CN115684299B - 一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器。本申请通过核酸芯片将待测生物分子浓度的变化转换为光学信号的变化，通过光电化学即光电极实现光学信号到电信号的转换。特定的功能核酸在识别待测的生物分子后，释放出的与其互补的单链DNA可激活CRISPR Cas系统，作用于核酸芯片。核酸芯片上的ssDNA一端与芯片基底相连，另一端偶联具有优良吸光性质或者发光性质的纳米颗粒。当核酸芯片上的ssDNA被非特异性切割后，就会释放出具有吸光性质或者发光性质的纳米颗粒，使得芯片的光学性质发生改变，从而实现了待测物浓度信息到光学信号的转换。本生物传感器可广泛应用于生物传感领域，研究生物体内生物化学信息的变化。

Description

一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器

技术领域

本申请涉及生物传感的技术领域，尤其涉及一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器。

背景技术

核酸芯片又称为DNA芯片、DNA微列阵，是通过原位合成技术或者微量点样技术，将DNA探针固定在固相支持物表面，从而产生DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行与高效的检测及分析。20世纪80年代中期，俄罗斯恩格尔哈得分子生物学研究所最早提出了用杂交法进行核酸测序的想法，英国牛津大学的Southern也取得了在固相载体上进行探针固定并用于杂交测序的国际专利，核酸芯片由此而诞生。在核酸芯片上，由于一个微阵列中可以包含上万种探针，所以一个微阵列反应就可以同步完成数目庞大的检测，从而大大加速了各种研究的进行。核酸芯片的这种高通量优势，正越来越多地被研究人员应用于基因表达检测、阐述基因功能、探索疾病原因和机理、以及发现可能的诊断和治疗靶位等方面。目前核酸芯片技术，在药物研发和筛选、疾病诊断、环境保护、司法、现代农业等领域得到广泛的应用。

规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspacedshortpalindromic repeats,CRISPR)是许多细菌和古细菌中的一种应对入侵的免疫机制。CRISPR及CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins，Cas)被称为CRISPR Cas系统。CRISPR Cas具有可编程性,可对靶标核酸进行特异性识别与切割，这赋予CRISPR Cas诊断工具快速、特异、准确、成本廉价和可靠等检测特点，因而CRISPR Cas系统一经出现，就被改造成为新型分子诊断技术。由于CRISPR Cas系统的多样性及Cas蛋白特殊的DNA酶活性，CRISPR Cas系统在生物传感器的开发中展现出了巨大的潜力，其中Cas12a和是核酸检测的生物传感器领域最为常用的亚型之一，是一种RNA引导的核酸内切酶，其对外源ssDNA的非特异性切割活性(反式切割)的发现使Cas12a用于开发多种高性能诊断工具成为可能。Cas12a-crRNA复合物与靶标dsDNA(携带PAM位点)或ssDNA(不需要PAM位点)结合之后，以大约1250周转/秒的催化速率非特异性切割外源ssDNA，这为基于CRISPR Cas12a构建用于核酸检测的生物传感器和生物放大器提供了基础。

光电化学(PEC)是从电化学发展而来，对光敏材料进行探索的一门学科，它涉及光到电的转换以及电能和化学能之间的相互转换。具体来说，光敏材料受到足够能量的光子激发产生电子-空穴对，随后光生载流子转移到电极上产生电信号，该过程伴随氧化还原反应的参与，最终实现能量转换。PEC传感是利用电极界面上的光敏材料作为信号转换器，在光照条件下产生与待检测物浓度信息相关的电信号，目前PEC传感器大多以采集电流信号为主。在整个PEC检测系统中，电信号的产生涉及到一系列的物理和化学过程，分别包括：(I)光子吸收，(II)电荷分离，(III)电荷迁移和复合，(IV)电荷利用(在电极-电解液界面处产生电信号和参与氧化还原反应)。光电转换效率和信号输出强度则取决于这四个过程的协同作用,被分析物直接或间接地改变光活性物质或电解环境，对上述一个或多个过程产生影响，从而引起PEC信号的改变。因此，可以通过多种途径对检测信号进行调控，实现对各种目标信息的高灵敏检测。

相关技术中，光电化学生物传感器，绝大部分是将生物分子直接修饰在光敏电极的表面，使待测样与光敏电极直接接触，从而对光电转换过程中的电荷分离、电荷迁移和电荷利用过程产生影响，输出与待测样浓度相关的电信号。待测样与生物分子修饰的光敏电极直接接触，可以灵敏地监测生物分子浓度，但是复杂生物样品中会存在一些其他的氧化性或者还原性的生物分子，会对光电信号的产生有一定干扰，影响检测的特异性和准确性，另外此种方法中光敏电极仅能一次性使用，可重复性较差，且材料没有得到充分有效的利用。因而目前缺乏一种构建抗干扰能力强、可重复性好、更加环保的光电化学生物传感器的方法。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器，能够避免相关技术中光电化学生物传感器的可重现性差、易受干扰等问题。

