CN115666727A - 包含t细胞重定向治疗剂和vla-4粘附途径抑制剂的组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种药物组合物，该药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和VLA‑4粘附途径抑制剂，并且公开了其用于杀死癌细胞的用途。

Description

包含T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月19日提交的美国临时申请63/026,885的权益，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及组合物以及利用T细胞重定向治疗剂杀死癌细胞。

以电子方式提交的参考序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。2021年4月9日创建的所述ASCII副本命名为JBI6312WOPCT1_SL.txt，大小为29KB。

背景技术

尽管有多种治疗方案，但目前还没有治愈急性髓性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)的方法。即使达到较高(50％-80％)的完全血液学缓解(CR)，定义为骨髓(BM)中存在≤5％的白血病细胞(AML)或浆细胞(MM)(1，2)，大多数AML或MM患者仍会复发(3-5)。复发与微小残留病变(MRD)有关，即少量的癌症干细胞(CSC)或其他恶性祖细胞未能被清除，甚至在治疗后仍然存在(6)。需要找到更好的策略来防止复发和寻找AML和MM的治愈方法以消除MRD。

与造血干细胞(HSC)一样，AML和MM中的癌症干细胞(CSC)存在并且优先持续存在于BM生态位中(7，8)。BM生态位通过分泌可溶性生长因子和细胞与细胞之间的相互作用来提供一专门的微环境，其对造血干细胞有保护作用(9)。此外，BM生态位具有免疫抑制作用，并且被认为是稳态下的免疫赦免位点，以允许正常的造血和免疫细胞生成(10)。BM生态位的这些方面提供了抵抗和最小化多种抗癌药物功效的抗性，包括化疗、靶向小分子抑制剂和基于抗体的疗法(11-14)。

T细胞能够特异性地裂解肿瘤细胞，并分泌细胞因子来积聚和提升对癌症的免疫力，这使得它们成为一种有吸引力的治疗选项。已经有若干种方法开始利用该策略，诸如双特异性T细胞啮合剂(BiTEs，小型双特异性生物制剂)、嵌合抗原受体(CARs)和双特异性抗体等(15)。BiTEs和抗体介导的重定向通过接触肿瘤细胞上的特定表位和T细胞上的CD3使T细胞与肿瘤细胞交联，导致T细胞被激活，并分泌穿孔素和颗粒酶，最终杀死肿瘤细胞。随着CD19×CD3 BiTE(blinatumomab)被批准用于治疗急性淋巴细胞性淋巴瘤(ALL)，这些CD3重定向疗法已被验证为临床上有效的抗癌策略(16)。然而，BM生态位的免疫抑制和保护性质可能对T细胞重定向疗法构成重大障碍。

例如，如本文所示，使用针对特定肿瘤抗原(CD123和BCMA)和CD3的双特异性抗体，观察到AML或MM细胞系与BM基质细胞的共同培养，其在体外显著保护了癌细胞免受双特异性T细胞介导的裂解。当人源化异种AML模型中存在的人类BM基质细胞削弱了双特异性抗体治疗所观察到的肿瘤生长抑制(TGI)时，在体内也观察到了类似的结果。CD3重定向细胞毒性受损与T细胞效应反应减少有关，从而提供了一种解释双特异性抗体活性丧失的机制。

发明内容

本文提供了一种药物组合物，该药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂，其中，T细胞重定向治疗剂包括对T细胞表面抗原具有特异性的第一结合区和对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的第二结合区。

在该药物组合物的一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞表面抗原选自由CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞表面抗原是CD3。

在该药物组合物的另一个实施方案中，肿瘤相关抗原(TAA)选自由BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞表面抗原是BCMA×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

在该药物组合物的另一个实施方案中，BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中，HCl和LCl配对以形成第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成第二抗原结合位点。

在该药物组合物的另一个实施方案中，HCl包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，LC1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，HC2包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且LC2包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列。

在该药物组合物的另一个实施方案中，HC1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，LC1包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，HC2包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且LC2包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列。

在该药物组合物的另一个实施方案中，T细胞表面抗原是CD123×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

在该药物组合物的另一个实施方案中，CD123×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中，HC1和LC1配对以形成第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成第二抗原结合位点。

在该药物组合物的另一个实施方案中，HCl包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，LC1包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，HC2包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，并且LC2包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列。

在该药物组合物的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂是抗VLA-4抗体或其抗原结合片段。

在该药物组合物的另一个实施方案中，抗VLA-4抗体或其抗原结合片段选自由单克隆抗体、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体组成的组。

在该药物组合物的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂是VLA-4拮抗剂。

在该药物组合物的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂是选自由BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035组成的组的VLA-4拮抗剂。

本文进一步提供了一种杀死癌细胞的方法，该方法包括施用治疗有效量的上述药物组合物。

在该方法的另一个实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。

在该方法的另一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

在该方法的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂在T细胞重定向治疗剂之前施用。

在该方法的另一个实施方案中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本文进一步提供了一种包含上述药物组合物的试剂盒。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本申请的实施方案和详细描述。然而，应当理解，本发明并不限于本文所公开的精确叙述。

图1显示，基质细胞的存在可保护AML和MM细胞系免受T细胞重定向的细胞毒性的影响。人类T细胞(40000个细胞/孔)与CFSE标记的AML KG1(A、B)或MM H929细胞系(C、D)在基质细胞(HS-5、HS-27a、原代MSC或CD105⁺内皮细胞；每孔20000个细胞)存在或不存在的情况下以2∶1的比例培养。将不同浓度的CD123×CD3(A、B)或BCMA×CD3(C、D)持续48小时加入到培养物中。通过流式细胞仪对死亡的CFSE⁺细胞的百分比进行定量。左侧的剂量滴定图(A、C)以平均值±标准差(SD)进行显示。右侧的散点图(B、D)显示双特异性抗体最高浓度的数据(带范围的中位数)。数据代表三个或更多实验。**p＜0.005，***p＜0.0005；****p＜0.0001；n.s.，无统计学意义。

图2显示，基质细胞抑制T细胞功能、上调肿瘤细胞的信号通路并保护肿瘤细胞免受T细胞重定向的细胞毒性的影响。(A)人类T细胞(40000个细胞/孔)与CFSE标记的KG-1细胞在基质细胞(HS-5、原代MSC或CD105⁺内皮细胞；每孔20000个细胞)存在或不存在的情况下以2∶1的比例培养。在培养物中加入33nM的CD123×CD3后，对CD8⁺T细胞的激活、效应和检查点抑制标志物进行分析。48小时后用流式细胞仪对几何平均荧光强度进行定量。(B)免疫印迹分析了单独培养或在HS-5基质细胞系存在的情况下培养48小时的KG-1细胞中PI3K和Akt的激活(磷酸化)以及Bcl-2的表达。(C)与A类似，但这里所有的培养物都用或不用Bcl-2i进行处理，并且用流式细胞仪对死亡的CFSE⁺细胞的百分比进行定量。(D)与A和C类似，在不存在或存在基质以及用或不用Bcl-2i进行处理的情况下，评估肿瘤和T细胞培养物中T细胞的激活状态。所有显示的数据都代表三个或更多实验，并以带SD的平均值(剂量滴定曲线)或带范围的中位数(散点图)来描述。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005；****p＜0.0001；n.s.，无统计学意义。

图3显示，基质细胞影响体内CD3重定向的疗效。在研究的第0天，将MOLM-13AML和带有HS-5骨髓基质细胞的MOLM-13(5∶1)皮下植入注射有huPBMC的雌性NSG小鼠体内。从肿瘤细胞植入后的第5天开始用CD123×CD3(8μg/kg)治疗小鼠，每周两次，共治疗5次。经PBS治疗的组作为对照。(A)所有组在不同时间点的平均肿瘤体积测量结果。(B)研究结束时(第24天)小鼠肿瘤中CD8⁺T细胞浸润的百分比。(C)第24天小鼠肿瘤中CD8⁺T细胞的激活、效应和检查点抑制标志物的分析。所示数据代表两个独立的实验，并且以平均值±平均数标准误差(SEM)(A)或带范围的中位数(B和C)表示。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005；n.s.，无统计学意义。

图4显示，细胞-细胞接触在介导基质细胞的免疫抑制和保护表型中起主导作用。(A)用Incucyte

Red标记的OCI-AML5细胞(20000个)与或不与Incucyte

Green标记的HS-5细胞(每孔20000个细胞)一起培养人类T细胞(40000个细胞/孔)，并用不同浓度的双特异性抗体处理人类T细胞72小时。代表性图像显示了在添加11nM的CD123×CD3双特异性抗体后72小时的培养物快照。(B)与A相同，但此处CFSE标记的肿瘤细胞与或不与基质细胞(HS-5或原代MSC)一起培养T细胞，并用不同浓度的双特异性抗体处理T细胞48小时。在这些试验中，基质细胞要么一起培养，要么在侵袭小室中与肿瘤和T细胞分离。通过流式细胞仪对死亡的CFSE⁺细胞的百分比进行定量。此处显示的来自一个实验的数据代表3个独立的生物重复实验。在此数据被显示为平均值±SD。(C)对杀死试验中CD8⁺T细胞的激活和效应标志物进行流式分析。数据被显示为带范围的中位数。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005；n.s.，无统计学意义。

图5显示，VLA-4的抑制逆转了基质介导的免疫抑制和保护肿瘤细胞免受体外CD3重定向细胞毒性的影响。用CFSE标记的肿瘤细胞与或不与基质细胞(HS-5或原代MSC)一起培养人类T细胞，并在存在或不存在VLA-4或CXCR4中和抗体的情况下，用不同浓度的双特异性抗体处理人类T细胞48小时。(A、B)通过流式细胞仪对死亡的CFSE⁺细胞的百分比进行定量。(C、D)对杀死试验中CD8⁺T细胞上颗粒酶B和CD25的表达进行流式分析。数据代表三个或更多个实验，并且以平均值±SD(A、B)和带范围的中位数(C、D)表示。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005；****p＜0.0001；n.s.，无统计学意义。

