的质量的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品结合率；(ii)当所述结合率达到至少85％(优选为至少90％)，则确定艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，提供了一种确定艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品结合率；(ii)当所述结合率达到至少85％(优选为至少90％)，则确定艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。
在某些实施方式中，所述艾博韦泰产品的结合率通过如下步骤确定：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应得到反应液；(iv)对步骤(iii)之后的艾博韦泰产品得到的反应液进行色谱分析；(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率或者第二AUC和第一AUC的调整后的比率，确定所述艾博韦泰产品的结合率。
在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少50％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少55％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少60％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少65％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少70％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少75％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少80％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少85％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少90％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少95％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少96％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少97％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少98％时，确定所述艾博韦泰产品的质量；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少99％时，确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少50％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少55％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少60％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少65％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少70％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少75％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少80％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少85％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少90％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少95％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少96％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少97％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少98％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少99％时，确定所述艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1的感染对象。
在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少50％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少55％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少60％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少65％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少70％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少75％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少80％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少85％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少90％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少95％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少96％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少97％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少98％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法；在某些实施方式中，当艾博韦泰产品的结合率达到至少99％时，确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。
5.3检测艾博韦泰产品中杂质的色谱分析和质控方法
艾博韦泰产品中可能含有马来酰亚胺未被破坏的酰胺水解物、异构体杂质、缺失肽、断裂肽等杂质，检测这些杂质也是艾博韦泰产品质控的重要部分。在长期稳定性试验中，艾博韦泰的主要降解产物有脱酰胺水解产物和二聚体。
发明人开发了有效的检测和质控方法，可以有效分离和检测艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰杂质，包括但不限于艾博韦泰多聚体杂质等。艾博韦泰产品中含有的多聚体杂质，包括但不限于艾博韦泰的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等，单独或其任意组合。
在某些实施方式中，可用色谱分析检测艾博韦泰杂质，可用色谱分析包括：高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、尺寸排阻色谱(SEC)、动态光散射测试(DLS)、差示扫描量热计(差示扫描量热计)、iso-asp定量、效价、UV/Vis光谱和傅里叶变换红外光谱(FTIR)。SEC(J.Pharm.Scien.,83:1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,1 1:485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15:1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14:1 133-1 140(1986))测量产品中的单体百分比，并给出可溶聚集物的数量的信息。这些方法仅是用于评估产品稳定性的本领域技术人员公知的示范性方法。举例来说，UV/Vis光谱法测量散射光强度并给出关于可溶的和不溶的聚集物的数量的信息。UV光谱法测量吸光度并给出蛋白质浓度的信息。FTIR(Eur.J.Pharm.Biopharm.,45:231(1998)；Pharm.Res.,12:1250(1995)；J.Pharm.Scien.,85:1290(1996)；J.Pharm.Scien.,87:1069(1998))测量酰胺区域中的IR光谱，给出蛋白质二级结构的信息。