本申请提供一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器，包括：

(a)光电极；

(b)核酸芯片，用以被配置在激发光源和所述光电极之间，所述核酸芯片由偶联在芯片基底的ssDNA-纳米粒子所形成，其中所述ssDNA-纳米粒子为由具有吸光性质或发光性质的纳米粒子偶联到单链DNA上所形成，所述纳米粒子的吸收光谱或发射光谱同所述光电极相匹配；

(c)CRISPR Cas系统，用于与核酸芯片在待测样的添加下形成共孵育，以通过所述共孵育产生光电信号的变化，进而由该光电信号的变化表征所述待测样的生物分子浓度信息。

应当说明的是，待测生物分子是指能与功能核酸相互作用，释放出单链DNA用以激活CRISPE Cas系统的形式。待测生物分子的具体实例包括但不限于ATP、癌胚抗原、DNA片段、RNA片段等生物分子。

前文的激发光源，能够被想到的是，其用以产生作用于核酸芯片和光电极的光谱。激发光源所发射的光谱与核酸芯片上所连的纳米颗粒的吸收光谱相匹配，确保纳米颗粒能够吸收激发光的光子将其转换为热能或者光能。

合适但非限制性地，所述核酸芯片包括石英玻璃和附着于所述石英玻璃上的二氧化硅薄膜层。

合适但非限制性地，所述二氧化硅薄膜层的制备方式为：以硅酸乙酯为前驱体，通过溶胶-凝胶法制备成膜溶液，然后通过旋涂法在石英玻片上所制备。

以此，通过上述方式所制备的二氧化硅薄膜层，其在紫外到红外辐射的连续波长范围内都有优良的透射比。

应当能够理解的是，前文表述“纳米粒子的吸收光谱或发射光谱同所述光电极相匹配”是指光电极的激发光谱和核酸芯片上的纳米颗粒的吸收光谱或者发射光谱至少部分有重叠，这样才能通过光电流的变化来监测核酸芯片光学性质的变化。

合适但非限制性地，所述纳米粒子为上转换纳米颗粒或聚多巴胺纳米颗粒。

以此，这些种类的纳米粒子具有具有良好吸光性质或发光性质。

合适但非限制性地，参与偶联ssDNA-纳米粒子的核酸芯片表面修饰有氨基基团。

以此，通过氨基基团的修饰，可以达到的作用是：带正电的氨基与ssDNA上带负电的磷酸基团的能够通过静电相互作用偶联，从而得到负载大量DNA的核酸芯片。

合适但非限制性地，此处，氨基基团的来源为丙氨基三甲氧基硅烷(APTMS)或丙氨基三乙氧基硅烷(APTS)。

合适但非限制性地，还包括用以与所述光电极形成电极配对的参比电极和辅助电极。

已为本领域技术人员所掌握的是，光电极以及与光电极形成三电极体系是为了形成光电信号进行向外输出以便于外界设备检测。

此处，所述参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。

合适但非限制性地，用以容纳所述光电极、核酸芯片、CRISPR Cas系统、激发光源、参比电极和辅助电极的电解池被配置成暗室环境。

以此，提高检测的灵敏度和信噪比。

本申请的有益效果如下：

1.本申请提供的方法将核酸芯片和光电化学分析技术相结合，使生物分子浓度信息传递到核酸芯片，然后进一步传递到光电极，以光电流的形式输出信号，进而反映相应生物分子的含量。

2.本申请采用了原位合成的方法制作核酸芯片，在芯片基底修饰氨基后，通过静电作用连接ssDNA，此种方法无需对ssDNA进行修饰，制作成本低、操作简单，易批量化生产。

3.本申请采用了聚多巴胺作为一种遮光材料，通过简单的孵育在其表面吸附一层金属离子后即可与DNA通过静电作用偶联，同样无需对DNA进行额外修饰，操作简单经济。聚多巴胺纳米颗粒在核酸芯片上的含量可影响光电化学分析的光子吸收过程，然后以光电流的形式输出信号。