图6显示，VLA-4的抑制逆转了基质介导的免疫抑制和保护肿瘤细胞免受体内CD3重定向细胞毒性的影响。在研究的第0天，将AML细胞系MOLM-13和带有HS-5骨髓基质细胞的MOLM-13(5∶1)皮下植入注射有huPBMC的雌性NSG小鼠体内。用CD123×CD3(8μg/kg)单独或与抗VLA-4的中和抗体(3mg/kg)联合治疗小鼠。经PBS治疗的组作为对照。(A)所有组在不同时间点的平均肿瘤体积测量结果。(B)第23天小鼠肿瘤中CD8⁺T细胞的激活、效应和检查点抑制标志物的分析。所示数据代表两个独立的实验，并且以平均值±SEM(A)和带范围的中位数(B)表示。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005；****p＜0.0001；n.s.，无统计学意义。

图7显示，VLA-4的抑制弥补了离体原代AML和MM培养物中CD3重定向的功效。来自3个原代AML样品的PBMC(A、B)或来自3个MM样品的BMMC(C、D)在存在HS-5的情况下用1μg/mL的双特异性抗体培养72小时，并使用/不使用抗VLA-4的中和抗体进行培养。针对所有3个原始样品的细胞毒性(A和C)或CD8 T细胞扩增(B)/激活(D)，以带范围的中位值进行描绘。*p＜0.05。

图8显示，CD123×CD3和BCMA×CD3结合肿瘤细胞以及介导杀死和T细胞激活。(A)用不同浓度的双特异性抗体对CD123⁺或BCMA⁺细胞系进行染色，以表征其表面结合情况。通过用小鼠抗人IgG4染色来检测双特异性抗体的结合情况。(B)CD123×CD3和BCMA×CD3介导T细胞活化的能力(通过上调CD25和产生颗粒酶b来测量)和CD123⁺或BCMA⁺肿瘤细胞系的细胞毒性。

图9显示，基质细胞的存在保护了AML和MM细胞系免受T细胞重定向的细胞毒性的影响。人类T细胞与CFSE标记的AML或MM细胞系在基质细胞(HS-5、HS-27a、原代MSC或CD105⁺内皮细胞)存在或不存在的情况下以2∶1的比例培养。将不同浓度的CD123×CD3或BCMA×CD3持续48小时加入到培养物中。通过流式细胞仪对死亡的CFSE⁺细胞的百分比进行定量。(A)表中显示了CD123×CD3和BCMA×CD3分别对AML细胞系KG-1和MM细胞系H929介导细胞毒性的EC50值的汇总。(B)与A类似的实验装置，但此处是将越来越多的HS-5细胞加入到KG-1-T细胞培养物中。(C)评估CD123×CD3在不存在或存在基质的情况下介导AML细胞系OCI-AML5和MOLM-13的细胞毒性的能力。(D)评估BCMA×CD3在不存在或存在基质的情况下介导MM细胞系RPMI-8226和MM.1S的细胞毒性的能力。

图10显示，基质细胞的存在抑制了T细胞的激活和增殖。(A)人类T细胞与CFSE标记的MM细胞系H929在基质细胞(HS-5、HS-27a、原代MSC或CD105+内皮细胞)存在或不存在的情况下以2∶1的比例培养。将不同浓度的BCMA×CD3持续48小时加入到培养物中。在用双特异性抗体处理后48小时，用流式细胞仪对T细胞激活标志物的几何平均荧光强度进行定量。(B)与A类似，但此处CFSE标记的T细胞与未标记的肿瘤细胞系在基质细胞(HS-5、原代MSC或CD105⁺内皮细胞)存在或不存在的情况下以2∶1的比例培养。FACS分析显示了CFSE稀释图的叠加(空白×CD3对照组以阴影显示，而治疗组以黑色直方图显示)，描绘了T细胞的增殖情况。

图11显示，用Bcl-2抑制剂治疗阻断了Bcl2的表达。在存在HS5基质细胞系的情况下培养的并且使用或不使用Bcl-2i处理48小时的KG-1细胞中，对Bcl-2的表达进行免疫印迹分析。

图12显示，细胞-细胞接触和VLA-4粘附途径在基质介导的对MOLM-13细胞的细胞毒性的抑制中发挥作用。(A)用CFSE标记的MOLM-13细胞与或不与HS-5或原代MSC细胞一起培养人类T细胞，并用不同浓度的双特异性抗体处理人类T细胞48小时。在这些试验中，基质细胞要么一起培养，要么在侵袭小室中与肿瘤和T细胞分离。通过流式细胞仪对死亡的CFSE⁺细胞的百分比进行定量。(B)与A类似，但此处是在所有细胞一起培养时并且在存在或不存在VLA-4或CXCR4中和抗体的情况下评估细胞毒性。

图13显示，用VLA-4中和抗体处理减少了AKT和PI3K途径的磷酸化。在存在HS5基质细胞系的情况下培养的并且使用或不使用抗VLA4中和抗体处理48小时的KG-1细胞中，对pAkt和pPI3K的表达进行免疫印迹分析。

图14显示了AML原代患者样品的门控策略。离体实验的门控策略利用AML原代患者样品来进行。对应的同种型对照显示在一侧。(A)通过首先对前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)进行门控处理来识别CD123⁺未成熟细胞，以分离出感兴趣的细胞。然后对活CD45⁺细胞进行门控处理，之后对CD38⁺ CD33⁺未成熟细胞进行门控处理。接下来，在不同的条件下对表达CD123的未成熟细胞进行定量。(B)为了量化样品中的T细胞扩增，首先对具有SSC/FSC的感兴趣的细胞进行门控处理，然后识别活CD45⁺细胞。然后，根据CD4和CD8的染色来识别CD4⁺CD8^-和CD8⁺CD4^-T细胞。

图15显示了MM原代患者样品的门控策略。离体实验的门控策略利用MM原代患者样品来进行。对应的同种型对照显示在一侧。(A)通过首先对FSC/SSC进行门控处理来识别CD138⁺MM细胞，以分离出感兴趣的细胞。然后在各种条件下对活CD138⁺细胞进行定量。(B)为了量化样品中的T细胞激活，首先对具有SSC/FSC的淋巴细胞进行门控处理，然后识别活CD138^-细胞。然后，测量CD8⁺T细胞上CD25的表达。

具体实施方式

背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。

应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式″一个/一种″和″所述/该″包括复数引用物。

除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语″约″修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。

除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语″至少″应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。

如本文所用，术语″包含″、″包括″、″具有″或″含有″或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则″或″是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B两者为真(或存在)。

如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语″和/或″被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由″和/或″连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语″和/或″的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语″和/或″的要求。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语″由......组成″表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。

如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语″基本上由......组成″表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，″受试者″是指任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人。如本文所用，术语″哺乳动物″涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更优选地包括人。

字词″右″、″左″、″下″和″上″指定附图中的方向，以此作为参照。

还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的″约″、″大约″、″大致″、″基本上″和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。

如本文所用，术语″分离的″意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经″分离的″核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。″分离的″核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果该组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。

如本文所用，同义地称为″核酸分子″、″核苷酸″或″核酸″的术语″多核苷酸″是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。″多核苷酸″包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，″多核苷酸″是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA。″修饰的″碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，″多核苷酸″包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。″多核苷酸″也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

如本文所用，术语″载体″是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语″宿主细胞″是指包含本发明的核酸分子的细胞。″宿主细胞″可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，″宿主细胞″是用本发明的核酸分子转染或转导的细胞。在另一个实施方案中，″宿主细胞″是此类经转染或转导的细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。

如本文所用，术语″表达″是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。

本文所使用的术语″抗体″广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。″全长抗体″包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。根据重链恒定结构域氨基酸序列，每个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，按以下顺序从氨基-羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，免疫球蛋白可分配到五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。

如本文所用的术语″单克隆抗体″是指从抗体分子的基本上同质群体中获得的抗体，即，除了可能熟知的改变(诸如从抗体重链移除C末端赖氨酸)或翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。

如本文所用的术语″人类抗体″是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人类抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人类抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人类抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人类抗体包含″源自″人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人类动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于用于获得人类抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或CDR中或两者，因此″人类抗体″与在人类中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，″人类抗体″的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，″人类抗体″可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，(2000)J MolBiol 296：57-86中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397：385-96和国际专利公开WO2009/085462中所述的其他启动子。″人类抗体″的定义中不包括至少一个CDR源自非人类物种的抗体。

本文所使用的术语″人源化抗体″是指其中至少一个CDR来源于非人类物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。

术语″分离的抗体″是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的抗体，并且涵盖分离至更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。

本文所使用的术语″抗原结合片段″或″抗原结合结构域″是指免疫球蛋白分子的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程改造的多肽，并且含有VH、VL、VH和VL、Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段、由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)、鲨鱼可变IgNAR结构域、驼峰化VH结构域、由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元。VH和VL结构域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中有所描述。

术语″双特异性″是指特异性地结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca cynomolgus)(cynomolgus，cyno)或黑猩猩(Pantroglodytes))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。

本文所使用的术语″多特异性″是指特异性结合地至少两个不同抗原或同一抗原内的至少两个不同表位的抗体。多特异性抗体可结合例如两个、三个、四个或五个不同抗原或同一抗原内的不同表位。

当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，″特异性结合″或″免疫特异性结合″或其衍生术语表示通过由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合至感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样品中的其它分子。通常，抗体与同源抗原结合的K_d小于约1x10^-8M，其为通过表面等离子体共振试验或细胞结合试验测得。