在某些实施方式中，可用的色谱分析是液相色谱分析。在某些实施方式中，可用的色谱分析是高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)或尺寸排阻色谱(SEC)。在某些实施方式中，可用的色谱分析是高效液相色谱(HPLC)。在某些实施方式中，可用的色谱分析是超高效液相色谱(UPLC)。在某些实施方式中，可用的色谱分析是尺寸排阻色谱(SEC)。
在某些实施方式中，本文公开了一种检测艾博韦泰产品中杂质的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰杂质的量。在某些实施方式中，艾博韦泰杂质包括但不限于马来酰亚胺未被破坏的酰胺水解物、异构体杂质、多聚体杂质等。
在某些实施方式中，本文公开了一种检测艾博韦泰产品中杂质的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰杂质的量；和基于艾博韦泰杂质的量，确定艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，艾博韦泰杂质包括但不限于马来酰亚胺未被破坏的酰胺水解物、异构体杂质、多聚体杂质等。
在某些实施方式中，本文公开了一种检测艾博韦泰产品中杂质的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰杂质的量；和基于艾博韦泰杂质的量，确定所述艾博韦泰产品是否适合用于治疗HIV-1感染对象。在某些实施方式中，艾博韦泰杂质包括但不限于马来酰亚胺未被破坏的酰胺水解物、异构体杂质、多聚体杂质等。
在某些实施方式中，本文公开了一种检测艾博韦泰产品中杂质的质控方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的杂质的量；和基于艾博韦泰杂质的量，确定所述艾博韦泰产品是否适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。在某些实施方式中，艾博韦泰杂质包括但不限于马来酰亚胺未被破坏的酰胺水解物、异构体杂质、多聚体杂质等。
在某些实施方式中，本文公开了一种确定艾博韦泰产品的质量的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰多聚体的量；(ii)满足如下条件时，则确定艾博韦泰产品的质量：所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.15％)。
在某些实施方式中，本文公开了一种确定艾博韦泰产品是否适用于治疗HIV-1感染对象的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰多聚体的量；(ii)满足如下条件时，则确定艾博韦泰产品适用于治疗HIV-1感染对象：所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.15％)。
在某些实施方式中，本文公开了一种确定艾博韦泰产品适用于制备治疗HIV-1感染对象的药物的方法，包括如下步骤：(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，以确定艾博韦泰产品中含有的艾博韦泰多聚体的量；(ii)满足如下条件时，则确定艾博韦泰产品适用于制备治疗HIV-1感染对象的药物适用于制备治疗HIV-1感染对象的药物：所述艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％(优选为不超过0.15％)。
可用于检测艾博韦泰产品中的多聚体杂质的色谱分析，包括但不限于：高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、尺寸排阻色谱(SEC)、动态光散射测试(DLS)、差示扫描量热计(差示扫描量热计)、iso-asp定量、效价、UV/Vis光谱和傅里叶变换红外光谱(FTIR)。
本文公开了一种确定艾博韦泰产品质量的方法，包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，分别检测艾博韦泰单体主峰、艾博韦泰的二聚体、和艾博韦泰的三聚体的峰的面积，选择符合以下条件的艾博韦泰产品：艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。
在某些实施方式中，用于检测有关物质的所述液相色谱分析是UPLC。对于色谱分析的条件，本领域技术人员可以容易的、根据有关物质的化学性质和经验来确定，包括但不限于：合适的色谱柱、流动相和稀释剂的组成、检测波长、柱温、流速、进样量、稀释剂的比例、梯度洗脱的时间等。在某些实施方式中，使用反向色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用硅胶色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用基质粒径为0.5-10μm的色谱柱进行分析，或者0.5-9μm、0.5-8μm、0.5-7μm、0.5-6μm、0.5-5μm、0.5-4.5μm、0.5-4μm、0.5-3.5μm、0.5-3μm、0.5-2μm、0.5-1.7μm、0.5-1.5μm、0.5-1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、1.7μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm的色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用基质孔径为
的色谱柱，或者基质孔径为
的色谱柱。在某些实施方式中，可用于色谱分析的流动相和稀释剂的溶剂包括但不限于：水、三氟乙酸(TFA)、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇，单独或其任意组合。在某些实施方式中，使用水、TFA、乙腈，单独或其组合来作为流动相或稀释剂。在某些实施方式中，流动相是含有水和TFA的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈和TFA的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有水、TFA和乙腈的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有水、TFA和乙腈的溶液。在某些实施方式中，使用214nm的检测波长。在某些实施方式中，使用柱温20-50℃，或者20-40℃，或者20-30℃，或者30-50℃，或者30-50℃，或者40-50℃，或者20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃的柱温。在某些实施方式中，使用流速0.05–2.0ml/min，或者0.05–1.75ml/min，或者0.05–1.5ml/min，或者0.05–1.25ml/min，或者0.05–1.0ml/min，或者0.05–0.75ml/min，或者0.05–0.5ml/min，或者0.05–0.4ml/min，或者0.05–0.3ml/min，或者0.05–0.2ml/min，或者0.05–0.1ml/min，或者0.05ml/min、0.1ml/min、0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.25ml/min、1.5ml/min、1.75ml/min、2.0ml/min的流速。在某些实施方式中，进样量为0.5-20μL、0.5-15μL、0.5-10μL、0.5-9μL、0.5-8μL、0.5-7μL、0.5-6μL、0.5-5μL、0.5-4μL、0.5-3μL、0.5-2μL、0.5-1μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL。在某些实施方式中，梯度洗脱的时间为15-120分钟，或者15-100分钟，或者15-90分钟，或者15-80分钟，或者15-70分钟，或者15-60分钟，或者15-50分钟，或者15-40分钟，或者15-30分钟，或者15-20分钟，或者15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120分钟。在某些实施方式中，使用Waters Acuity UPLC PeptideBEH C18,2.1*150mm,1.7μm,
的色谱柱。