4.本申请采用了核酸芯片作为信息传递的媒介，避免了待测样品和光电极的直接接触，相比于传统的光电化学生物传感，提供了抗干扰能力更强、更为准确的检测。

附图说明

下面结合附图，通过对本申请的具体实施方式详细描述，将使本申请的技术方案及其它有益效果显而易见。

图1为本申请实施例提供的核酸芯片的合成示意图；

图2为本申请实施例提供的生物传感的特异性识别过程，待测生物分子与功能核酸相互作用，释放出激活链DNA用以激活CRISPR Cas12a系统的示意图；

图3为本申请实施例提供的CRISPR Cas12a系统作用于核酸芯片，非特异性切割其表面负载的连接有纳米颗粒的ssDNA的示意图；

图4为本申请实施例提供的光电流测量的示意图。

具体实施方式

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本申请的不同结构。为了简化本申请的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本申请。此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本申请提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

实施例

参考图1-图4，本申请通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器，按照以下方法来制备，该制备方法包括如下步骤：

(1)以乙醇为溶剂、盐酸为催化剂、正硅酸乙酯为前体，通过在匀胶机上旋涂的方式在高透光石英玻片表面制备一层二氧化硅薄膜。

(2)将覆盖了一层二氧化硅薄膜的石英玻片，在体积分数为5％的丙氨基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中孵育，使其表面修饰上足够的氨基，得到核酸芯片的基底。

(3)基于盐酸多巴胺在水、乙醇、氨混合物中的自聚合反应制备聚多巴胺纳米球，将聚多巴胺纳米球孵育在一定浓度的氯化钙溶液中，使其表面吸附上Ca²⁺，便于进一步偶联DNA。

(4)将聚多巴胺纳米球和ssDNA在HEPES缓冲溶液中共孵育，将聚多巴胺纳米球偶联到ssDNA上。

(5)将偶联有聚多巴胺纳米球的ssDNA分散在Tis缓冲溶液中，将核酸芯片基底浸没在溶液中，孵育后取出核酸芯片，并用缓冲溶液洗涤三次。

(6)通过水热法在ITO玻片上制备氧化锌纳米棒，然后通过连续离子层吸附在其表面形成硫化镉纳米粒子，由此得到负载光敏材料的光电极。

(7)在NEB缓冲溶液中，将核酸芯片与CRISPR Cas12a系统、待测样混合，孵育后，取出核酸芯片，用缓冲溶液洗涤三次后，在室温下干燥备用。

(8)在黑色尼龙的电解池构建的暗室环境中，以饱和甘汞电极为为参比电极，以铂电极为辅助电极，以Na₂S溶液为电解液，以ITO|ZnO|CdS为工作电极，以波长为400-700nm的LED白光为激发光源，将孵育前后的核酸芯片置于激发光源和工作电极之间(即图4所表示的工作电极正上方)后，进行光电流信号的测量。核酸芯片光电流信号的变化，即可反映待测样中待测生物分子的浓度。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种通过结合核酸芯片和光电化学构建的生物传感器，其特征在于，包括：

(a)光电极；

(b)核酸芯片，用以被配置在激发光源和所述光电极之间，所述核酸芯片由偶联在芯片基底的ssDNA-纳米粒子所形成，其中所述ssDNA-纳米粒子为由具有吸光性质或发光性质的纳米粒子偶联到单链DNA上所形成，所述纳米粒子的吸收光谱或发射光谱同所述光电极相匹配；

(c)CRISPR Cas系统，用于与核酸芯片在待测样的添加下形成共孵育，以通过所述共孵育产生光电信号的变化，进而由该光电信号的变化表征所述待测样的生物分子浓度信息。

2.根据权利要求1所述生物传感器，其特征在于，所述核酸芯片包括石英玻璃和附着于所述石英玻璃上的二氧化硅薄膜层。

3.根据权利要求2所述生物传感器，其特征在于，所述二氧化硅薄膜层的制备方式为：以硅酸乙酯为前驱体，通过溶胶-凝胶法制备成膜溶液，然后通过旋涂法在石英玻片上所制备。

4.根据权利要求1所述生物传感器，其特征在于，所述纳米粒子为上转换纳米颗粒或聚多巴胺纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述生物传感器，其特征在于，参与偶联ssDNA-纳米粒子的核酸芯片表面修饰有氨基基团。

6.根据权利要求5所述生物传感器，其特征在于，所述氨基基团的来源为丙氨基三甲氧基硅烷(APTMS)或丙氨基三乙氧基硅烷(APTS)。

7.根据权利要求1所述生物传感器，其特征在于，还包括用以与所述光电极形成三电极体系的参比电极和辅助电极。

8.根据权利要求7所述生物传感器，其特征在于，所述参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。

9.根据权利要求7所述生物传感器，其特征在于，用以容纳所述光电极、核酸芯片、CRISPR Cas系统、激发光源、参比电极和辅助电极的电解池被配置成暗室环境。