术语″癌症″是指广泛的各种疾病，其特征在于身体中异常细胞的不受控制的生长。未受控制的细胞分裂和生长导致形成侵入相邻组织的恶性肿瘤，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。″癌症″或″癌症组织″可包括肿瘤。

本文所使用的术语″与......组合″意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受治疗者。

本文所使用的术语″增强″或″增强的″是指当与对照分子相比时一种测试分子的一种或多种功能增强，或当与一个或多个对照分子相比时测试分子组合的一种或多种功能增强。可测量的示例性功能是肿瘤细胞杀死、T细胞活化、相对或绝对T细胞数、Fc介导的效应功能(例如ADCC、CDC和/或ADCP)或与Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。″增强的″可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的增强，或统计意义上显著的增强。

本文所使用的术语″突变″是指与参考序列相比，多肽或多核苷酸序列中工程化或天然存在的改变。该改变可以是一个或多个氨基酸或多核苷酸的置换、插入或缺失。

本文所使用的术语″非固定组合″是指在非特定间隔时间限制下同时、并行或顺序地作为独立实体施用的T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的单独药物组合，其中此类施用在受试者体内提供有效水平的两种化合物。

本文所使用的术语″药物组合物″是指包含活性成分和药学上可接受的载体的组合物。

本文所使用的术语″药学上可接受的载体″或″赋形剂″是指药物组合物中除活性成分之外的成分，该成分对受试者无毒。

本文所使用的术语″重组体″是指当将来自不同来源的片段连接以产生重组DNA、抗体或蛋白质时，通过重组手段制备、表达、形成或分离的DNA、抗体和其他蛋白质。

本文所使用的术语″降低″或″降低的″是指当与一种或多种对照分子相比时，与对照分子或测试分子的组合相比，测试分子的一种或多种功能的降低。可测量的示例性功能是肿瘤细胞杀死、T细胞活化、相对或绝对T细胞数、Fc介导的效应功能(例如ADCC、CDC和/或ADCP)或与Fcγ受体(FcγR)或FcRn的结合。″降低的″可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的降低，或统计意义上显著的降低。

本文所使用的术语″难治性″是指不适于外科手术干预并且初始对治疗无响应的癌症。

本文所使用的术语″复发性″是指对治疗反应但然后返回的癌症。

本文所使用的术语″受试者″包括任何人类或非人类动物，″非人类动物″包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另外指出，术语″患者″或″受试者″可互换使用。

本文所使用的术语″治疗有效量″是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效的治疗剂或治疗剂的组合的示例性指标包括例如改善患者的健康。

本文所使用的术语″治疗(treat)″或″治疗(treatment)″是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。″治疗″也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的个体包括已患有病症或障碍的个体以及易患病症或障碍的个体或者要预防病症或障碍的个体。

本文所使用的术语″肿瘤细胞″或″癌细胞″是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平调节、侵入、肿瘤生长。

T细胞重定向治疗剂

本文公开的T细胞重定向治疗剂(在本申请中也被称为″T细胞重定向双特异性抗体″或″双特异性抗体″)是指包含两个或更多个结合区的分子，其中结合区中的一个结合区特异性地结合靶细胞或组织上的细胞表面抗原(诸如肿瘤相关抗原(TAA))，并且其中该分子的第二结合区特异性地结合T细胞表面抗原(诸如CD3)。这种双靶/多靶结合能力将T细胞募集到靶细胞或组织，从而根除靶细胞或组织。

本文使用的T细胞重定向治疗剂可以是抗体、抗体衍生的蛋白质，或例如表现出抗原结合位点的重组蛋白。在一个实施方案中，本文使用的T细胞重定向治疗剂是双特异性抗体，包括″整个″抗体，诸如整个IgG或IgG样分子，以及小型重组形式，诸如串联单链可变片段分子(taFvs)、双价抗体(Dbs)、单链双价抗体(scDbs)及其各种其他衍生物(参见：ByrneH.等人(2013)Trends Biotech，31(11)：621-632所述的双特异性抗体形式，其中图2显示各种双特异性抗体格式；Weidle U.H.等人(2013)Cancer Genomics and Proteomics 10：1-18，特别地图1显示各种双特异性抗体格式；以及Chan，A.C.和Carter，P.J.(2010)Nat RevImmu 10：301-316，其中图3显示各种双特异性抗体形式)。双特异性抗体格式的示例包括但不限于：四价体瘤、化学耦合Fab(片段抗原结合)和

(双特异性T细胞吞噬者)。

在一个实施方案中，本文使用的双特异性抗体可选自包括以下项的组：Triomab；混合杂交瘤(四价体瘤)；多特异性anticalin平台(Pieris)；双价抗体(Diabodies)；单链双价抗体；串联单链Fv片段；TandAbs，三特异性抗体(Affimed)(105-110kDa)；Darts(双亲和重靶向；Macrogenics)；双特异性Xmabs(Xencor)；双特异性T细胞衔接子(Bites；Amgen；55kDa)；三重抗体(Triplebodies)；三价抗体(Tribody)＝Fab-scFv融合蛋白(CreativeBiolabs)多功能重组抗体衍生物(110kDa)；Duobody平台(Genmab)；Dock和lock平台；Knob into hole(KIH)平台；人源化双特异性IgG抗体(REGN1979)(Regeneron)；Mab2双特异性抗体(F-Star)；DVD-Ig＝双可变域免疫球蛋白(Abbvie)；kappa-lambda体；四价双特异性串联Ig；和CrossMab。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性IgG样抗体(BsIgG)，其包括CrossMab；DAF(二合一(two-in-one))；DAF(四合一(four-in-one))；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes common LC；Knobs-in-holes assembly；电荷对；Fab-arm交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-body；和Orthogonal Fab。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.，Zhai Q.和Carter P.J.(2015)MolecularImmunology67：95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自附有IgG的抗体，其额外的抗原结合分子包括DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L，H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；和DVI-IgG(四合一(four-in-one))。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.，Zhai Q.和Carter P.J.(2015)MolecularImmunology 67：95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性抗体片段，其包括Nanobody；Nanobody-HAS；BiTE；Diabody；DART；TandAb；scDiabody；sc-Diabody-CH3；Diabody-CH3；Triple Body；Miniantibody；Minibody；TriBi minibody；scFv-CH3 KIH；Fab-scFv；scFv-CH-CL-scFv；F(ab′)2；F(ab′)2-scFv2；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；Tetravalent HCAb；scDiabody-Fc；Diabody-Fc；Tandem scFv-Fc；和Intrabody。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.，Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67：95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性融合蛋白，其包括Dock and Lock；ImmTAC；HSAbody；scDiabody-HAS；和Tandem scFv-Toxin。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67：95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可选自双特异性抗体缀合物，其包括IgG-IgG；Cov-X-Body；和scFv1-PEG-scFv2。这些双特异性抗体形式在以下文章中示出和描述：例如，Spiess C.、Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67：95-106，特别是图1和对应描述，例如，第95-101页。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体可基于任意免疫球蛋白类(例如，IgA、IgG、IgM等)和亚类(例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)。在一方面，本文所使用的双特异性抗体可具有IgG样形式(基于IgG，也称为″IgG类型″)，其通常包括两条重链和两条轻链。具有IgG样格式的抗体的示例包括四价体瘤和各种IgG-scFv格式(参见：ByrneH.等人(2013)Trends Biotech，31(11)：621-632；FIG.2A-E)，其中优选四价体瘤，其优选地通过两种不同杂交瘤的融合产生。在IgG类中，双特异性抗体可基于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。

在另一个实施方案中，本文所使用的双特异性抗体是IgG样抗体形式，其包括例如混合杂交瘤(四价体瘤)、具有共同轻链的knobs-into-holes、各种IgG-scFv形格式、各种scFv-IgG格式、二合一(two-in-one)IgG、双V域IgG、IgG-V和V-IgG，其例如在Chan，A.C.和Carter，P.J.(2010)Nat Rev Immu 10：301-316的图3c中示出并且在所述文章中描述。另外的示例性双特异性IgG样抗体格式包括例如DAF、CrossMab、IgG-dsscFv、DVD、IgG-dsFV、IgG-scFab、scFab-dsscFv和Fv2-Fc，其在Weidle U.H.等人(2013)Cancer Genomics andProteomics 10：1-18的图1A中示出并在所述文章中描述。更进一步的示例性双特异性IgG样抗体格式包括DAF(二合一(two-in-one))；DAF(四合一(four-in-one))；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes assembly；电荷对；Fab-arm交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-body；Orthogonal Fab；DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L，H)-FV；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；以及DVI-IgG(四合一(four-in-one)，如在例如Spiess C.，Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67：95-106，特别是图1和对应描述(例如，第95-101页)中所示和所描述的(四合一(four-in-one))。

例如，双特异性抗体可通过三种不同方法产生：(i)化学缀合，其涉及化学交联；(ii)两种不同杂交瘤细胞系的融合；或(iii)涉及重组DNA技术的遗传方法。两个不同的杂交瘤融合产生一个混合杂交瘤(或″四价体瘤″)，其分泌包括双特异性分子的异质性抗体群。替代方法包括两个不同的mAb和/或更小的抗体片段的化学缀合。将两个不同的抗体或抗体片段连接起来的氧化再结合策略被视作低效，因为在多个本地二硫键的再氧化过程中存在副反应。当前用于化学缀合的方法主要是使用同源或异源双功能交联试剂。通过对基因的人工操作，重组DNA技术已经产出最大范围的双特异性抗体，并且代表了用于产生双特异性抗体的最多样化的方法(在过去二十年中有45种格式；参见Byrne H.等人(2013)Trends Biotech，31(11)：621-632)。

