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CN115506036A - Dna编码化合物文库起始片段及其制备和应用 - Google Patents

Dna编码化合物文库起始片段及其制备和应用 Download PDF

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CN115506036A CN202210708699.1A CN202210708699A CN115506036A CN 115506036 A CN115506036 A CN 115506036A CN 202210708699 A CN202210708699 A CN 202210708699A CN 115506036 A CN115506036 A CN 115506036A
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multifunctional
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索延瑞
张雨晴
刘小红
郑明月
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陆晓杰
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Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
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Abstract

本发明提供了一种新型DNA编码化合物文库起始片段的构建方法。本发明的构建方法包括如下步骤：提供一个具有编码区和功能区的起始片段，功能区上有至少一个反应位点，编码区为两条互补的脱氧核糖核苷酸单链。本发明提供的方法操作简单，条件温和，收率较高，对医药领域的发展具有促进作用。

Description

DNA编码化合物文库起始片段及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及DNA编码化合物文库起始片段及其制备和应用。
背景技术
二十世纪九十年代初，受到“人类基因组计划”的影响，药物化学家们加深了对生物靶点的认识，并开发了各种方法，深度挖掘出潜在的成药靶点。在掌握了大量靶点后，药物化学家们希望能够借助筛选的方法获得对目标靶点具有一定生理活性的先导化合物的结构，用于开展后续的结构优化，药理病理研究和临床试验，最终成为一款治疗药物。
为了增加筛选的成功率，一个高质量，大规模的化合物库尤为重要。理论上，库容量越大，在化学空间的分布越均匀(多样性越大)，筛选到活性分子的命中率就越高。目前在新药研发中占据举足轻重地位的高通量筛选技术便是基于数量庞大的化合物库，采用自动化的方式对目标靶点进行筛选。然而，建立一个可用于高通量筛选的分子库，是一个费时费力成本高的过程，它需要数十年间化学合成工作者们的积累和维护。即便如此，分子库所拥有的化合物数量也有限，最多再百万级左右。除此之外，仪器的保养及筛选所需的量目标蛋白的用量也是一笔不小的开支。因此，只有少数大型的制药企业能够通过高通量筛选的方式开展新药研发工作。
1988年，Furda等人提出了“组合化学”的概念，在90年代初得到迅猛发展。组合化学不同于传统化学的合成方式，它基于组合原理，能在短时间内将不同的合成砌块以共价键的形式系统地，反复地连接，进而产生大批结构相关但有序的化合物。组合技术很快被应用于新药的设计、合成和筛选中。为了提高筛选和鉴定效率，降低人力和资金成本，研究者们将同步编码合成策略纳入组合合成中，该合成策略需要用到含有多官能团的起始片段作为连接目标分子及编码分子的枢纽，在混合-分离的合成过程中，每安装目标分子的一个合成砌块，就在相应的编码区连接一个能代表该合成砌块的编码块。在完成构建及靶点筛选后，活性分子的结构可以通过测定编码区的序列给出。借助高通量核酸测序技术的迅猛发展，1992年，Scripps研究所的Brenner和Lenner教授将可测序的DNA序列放入编码区，发展了DNA编码化合物库技术。
DNA编码化合物库技术结合了组合化学和分子生物学的特点，使其既可以在短时间内构建大规模的化合物库，也可以10-12级别的量进行筛选和鉴定。不仅如此，化合物库的维护及操作也极为简单，这大大缩短了研发周期，降低了研发成本。
DNA编码化合物库技术同样需要一个多官能团的起始片段来连接目标分子和编码区。目前主流使用的起始片段为含有一个氨基和两个磷酸酯官能团的叔碳结构。氨基用于合成目标分子，而磷酸酯则用于连接双链DNA作为砌块的编码。双链DNA较单链DNA能够兼容更多的化学反应类型，合成更为多样性的化合物库。但缺点也很明显，一是PCR扩增效率不如单链，为测序带来困难，二是无法对某些特殊靶点实行有针对性的筛选方式，如交联筛选。此外，合成叔碳起始片段的路线较为复杂，无法实现目标分子区与编码区在空间和结构上的灵活对接。
为了克服现有技术的缺点，本领域亟需寻找一种操作简单，反应条件温和，收率较高，可灵活进行目标区和编码区对接和单/双链DNA互变的DNA编码化合物库起始片段的优化方案，以促进该类技术在医药领域的广泛应用。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种新型的DNA编码化合物文库起始片段结构的方法，该方法操作步骤简单，反应条件温和，收率较高，能够促进DNA编码化合物库技术在医药领域的广泛开发和应用。
本发明的第一方面提供了一种构建DNA编码化合物文库起始片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供多官能团骨架化合物L；
(2)使所述多官能团骨架化合物L与化合物A2-C2-ssDNA1、化合物A3-C3-ssDNA2以及化合物R-C1-A1反应，从而形成式I化合物，即DNA编码化合物文库起始片段；
Figure BDA0003706324340000031
其中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
在另一优选例中，至少一个X为无(即不是化学切割位点)。
