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CN115466680A - 实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法 - Google Patents

实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法 Download PDF

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CN115466680A
CN115466680A CN202211309026.5A CN202211309026A CN115466680A CN 115466680 A CN115466680 A CN 115466680A CN 202211309026 A CN202211309026 A CN 202211309026A CN 115466680 A CN115466680 A CN 115466680A
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microbeads
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魏泽文
丁文拥
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Beijing Institute of Technology BIT
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Abstract

本发明提供一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法，微流控芯片包括微结构通道层和玻璃基片，所述微结构通道层设置于所述玻璃基片的上方；微结构通道层的靠近所述玻璃基片的一侧设置有细胞培养区、凝胶隔离区和因子检测区，所述凝胶隔离区设置于所述细胞培养区与所述因子检测区之间；所述凝胶隔离区中填充有凝胶层以阻止细胞培养区内的细胞进入因子检测区；类器官与免疫细胞进入细胞培养区，并在细胞培养区构建免疫微环境，细胞培养区内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区中的凝胶层进入因子检测区，在所述因子检测区对细胞因子进行检测。本发明的一个技术效果在于，设计合理，能够实现对类器官免疫杀伤的实施监测，检测结构比较准确。

Description

实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法。
背景技术
近年来，癌症的发病率和死亡率迅速上升，癌症的发生与治疗都与肿瘤免疫息息相关，不同肿瘤可以通过不同环节的异常抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤而产生免疫耐受，促进肿瘤的发生、发展。所以，我们需要在体外构建一个合适的肿瘤免疫微环境，快速地检测到患者体内免疫细胞对肿瘤细胞的识别、杀伤，从而对患者的后续治疗进行指导。
现在，体外构建免疫微环境多使用细胞系来进行构建且大多在孔板内构建，这就导致构建的免疫环境与体内相差甚远，难以做到精准预测反应。而患者来源的类器官作为一种新型的自组织三维结构，相比于二维的细胞系能更好的在体外保留肿瘤的结构与功能，通过将患者来源的肿瘤类器官与该患者的免疫细胞共培养能更好的在体外构建免疫微环境。在杀伤过程中，免疫细胞能通过连接T细胞受体(TCR)后产生相关的细胞因子靶向肿瘤细胞进行破坏，从而诱导肿瘤清除。所以免疫细胞因子的分泌能反应免疫细胞的活化参数，通过检测免疫细胞因子的量可以实时监测免疫细胞的免疫激活和杀伤。在常规检测中，由于样本量的限制通常是最后阶段取上清用试剂盒对相关因子进行检测，无法做到实时检测，并且这种手动采集样本检测的方法还存在工作量大、孔间干扰的问题。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片及其方法的新技术方案。
根据本发明的第一方面，提供了一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，包括微结构通道层和玻璃基片，所述微结构通道层设置于所述玻璃基片的上方；
微结构通道层的靠近所述玻璃基片的一侧设置有细胞培养区、凝胶隔离区和因子检测区，所述凝胶隔离区设置于所述细胞培养区与所述因子检测区之间；所述凝胶隔离区中填充有凝胶层以阻止细胞培养区内的细胞进入因子检测区；
类器官与免疫细胞进入细胞培养区，并在细胞培养区构建免疫微环境，细胞培养区内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区中的凝胶层进入因子检测区，在所述因子检测区对细胞因子进行检测。
可选地，所述微结构通道层上设置有培养进样口、培养出样口、隔离进样口、隔离出样口、检测进样口和检测出样口；
所述细胞培养区的一端与所述培养进样口连通，另一端与所述培养出样口连通；所述凝胶隔离区的一端与所述隔离进样口连通，另一端与所述隔离出样口连通；所述因子检测区的一端与所述检测进样口连通，另一端与所述检测出样口连通。
可选地，沿所述细胞培养区内液体的流动方向间隔设置有多排第一定位单元，相邻排的第一定位单元之间相互交错，所述第一定位单元的形状为开口朝向所述培养进样口的V型，所述第一定位单元用于细胞的捕获定位。
可选地，所述第一定位单元包括多个第一微柱，多个第一微柱构成V字型，相邻的第一微柱之间形成间隙。
可选地，所述第一定位单元的高度为20-500微米，每个第一定位单元的第一微柱的数量为10-30个；所述第一微柱为圆柱，直径为10微米；相邻的第一微柱之间的间隙为5微米。