特别是通过使用这种重组DNA技术，最近也出现了多种进一步的多特异性抗体。术语″多特异性抗体″是指具有一个以上的补位并能与两个或多个不同表位结合的蛋白质。因此，术语″多特异性抗体″包括如上定义的双特异性抗体，但通常也包括蛋白质，如抗体，支架，特别是与三个或更多不同的表位结合，即具有三个或更多补位的抗体。这种多特异性蛋白，特别是具有三个或更多补位的蛋白，通常通过重组DNA技术来实现。在本发明的背景下，该抗体可特别具有两个以上的特异性，因此具有两个以上的补位，因为根据本发明至少需要两个补位，例如一个用于靶细胞，另一个用于T细胞。因此，根据本发明，除了两个补位之外，使用的抗体可具有另外的补位，特别是与进一步的特异性有关的补位。因此，本发明还包括多特异性抗体。因此应当理解，本发明不局限于双特异性抗体，尽管这里特别提到了代表最低要求的双特异性抗体。因此，本文所述的关于双特异性抗体的内容也可适用于多特异性抗体。

如上文所定义的双特异性抗体和多特异性抗体，能够针对在疾病过程中起关键作用的靶细胞来重定向效应细胞。特别地，本文使用的T细胞重定向双特异性抗体可以例如与T细胞受体(TCR)复合物结合，并将T细胞″重定向″到靶细胞，诸如例如肿瘤细胞。为此，本文使用的这种双特异性抗体通常具有至少一个特异性，例如至少一个补位，用于募集T细胞，该补位对T细胞具有特异性，优选地对于T细胞表面抗原具有特异性，例如CD3，以及至少一个其他特异性，例如至少一个补位，用于将T细胞引导到肿瘤细胞，该补位对肿瘤细胞具有特异性，优选地对肿瘤细胞上的TAA具有特异性。通过T细胞重定向双特异性抗体将T细胞″重定向″到肿瘤细胞，通常会导致由T细胞介导的对肿瘤细胞的杀死。

在一个实施方案中，本文所使用的T细胞重定向治疗剂包括对T细胞表面抗原具有特异性的第一结合区和对肿瘤细胞上TAA局域特异性的第二结合区。

在又一实施方案中，T细胞表面抗原可选自CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C。或者，T细胞表面抗原是CD3。

在另一个实施方案中，TAA可选自B细胞成熟抗原(BCMA)、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD10、CD21、CD22、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD52、CD133、ROR1、B7-H6、B7-H3、HM1.24、SLAMF7、Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3、CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2、Her3、IGFR、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白、卷曲蛋白1-10、VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4、CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8或Tie2。肿瘤细胞上的进一步的示例性TAA包括A33、frizzled-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、de2-7、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸结合蛋白、G250、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关的细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)、hK2、TAG-72或肿瘤细胞新抗原。或者，TAA可选自BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7。或者，TAA可选自BCMA或CD123。

在一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是一种BCMA×CD3双特异性抗体，其能免疫特异性地与BCMA⁺MM细胞和CD3 T细胞结合。BCMA×CD3双特异性抗体可选自WO2007117600、WO2009132058、WO2012066058、WO2012143498、WO2013072406、WO2013072415、WO2014122144和US10,072,088中公开的抗体，其全部内容以引用方式并入本文。

在一个实施方案中，BCMA×CD3双特异性抗体是US10,072,088中公开的双特异性

抗体，其全部内容以引用方式并入本文。BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，其中，HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。在一个实施方案中，BCMA×CD3抗体包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HC2和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的LC2，其中，HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。在一个实施方案中，BCMA×CD3抗体包括具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HC2和具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的LC2，其中，HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

在一个实施方案中，T细胞重定向治疗剂是一种CD123×CD3双特异性抗体，其能免疫特异性地与CD123⁺ AML细胞和CD3 T细胞结合。CD123×CD3双特异性抗体可为US9,850,310中公开的双特异性

抗体，其全部内容以引用方式并入本文。在一个实施方案中，CD123×CD3抗体包括具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HC2和具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的LC2，其中，HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合CD 123的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

SEQ ID NO：1

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISKNSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSMYYSGSTYYNSSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGGASIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO：2

SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDMDACWYQQRPGQSPVVVIYQDSERPSGIPERFAGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO：3

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:6

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:7

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWISWVRQMPGKGLEWMGIIDPSDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDGSTDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:8

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQDYGFPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:9

EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNAYATYYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO：10

QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

VLA-4粘附途径抑制剂

极迟抗原-4(VLA-4)，也被称为α4β1，是细胞表面受体β1整合素家族的成员。VLA-4包含一条α4链和一条β1链，并且参与细胞与细胞之间的相互作用。其表达主要限于淋巴细胞和骨髓细胞。它在细胞粘附中起关键作用。研究还表明，VLA-4在介导BM中AML/MM-基质的相互作用中起重要作用。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)(由成骨细胞和内皮细胞表达)和纤连蛋白(细胞外基质的组成部分)是VLA-4的两个配体。

本文所使用的VLA-4粘附途径抑制剂可以是能够阻断由VLA-4介导的粘附途径的任何分子。

例如，本文使用的VLA-4粘附途径抑制剂可以是抗VLA-4抗体或由抗VLA-4抗体制备的VLA-4结合片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；并且由一条重链和一条轻链组成的二聚体也在本文考虑之列。此类抗体片段可通过化学方法生产，例如通过用蛋白酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶来裂解完整的抗体，或经由重组DNA技术生产，例如通过使用用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞。重链和轻链单体类似地可通过用还原剂诸如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇处理完整的抗体，或通过使用用DNA编码期望重链或轻链或这两者(或者诸如其单克隆抗体或抗体片段)而转化的宿主细胞来生产。

能够阻断由VLA-4介导的粘附途径的任何合适的抗VLA-4抗体或VLA-4结合片段都可在本文中使用，其包括但不限于那他珠单抗(natalizumab)和那些在美国专利号6,602,503和美国专利申请公开号US20140161794 A1中公开的抗体，其全部内容以引用方式并入本文。

在某些实施方案中，本文所使用的VLA-4粘附途径抑制剂可以是能够阻断由VLA-4介导的粘附途径的VLA-4拮抗剂。本文所使用的示例性VLA-4拮抗剂包括但不限于来自Tocris Bioscience的VLA-4拮抗剂(例如BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035)。

由于VCAM-1和纤连蛋白是VLA-4的配体，VLA-4粘附途径抑制剂也可包括VCAM-1或纤连蛋白的拮抗剂(包括抗体)。

药物组合物

本文进一步公开了包括如上文所公开的T细胞重定向治疗剂、如上文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的多核苷酸，多肽，宿主细胞和/或工程化免疫细胞以及包含它们的组合物还可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。在某些实施方案中，药物组合物是包括如上文所公开的T细胞重定向治疗剂、如上文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂和药学上可接受的载体的独立组合物。在其他实施方案中，药物组合物不是独立组合物，并且药物组合物包含如上文所公开的T细胞重定向治疗剂、如上文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂和药学上可接受的载体。

如本文所用，术语″载剂″是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其他材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语″药学上可接受的载剂″是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据具体实施方案，根据本公开，适用于多核苷酸、多肽、宿主细胞和/或工程化免疫细胞药物组合物的任何药学上可接受的载剂均可用于本发明。

药物活性成分与药学上可接受的载剂的制剂为本领域中已知的，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)以及任何后续版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载剂可用于配制本发明的药物组合物。

在本公开的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。

在一个实施方案中，药物组合物可被配制为可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射的注射剂。注射可以例如皮下、肌内、腹膜内、玻璃体内或静脉内递送。

在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。

使用方法

在另一个一般方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含如本文所公开的T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的药物组合物。

在另一个一般方面，本发明涉及一种杀死癌细胞的方法，该方法包括让癌细胞接受包含如本文所公开的T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的组合物。

受试者可能患有新诊断的癌症或者在经过先前的抗癌疗法后是复发性的或难治性的。癌症可以是血液恶性肿瘤或实体瘤。

根据本发明的实施方案，药物组合物包含治疗有效量的T细胞重定向治疗剂和如本文公开的VLA-4粘附途径抑制剂。如本文所用，术语″治疗有效量″是指在受试者中引起期望的生物学或药物学响应的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验并以常规方式进行确定。

如本文参考T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂所用，治疗有效量意指T细胞重定向治疗剂与VLA-4粘附途径抑制剂联合用于调节有需要的受试者的免疫应答的量。此外，如本文参考T细胞重定向治疗剂所用，治疗有效量意指具有VLA-4粘附途径抑制剂的T细胞重定向治疗剂用于实现以下目的的量：治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症的发展；或者减轻或完全缓解与疾病、障碍或病症相关联的症状。

治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如欲被治疗的疾病、障碍或病症、施用方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人或动物、施用的其他药物，以及是否为预防性或治疗性治疗。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。

如本文所用，术语″处理″和″治疗″(″treat″、″treating″和″treatment″)均旨在是指与癌症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语″处理″和″治疗″也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在一个特定实施方案中，″处理″和″治疗″是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选地癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，″处理″和″治疗″是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，″处理″和″治疗″是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在特定实施方案中，″处理″和″治疗″是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。

根据具体实施方案，提供了用于治疗癌症的药物组合物。对于癌症疗法，所提供的药物组合物可以与另一种治疗联合使用，该另一种治疗包括但不限于化学疗法、抗CD20mAb、抗TIM-3mAb、抗LAG-3mAb、抗EGFR mAb、抗HER-2mAb、抗CD19mAb、抗CD33mAb、抗CD47 mAb、抗CD73mAb、抗DLL-3mAb、抗apelin mAb、抗TIP-1mAb、抗FOLR1mAb、抗CTLA-4mAb、抗PD-L1mAb、抗PD-1mAb、其他免疫-肿瘤学药物、抗血管生成剂、放射疗法、抗体-药物缀合物(ADC)、靶向疗法或其他抗癌药物。