在某些实施方式中，用于检测有关物质的所述液相色谱分析是SEC。对于色谱分析的条件，本领域技术人员可以容易的、根据有关物质的化学性质和经验来确定，包括但不限于：合适的色谱柱、流动相和稀释剂的组成、检测波长、柱温、流速、进样量、稀释剂的比例、等度洗脱的时间等。在某些实施方式中，使用反向色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用硅胶色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用球状亲水改性硅胶色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用基质粒径为0.5-10μm的色谱柱进行分析，或者0.5-9μm、0.5-8μm、0.5-7μm、0.5-6μm、0.5-5μm、0.5-4.5μm、0.5-4μm、0.5-3.5μm、0.5-3μm、0.5-2μm、0.5-1.7μm、0.5-1.5μm、0.5-1μm、0.5μm、1μm、1.5μm、1.7μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm的色谱柱进行分析。在某些实施方式中，使用基质孔径为
的色谱柱，或者基质孔径为
的色谱柱。在某些实施方式中，可用的流动相和稀释剂的溶剂包括但不限于：水、三氟乙酸(TFA)、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇，单独或其任意组合。在某些实施方式中，使用水、TFA、乙腈，单独或其组合来作为流动相或稀释剂。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-70：70-30：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-65：70-25：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-60：70-40：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-55：70-45：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-50：70-50：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-45：70-55：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-40：70-60：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为30-35：70-65：0.05-2.0)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为35：65：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为35：65：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为35：65：0.1)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为40：60：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为40：60：0.1)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为45：55：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为45：55：0.1)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为50：50：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为50：50：0.1)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为55：45：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为55：45：0.1)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为60：40：0.05)的溶液。在某些实施方式中，流动相是含有乙腈、水和TFA(比例为60：40：0.1)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例是35：65：0.05)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例是35：65：0.1)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为40：60：0.05)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为40：60：0.1)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为45：55：0.05)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为45：55：0.1)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为50：50：0.05)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为50：50：0.1)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为55：45：0.05)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为55：45：0.1)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为60：40：0.05)的溶液。在某些实施方式中，稀释剂是含有乙腈、水和TFA(比例为60：40：0.1)的溶液。在某些实施方式中，所述比例是体积比或者重量比。在某些实施方式中，使用214nm的检测波长。在某些实施方式中，使用柱温20-50℃，或者20-40℃，或者20-30℃，或者30-50℃，或者30-50℃，或者40-50℃，或者20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃的柱温。在某些实施方式中，使用流速0.05–2.0ml/min，或者0.05–1.75ml/min，或者0.05–1.5ml/min，或者0.05–1.25ml/min，或者0.05–1.0ml/min，或者0.05–0.75ml/min，或者0.05–0.5ml/min，或者0.05–0.4ml/min，或者0.05–0.3ml/min，或者0.05–0.2ml/min，或者0.05–0.1ml/min，或者0.05ml/min、0.1ml/min、0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.25ml/min、1.5ml/min、1.75ml/min、2.0ml/min的流速。在某些实施方式中，进样量为0.5-40μL、0.5-35μL、0.5-30μL、0.5-25μL、0.5-20μL、0.5-15μL、0.5-10μL、0.5-9μL、0.5-8μL、0.5-7μL、0.5-6μL、0.5-5μL、0.5-4μL、0.5-3μL、0.5-2μL、0.5-1μL、1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL。在某些实施方式中，等度洗脱的时间为15-60分钟，或者15-55分钟，15-50分钟，15-45分钟，或者15-40分钟，15-35分钟，或者15-30分钟，15-25分钟，或者15-20分钟，或者15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60分钟。在某些实施方式中，使用TSKgel G2000SWXL,7.8×300mm,5μm的色谱柱进行分析。
在某些实施方式中，基于艾博韦泰产品中多聚体杂质的量，来确定所述艾博韦泰产品的质量，该多聚体杂质的量是基于UPLC色谱分析确定的。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，基于艾博韦泰产品中多聚体杂质的量，来确定所述艾博韦泰产品的质量，该多聚体杂质的量是基于SEC色谱分析确定的。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，确定所述艾博韦泰产品的质量。
在某些实施方式中，基于艾博韦泰产品中多聚体杂质的量，确定所述艾博韦泰产品适合用于治疗HIV-1感染对象，该多聚体杂质的量是基于UPLC色谱分析确定的。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，确定所述艾博韦泰产品适合用于治疗HIV-1感染对象。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，确定所述艾博韦泰产品适合用于治疗HIV-1感染对象。