在另一优选例中，所述化学链C2和C3上均没有X。
在另一优选例中，X位于第二化学链C2或第三化学链C3上任意位置。
在另一优选例中，所述的“序列互补”指出ssDNA1的序列和ssDNA2的序列是完全互补或基本完全互补的，从而可以形成DNA双链结构(即互补程度≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％或为100％)。
在另一优选例中，所述的ssDNA1和ssDNA2形成的DNA双链结构具有平头末端，或具有粘性末端(即含有1、2和3个突出的核苷酸)。
在另一优选例中，所述的化学切割位点为可逆的或不可逆的。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)在惰性溶剂中，使化合物A2-C2-ssDNA1与多官能团骨架化合物L进行反应，从而形成式Ia化合物；
Figure BDA0003706324340000032
(b)在惰性溶剂中，使所述式Ia化合物与化合物A3-C3-ssDNA2进行反应，从而形成式Ib化合物；
Figure BDA0003706324340000041
(c)在惰性溶剂中，使所述式Ib化合物与化合物R-C1-A1进行反应，从而形成式I化合物，即DNA编码化合物文库起始片段；
Figure BDA0003706324340000042
其中，在式I、式Ia和式Ib中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
在另一优选例中，在步骤(b)和(c)之间还包括：从步骤(b)的反应混合物中，分离或纯化出所述的式Ib化合物。
在另一优选例中，所述的第一化学链C1、第二化学链C2和第三化学链C3的主链(main chain)的主链原子选自下组：C、O、N、P、或其组合，并且所述的第一化学链C1、第二化学链C2和第三化学链C3为饱和或不饱和的化学链。
在另一优选例中，所述的第一化学链C1、第二化学链C2和第三化学链C3的主链(main chain)的主链原子数量各自独立地为1-20，较佳地3-15，更佳地4-10。
在另一优选例中，所述C1为取代或未取代的-(L1)n1-，其中，各个L1各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)、N、氧原子、硫原子、磷原子；n1为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C2为取代或未取代的-(L2)n2-，其中，各个L2各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n2为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C3为取代或未取代的-(L3)n3-，其中，各个L3各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n3为3-30的正整数，较佳地5-25；
附加条件是，至少一个L2和L3为剪切位点X；
并且，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：O、C1-C4烷基、-OH、C1-C4烷基-OH、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一链接化学键A1、第二链接化学键A2和第三链接化学键A3各自独立地选自下组：化学键、酰胺键、酯键、磷酸键，或其组合。
在另一优选例中，所述的化学键选自下组：碳碳键、碳氮键、碳氧键。
在另一优选例中，所述多官能团骨架L含有3个或4个用于与第一链接化学键A1、第二链接化学键A2和第三链接化学键A3反应的活性反应位点。
在另一优选例中，所述的多官能团骨架L不是叔碳骨架。
在另一优选例中，所述多官能团骨架L选自下组：
Figure BDA0003706324340000051
在另一优选例中，L为来自骨架化合物三聚氯氰的多官能团骨架
Figure BDA0003706324340000052
在另一优选例中，所述C2和C3上均没有化学切割位点X；或C2或C3上有一个化学切割位点X。
在另一优选例中，所述化学切割位点X选自下组：化学键、可被酶切的DNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述化学切割位点X为能被剪切酶切断的DNA序列，如GAATTC。
在另一优选例中，所述化学切割位点X选自下组：
(i)在酸性条件下可被切断的化学键；
较佳地，所述在酸性条件下可被切断的化学键选自下组：
Figure BDA0003706324340000061
(ii)在碱性条件下可被切断的化学键；
较佳地，所述在碱性条件下可被切断的化学键选自下组：
Figure BDA0003706324340000062
(iii)光可切断的化学键，
较佳地，所述光可切割的化学键选自下组：
Figure BDA0003706324340000063
(iv)在还原条件下可被切断的化学键，
较佳地，所述的在还原条件下可被切断的化学键包括二硫键；
(v)上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)的任意组合。
在另一优选例中，所述的X为二硫键。
在另一优选例中，所述起始片段功能区的反应位点R的反应基团选自下组：氨基、羟基、巯基(-SH)、醛羰基(-CHO)、酮羰基(-C(O)-)、羧基(-COOH)、叠氮(-N＝N-)、炔基、卤素、或其组合，更佳地为氨基。
在另一优选例中，第一化学链C1的反应位点与起始片段功能区的反应位点R以共价连接，更佳地选自下组：氨基、羧基、磺酰基、卤代芳环、芳杂环、异氰酸酯基、醛、酮、α，β-不饱和酮或酯、或其组合。
在另一优选例中，所述化合物R-C1-A1为具有至少两个端部氨基且含有1、2或3个氧原子的氧杂C4-C10烷，较佳地为1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷。
在另一优选例中，所述的ssDNA1和ssDNA2是完全互补或部分互补，形成双链DNA结构。