根据具体实施方案，治疗有需要的受试者的癌症的方法包括向受试者施用如本文所公开的T细胞重定向治疗剂与VLA-4粘附途径抑制剂的联合。

如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的上下文中，术语″联合″是指使用多于一种疗法。术语″联合″的使用并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的T细胞重定向治疗剂)可在第二疗法(例如，VLA-4粘附途径抑制剂)施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。

试剂盒

在另一个一般方面，本文提供了试剂盒、单位剂量和制品，其包含如本文所公开的T细胞重定向治疗剂、如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂和任选的药物载剂。在某些实施方案中，试剂盒优选地提供其使用说明。

在另一个特定方面，本文提供了试剂盒，其包含(1)如本文所公开的T细胞重定向治疗剂和(2)如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂。

在另一个特定方面，本文提供了包含药物组合物的试剂盒，该药物组合物包含药学上可接受的载体和(1)如本文所公开的T细胞重定向治疗剂和(2)如本文所公开的VLA-4粘附途径抑制剂。

实施方案

本发明的实施方案1包括药物组合物，所述药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂，其中，所述T细胞重定向治疗剂包括免疫特异性地结合T细胞表面抗原的第一结合区和免疫特异性地结合肿瘤相关抗原(TAA)的第二结合区。

本发明的实施方案2包括根据实施方案1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

本发明的实施方案3包括根据实施方案1或2所述的药物组合物，其中，所述T细胞重定向治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

本发明的实施方案4包括根据实施方案1-3中任一项所述的药物组合物，其中，所述T细胞表面抗原选自由CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C组成的组。

本发明的实施方案5包括根据实施方案4所述的药物组合物，其中，所述T细胞表面抗原是CD3。

本发明的实施方案6包括根据实施方案1-5中任一项所述的药物组合物，其中，所述TAA选自由BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7组成的组。

本发明的实施方案7包括根据实施方案6所述的药物组合物，其中，所述T细胞重定向治疗剂是BCMA×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

本发明的实施方案8包括根据实施方案7所述的药物组合物，其中，所述BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，并且其中，所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

本发明的实施方案9包括根据实施方案8所述的药物组合物，其中，所述HC1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列，所述LC2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

本发明的实施方案10包括根据实施方案8所述的药物组合物，其中，所述HC1包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ IDNO：3的氨基酸序列，所述LC2包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

本发明的实施方案11包括根据实施方案6所述的药物组合物，其中，所述T细胞重定向治疗剂是CD 123×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

本发明的实施方案12包括根据实施方案11所述的药物组合物，其中，所述CD123×CD3双特异性抗体包括第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，其中，所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

本发明的实施方案13包括根据实施方案12所述的药物组合物，其中，所述HC1包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ IDNO：9的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO：10氨基酸序列。

本发明的实施方案14包括根据实施方案1-13中任一项所述的药物组合物，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂是抗VLA-4抗体或其抗原结合片段。

本发明的实施方案15包括根据实施方案14所述的药物组合物，其中，所述抗VLA-4抗体或其抗原结合片段选自由单克隆抗体、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体组成的组。

本发明的实施方案16包括根据实施方案1-13中任一项所述的药物组合物，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂是VLA-4拮抗剂。

本发明的实施方案17包括根据实施方案16所述的药物组合物，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂是选自由BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035组成的组的VLA-4拮抗剂。

本发明的实施方案18包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案19包括根据实施方案18所述的方法，其中，所述T细胞重定向治疗剂和所述VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案20包括根据实施方案19所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案21包括根据实施方案20所述的方法，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案22包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案23包括根据实施方案22所述的方法，其中，所述T细胞重定向治疗剂和所述VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案24包括根据实施方案22所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案25包括根据实施方案22所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

实施方案26包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案27包括根据实施方案26所述的方法，其中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案28包括根据实施方案26所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案29包括根据实施方案26所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案30包括杀死癌细胞的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触并增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案31包括根据实施方案30所述的方法，其中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案32包括根据实施方案30所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案33包括根据实施方案30所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案34包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案35包括根据实施方案34所述的方法，其中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案36包括根据实施方案34所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案37包括根据实施方案34所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案38包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触，包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

实施方案39包括根据实施方案38所述的方法，其中，所述T细胞重定向治疗剂和所述VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案40包括根据实施方案38所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案41包括根据实施方案38所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案42包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案43包括根据实施方案42所述的方法，其中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案44包括根据实施方案42所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案45包括根据实施方案42所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案46包括改变肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触并增加T细胞依赖的细胞毒性，包括使肿瘤微环境经受治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，所述肿瘤微环境中的免疫抑制减弱，并且癌细胞经历一些形式的细胞死亡。

本发明的实施方案47包括根据实施方案46所述的方法，其中，T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案48包括根据实施方案46所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案49包括根据实施方案46所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案50包括治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的药物组合物。

本发明的实施方案51包括根据实施方案50所述的方法，其中，所述受试者患有新诊断的癌症。

本发明的实施方案52包括根据实施方案51所述的方法，其中，所述受试者在经过先前的抗癌疗法后是复发性的或难治性的。

本发明的实施方案53包括根据实施方案50-52中任一项所述的方法，其中，所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。

本发明的实施方案54包括根据实施方案53所述的方法，其中，所述受试者患有AML或MM。

本发明的实施方案55包括根据实施方案50-54所述的方法，其中，所述T细胞重定向治疗剂和所述VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

本发明的实施方案56包括根据实施方案55所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之前施用。

本发明的实施方案57包括根据实施方案55所述的方法，其中，VLA-4粘附途径抑制剂在施用T细胞重定向治疗剂之后施用。

本发明的实施方案58包括试剂盒，所述试剂盒包括根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物。

本发明的实施方案59包括试剂盒，所述试剂盒包括根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物单独包装。

本发明的实施方案60包括试剂盒，所述试剂盒包括根据实施方案1-17中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包装在一起。

实施例

材料和方法

抗体设计

生产靶向人类CD123和CD3或靶向人类BCMA和CD3的双特异性抗体，其中抗CD123或抗BCMA抗体和抗CD3抗体通过使用Genmab技术产生受控片段抗原结合臂交换来在纯化后接合在一起(17、18)。这导致形成单价结合的双功能

抗体，其能特异性地与人类CD123⁺AML或人类BCMA⁺MM细胞和CD3 T细胞结合(图8A和8B)。为了最小化抗体介导的效应功能，在Fc结构域中引入突变以减少与Fcγ受体的相互作用。以下实验中使用的双特异性抗体(BCMA×CD3双特异性和CD123×CD3双特异性)包括第一重链(HC1)、第二重链(HC2)、第一轻链(LC1)和第二轻链(LC2)，其中，HC1和LC1配对以形成免疫特异性地结合CD123或BCMA的第一抗原结合位点，并且HC2和LC2配对以形成免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。以下实施例中使用的BCMA×CD3双特异性包括具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的HC2和具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的LC2。以下实施例中使用的CD123×CD3双特异性包括具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HC1、具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的LC1、具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HC2和具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的LC2。

体外和离体细胞毒性试验

用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记肿瘤细胞系，并在存在或不存在基质细胞系(HS-5和HS-27a)、原始间质细胞(MSC)和CD105⁺内皮细胞的情况下将该肿瘤细胞系与解冻的纯化冷冻T细胞共培养。24小时后，在孔中加入双特异性抗体，并在37℃和5％CO₂的条件下将板培养48小时。然后在流式细胞仪上分析之前，对细胞进行各种标记物染色。对于侵袭小室相关的实验，在96孔U型底板中进行试验，该板带有或不带有0.4μm的侵袭小室嵌件(HTS TRANSWL96，Corning)。对于

相关的实验，使用红色荧光OCI-AML5细胞(OCI-AML5-NucLight Red)和绿色HS-5(HS-5-NucLight Green)。

在离体试验中，HS-5细胞在加入AML外周血单核细胞(PBMCs)或MM骨髓单核细胞(BMMCs)之前被放入板中。加入CD123×CD3或BCMA×CD3或空白×CD3双特异性抗体(1μg/ml)，其中加入或不加入抗VLA4抗体(5μg/ml)。72小时后，经由流式细胞仪监测CD123⁺未成熟细胞或CD138⁺MM浆细胞的消耗情况。另外，还评估了CD8 T细胞的扩增及其激活状态(CD25的上调)。

体内MOLM-13异种移植模型

在肿瘤细胞植入前6-7天静脉内接种人类PBMC(1×107个细胞/小鼠)。在研究的第0天，对小鼠皮下(sc)植入1×106个MOLM-13细胞和两种浓度(2×105和5×105)的HS-5骨髓基质细胞。每三天(q3d)进行静脉内(iv)注射CD123×CD3(0.04mg/kg和0.008mg/kg，n＝8)或赋形剂PBS对照(n＝5)，共5次。在研究期间，每周两次监测单个小鼠的体重下降和肿瘤生长抑制情况。在使用VLA-4阻断抗体的体内研究中，用CD123×CD3双特异性抗体(0.008mg/kg，n＝8或9)或PBS赋形剂对照(n＝5)进行静脉内治疗，并腹膜内(ip)注射抗VLA-4抗体(5mg/kg)。没有动物被排除在分析之外。

统计方法

通过GraphPad软件Prism版本8(SAS Institutes，Cary，NC)分析数据。对于图1和图2，采用Browne-Forsythe和Welch ANOVA测试分析，而对于图3至图7采用普通双向方差分析(ANOVA)。