在某些实施方式中，基于艾博韦泰产品中多聚体杂质的量，确定所述艾博韦泰产品适合用于治疗HIV-1感染对象，该多聚体杂质的量是基于SEC色谱分析确定的。在某些实施方式中，艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，确定所述艾博韦泰产品适合用于治疗HIV-1感染对象。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，确定所述艾博韦泰产品适合用于治疗HIV-1感染对象。
在某些实施方式中，基于艾博韦泰产品中多聚体杂质的量，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物，该多聚体杂质的量是基于UPLC色谱分析确定的。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。
在某些实施方式中，基于艾博韦泰产品中多聚体杂质的量，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物，该多聚体杂质的量是基于SEC色谱分析确定的。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，确定所述艾博韦泰产品的质量。在某些实施方式中，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，确定所述艾博韦泰产品适合用于制备治疗HIV-1感染对象的药物。
5.4确定艾博韦泰产品质量的方法
本文提供了一种确定艾博韦泰产品质量的方法，包括如下步骤：(A)对所述艾博韦泰的产品进行色谱分析，确定所述艾博韦泰产品的结合率达到至少85％(优选为至少90％)；以及(B)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，确定所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量，其中所述艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。
5.5艾博韦泰产品
在某些实施方式中，相对于对照组，当施用的艾博韦泰产品的结合率达到至少50％时，至少55％时，至少60％时，至少65％时，至少70％时，至少75％时，至少80％时，至少85％时，至少90％时，至少95％时，至少96％时，至少97％时，至少98％时，或至少99％时，施用后对象获得了临床益处。在某些实施方式中，所述临床益处包括：发生率≧2％的临床不良反应的发生率小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％。在某些实施方式中，所述临床不良反应选自腹泻、胃肠炎、皮疹、头痛、头晕、血尿症等。所述临床益处还包括：实验室异常值降低至少30％、至少20％、至少10％、至少5％、至少4％、至少3％、至少2％、至少1％、至少0.9％、至少0.8％、至少0.7％、至少0.6％、至少0.5％、至少0.4％、至少0.3％、至少0.2％、至少0.1％。在某些实施方式中，实验室异常值选自：血甘油三酯升高、血胆固醇升高、高脂血症、高甘油三酯血症、丙氨酸氨基转移酶升高、天门冬氨酸氨基转移酶升高、γ-谷氨酰转移酶升高、高胆红素血症和血尿酸升高等。
在某些实施方式中，相对于对照组，当施用的艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，施用的对象获得了临床益处。在某些实施方式中，相对于对照组，当施用的艾博韦泰产品中艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，施用的对象获得了临床益处。在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，施用后的对象获得了临床益处。在某些实施方式中，所述临床益处包括：发生率≧2％的临床不良反应的发生率小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％。在某些实施方式中，所述临床不良反应选自腹泻、胃肠炎、皮疹、头痛、头晕、血尿症等。在某些实施方式中，所述临床益处还包括：实验室异常值降低至少30％、至少20％、至少10％、至少5％、至少4％、至少3％、至少2％、至少1％、至少0.9％、至少0.8％、至少0.7％、至少0.6％、至少0.5％、至少0.4％、至少0.3％、至少0.2％、至少0.1％。在某些实施方式中，实验室异常值选自：血甘油三酯升高、血胆固醇升高、高脂血症、高甘油三酯血症、丙氨酸氨基转移酶升高、天门冬氨酸氨基转移酶升高、γ-谷氨酰转移酶升高、高胆红素血症和血尿酸升高等。
在某些实施方式中，所述临床益处包括：发生率≧2％的临床不良反应的发生率小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％。在某些实施方式中，所述临床不良反应选自腹泻、胃肠炎、皮疹、头痛、头晕、血尿症等。所述临床益处还包括：实验室异常值降低至少30％、至少20％、至少10％、至少5％、至少4％、至少3％、至少2％、至少1％、至少0.9％、至少0.8％、至少0.7％、至少0.6％、至少0.5％、至少0.4％、至少0.3％、至少0.2％、至少0.1％。在某些实施方式中，实验室异常值选自：血甘油三酯升高、血胆固醇升高、高脂血症、高甘油三酯血症、丙氨酸氨基转移酶升高、天门冬氨酸氨基转移酶升高、γ-谷氨酰转移酶升高、高胆红素血症和血尿酸升高等。
在某些实施方式中，相对于对照组，当施用艾博韦泰产品的结合率达到至少50％时，至少55％时，至少60％时，至少65％时，至少70％时，至少75％时，至少80％时，至少85％时，至少90％时，至少95％时，至少96％时，至少97％时，至少98％时，至少99％时，在施用对象中提高了艾博韦泰产品的疗效。在某些实施方式中，所述疗效的指标包括：相对于对照组，施用艾博韦泰产品后，控制100,000copies/ml以上高病毒载量感染者的比例更高、以及降低CD4细胞计数低于100个/μl的感染者的病毒复制的比例更高。在某些实施方式中，试验组为艾博韦泰(每周一次静脉给药)和洛匹那韦/利托那韦(LPV/r)两药组合。在某些实施方式中，对照组为三药组合(LPV/r+替诺福韦(TDF)或齐多夫定(AZT)+拉米夫定(3TC))。
在某些实施方式中，相对于对照组，当施用的艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％，不超过14.0％，不超过13.0％，不超过12.0％，不超过11.0％，不超过10.0％，不超过9％，不超过8％，不超过7.0％，不超过6.0％，不超过5.0％，不超过4.0％，不超过3.0％，不超过2％，不超过1％，不超过0.9％，不超过0.8％，不超过0.7％，不超过0.6％，不超过0.5％，在施用对象中提高了艾博韦泰产品的疗效。在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品中艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，不超过0.90％，不超过0.80％，不超过0.7％，不超过0.60％，不超过0.50％，不超过0.45％，不超过0.40％，不超过0.45％，不超过0.3％，不超过0.25％，不超过0.35％，不超过0.25％，不超过0.20％，不超过0.15％，不超过0.10％，不超过0.05％，在施用对象中提高了艾博韦泰产品的疗效。在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品中，艾博韦泰的二聚体的量不超过15.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过1.0％，艾博韦泰的二聚体的量不超过10％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.5％，艾博韦泰的二聚体的量不超过2.0％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.10％，艾博韦泰的二聚体的量不超过3％且艾博韦泰的三聚体的量不超过0.15％，在施用对象中提高了艾博韦泰产品的疗效。在某些实施方式中，所述疗效的指标包括：相对于对照组，施用艾博韦泰产品后，控制100,000copies/ml以上高病毒载量感染者的比例更高、以及降低CD4细胞计数低于100个/μl的感染者的病毒复制的比例更高。在某些实施方式中，试验组为艾博韦泰(每周一次静脉给药)和洛匹那韦/利托那韦(LPV/r)两药组合。在某些实施方式中，对照组为三药组合(LPV/r+替诺福韦(TDF)或齐多夫定(AZT)+拉米夫定(3TC))。