在另一优选例中，所述的ssDNA1和ssDNA2的长度各自独立为3-30nt(或bp)，更佳地为5-20nt(或bp)。
在另一优选例中，所述ssDNA1的寡聚核苷酸序列为：TGACTCCC。
本发明的第二方面提供了一种用于构建DNA编码化合物文库的起始片段，所述的起始片段具有如下式I所示的结构：
Figure BDA0003706324340000071
其中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
在另一优选例中，L为多官能团骨架，选自下组：
Figure BDA0003706324340000081
和/或R选自下组：氨基、羟基、巯基(-SH)、醛羰基(-CHO)、酮羰基(-C(O)-)、羧基(-COOH)、叠氮(-N＝N-)、炔基、卤素。
在另一优选例中，所述C1为取代或未取代的-(L1)n1-，其中，各个L1各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)、N、氧原子、硫原子、磷原子；n1为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C2为取代或未取代的-(L2)n2-，其中，各个L2各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n2为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C3为取代或未取代的-(L3)n3-，其中，各个L3各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n3为3-30的正整数，较佳地5-25；
附加条件是，至少一个L2和L3为剪切位点X；
并且，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：O、C1-C4烷基、-OH、C1-C4烷基-OH、或其组合。
在另一优选例中，所述的起始片段选自下组：
Figure BDA0003706324340000082
本发明的第三方面提供了一种如权利要求二方面所述的用于构建DNA编码化合物文库的起始片段的用途，用于制备用于构建DNA编码化合物文库的试剂。
本发明的第四方面提供了一种构建DNA编码化合物文库的方法，包括步骤：
(S1)将权利要求11所述的式I所示的结构的构建DNA编码化合物文库的起始片段，与预定的化合物进行连接，从而形成DNA编码化合物文库：
Figure BDA0003706324340000091
其中，
R、L、C1、C2、C3、A1、A2、A3、X、ssDNA1和ssDNA2定义如权利要求11中所述。
在另一优选例中，在步骤(S1)中还包括：在所述起始片段与预定的化合物进行连接之前或之后，将DNA编码寡聚核苷酸(或barcode片段)与ssDNA1和ssDNA2形成的DNA双链结构进行连接，从而形成DNA编码化合物文库。
在另一优选例中，所述起始片段与预定的化合物通过R进行连接。
在另一优选例中，所述的化合物包括小分子化合物。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(S2)将所述DNA编码化合物文库与目标靶点共同孵育，收集与目标靶点有亲和作用的文库成员；和
(S3)对步骤(f)的文库成员对应的编码寡聚核苷酸进行PCR扩增和高通量测序，从而确定能与目标靶点相结合的文库成员的结构。
在另一优选例中，所述的目标靶点包括：蛋白、核酸、细胞、病毒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了实施例1中制备的起始片段Linker-1的质谱。
图2显示了实施例2中步骤(3)制备的BB1-S-Linker-1-P-T1的质谱。
图3显示了实施例2中步骤(4)制备的BB2-BB1-S-Linker-1-P-T1-T2的质谱。
图4显示了实施例2中步骤(5)制备的DNA编码化合物文库BB2-BB1-S-Linker-1-P-T1-T2-Closing的质谱。
图5显示了实施例3中制备的起始片段Linker-2的质谱。
图6显示了实施例4中制备的片段Linker-2-P的质谱。
图7显示了实施例5中制备的片段Linker-2-P-T1的质谱。
图8显示了实施例6中制备片段Linker-2-P-T1-T2的质谱。
图9显示了实施例7中切割二硫键得到的两条链的质谱。
图10显示了实施例8中切割DNA编码化合物文库BB2-BB1-S-Linker-1-P-T1-T2-Closing二硫键得到的DNA沉淀的质谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，首次开发了一种结构新颖DNA编码化合物文库起始片段及其构建方法。本发明的起始片段的结构独特，构建方法路线简单、操作简便，反应条件温和，收率较高。本发明人还提供了用本发明的起始片段构建DNA编码化合物文库的方法及其应用。在此基础上，完成了本发明。
术语
在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C6烷基、C3～C8环烷基、C1～C6烷氧基、卤素、羟基、羧基(-COOH)、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、氨基。
除特别说明之处，本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
术语“C1～C6烷基”指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
术语“C3～C8环烷基”指具有3～8个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、或类似基团。
术语“3-8元杂环基”指具有选自下组的1-3个杂原子的3～8元饱和环失去一个氢原子形成的基团：N、S、O；例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、或类似基团。
术语“6-10元芳基”指6～10元芳基失去一个氢原子形成的基团；例如苯基、萘基，或类似基团。