细胞系

KG1、H929、RPMI-8226、MM.1S、HS-5和HS-27a细胞系获自于美国组织培养库(弗吉尼亚州马纳萨斯)。MOLM 13和OCI-AML5获自Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(德国DSMZ)。来自正常人捐赠者的冷冻保存的原始间质干细胞购自Lonza公司(瑞士巴塞尔)，并且CD105⁺骨髓内皮细胞购自All Cells公司(加利福尼亚州阿拉梅达)。

NucLight Green或NucLight Red慢病毒试剂(EF1a，Puro)购自EssenBioscience(密西根州安娜堡)，并根据制造商的说明用于生成HS-5-NucLight Green和OCI-AML5-NucLight Red细胞。嘌呤霉素的处理用于选择荧光阳性细胞系。虽然细胞系最近没有经过鉴定，但它们的支原体污染测试结果呈阴性。

带有双特异性抗体的结合试验

将所有肿瘤细胞离心，用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤两次，并且将1×104个细胞与可结晶(Fc)的片段块(人类IgG1片段)一起加入到96孔U型底板的每个孔中心，以2mg/mL的浓度持续加入10分钟。将连续稀释的双特异性抗体加入合适的孔中。将板在37℃和5％CO₂的黑暗环境中温育4小时。然后将细胞用DPBS洗涤，并且通过用小鼠抗人IgG4(Southem Biotech，克隆HP6025，目录号9200-09)和LIVE/DEAD(L/D；Invitrogen，目录号L34976)染色30分钟来检测双特异性抗体的结合情况。最后，洗涤细胞，重新悬浮于染色缓冲液中，并在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。在Prism版本7(GraphPad)中绘制几何平均荧光强度(gMFI)。对X轴进行对数转换，并且应用4参数非线性曲线拟合。

细胞系的体外细胞毒性试验

对肿瘤细胞系(KG1、MOLM13、OCI-AML5、H929、RPMI-8226和MM.1S)进行计数，并且用DPBS洗涤，然后用CFSE(重新悬浮于于150μL二甲亚砜中并且以1∶10000的比例稀释)在室温下以1×107个细胞/mL的CFSE进行培育8分钟。用HI FBS淬灭染色。在完全培养基中洗涤细胞，然后在含有1mg/mL人类IgG1片段的完全培养基中以2×10⁵细胞/mL进行重新悬浮，然后培育15分钟。将纯化的冷冻T细胞(从BioIVT(Westport，纽约)获取)解冻并以1×10⁶个细胞/mL重新悬浮。通过使用Ficoll梯度(用来分离单核细胞)和在室温下培育后用抗体混合物(CD16、CD19、CD36、CD56和CD66b)进行阴性选择来从全血中分离T细胞，以去除″不想要的″细胞。收获基质细胞系(HS-5和HS-27a)，清洗、计数并以4×10⁵个细胞/mL重新悬浮。关于原代间质细胞(MSC)和CD105⁺内皮细胞，对分别源自Lonza和All cells的冷冻等分物进行解冻，并以4×10⁵个细胞/mL重新悬浮。最后，将50μL纯化的T细胞、50μL基质细胞和100μL标记的肿瘤细胞与0.5mg/mL人类IgG1片段结合在96孔U型底板的每个孔中。24小时后，将测试抗体加入孔中。在DPBS或完整培养基中，将抗体稀释至133nM的最终起始浓度。将抗体进一步稀释3倍并加入合适的孔中。在加入抗体后，将所有板在37℃和5％CO2的环境中培育48小时。然后在流式细胞仪上分析之前，使用DPBS清洗细胞并对细胞进行各种标记物染色。

对于增殖实验，如上详述那样进行体外试验，只是在此在共培养之前用CFSE染料标记T细胞，从而允许在加入双特异性抗体后96小时通过监测CFSE来评估增殖情况。

对于侵袭小室相关的实验，在96孔U型底板中进行试验，该板带有或不带有0.4μM的侵袭小室嵌件(HTS TRANSWL96，Corning)。基质细胞可与T细胞和肿瘤细胞结合，也可通过在侵袭小室嵌件上接种来与T细胞和肿瘤细胞分离。

对于

相关的实验，使用红色荧光OCI-AML5细胞(OCI-AML5-NucLightRed)和绿色HS-5(HS-5-NucLight Green)。在无酚红RPMI/10％HI FBS中清洗肿瘤、基质和T细胞并结合起来进行这些试验。在120小时的时间段内，每个孔的红色和绿色对象(表示红色OCI-AML5和绿色HS-5)的图像由

Zoom每6小时记录一次。

对于阻断实验，使用以下抑制剂和中和抗体：Bcl-2抑制剂(HA14-1)、抗人CXCR4(12G5)和抗人ITGA4/VLA4(2B4)，抗体购自R&D系统(明尼苏达州明尼阿波利斯)。

原代AML和MM患者样品的离体细胞毒性试验

将30000或600000个HS-5细胞过夜存放于6孔板的每孔中。第二天早晨，小心地取出培养基，然后用3×10⁶个原代AML或MM PBMC和BMMC替换，它们分别在带有0.5mg/mL人类IgG1片段的αMEM+10％胎牛血清(FBS原代)中。接下来，加入CD123×CD3、BCMA×CD3或空白×CD3双特异性抗体(1μg/ml)，其中加入或不加入抗VLA4抗体(5μg/ml)。72小时后，经由流式细胞仪监测CD123⁺未成熟细胞或CD138⁺MM浆细胞的消耗情况。另外，还评估了CD8 T细胞的扩增及其激活状态(CD25的上调)。

流式细胞仪和抗体试剂

用于流式细胞仪的抗体包括以下抗人类抗体：CD278/ICOS(DX-29)、CD4(SK3)、颗粒酶B(GB11)(购自BD Biosciences)、CD8(RPA-T8)、41BB/CD137(4B4-1)、CD25(BC96)、穿孔素(dG9)、Tbet(4b10)、PD-1/CD279(EH12.2H7)、TIM3(F38-2E2)、CD33(WM53)、CD38(HIT2)、CD123(6H6)、CD138(MI15)(购自BioLegend)、LAG3(3DS223H)(购自eBiosciences)和LIVE/DEAD Near-IR(Life Technologies)。

关于FACS分析，将板以1500rpm离心5分钟。然后用DPBS清洗细胞，并针对T细胞激活标志物和细胞毒性进行30分钟的染色。最后，洗涤细胞并重新悬浮于染色缓冲液中。关于细胞内染色，根据制造商的说明，使用IC染色试剂盒(eBiosciences)对细胞进行固定和透化，并稍作修饰(在用细胞内细胞因子抗体培育前用透化缓冲液洗涤四次)。

在FACSCanto II(BD Biosciences)或LSRFortessa(BD Biosciences)上获取数据。通过对前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)进行门控处理以识别细胞群，然后是CFSE⁺肿瘤事件，最后LIVE/DEAD Near-IR来评估肿瘤细胞毒性，从而评估肿瘤细胞死亡情况。在与经PBS治疗的对照和同种型对照进行比较后，绘制L/D+门。这些对照也有助于说明与抗体的非特异性结合或溢出效应有关的错误。通过对FSC和SSC的门控来评估T细胞的激活，以确定细胞群、CFSE^-事件、活细胞，然后寻找若干标记物的阳性染色。使用Prism 8绘制死亡肿瘤细胞的百分比，并用4参数非线性回归曲线拟合进行分析。对于T细胞激活标志物，通过FlowJo软件分析各种标志物的几何平均荧光强度，并使用Prism 8作图。

免疫印迹和抗体试剂

根据制造商的说明，使用Wes自动化系统(ProteinSimple，加利福尼亚州，美国)执行自动蛋白质印迹。将样品与含有SDS、DTT和荧光分子量标准物的5倍样品缓冲液混合，并在95℃下加热5分钟，然后装入预装有堆叠和分离基质的板上，同时还有阻断和洗涤缓冲液、抗体溶液和检测试剂。使用默认设置用于分析。使用购自Cell Signaling Technology公司(Danvers，MA)的下列抗人类抗体来检测蛋白质：Bcl-2(#2872)、Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9)

Rabbit mAb(#4511)、Phospho-Akt(Ser473)(D9E)

Rabbit mAb(#4060)和β-Actin(D6A8)Rabbit mAb(#8457)。

动物

雌性NSG(NOD scid gamma或NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(TheJackson Laboratory，Bar Harbor，ME)在大约6-8周龄时使用，体重为20g。在实验使用之前，允许所有动物适应环境并从任何与运输相关的压力中恢复至少5天。随意提供反渗透(RO)氯化水和经照射的食物(实验室可高压消毒的啮齿动物饮食5010，实验室饮食)，并且将动物在12h光照和黑暗循环中保持不变。使用前对笼子、寝具和水瓶进行高压消毒，标签每周更换一次。所有实验都根据《实验室动物护理和使用指南(The Guide for the Careand Use of Laboratory Animals)》进行，并得到了宾夕法尼亚州春天之家Janssen R&D机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of JanssenR&D，Spring House，PA)的批准。