在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品符合如下条件时，在施用对象中获得了临床益处：(A)所述艾博韦泰产品的结合率达到至少85％(优选为至少90％)；以及(B)所述艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。在某些实施方式中，所述临床不良反应选自腹泻、胃肠炎、皮疹、头痛、头晕、血尿症等。所述临床益处还包括：实验室异常值降低至少30％、至少20％、至少10％、至少5％、至少4％、至少3％、至少2％、至少1％、至少0.9％、至少0.8％、至少0.7％、至少0.6％、至少0.5％、至少0.4％、至少0.3％、至少0.2％、至少0.1％。在某些实施方式中，实验室异常值选自：血甘油三酯升高、血胆固醇升高、高脂血症、高甘油三酯血症、丙氨酸氨基转移酶升高、天门冬氨酸氨基转移酶升高、γ-谷氨酰转移酶升高、高胆红素血症和血尿酸升高等。
在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品符合如下条件时，在施用对象中提高了艾博韦泰产品的疗效：(A)所述艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。在某些实施方式中，所述疗效的指标包括：相对于对照组，施用艾博韦泰产品后，控制100,000copies/ml以上高病毒载量感染者的比例更高、以及降低CD4细胞计数低于100个/μl的感染者的病毒复制的比例更高。在某些实施方式中，试验组为艾博韦泰(每周一次静脉给药)和洛匹那韦/利托那韦(LPV/r)两药组合。在某些实施方式中，对照组为三药组合(LPV/r+替诺福韦(TDF)或齐多夫定(AZT)+拉米夫定(3TC))。
在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品符合如下条件时，在施用对象中获得了临床益处：(A)所述艾博韦泰产品的结合率达到至少85％(优选为至少90％)；(B)所述艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。在某些实施方式中，所述临床不良反应选自腹泻、胃肠炎、皮疹、头痛、头晕、血尿症等。所述临床益处还包括：实验室异常值降低至少30％、至少20％、至少10％、至少5％、至少4％、至少3％、至少2％、至少1％、至少0.9％、至少0.8％、至少0.7％、至少0.6％、至少0.5％、至少0.4％、至少0.3％、至少0.2％、至少0.1％。在某些实施方式中，实验室异常值选自：血甘油三酯升高、血胆固醇升高、高脂血症、高甘油三酯血症、丙氨酸氨基转移酶升高、天门冬氨酸氨基转移酶升高、γ-谷氨酰转移酶升高、高胆红素血症和血尿酸升高等。
在某些实施方式中，相对于对照组，当艾博韦泰产品符合如下条件时，在施用对象中提高了艾博韦泰产品的疗效：(A)所述艾博韦泰产品的结合率达到至少85％；(B)所述艾博韦泰产品中艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2.0％)且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)。在某些实施方式中，所述疗效的指标包括：相对于对照组，施用艾博韦泰产品后，控制100,000copies/ml以上高病毒载量感染者的比例更高、以及降低CD4细胞计数低于100个/μl的感染者的病毒复制的比例更高。在某些实施方式中，试验组为艾博韦泰(每周一次静脉给药)和洛匹那韦/利托那韦(LPV/r)两药组合。在某些实施方式中，对照组为三药组合(LPV/r+替诺福韦(TDF)或齐多夫定(AZT)+拉米夫定(3TC))。
在某些实施方式中，所述确定或检测所述艾博韦泰产品的结合率的色谱分析的参见本文5.2节。在某些实施方式中，所述确定或检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的量的色谱分析的方法参见本文5.3节。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象每天施用艾博韦泰产品。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象每周施用艾博韦泰产品。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象每两周施用艾博韦泰产品。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象每月施用艾博韦泰产品。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象每两个月一次施用艾博韦泰产品。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象每季度施用艾博韦泰产品。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象施用本文公开的所述艾博韦泰产品，包括每次施用320mg艾博韦泰。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象施用本文公开的所述艾博韦泰产品，包括每周施用320mg艾博韦泰。在某些实施方式中，本文提供的方法包括向有需要的对象施用所述艾博韦泰产品，包括每两周施用320mg艾博韦泰。
在某些实施方式中，所述艾博韦泰药物产品可以作为单独治疗来施用。在某些实施方式中，所述艾博韦泰药物产品可以与在预防或治疗HIV感染中有用的其他药物或治疗一起使用。如本文使用的，当两种药剂同时地施用、或以药剂将同时起作用的方式独立地施用，两种(或更多种)药剂被称为组合施用。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括与一种或更多种其他HIV治疗组合地施用本文公开的所述艾博韦泰药物制剂。在某些实施方式中，本文公开的所述艾博韦泰产品在所述其他HIV治疗之前施用。在某些实施方式中，本文公开的所述艾博韦泰产品在所述其他HIV治疗之后施用。在某些实施方式中，本文公开的所述艾博韦泰产品与所述其他HIV治疗同时地施用。在某些实施方式中，本文公开的所述艾博韦泰产品与所述其他HIV治疗在相同的治疗期期间施用。在某些实施方式中，本文公开的所述艾博韦泰产品与所述其他HIV治疗在重叠的治疗期期间施用。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括与一种或更多种其他HIV治疗组合地施用本文公开的所述艾博韦泰产品，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是对于HIV治疗安全有效的本领域已知的任何其他HIV治疗。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是美国食品药品管理局(FDA)或其他管辖区域中等价管理机构批准的任何HIV治疗。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以选自以下构成的组：(a)阿巴卡韦(ZIAGEN)；(b)肠溶包衣的去羟肌苷(VIDEX EC)；(c)去羟肌苷(VIDEX))；(d)恩曲他滨(EMTRIVA)；(e)拉米夫定(EPIVIR)；(f)司他夫定(ZERIT)；(g)替诺福韦艾拉酚胺(VEMLIDY)；(h)富马酸替诺福韦酯(VIREAD)；(i)齐多夫定(RETROVIR)；(j)施多宁(SUSTIVA)；(k)依曲韦林(INTELENCE)；(l)奈韦拉平(VIRAMUNE)；(m)利匹韦林(EDURANT)；(n)阿扎那韦(REYATAZ)；(o)ATV/c(EVOTAZ)；(p)地瑞那韦(PREZISTA)；(q)DRV/c(PREZCOBIX)；(r)膦沙那韦(LEXIVA)；(s)茚地那韦(CRIXIVAN)；(t)洛匹那韦/利托那韦(KALETRA)；(u)奈非那韦(VIRACEPT)；(v)利托那韦(NORVIR)；(w)沙奎那韦(INVIRASE)；(x)替拉那韦(APTIVUS)；(y)度鲁特韦(TIVICAY)；(z)雷特格韦(ISENTRESS)；(aa)恩夫韦肽(PUZEON)；(ab)马拉韦罗(SETZENTRY)；(ac)ibalizumab(TROGARZO)；及其任何组合。