术语“5-10元杂芳基”指具有选自下组的1-3个杂原子的5～8元芳基失去一个氢原子形成的基团：N、S、O，其中每个杂芳基的环状体系可以是单环或多环的；例如吡咯基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、嘧啶基、苯并噻吩基、吲哚基、咪唑并吡啶基、喹啉基或类似基团。
术语“C1～C6烷氧基”指具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
除非特别说明，本发明所描述的结构式意在包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构和几何异构体(或构象异构体)：例如含有不对称中心的R、S构型，双键的(Z)、(E)异构体和(Z)、(E)的构象异构体。因此本发明的化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。
在本文中，形如“C1～C6”的基团，表示该基团可以具有1个至6个碳原子，例如1个、2个、3个、4个、5个或6个。
起始片段
如本文所用，术语“本发明的起始片段”、“本发明的DNA编码化合物文库起始片段”可互换使用，指本发明第二方面中所述的起始片段。本发明的起始片段具有式I所示的结构。
应理解，在本发明的式I、Ia和Ib中，C1和C1表示相同含义，均表示第一化学链；类似地，C2和C2表示相同含义，C3和C3表示相同含义。
本发明的起始片段具有如下式I所示的结构：
Figure BDA0003706324340000111
其中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
另一些实施方式中，L为多官能团骨架，选自下组：
Figure BDA0003706324340000121
和/或R选自下组：氨基、羟基、巯基(-SH)、醛羰基(-CHO)、酮羰基(-C(O)-)、羧基(-COOH)、叠氮(-N＝N-)、炔基、卤素。
另一些实施方式中，所述C1为取代或未取代的-(L1)n1-，其中，各个L1各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)、N、氧原子、硫原子、磷原子；n1为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C2为取代或未取代的-(L2)n2-，其中，各个L2各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n2为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C3为取代或未取代的-(L3)n3-，其中，各个L3各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n3为3-30的正整数，较佳地5-25；
附加条件是，至少一个L2和L3为剪切位点X；
并且，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：O、C1-C4烷基、-OH、C1-C4烷基-OH、或其组合。
另一些实施方式中，所述的起始片段选自下组：
Figure BDA0003706324340000131
DNA编码化合物文库起始片段的制备
本发明还提供了一种DNA编码化合物文库起始片段的制备方法。
一种代表性的构建方法如流程I所示，包括以下步骤：
(a)在惰性溶剂中，使化合物A2-C2-ssDNA1与多官能团骨架化合物L进行反应，从而形成式Ia化合物；
Figure BDA0003706324340000132
(b)在惰性溶剂中，使所述式Ia化合物与化合物A3-C3-ssDNA2进行反应，从而形成式Ib化合物；
Figure BDA0003706324340000133
(c)在惰性溶剂中，使所述式Ib化合物与化合物R-C1-A1进行反应，从而形成式I化合物，即DNA编码化合物文库起始片段；
Figure BDA0003706324340000141
其中，在式I、式Ia和式Ib中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
其中，
多官能团骨架L选自下组：
Figure BDA0003706324340000142
R选自下组：氨基、羟基、巯基、醛羰基、酮羰基、羧酸、叠氮、炔基、卤素；
C1、C2、C3为多官能团骨架L与功能区、编码区的化学链，各自独立地选自下组：含有碳原子，氧原子，氮原子，磷原子的饱和链和不饱和链；
A1、A2、A3各自独立地选自下组：碳碳键、碳氮键、碳氧键、酰胺键、酯键、磷酸键和三氮唑。
所述多官能团骨架L含有多个活性反应位点。
所述步骤(1)中，多官能团骨架L通过链接化学键A1、A2和A3与起始片段上的功能区与编码区连接。
所述化学链C2和C3上的化学切断位点X可在温和的条件下实现键的断裂。
所述编码区带有的切断位点X的脱氧核糖核苷酸单链通过酶联方式引入其他编码寡聚核苷酸。
所述起始片段结构I的功能区的化学反应位点R与含有至少一个反应位点的合成砌块通过共价键连接。
一些实施方式中，化学切断位点X选自能被剪切酶切断的脱氧核苷酸序列，如GAATTC。
另一些实施方式中，化学切断位点X选自能被还原方法切断的化学键，如二硫键。
另一些实施方式中，化学切断位点X选自下组在酸性条件下能被切断的化学键
Figure BDA0003706324340000151
另一些实施方式中，化学切断位点X选自下组在碱性条件下能被切断的化学键
Figure BDA0003706324340000152
另一些实施方式中，化学切断位点X选自下组能在光照下被切断的化学键：
Figure BDA0003706324340000153
此外，在ssDNA1和ssDNA2或其形成的DNA双链结构中，还可含有额外的酶切位点Z。较佳地，带有的酶切位点Z的脱氧核糖核苷酸单链(或双链)可与代表反应砌块信息的编码脱氧核糖核苷酸链，通过酶促反应进行连接。
应用
本发明还提供了起始片段的应用，尤其是用于构建DNA编码化合物文库，用于大规模和高通量地筛选活性化合物。
典型地，本发明方法包括：
(S1)将式I所示的结构的构建DNA编码化合物文库的起始片段，与预定的化合物进行连接，从而形成DNA编码化合物文库：