结果

BM基质细胞保护AML和MM细胞系免受CD3双特异性抗体和由T细胞介导的细胞毒性 的影响

BM生态位的特征在于其保护性和免疫抑制性微环境。BM基质细胞被用于模拟BM生态位，因其为骨内和血管生态位的主要细胞成分，该生态位管理基本的造血干细胞(HSC)细胞命运决定，包括自我更新、生存、分化和增殖(19、20)。还记录了BM基质细胞可介导免疫抑制(13、21)，同时还可激活肿瘤细胞的多种生存和抗凋亡途径，从而使它们对不同类型的治疗产生抗性(22)。在不存在或存在BM基质细胞的情况下，将AML或MM细胞系与T细胞和双特异性抗体共培养。使用靶向CD123或BCMA和CD3(工具抗体)的双特异性抗体。图8中示出了结合、杀死和T细胞活化数据，表明了这些抗体的功效。使用CD123×CD3双特异性抗体，观察到表达CD123的白血病细胞系KG-1的剂量依赖性杀死(图1A和图1B)。使用表达CD3或CD123的双特异性抗体以及非靶向(空)臂时，没有观察到该杀死(图1A和图1B)。当使用表达BCMA的MM细胞系H929和另一种双特异性抗体BCMA×CD3(图1C至图1D)时，也观察到类似的结果，即与空对照相比的由BCMA×CD3介导的特异性杀死。当将基质细胞添加到共培养物中时，即使在高浓度的双特异性抗体中，观察到的最大细胞毒性反应也出现了显著的统计学意义的下降(图1A至图1D)。此外，在存在基质的情况下，双特异性抗体的EC50值高出3-5倍(图9A)。基质对双特异性抗体活性的抑制不仅限于成纤维基质细胞系(HS-5和HS-27a)，而且还观察到来自健康供体BM的原代间充质基质细胞(MSC)(图1A至图1D)。双特异性抗体活性的抑制取决于共培养物中存在的基质细胞的数量；因此，当基质细胞比共培养物中的癌细胞少10倍时，仍然观察到效果的下降(图9B)。有趣的是，加入从健康供体的BM单核细胞中分选出来的CD105⁺内皮细胞时，没有观察到抑制作用(图1A至图1D)。该结果表明，并非所有基质细胞都对CD3重定向双特异性抗体的效果产生不利影响，也说明了在肿瘤-T细胞共培养中仅仅存在另一种细胞类型并不有助于抑制作用的事实情况。基质介导的对双特异性抗体活性的抑制不是由来自一个供体的T细胞所独有的，而是出现在来自多个供体的T细胞中(图1A、图1C和图1B、图1D分别绘制了不同供体的平均值和中位数)。这些数据不是特定于一个AML或MM细胞系，因为在其他CD123⁺AML(MOLM-13和OCI-AML5)和BCMA⁺MM细胞系(RPMI-8226和MM.1S)中也观察到类似结果(图9C和9D)。这些数据首次证明了基质细胞对CD3重定向双特异性抗体的疗效和效力的影响。

BM基质细胞抑制T细胞活性并激活癌细胞中的存活和抗凋亡途径

接下来，研究了基质抑制双特异性抗体活性的机制。为此，在不存在或存在基质细胞的情况下，在T细胞-肿瘤共培养细胞毒性试验中评估T细胞的表型。在没有基质的情况下，用CD123×CD3双特异性抗体处理，其导致活化标志物包括CD25、CD137和ICOS的上调以及检查点标志物包括PD1、LAG3和TIM3在CD8⁺T细胞中相应的增加(图2A)。此外，CD8⁺T细胞通过效应蛋白如穿孔素和颗粒酶B的产量增加以及T-bet的表达上调(图2A)表现出了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特征。然而，当共培养中存在基质细胞时，在活化、效应和检查点标志物的表达降低的情况下，T细胞活化程度较低(图2A)。这些结果在多个T细胞供体(图2A中绘制了不同供体的中位数)以及MM细胞系H929和BCMA×CD3双特异性抗体(图10A)中均可观察到。鉴于PD1、TIM3和LAG3被认为是用于调节T细胞激活反应的抑制性蛋白，在有基质存在的情况下，出现T细胞上检查点标志物的表达减少的结果可能一开始就有悖常理。然而，这些蛋白质仅在T细胞活化时被诱导，并且在原初T细胞中不存在(23-29)。鉴于这些数据，因此，在基质细胞存在的情况下PD1、TIM3和LAG3在T细胞上的上调减弱以及在抑制性基质区存在的情况下支持的T细胞激活表型较少并非意料之外。此外，在有基质存在的情况下，经两种双特异性抗体处理后，T细胞增殖减少(图10B)。

除了免疫抑制外，还研究了白血病和骨髓瘤肿瘤细胞中基质介导的多种促生存和抗凋亡途径的激活是否可成为介导抗治疗的一个额外机制(30)。在与HS-5基质细胞一起培养的KG-1细胞中，观察到磷酸肌肽3-激酶(PI3K)和Akt的磷酸化增加以及Bcl-2的蛋白表达增加，而在单独培养的KG-1或HS-5细胞中则没有观察到增加(图2B)。这些数据共同表明，AML和MM肿瘤细胞可通过基质细胞依赖性机制逃避T细胞介导的死亡，除了抑制T细胞的激活外，还涉及肿瘤细胞的抵抗途径的激活。

接下来，研究了T细胞免疫抑制和促生存途径的上调对CD3重定向疗效降低的表型的相对贡献。鉴于Bcl-2已经直接涉及到AML和MM细胞的存活和对若干疗法的抵抗(30，31)，在有或没有添加Bc1-2抑制剂HA14-1的情况下进行细胞毒性试验。虽然抑制剂成功地阻止了Bcl-2的表达(图11)，但其并没有逆转基质介导的对CD3重定向的抑制(图2C)，T细胞的活化程度仍然较低(图2D)。这些数据支持先前发表的研究结果，即Bcl-2在靶细胞中的过度表达对AMG110(EpCAM×CD3 BiTE)的活性影响很小(32)。

骨髓基质细胞削弱体内CD3重定向的疗效

接下来，研究了基质细胞是否能保护肿瘤细胞免受体内双特异性抗体-T细胞介导的细胞毒性的影响。为此，将人类PBMC静脉接种到雌性NSG小鼠体内，一周后，将MOLM-13连同或不连同HS-5骨髓基质细胞通过皮下注射(sc)的方式植入小鼠的侧腹。然后从肿瘤细胞植入后的第5天开始用CD123×CD3(8μg/kg)治疗小鼠，每周两次，共治疗5次。与PBS或CD3×空对照组相比，使用CD123×CD3治疗明显抑制了MOLM-13单独组的皮下肿瘤生长(肿瘤生长抑制(TGI第25天)＝78％，p＜0.0001)(图3A)。在存在基质的情况下，该抗肿瘤活性明显降低(第25天TGI＝15％)，与经双特异性抗体处理的MOLM-13单独组相比有统计学意义(p＜0.0001)(图3A)。此外，虽然在有或没有基质的肿瘤中观察到了相同的CD8⁺T细胞浸润(图3B)，但T细胞的激活谱存在的差异与基质的存在相关(图3C)。与MOLM-13对照组相比，经双特异性抗体处理的MOLM-13+HS-5组的CD8⁺T细胞表现出CD25、PD1和颗粒酶B的上调受损(图3C)。这些结果支持体外观察，并清晰地表明BM基质细胞通过抑制T细胞的激活从而降低了其他有效的CD3重定向治疗剂的疗效。

对基质的粘附是介导免疫抑制和癌细胞存活的关键

基质细胞可通过分泌可溶性因子，包括免疫抑制介质，诸如IL-10、TGF-β和PGE2或生长因子，诸如干细胞因子(SCF)、IL-7、IL-15、CXCL-12等，来介导免疫抑制和保护肿瘤细胞免受细胞毒性的影响(21、33)。另外，基质细胞可通过粘附途径与肿瘤细胞直接相互作用来诱发抗性(34)，从而以细胞-细胞接触依赖的方式保护恶性细胞免受T细胞介导的细胞毒性的影响。细胞毒性试验的目视检查结果显示，未被双特异性抗体-T细胞介导的细胞毒性杀死的残留白血病细胞紧密地聚集在基质细胞周围(图4A)，其表明细胞-细胞接触途径可能在基质介导的癌细胞保护中发挥重要作用。为了区分可溶性与细胞-细胞接触的依赖机制，进行了体外侵袭小室试验，以评估基质细胞是否即使与肿瘤和T细胞分开仍能抑制双特异性抗体-T细胞介导的裂解效果。据观察，细胞-细胞接触在介导AML和MM细胞系的基质保护中起主导作用，因为当与肿瘤细胞分离时，基质细胞没有表现出任何抑制作用(图4B和图12A)。用来自不同供体的T细胞观察到类似的趋势(图4B中使用了2个不同的T细胞供体)。此外，当基质细胞被放置在一个侵袭小室嵌件中时，其无法抑制T细胞的激活和穿孔素、颗粒酶B和T-bet的表达(图4C)。这些数据表明，基质介导的T细胞抑制和保护免受T细胞依赖的细胞毒性严重依赖于细胞与细胞之间的相互作用。

在体外和体内阻断VLA4可逆转基质介导的对CD3重定向的抑制

研究粘附途径以确定对基质抑制双特异性抗体的功效至关重要的途径。CXCR4和VLA-4要重点关注，因为它们在介导BM中的AML/MM-基质相互作用中发挥的作用已被记录下来(34)。使用针对VLA-4或CXCR4的阻断抗体(购自R&D系统公司)，观察到与CXCR4的抑制不同，在有基质的情况下，VLA-4的抑制未能逆转双特异性抗体介导的细胞毒性反应，VLA-4的抑制逆转了(50-60％)基质介导的对KG-1和MOLM-13的免受CD123×CD3双特异性抗体T细胞的细胞毒性影响的保护(图5A和图12B)。这种效果在H929和BCMA×CD3双特异性抗体中更为明显，其中VLA-4的抑制恢复了细胞毒性反应(80-100％)，甚至在有基质的情况下(图5B)。对VLA-4增加的细胞毒性反应的抑制与恢复的T细胞活化标志物如颗粒酶B和CD25的表达相关，这些标志物在CXCR4阻断下仍被压制(图5C和图5D)。与未经处理的对应物(含有HS-5或原代间充质基质细胞(MSC)的共培养物)相比，VLA-4抑制的T细胞活化标志物的增加也有统计学意义。VLA-4的抑制也削弱了Akt和PI3K途径的磷酸化(图13)。