在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是阿巴卡韦(ZIAGEN)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是肠溶包衣的去羟肌苷(VIDEX EC)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是去羟肌苷(VIDEX)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是恩曲他滨(EMTRIVA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是拉米夫定(EPIVIR)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是司他夫定(ZERIT)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是替诺福韦艾拉酚胺(VEMLIDY)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是富马酸替诺福韦酯(VIREAD)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是齐多夫定(RETROVIR)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是施多宁(SUSTIVA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是依曲韦林(INTELENCE)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是奈韦拉平(VIRAMUNE)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是利匹韦林(EDURANT)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是阿扎那韦(REYATAZ)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是ATV/c(EVOTAZ)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是地瑞那韦(PREZISTA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是DRV/c(PREZCOBIX)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是膦沙那韦(LEXIVA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是茚地那韦(CRIXIVAN)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是洛匹那韦/利托那韦(KALETRA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是奈非那韦(VIRACEPT)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是利托那韦(NORVIR)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是沙奎那韦(INVIRASE)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是替拉那韦(APTIVUS)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是度鲁特韦(TIVICAY)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是雷特格韦(ISENTRESS)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是恩夫韦地(FUZEON)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是马拉韦罗(SETZENTRY)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是ibalizumab(TROGARZO)。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括与一种或更多种其他HIV治疗组合地施用本文公开的所述艾博韦泰产品。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以选自以下构成的组：(a)ABC/ZDV/3TC(TRIZIVIR)；(b)ABC/3TC(EPZICOM)；(c)ABC/3TC/DTG(TRIUMEQ)；(d)FTC/EFV/TDF(ATRIPLA)；(e)FTC/RPV/TDF(COMPLERA)；(f)FTC/TAF(DESCOVY)；(g)FTC/EVG/c/TAF(GENVOYA)；(h)FTC/RPV/TAF(ODEFSEY)；(i)FTC/EVG/c/TDF(STRIBILD)；(j)FTC/TDF(TRUVADA)；(k)3TC/AZT(COMBIVIR)；(l)BIC/FTC/TAF(BIKTARVY)；(m)DTG/RPV(JULUCA)；以及其任何组合。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括与一种或更多种其他HIV治疗组合地施用本文公开的所述艾博韦泰产品。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是ABC/ZDV/3TC(TRIZIVIR)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是ABC/3TC(EPZICOM)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是ABC/3TC/DTG(TRIUMEQ)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/EFV/TDF(ATRIPLA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/RPV/TDF(COMPLERA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/TAF(DESCOVY)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/EVG/c/TAF(GENVOYA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/RPV/TAF(ODEFSEY)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/EVG/c/TDF(STRIBILD)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是FTC/TDF(TRUVADA)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是3TC/AZT(COMBIVIR)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是BIC/FTC/TAF(BIKTARVY)。在某些实施方式中，所述一种或更多种其他HIV治疗可以是DTG/RPV(JULUCA)。
本领域的普通技术人员将理解的是，本文公开的或本领域已知的所述其他HIV治疗的不同排列与组合可以与本文公开的所述艾博韦泰产品组合使用。适当的组合治疗的选择将由主治医师决定。
在某些实施方式中，要治疗的所述对象是人。
6具体实施方式
以下是研究中使用的各种方法和材料的说明，以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的示范性说明，既不意味着限制发明人视作他们的发明的范围，也不意味着它们是为了表明进行了以下实验以及是所有可以进行的实验。已经进行了努力来确保所使用的数字(例如，量、温度，等)的精确性，但是应当考虑一定的实验误差和偏差。
除非另外指明，份数是按重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏温度(℃)，以及压力是处在或接近大气压。使用标准的缩写，包括以下的：mg＝毫克；g＝克；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；Da＝道尔顿；v/v＝体积/体积；TFA＝三氟乙酸；ACN＝乙腈；HAc＝乙酸；HPLC＝高效液相色谱；UPLC＝超高效液相色谱；LC-MS＝液相色谱-质谱；ABT＝艾博韦泰；N/D＝未测定；RRT＝相对保留时间；RT＝保留时间；Alloc＝烯丙氧基羰基；MS＝质谱；MPA3-马来酰亚胺基丙酸；HSA＝人血清白蛋白。
6.1实施例1-艾博韦泰的合成
艾博韦泰可以通过标准的固相合成利用Rink酰胺树脂和9-茐甲氧羰基保护的氨基酸来制备，例如WO2020/223906A1中，其全文通过引用并入本申请。第13位的赖氨酸残基的侧链通过交叉保护方法，其允许选择性去保护并添加[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸和3-马来酰亚胺基丙酸的接头分子，从而实现选择性的长效修饰。
将裂解后的肽溶解在含0.1％TFA的30％ACN的水(v/v)，通过反相HPLC纯化，纯度大于90％。通过LC-MS验证纯度和分子量。