Figure BDA0003706324340000161
其中，
R、L、C1、C2、C3、A1、A2、A3、X、ssDNA1和ssDNA2定义如上所述。
在另一优选例中，在步骤(S1)中还包括：在所述起始片段与预定的化合物进行连接之前或之后，将DNA编码寡聚核苷酸(或barcode片段)与ssDNA1和ssDNA2形成的DNA双链结构进行连接，从而形成DNA编码化合物文库。
在另一优选例中，所述起始片段与预定的化合物通过R进行连接。
在另一优选例中，所述的化合物包括小分子化合物。
在另一优选例中，本发明的方法还包括如下步骤：
(S2)将起始片段结构I构建的DNA编码化合物库与目标靶点蛋白共同孵育，收集与靶点有一定亲和力作用的DNA编码分子；
(S3)对步骤(S2)中收集到的DNA编码分子所带有的脱氧核苷酸序列进行PCR扩增，高通量测序，确定收集到的编码分子的具体结构；
(S4)化学合成步骤(S3)中收集到的编码分子，通过药理学实验验证分子的活性。
本发明的主要优点包括：
1)避免了已有的起始片段繁琐的合成路线，使得目标分子链以及编码链能够以更加简洁，灵活的方式连接。
2)在构建DNA编码化合物库时，可以用更加稳定的双链DNA作为编码参与建库的化学反应；在对目标靶点进行筛选时，可以有针对性的，灵活的选择更合适的筛选方案：a)以双链DNA作为编码进行筛选。b)通过温和的条件切断后，以单链DNA的形式参与筛选。c)单链DNA交联一条辅助链，共同完成筛选工作。
3)筛选后，将双链DNA转化为单链DNA，能极大的提升PCR的效率，降低碱基对错配的风险，提升DNA测序的准确率，使得整个编码技术变得更为可靠。
4)在合成及切断新型DNA编码化合物库起始片段过程中所需要用到的试剂均廉价易得，涉及到的反应条件温和，收率较高，新型起始片段的稳定性较好。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：起始片段Linker-1的制备
在本实施例中，合成了具有以下核酸序列的5'磷酸化的DNA链作为起始片段。
Figure BDA0003706324340000171
1.1ssDNA结构
单链DNA ssDNA-1结构：
Figure BDA0003706324340000172
单链DNA ssDNA-2结构：
Figure BDA0003706324340000173
1.2方法
将100nmol ssDNA-1的水溶液(100μL)用100μL硼酸钠缓冲液(pH＝9.4,500mM)稀释，加入7.5μL三聚氯氰的乙腈溶液(200mM)。反应体系在4℃下反应10分钟。然后加入100nmol ssDNA-2的水溶液(100μL)，反应体系在室温下反应1小时。反应结束后，向反应液加入30μL的5M的氯化钠溶液和1000μL的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，冻干除去残留的溶剂。将得到的固体加入pH 9.4硼酸钠缓冲液配成0.5mM的水溶液，向其中加入150μL 1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷的DMA溶液(200mM)，反应体系在80℃下反应2小时。反应结束后，向反应液加入30μL的5M的氯化钠溶液和1000μL的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，冻干除去残留的溶剂，得到Linker-1，鉴定结果如图1所示。
实施例2：96×96库的DNA编码化合物文库的制备
1、步骤(1)：将4-氟-3-硝基苯甲酸与片段Linker-1的连接，得到带有反应骨架的片段S-Linker-1。
将600nmol的linker-1溶于600μL的硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.4，250mM)中，加入45μL 200mM的Fmoc-AOP(溶解于DMA中，15当量，现用现配)、45μL 200mM的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称HATU)(溶解于DMA中，15当量，现用现配)、45μL200mM的N,N-二异丙基乙胺(简称DIPEA)(溶解于DMA中，15当量，现用现配)，在室温下反应。反应结束后，向反应液加入74μL的5M的氯化钠溶液和2100μL的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到DNA沉淀继续溶于5％的哌啶水溶液。待反应完全后，如上所述乙醇沉淀，使用大小500μL的规格为3K的超滤管(Amicon Ultra Centrifugal)对产物进行脱盐和提纯。将得到的滤液加到600μL的硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.4，250mM)中，加入180μL200mM的4-氟-3-硝基苯甲酸(溶解于DMA中，60当量，现用现配)、180μL 200mM的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称HATU)(溶解于DMA中，60当量，现用现配)、180μL 200mM的N,N-二异丙基乙胺(简称DIPEA)(溶解于DMA中，60当量，现用现配)，在室温下反应。反应结束后，向反应液中加入11.4μL的5M的氯化钠溶液和3200μL的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到带有反应骨架的片段S-Linker-1。
2、步骤(2)：起始引物(Primer)与片段S-Linker-1的连接，得到带有引物的片段S-Linker-1-P
在此示例性DNA编码化合物文库中，将一种固定编码的核苷酸双链(简称起始引物，苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)连接于S-Linker-1，用于后续筛选所有DNA编码化合物的PCR的通用引物片段：
起始引物上链：5'-PO4 2--AGGCTAACTTGCGTACACAG-3'(序列编号：01)