先前的体内结果显示，用HS-5骨髓基质细胞治疗MOLM-13肿瘤时，CD123×CD3的疗效会减弱。为了确定是否能恢复抗肿瘤效果，将抗VLA-4中和抗体与CD123×CD3结合起来治疗经MOLM-13处理的小鼠。与先前的观察类似，与经PBS治疗的对照组相比，CD123×CD3(8μg/kg)促使TGI在第24天达到52.3％(p≤0.0001)，而相同剂量的双特异性抗体对与HS-5细胞共同注射的MOLM-13肿瘤的效果最小(第23天TGI＝7.6％)(图6A)。然而，同时加入抗VLA-4抗体与CD123×CD3，会导致MOLM-13肿瘤与HS-5细胞的TGI在第23天增加48.4％，(p＝0.0001)(图6A)。接受VLA-4阻断和双特异性抗体治疗的带有基质的MOLM-13肿瘤的TGI增加伴随着CD8⁺T细胞激活和效应反应的增强，包括穿孔素、CD25和PD1的表达(图6B)。增加的TGI和增强的CD8⁺T细胞反应仅限于那些接受VLA-4阻断和双特异性抗体联合治疗的经肿瘤+HS-5处理的小鼠，而当小鼠单独使用任何一种药剂时都没有出现上述增强。这些结果强烈地表明，同时阻断VLA-4和CD3重定向剂可以克服基质细胞介导的抑制作用，并可介导卓越的抗肿瘤反应。

尽管存在基质细胞，但在体外原代患者培养物中阻断VLA-4可恢复CD3重定向的疗 效

然后用原代冷冻/解冻的AML和MM样品验证了发现。鉴于在没有外源性细胞因子补充或基质支持的情况下维持原代肿瘤细胞的培养具有挑战性，用不同数量的基质细胞对AML/MM样品进行了离体培养(图14和图15中显示的代表性门控策略)。意想不到的是，我们观察到在经CD123×CD3和BCMA×CD3双特异性抗体处理的培养物中，对CD123⁺CD33⁺AML未成熟细胞以及BCMA⁺CD138⁺MM肿瘤细胞有明显的选择性杀死，此时培养物的基质/肿瘤比例较低(0.01×HS-5)，而用空对照物处理时则没有出现上述杀死(图7A和图7C)。在具有高基质/肿瘤比(0.2×HS-5、图7A和图7C)的培养物中，CD123×CD3杀死作用最小。此外，对原代肿瘤细胞的有效细胞毒性反应的清除是通过扩展或激活CD8⁺T细胞来实现的，这些细胞被限制在具有较少基质含量的经双特异性抗体处理的培养物中(图7B和图7D)。最后，当中和的VLA-4与CD123×CD3或BCMA×CD3联合使用时，尽管培养物中的基质含量较高，但可观察到对肿瘤细胞的卓越杀死力和双特异性抗体的功效恢复(图7A至图7D)。在双特异性抗体治疗的同时阻断VLA-4也恢复了具有较高基质含量的培养物中CD8⁺T细胞的扩展/激活(图7B和图7C)。这些结果在3个不同的患者身上均有观察到(图7A-B为AML患者，图7C-D为MM患者)，并巩固了先前体外和体内的发现。在其中一个AML患者样品中，VLA-4抑制本身导致了高基质/肿瘤比例的培养物中CD123⁺未成熟细胞消耗的增加，但这种效果并没有被广泛观察到(数据未显示)。这些数据确实表明，将VLA-4阻断与CD3重定向双特异性抗体疗法相结合，可以克服基质细胞的抑制作用，并为在临床上探索此类组合提供依据。

讨论

近年来，随着对用于维持和调节造血干细胞的分子和细胞因素的理解取得重大进展，业界开始真正意识到BM生态位的复杂性。在血液恶性肿瘤方面，癌症干细胞可利用同样的因素来保护和抵抗一些抗癌疗法，从而导致微小残留病变。

本文的结果首次显示了其他有效的T细胞疗法如何被BM微环境的成分所阻碍。具体来说，观察到在有BM基质细胞存在的情况下，AML和MM癌细胞受到保护以免受T细胞和双特异性抗体介导的细胞毒性影响。癌细胞的杀死力降低与T细胞的激活和效应反应减弱有关。阻断细胞与细胞之间的相互作用，特别是那些由VLA-4途径介导的相互作用，可逆转T细胞的免疫抑制，从而增加对AML和MM癌细胞的杀死。因此，这些结果再次证实，即使有其他强有力和有效的免疫疗法(如CD3重定向)，BM微环境也是一个不容忽视的因素，需要加以考虑。这些结果也为将干扰粘附性的药物与CD3重定向治疗剂相结合以更好、更彻底地消除MRD提供了理论基础和证据。

虽然证明了阻断VLA-4可逆转基质对由双特异性T细胞介导的细胞毒性和免疫抑制的功效的抑制，但形成这种调节的机制仍有待确定。VLA-4在T细胞上表达，除了介导白细胞的粘附和跨内皮迁移外，还能提供协同刺激信号，引发T淋巴细胞的激活(35-38)。在多发性硬化症患者中使用纳他利珠单抗(一种被批准用于MS的人源化单克隆IgG4 VLA-4阻断抗体)的临床研究表明，该药物不仅增加了外周血中CD4⁺和CD8⁺T细胞的数量(39)，还刺激了CD4⁺和CD8⁺T细胞产生更多的IL-2、TNF-a、IFN-γ和IL-17(40-43)。虽然结果比较温和，但在体外也观察到类似的结果，其中纳他利珠单抗诱导在健康供体离体繁殖的活化原代人类CD4⁺T细胞中轻度上调IL-2、IFN-γ和IL-17的表达，表明纳他利珠单抗直接作用于T细胞(42)。上述研究聚焦于CD4⁺T细胞。因此，关于在体外是否对CD8⁺T细胞也能观察到同样的现象，还有待进一步研究。可用于解释VLA-4阻断作用的另一个机制可能是阻断肿瘤和基质细胞之间的相互作用，其破坏了肿瘤细胞在基质周围的聚集，从而使T细胞能够进入肿瘤细胞，导致CD3重定向具有更好疗效。最后，VLA-4的抑制已被证明可直接作用于AML和MM细胞，通过阻止肿瘤细胞本身的关键促生存途径的表达和上调(34)或改变肿瘤细胞产生的抗炎细胞因子，使它们更容易受到化疗和靶向治疗的影响。

虽然这项研究聚焦于BM微环境，但类似的现象也可能发生在实体瘤中。实体瘤含有复杂致密的细胞外基质分子网络以及各种基质细胞类型，其可能具有免疫抑制性。

结果指出了面向BM微环境与CD3重定向疗法联合的重要性。此外，研究结果表明，VLA-4有可能被用作预测对CD3重定向反应的生物标志物，并且也许可用来指导患者对这些免疫疗法的选择。

参考文献

本文引用的所有出版物全文均以引用方式并入本文。

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序列表

<110> JANSSEN BIOTECH INC.

<120> 包含T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂的组合物

<130> JBI6312WOPCT1

<150> 63/026885

<151> 2020-05-19

<160> 10

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<210> 5

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Gly Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 7

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Gly Ser Thr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 8

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Gly Phe Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Ala Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

210 215 220

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

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435 440 445

Ser Leu Gly Lys

450

<210> 10

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

Claims (23)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含T细胞重定向治疗剂和VLA-4粘附途径抑制剂，其中，所述T细胞重定向治疗剂包括免疫特异性地结合T细胞表面抗原的第一结合区和免疫特异性地结合肿瘤相关抗原（TAA）的第二结合区。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述T细胞重定向治疗剂是抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中，所述T细胞表面抗原选自由CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、CD137、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD-1、CD195和NKG2C组成的组。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述T细胞表面抗原是CD3。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中，所述TAA选自由以下组成的组：BCMA、CD123、GPRC5D、CD33、CD19、PSMA、TMEFF2、CD20、CD22、CD25、CD52、ROR1、HM1.24、CD38和SLAMF7。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述T细胞重定向治疗剂是BCMA×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合BCMA的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述BCMA×CD3双特异性抗体包括第一重链（HC1）、第一轻链（LC1）、第二重链（HC2）和第二轻链（LC2），并且其中所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

9. 根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述HC1包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。

10. 根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述HC1包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。

11.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，所述T细胞重定向治疗剂是CD123×CD3双特异性抗体，其具有免疫特异性地结合CD123的第一抗原结合位点和免疫特异性地结合CD3的第二抗原结合位点。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述CD123×CD3双特异性抗体包括第一重链（HC1）、第一轻链（LC1）、第二重链（HC2）和第二轻链（LC2），并且其中，所述HC1和所述LC1配对以形成所述第一抗原结合位点，并且所述HC2和所述LC2配对以形成所述第二抗原结合位点。

13. 根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述HC1包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列，所述LC1包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列，所述HC2包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列，并且所述LC2包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂是抗VLA-4抗体或其抗原结合片段。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述抗VLA-4抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体以及由一条重链和一条轻链组成的二聚体。

16.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂是VLA-4拮抗剂。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中，所述VLA-4拮抗剂选自由BIO1211、TCS2314、BIO5192和TR14035组成的组。

18.一种杀死癌细胞的方法，所述方法包括破坏癌细胞和基质细胞之间的细胞-细胞接触，包括使癌细胞经受治疗有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的药物组合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述癌症是血液恶性肿瘤或实体瘤。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述T细胞重定向治疗剂和所述VLA-4粘附途径抑制剂同时或依次施用。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂在所述T细胞重定向治疗剂之前施用。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述VLA-4粘附途径抑制剂在施用所述T细胞重定向治疗剂之后施用。

23.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至17中任一项所述的药物组合物。

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