6.2实施例2-检测艾博韦泰产品中杂质的质控方法II
照分子排阻色谱法(SEC)测定，方法如下：
溶剂、系统适用性溶液见有关物质Ⅰ项下。
供试品溶液取待测产品适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含0.8mg的溶液(2～8℃冷藏保存，24小时内检测)。
色谱条件用球状亲水改性硅胶为填充剂(TSKgel G2000 SWXL，
7.8×30cm，5μm，或效能相当的色谱柱)；以乙腈-水-三氟乙酸溶液(45:55:0.05)为流动相；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测波长为214nm；进样体积为15μl。
系统适用性要求参考艾博韦泰有关物质Ⅱ系统适用性溶液典型色谱图(图1)进行特定杂质归属。系统适用性溶液色谱图中，三聚体、二聚体、艾博韦泰依次出峰，艾博韦泰峰拖尾因子不得大于2.0，艾博韦泰峰与二聚体峰分离度应不低于2.0，理论塔板数按艾博韦泰峰计算应不低于10000。
测定法精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图至32分钟，得到三聚体、二聚体和艾博韦泰的含量，当艾博韦泰二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％，且艾博韦泰三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％时，判定该样品合格，结果表明艾博韦泰产品符合该标准。
6.3实施例3-艾博韦泰结合率的检测
本发明中，艾博韦泰与含巯基小分子试剂结合的结合率检测方法如下步骤所述：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Welch
XB-C18，4.6×250mm，5μm，孔径
或效能相当的色谱柱)；以0.1％三氟乙酸-水溶液为流动相A，0.1％三氟乙酸-乙腈溶液为流动相B，流速为每分钟1.0ml，柱温为20℃，检测波长为214nm。按下述表1进行梯度洗脱。取本品适量，加水溶解，配制成每1ml中约含艾博韦泰10mg的溶液，作为供试品储备液；精密量取供试品储备液适量，加混合溶剂【流动相A-流动相B(65:35)混合均匀】稀释1000倍，摇匀，制成每1ml中约含艾博韦泰10μg的溶液，作为对照溶液。精密量取对照溶液40μl注入高效液相色谱仪，重复测定6次，理论塔板数按艾博韦泰峰计算应不低于10000，艾博韦泰峰的曲线下面积的相对标准偏差应不大于2.0％，艾博韦泰保留时间的相对标准偏差应不大于1.0％。
表1
在采用含巯基小分子试剂时(以半胱氨酸为例)，精密量取上述供试品储备液(临用新配)适量，加0.25mg/ml的L-半胱氨酸溶液(取0.1mol/L磷酸二氢钾溶液适量，用氢氧化钠溶液调pH至5.5，然后加入L-半胱氨酸适量，振荡溶解，摇匀，制成每1ml中约含0.25mg半胱氨酸的溶液；临用新配)至10倍体积，室温静置10min，立即精密量取适量，加混合溶剂稀释2倍，制成每1ml中约含艾博韦泰与半胱氨酸结合物0.5mg的溶液，作为供试品溶液。按照所述方法测定供试品的色谱结果。供试品溶液色谱图中如显艾博韦泰色谱峰(保留时间与对照溶液主峰保留时间一致)，其峰的曲线下面积不得大于对照溶液主峰的曲线下面积的5倍，即按照计算公式计算艾博韦泰-半胱氨酸结合率不得低于85.0％。对照溶液和供试品溶液应于配制后12小时内检测。计算公式如下：
式中AS为供试品未结合峰的曲线下面积均值；
AR为对照溶液主峰的曲线下面积均值。
6.4实施例4-艾博韦泰体外长效结合活性的评估方法研究
6.4.1艾博韦泰与人血清白蛋白结合的机制研究
将艾博韦泰(研究代号FB006M)与过量人血清白蛋白HSA混合(摩尔比约1﹕3)，15min后进样检测，见图3。图3中的A为HSA的高效液相色谱图，图3中的B为艾博韦泰的高效液相色谱图，3中的C、3中的D为艾博韦泰与HSA混合反应后的高效液相色谱图。从图3中的C和3中的A中可以看出，与混合前相比，HSA与ABT结合后的第一个HSA色谱峰无明显变化，HSA的第二个色谱峰显著变小，艾博韦泰色谱峰几乎消失，新增出现保留时间为15.8min的第三个色谱峰，经质谱确认，该色谱峰分子量约为71096Da，相比HSA的分子量66430Da，约大4666Da，为HSA与艾博韦泰的1﹕1共价结合物，见图2中的C；经质谱确认，未检出HSA结合两个或以上艾博韦泰等其他形式的艾博韦泰-HSA结合物。
研究结果显示，艾博韦泰通过与白蛋白1：1结合发挥其长效作用，这种结合能力决定其生物活性。对结合物进行分析发现，这种结合实际上是通过艾博韦泰侧链上的马来酰亚胺基团与白蛋白中的自由巯基结合实现的。
将艾博韦泰与过量大鼠血浆混合，同法试验，试验现象一致，见图4。
6.4.2检测艾博韦泰与人血清白蛋白的结合率表征研究
选择HSA:ABT＝30:1进行试验。按此比例制备HSA和ABT的结合反应混合液，混匀后，37℃孵育15min，检测结合率；同法制备HSA空白液；同时制备浓度相当于前述结合反应混合液中ABT浓度2％的溶液，作为自身对照液。结合物色谱保留时间约33.6min，艾博韦泰的保留时间约38.1min见图5，艾博韦泰处的局部放大图见图6。
试验结果表明，在色谱图中ABT的保留时间处(约38.1min)，HSA和ABT结合反应物色谱图的基线比HSA空白色谱图基线稍高，但从峰型来看小于2％自身对照的响应。即定性来看ABT与HSA于37℃反应15min后，未结合物的色谱响应低于2％自身对照的响应，由此推测通过HSA检测得的ABT结合率约98％左右。
上述结果显示，由于白蛋白试剂分子量高而且是一种组分、结构复杂的混合物，HSA试剂导致的本底响应处于高水平，进而覆盖了ABT本身的响应。此外，考虑到白蛋白的通用生产工艺的均易导致本底物质含量较高且批次间重复性较差，故直接检测艾博韦泰与HSA的检测方法不适合用于定量质控，考虑寻找更合适的结合试剂。
6.4.3艾博韦泰与半胱氨酸的结合
从上面描述的研究可知，艾博韦泰与人血清白蛋白的结合，其化学基础就是艾博韦泰侧链的马来酰亚胺基团与人血清白蛋白的自由巯基结合，因此，考虑以含有巯基的游离氨基酸作为人血清白蛋白的替代物与艾博韦泰反应，从而可以反映艾博韦泰中马来酰亚胺基团含量，与此同时，半胱氨酸与艾博韦泰的结合物仍是多肽，适用于反相色谱分析，易定量测定；反应快速可控，适宜作为对艾博韦泰体内发挥长效功能的质量属性进行质控。
我们首先对半胱氨酸(Cys)与3-马来酰亚胺基丙酸(MPA)的结合反应进行研究，试验结果表明该反应具有点击化学(click chemistry)的反应特点：在室温、pH7.0环境下可以定量地(100％原子经济型)、瞬时(<1min)生成C-S偶联(1，4加成)产物，能且只能生成1:1摩尔比的加成产物，Cys与MPA的降解产物无反应；结合反应对MPA马来酰亚胺基团的完整性具有指示性。
进而考察了半胱氨酸与艾博韦泰反应，取过量半胱氨酸与艾博韦泰反应(摩尔比约15﹕1)，结合过夜(>15hr)，经质谱确认1个艾博韦泰分子仅能结合1个半胱氨酸分子。综上所述，半胱氨酸仅能与艾博韦泰上的马来酰亚胺结合，能且仅能形成1:1加成产物，同艾博韦泰与白蛋白结合的现象一致。
作为阴性对照，也考察了半胱氨酸与不含马来酰亚胺侧链的FB006(为含34个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与艾博韦泰主链序列相同，但第13位Lys上无侧链修饰)的反应性。取半胱氨酸与FB006，结合过夜(>15hr)，色谱与质谱中均未检出两者的结合物，即艾博韦泰主链上无半胱氨酸结合位点。
由此可见，半胱氨酸(Cys)只能与艾博韦泰分子上的马来酰亚胺基团结合；Cys与艾博韦泰的结合速率不低于Cys与MPA的结合速率；此反应对艾博韦泰分子中长效功能团马来酰亚胺基团的完整性具有指示性。
随着反应混合物中半胱氨酸∶艾博韦泰(mol/mol)比率的升高，结合率逐渐升高并趋于饱和，其关系曲线呈S形，见图7，与生物学结合活性检测中常见的S型曲线类似。
取L-半胱氨酸(Cys)与艾博韦泰(ABT)，分别按照8:1、6.4:1、4:1、1.6:1、0.8:1、0.4:1、0.16:1、0.08:1的摩尔比制备结合反应混合液，在相同环境条件反应相同时间，检测结合率，结果见下表2和图7。
表2
| Cys/ABT | 0.08 | 0.16 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 4.0 | 6.4 | 8.0 |
| Log<sub>2</sub>(Cys/ABT) | -3.6 | -2.6 | -1.3 | -0.3 | 0.7 | 2.0 | 2.7 | 3.0 |
| 结合率 | 8.0％ | 12.1％ | 24.6％ | 44.2％ | 82.2％ | 97.0％ | 97.4％ | 97.5％ |
通过方法学验证，半胱氨酸、半胱氨酸-艾博韦泰结合物对艾博韦泰峰无干扰；系统适用性满足要求；检测限为0.05％、定量限为0.2％；重复性RSD为0.12％(n＝6)；中间精密度RSD为0.05％(n＝6)；准确度回收率为99.1～109.6％；线性、范围、耐用性、溶液稳定性均符合要求。验证结果表明，本方法满足结合率定量测定要求。