起始引物下链：5'-PO4 2--ACGCAAGTTAGCCTTCGGGA-3'(序列编号：02)
将1mM的片段S-Linker-1水溶液600μL与660nmol的、已经退火的起始引物水溶液368μL混合均匀，在0℃下加入T4缓冲溶液，T4连接酶，16℃条件下反应16小时。待反应完全后，加入300μL的5M的氯化钠水溶液和8500μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于585μL蒸馏水中，得到带有引物的片段S-Linker-1-P。
3、步骤(3)：DNA编码化合物库第一个循环的合成
类似于步骤(2)的链接反应，设置了96种连接反应，将浓度为1mM带有引物的片段S-Linker-1-P溶液分装到96孔板的96个连续的孔中，每个孔5.5μL，继续向每个孔加入浓度为1.8mM的第一个循环的标记核苷酸双链的上链和下链(简称第一个循环标记核苷酸双链，苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)各3.1μL。按照步骤(2)加入T4缓冲溶液，T4连接酶，待反应完全后，如上所述乙醇沉淀，得到DNA沉淀继续溶于8μL的硼酸钠缓冲溶液(pH＝9.4，250mM)中，加入对应的化合物结构单元-小分子伯胺(100当量，200mM的DMA溶液)，在PCR仪中60℃加热16小时(顶盖温度105℃)。待反应完全后，如上所述乙醇沉淀，得到DNA沉淀溶于200μL蒸馏水中，用大小500μL的规格为10K的超滤管(Amicon UltraCentrifugal)对产物进行脱盐和提纯。纯化后的DNA沉淀溶于500μL蒸馏水(0.8mM)中，加入160μL 200mM的FeSO4(溶解于蒸馏水中，80当量，现用现配)，在PCR仪中60℃加热16小时(顶盖温度105℃)。待反应完全后，4℃离心，弃掉沉淀，对上清液进行如上所述乙醇沉淀，得到第一个循环的产物BB1-S-Linker-1-P-T1。鉴定结果如图2所示。
第一个循环的小分子和对应的核苷酸双链信息如下表A所示：
表A
Figure BDA0003706324340000191
Figure BDA0003706324340000201
Figure BDA0003706324340000211
Figure BDA0003706324340000221
4、步骤(4)：DNA编码化合物库第二个循环的合成
第二个循环的标记核苷酸双链(苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)与第一个循环的产物BB1-S-Linker-1-P-T1的链接类似于步骤(2)的链接反应，纯化后的DNA沉淀继续溶于3μL的磷酸缓冲溶液(pH＝5.5，500mM)中，加入对应的化合物结构单元-小分子醛(200当量，200mM的DMA溶液)，于室温下过夜反应。待反应完全后，所有反应液混合到一起，如上所述进行乙醇沉淀，得到DNA沉淀继续溶于200μL蒸馏水中，用大小500μL的规格为10K的超滤管(Amicon Ultra Centrifugal)对产物进行脱盐和提纯，得到第二个循环的产物BB2-BB1-S-Linker1-P-T1-T2。鉴定结果如图3所示。
第二个循环的小分子和对应的核苷酸双链信息具体如下表B所示：
表B
Figure BDA0003706324340000231
Figure BDA0003706324340000241
Figure BDA0003706324340000251
Figure BDA0003706324340000261
5、步骤(5)：尾端引物与DNA编码化合物库连接
在此示例性DNA编码化合物文库中，将一种固定编码的核苷酸双链(简称尾端引物，苏州金唯智生物科技有限公司定制，HPLC纯化)连接于DNA编码化合物文库上，作为的PCR的另一端通用引物片段：
尾端引物上链：
5'-PO4 2--ACATAAACGCTBBBBBBBBBBBBCTGATGGCGCGAGGGAGGC-3'(序列编号：03)
尾端引物下链：5'-PO4 2--TTTATGTAC-3'(序列编号：04)
将1mM的DNA编码化合物文库水溶液30μL水溶液与1mM的、已经退火的尾端引物水溶液24μL混合均匀，在0℃下加入T4缓冲溶液，T4连接酶，16℃条件下反应16小时。待反应完全后，加入12μL的5M的氯化钠水溶液和350μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于50μL蒸馏水中，用大小500μL的规格为10K的超滤管(AmiconUltra Centrifugal)对产物进行脱盐和提纯，得到的DNA编码化合物文库BB2-BB1-S-Linker-1-P-T1-T2-Closing(鉴定结果如图4所示)用于后续的蛋白亲和筛选中。
实施例3：起始片段Linker-2制备
合成了具有以下核酸序列的5'磷酸化的DNA链作为起始片段。
Figure BDA0003706324340000271
3.1.ssDNA结构
单链DNA ssDNA-3结构：
Figure BDA0003706324340000272
单链DNA ssDNA-4结构：
Figure BDA0003706324340000273
3.2.方法
将100nmol ssDNA-3的水溶液(100μL)用100μL硼酸钠缓冲液(pH＝9.4,500mM)稀释，加入7.5μL三聚氯氰的乙腈溶液(200mM)。反应体系在4℃下反应10分钟，然后加入100nmol ssDNA-4的水溶液(100μL)。反应体系在室温下反应1小时。反应结束后，向反应液加入30μL的5M的氯化钠溶液和1000μL的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，冻干除去残留的溶剂。向得到的固体中加入pH 9.4的硼酸钠缓冲液配成0.5mM的水溶液，向其中加入150μL1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷的DMA溶液(200mM)，反应体系在80℃下反应2小时。反应结束后，向反应液加入30μL的5M的氯化钠溶液和1000μL的冷乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，冻干除去残留的溶剂，得到linker-2,鉴定结果如图5所示。
实施例4：连接起始引物
起始引物上链：5'-PO4 2--AAATCGATGTG-3'(序列编码05)
起始引物下链：5'-PO4 2--CATCGATTTGG-3’(序列编号06)
将5nmol的起始片段Linker-2水溶液5μL与5.5nmol的，已经退火的起始引物水溶液3μL混合均匀，在0℃下加入T4缓冲溶液，T4连接酶，16℃条件下反应16小时。待反应完全后，加入2μL的5M的氯化钠水溶液和100μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于5μL蒸馏水中，得到带有起始引物的片段Linker-2-P，鉴定结果如图6所示。
实施例5：连接第一轮DNA编码序列
编码上链：5'-PO4 2--AGACGCAAGAG-3’(序列编号07)
编码下链：5'-PO4 2--CTTGCGTCTCA-3’(序列编号08)
将5nmol的Linker-2-P水溶液5μL与5.5nmol的，已经退火的第一轮DNA编码序列水溶液3μL混合均匀，在0℃下加入T4缓冲溶液，T4连接酶，16℃条件下反应16小时。待反应完全后，加入2μL的5M的氯化钠水溶液和100μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于5μL蒸馏水中，得到带有起始引物的片段Linker-2-P-T1，鉴定结果如图7所示。
实施例6：连接第二轮DNA编码序列
编码上链：5'-PO4 2--TCCTTGTCAGT-3’(序列编号09)
编码下链：5'-PO4 2--TGACAAGGACT-3’(序列编号10)
将5nmol的Linker-2-P-T1水溶液5μL与5.5nmol的，已经退火的第二轮DNA编码序列水溶液3μL混合均匀，在0℃下加入T4缓冲溶液，T4连接酶，16℃条件下反应16小时。待反应完全后，加入2μL的5M的氯化钠水溶液和100μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于5μL蒸馏水中，得到带有起始引物的片段Linker-2-P-T1-T2,鉴定结果如图8所示。
实施例7：切割双硫键
将5nmol的Linker-2-P-T1-T2水溶液与5μL的pH 9.4的缓冲溶液混合，加入1M的DTT水溶液0.5μL,室温反应1小时。待反应完全后，加入1μL的5M氯化钠水溶液和50μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于5μL蒸馏水中。切割生成的两条链的分子量分别是12328和13361，鉴定结果如图9所示。
实施例8：切割DNA编码化合物库中的双硫键
将2nmol的DNA编码化合物文库BB2-BB1-S-Linker-1-P-T1-T2-Closing水溶液与2μL的pH 9.4的缓冲溶液混合，加入1M的DTT水溶液0.2μL,室温反应1小时。待反应完全后，加入0.2μL的5M氯化钠水溶液和20μL的冻乙醇，-78℃放置0.5小时后再4℃离心，去除上清液，得到的DNA沉淀溶于2μL蒸馏水中，通过LCMS进行鉴定，鉴定结果如图10所示。
实施例9：两条核酸单链分离
使用500μL Streptavidin MagPoly beads将其中一条单链拉出。留下另一条核酸链进行筛选。
实施例10：光交联筛选
5μg蛋白(对照组不加蛋白)，单链核酸和佩带光交联基团的互补核酸链在50μL缓冲液中(PBS pH7.4，0.3mg/mL，sssDNA,0.1M NaCl)孵育1h，转移到96-孔板中。冰上365nmUV照射20min。加入50μL 10％SDS。转移至12μL磁珠中，孵育1h。使用洗涤缓冲液(PBSpH7.4，0.2％SDS,0.01％吐温-20)洗涤5次。200mM咪唑洗脱；洗脱液二代测序。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种构建DNA编码化合物文库起始片段的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供多官能团骨架化合物L；
(2)使所述多官能团骨架化合物L与化合物A2-C2-ssDNA1、化合物A3-C3-ssDNA2以及化合物R-C1-A1反应，从而形成式I化合物，即DNA编码化合物文库起始片段；
Figure FDA0003706324330000011
其中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
2.一种构建DNA编码化合物文库起始片段的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)在惰性溶剂中，使化合物A2-C2-ssDNA1与多官能团骨架化合物L进行反应，从而形成式Ia化合物；
Figure FDA0003706324330000012
(b)在惰性溶剂中，使所述式Ia化合物与化合物A3-C3-ssDNA2进行反应，从而形成式Ib化合物；
Figure FDA0003706324330000021
(c)在惰性溶剂中，使所述式Ib化合物与化合物R-C1-A1进行反应，从而形成式I化合物，即DNA编码化合物文库起始片段；
Figure FDA0003706324330000022
其中，在式I、式Ia和式Ib中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一化学链C1、第二化学链C2和第三化学链C3的主链(main chain)的主链原子选自下组：C、O、N、P、或其组合，并且所述的第一化学链C1、第二化学链C2和第三化学链C3为饱和或不饱和的化学链。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C1为取代或未取代的-(L1)n1-，其中，各个L1各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)、N、氧原子、硫原子、磷原子；n1为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C2为取代或未取代的-(L2)n2-，其中，各个L2各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n2为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C3为取代或未取代的-(L3)n3-，其中，各个L3各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n3为3-30的正整数，较佳地5-25；