上述结合率结果示出的是该方法下主峰中含马来酰亚胺的量。马来酰亚胺是艾博韦泰与人血白蛋白结合的长效功能团，通过结合率方法测定的艾博韦泰产品中的马来酰亚胺量，表明艾博韦泰在体内达到长效活性。
6.5艾博韦泰与其他含巯基小分子的结合实验
为研究艾博韦泰活性检测中测试试剂的选择，考察了同一批次的艾博韦泰分别与半胱氨酸、谷胱甘肽以及二硫苏糖醇反应的结果。具体地，分别取过量的半胱氨酸、谷胱甘肽以及二硫苏糖醇与艾博韦泰反应，测定与艾博韦泰的结合率(参照与6.4中相同的方法进行测定)，测定其各自的结合率，结果如下表3中所述：
表3使用不同测试试剂情况下艾博韦泰结合率
结果显示，试验组1中，GSH(含游离巯基，氨基酸类小分子)2份结合率结果的平均值为97.3％，与对照组(Cys)98.0％相比，差值为0.7％，相对偏差为0.4％，符合可接受标准RD<2％。
试验组2中，DTT2份结合率结果的平均值为85.8％，与对照组(Cvs)98.0％相比，差值为12.3％，相对偏差为6.7％(RD>2％)。
结果显示，氨基酸小分子GSH在该结合实验中体现出符合测试标准的结合率，而非氨基酸类含巯基小分子DTT与艾博韦泰的结合率结合率远低于Cys与艾博韦泰的结合率。上述结果表明，虽然艾博韦泰与测试试剂的结合位点为巯基，但并非所有含巯基小分子都能起到同样的结合效率，氨基酸类小分子作为测试试剂时，与艾博韦泰的结合率符合测试标准，提示在这一实验中，氨基酸类小分子为最适宜的选择。
6.6艾博韦泰的毒理实验
为支持本品分析方法及质量标准制定，选取冷藏条件下储存时间较长的注射用艾博韦泰进行了大鼠4周重复给药毒性试验，以确定本品杂质的安全限度。大鼠毒理实验所用的是171101批、180701批、180801批、180901批冷藏储存样品，以保证毒理实验研究所覆盖的杂质种类和杂质水平支持制定的质量标准。试验结果表明，艾博韦泰在临床前及临床研究中均显示了良好的安全性，毒理试验及临床试验剂量见表4，杂质安全限度计算及质量标准制定见表5。
表4艾博韦泰毒理试验及临床剂量
表5大鼠重复给药毒性试验批次有关物质含量及安全限度计算(单位：％)
备注：
1.大鼠暴露量(mg/kg)＝毒理批杂质百分含量×毒理试验公斤给药量(360mg/kg)。
2.杂质人体等价暴露量(mg/kg)＝大鼠暴露量(mg/kg)÷大鼠/人体比表面积换算系数(Km,6.2)。
3.杂质在货架期最大限度下的人体暴露量(mg/kg)＝杂质货架期标准百分数×人体公斤给药量(320mg/人÷60kg/人)。
4.货架期标准与毒理实验支持的杂质人体等价暴露量相比的安全倍数＝杂质人体等价暴露量(mg/kg)÷杂质在货架期最大限度下的人体暴露量(mg/kg)。
艾博韦泰每日最大给药剂量为320mg(以艾博韦泰计)，相当于一个体重60kg的人给药剂量为5.33mg/kg。大鼠4周重复给药试验确定其NOAEL为360mg/kg，换算到人体等效安全剂量为360mg/kg÷6.2＝58.06mg/kg，是临床给药剂量的58.06mg/kg÷5.33mg/kg＝10.89倍。基于上表计算出毒理批中各个杂质的毒理试验暴露量及其相应的人体等价暴露量，与货架期杂质限度人体暴露量相比，即便杂质水平达到货架期标准上限，根据计算，二聚体杂质仍有3～4倍的安全空间，含量较低三聚体杂质仍有1～2倍的安全空间，总杂仍有5倍左右的安全空间。由此可以说明，毒理试验结果充分支持质量标准中的杂质控制限度。
本发明中参考了各种出版物。这些出版物的完整的公开内容通过引用合并到本申请中，以更完整地描述本公开内容所属领域的现有技术水平。虽然已经参考上文提供的实施例描述了本发明，需要理解的是，可以对其进行各种修改而不背离本发明的精神。
Claims (10)
1.一种艾博韦泰的检测方法，包括检测艾博韦泰产品的长效活性的方法，所述检测艾博韦泰产品的长效活性的方法包括如下步骤：
(i)对所述艾博韦泰产品进行色谱分析；
(ii)测量第一曲线下面积(AUC)，所述第一AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；
(iii)将所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物反应，得到反应液；其中，所述含有硫醇基团的小分子化合物为含有一个自由巯基的小分子化合物；
(iv)对步骤(iii)得到的反应液进行色谱分析；
(v)测量第二AUC，所述第二AUC是对应艾博韦泰的峰的AUC；和
(vi)基于第二AUC和第一AUC的比率确定所述艾博韦泰产品的结合率；
优选地，所述色谱分析通过液相色谱进行；更为优选地，所述的液相色谱优选为HPLC或UPLC。
2.如权利要求1所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述检测艾博韦泰产品的长效活性的方法还包含如下步骤：基于所述的艾博韦泰产品的结合率，确定所述艾博韦泰产品的质量；
优选地，所述检测艾博韦泰产品的长效活性的方法基于所述艾博韦泰产品与含有硫醇基团的小分子化合物的结合率，反映所述艾博韦泰产品人血清白蛋白的结合率，从而确定所述艾博韦泰产品的质量。
3.如权利要求1或2所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述检测艾博韦泰产品的长效活性的方法还包括如下步骤：基于所述结合率，确定所述艾博韦泰产品是否适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。
4.如权利要求2或3所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，当所述结合率达到至少85％(优选为达到至少90％)，则确定所述艾博韦泰产品适合用作HIV-1感染对象的长效维持疗法。
5.如权利要求1至0中任一项所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述含有硫醇基团的小分子化合物为氨基酸类小分子化合物，较佳地选自下组：半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、丙硫醇、乙酰半胱氨酸，或者上述小分子化合物的二聚或者多聚体。
6.如权利要求5所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述氨基酸类小分子化合物为L-半胱氨酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括含有如下步骤检测杂质的质控方法：对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，检测所述艾博韦泰产品中含有的多聚体的含量；
优选地，所述艾博韦泰多聚体是艾博韦泰的二聚体和/或艾博韦泰的三聚体。
8.根据权利要求7所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述质控方法还包括如下步骤：对所述艾博韦泰产品进行超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析，分别检测艾博韦泰单体主峰、和艾博韦泰的多聚体的峰的面积。
9.根据权利要求7或8所述的艾博韦泰的检测方法，其特征在于，所述的方法还包括选择符合以下条件的艾博韦泰产品：艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％(优选为不超过2.0％)，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％(优选为不超过0.15％)；
优选地，所述的色谱分析选自下组：高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、尺寸排阻色谱(SEC)、动态光散射测试(DLS)、差示扫描量热计(差示扫描量热计)、iso-asp定量、效价、UV/Vis光谱和傅里叶变换红外光谱(FTIR)；所述的色谱分析优选为超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析。
10.一种确定艾博韦泰产品质量的方法，包括如下步骤：
对所述艾博韦泰产品进行色谱分析，从而检测艾博韦泰单体的含量，以及选自下组的一种或多种组分的含量：艾博韦泰二聚体、艾博韦泰三聚体；
选择符合以下条件的艾博韦泰产品：艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的10.0％，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.5％；更佳地，选择符合以下条件的艾博韦泰产品：艾博韦泰的二聚体的量不超过艾博韦泰单体的2.0％，且艾博韦泰的三聚体的量不超过艾博韦泰单体的0.15％；
优选地，所述的色谱分析为超高效液相色谱(UPLC)分析或尺寸排阻色谱(SEC)分析。
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