附加条件是，至少一个L2和L3为剪切位点X；
并且，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：O、C1-C4烷基、-OH、C1-C4烷基-OH、或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一链接化学键A1、第二链接化学键A2和第三链接化学键A3各自独立地选自下组：化学键、酰胺键、酯键、磷酸键，或其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多官能团骨架L选自下组：
Figure FDA0003706324330000031
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C2和C3上均没有化学切割位点X；或C2或C3上有一个化学切割位点X。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学切割位点X选自下组：化学键、可被酶切的DNA序列、或其组合。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述化学切割位点X选自下组：
(i)在酸性条件下可被切断的化学键；
较佳地，所述在酸性条件下可被切断的化学键选自下组：
Figure FDA0003706324330000032
(ii)在碱性条件下可被切断的化学键；
较佳地，所述在碱性条件下可被切断的化学键选自下组：
Figure FDA0003706324330000041
(iii)光可切断的化学键，
较佳地，所述光可切割的化学键选自下组：
Figure FDA0003706324330000042
(iv)在还原条件下可被切断的化学键，
较佳地，所述的在还原条件下可被切断的化学键包括二硫键；
(v)上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)的任意组合。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述起始片段功能区的反应位点R的反应基团选自下组：氨基、羟基、巯基(-SH)、醛羰基(-CHO)、酮羰基(-C(O)-)、羧基(-COOH)、叠氮(-N＝N-)、炔基、卤素、或其组合，更佳地为氨基。
11.一种用于构建DNA编码化合物文库的起始片段，其特征在于，所述的起始片段具有如下式I所示的结构：
Figure FDA0003706324330000043
其中，
R为起始片段功能区的反应位点；
L为多官能团骨架；
C1为用于连接所述多官能团骨架L与所述功能区的第一化学链；
C2为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA1的第二化学链；
C3为用于连接所述多官能团骨架L与编码区ssDNA2的第三化学链；
A1为用于连接C1和L的第一链接化学键；
A2为用于连接C2和L的第二链接化学键；
A3为用于连接C3和L的第三链接化学键；
每个X各自独立地为无或化学切割位点，且所述X位于C2或C3上任何位置；
ssDNA1和ssDNA2各自独立为单链DNA，并且ssDNA1和ssDNA2是序列互补的。
12.如权利要求11所述的起始片段，其特征在于，L为多官能团骨架，选自下组：
Figure FDA0003706324330000051
和/或R选自下组：氨基、羟基、巯基(-SH)、醛羰基(-CHO)、酮羰基(-C(O)-)、羧基(-COOH)、叠氮(-N＝N-)、炔基、卤素。
13.如权利要求11所述的起始片段，其特征在于，所述C1为取代或未取代的-(L1)n1-，其中，各个L1各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)、N、氧原子、硫原子、磷原子；n1为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C2为取代或未取代的-(L2)n2-，其中，各个L2各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n2为3-30的正整数，较佳地5-25；
所述C3为取代或未取代的-(L3)n3-，其中，各个L3各自独立地选自下组：CH2，CH、C、NH、C(O)，N、氧原子、硫原子、磷原子、或剪切位点X；n3为3-30的正整数，较佳地5-25；
附加条件是，至少一个L2和L3为剪切位点X；
并且，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：O、C1-C4烷基、-OH、C1-C4烷基-OH、或其组合。
14.如权利要求14所述的起始片段，其特征在于，所述的起始片段选自下组：
Figure FDA0003706324330000052
Figure FDA0003706324330000061
15.一种权利要求11所述的用于构建DNA编码化合物文库的起始片段的用途，其特征在于，用于制备用于构建DNA编码化合物文库的试剂。
16.一种构建DNA编码化合物文库的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)将权利要求11所述的式I所示的结构的构建DNA编码化合物文库的起始片段，与预定的化合物进行连接，从而形成DNA编码化合物文库：
Figure FDA0003706324330000062
其中，
R、L、C1、C2、C3、A1、A2、A3、X、ssDNA1和ssDNA2定义如权利要求11中所述。
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