可选地，沿所述因子检测区内液体的流动方向间隔设置有多排第二定位单元，相邻排的第二定位单元之间相互交错，所述第二定位单元为由三个第二微柱构成的V字型，所述第二定位单元的开口朝向所述检测进样口，且相邻的第二微柱之间形成间隙；所述第二定位单元用于捕获微珠的捕获定位；
捕获微珠和检测微珠由检测进样口进入所述因子检测区；其中，捕获微珠为连有细胞因子抗体的不带荧光的直径为15微米的聚苯乙烯微珠，检测微珠为连有细胞因子抗体的带荧光的直径为0.5微米的聚苯乙烯微珠；每个所述第二定位单元捕获一个所述捕获微珠，所述检测微珠从相邻的第二微柱之间形成的间隙通过。
可选地，所述第二定位单元的高度为20-500微米，所述第二微柱为圆柱，直径为10微米；相邻的第二微柱之间的间隙为10微米。
可选地，所述凝胶隔离区设置有两行第三微柱阵列，行间距为100-500微米；其中一行所述第三微柱阵列位于所述细胞培养区与所述凝胶隔离区之间，另一行所述第三微柱阵列位于所述凝胶隔离区与所述因子检测区之间；
第三微柱的高度为20-500微米，相连的第三微柱之间的间隙为10-50微米。
可选地，所述细胞培养区的相对两侧分别设置两个所述凝胶隔离区，每个所述凝胶隔离区的远离所述细胞培养区的一侧均设置有所述因子检测区。
根据本发明的第二方面，提供了一种实时监测类器官免疫杀伤的方法，包括如下步骤：
将凝胶以预设流速通入凝胶隔离区，并在紫外线照射下自发凝固形成凝胶层；其中，凝胶隔离区将细胞培养区与因子检测区隔离，使得细胞培养区内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区中的凝胶层进入因子检测区，并使得细胞培养区内的细胞在凝胶层的作用下无法进入因子检测区；
将患者来源的肿瘤类器官与免疫细胞以预设流速通入细胞培养区，细胞培养区内的每个第一定位单元捕获一团细胞，以构建免疫微环境；通过荧光染色的方式在荧光显微镜下对细胞培养区中免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定；
将捕获微珠和检测微珠以预设流速通入因子检测区，因子检测区内的每个第二定位单元捕获一个捕获微珠，而检测微珠可穿过第二定位单元；当细胞培养区释放的细胞因子通过凝胶隔离区渗透到因子检测区后，捕获微珠与检测微珠形成捕获微珠-抗体-细胞因子-抗体-检测微珠的连接结构并被第二定位单元捕获。
本发明的一个技术效果在于：
在本申请实施例中，在细胞培养区构建免疫微环境，并通过荧光染色的方式在荧光显微镜下对细胞培养区中免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定，从而实现对类器官免疫杀伤进行实时监测。另外，凝胶隔离区对细胞培养区中的细胞进行隔离，并可允许细胞因子穿过凝胶隔离区进入因子检测区进行检测，对细胞因子的检测过程不影响细培养区的免疫微环境，避免对细胞产生影响，有助于保证检测结果的准确性。
另外，该微流控芯片实现了培养与检测的集成化与自动化。所有操作全部在一片芯片上完成，避免了样品在不同腔室间的转移带来的不可预计的损失。而且，从样品注入微流控芯片到检测完成，整个过程自动化，大大减少了人工操作，节省了大量的人力和时间。
附图说明
图1为本发明一实施例的一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片的分解结构示意图；
图2为本发明一实施例的一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片的微结构通道层的结构示意图；
图3为图2中A处的细节放大图；
图4为本发明一实施例的一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片的第三微柱阵列的结构示意图。
图中：1、微结构通道层；2、玻璃基片；3、培养进样口；4、隔离进样口；5、检测进样口；6、检测出样口；7、隔离出样口；8、培养出样口；9、因子检测区；10、细胞培养区；11、凝胶隔离区；12、第一定位单元；13、第二定位单元；14、第三微柱阵列。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本申请的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本申请的范围。
下面将详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。此外，说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一，字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
参见图1至图4，根据本发明的第一方面，提供了一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片。通过微流控芯片可以实时监测类器官免疫杀伤情况。
具体地，包括微结构通道层1和玻璃基片2，所述微结构通道层1设置于所述玻璃基片2的上方。且微结构通道层1和玻璃基片2之间彼此密封。优选地，所述玻璃基片2的厚度为0.15mm-2mm。玻璃基片2能够较好地实现对微结构通道层1的密封，同时，也便于在荧光显微镜下对类器官免疫杀伤进行实时监测。
例如，微结构通道层1的靠近玻璃基片2的一侧设置有微结构凹槽，通过玻璃基片2封闭微结构凹槽以形成微流控芯片的微结构通道。
在一个实施方式中，所述微结构通道层1的厚度为2-5毫米，微结构通道的深度为30-500微米，这能够较好地实现微结构通道层1的功能，同时也能保证微结构通道层1的结构稳定。
进一步具体地，微结构通道层1的靠近所述玻璃基片2的一侧设置有细胞培养区10、凝胶隔离区11和因子检测区9，所述凝胶隔离区11设置于所述细胞培养区10与所述因子检测区9之间；所述凝胶隔离区11中填充有凝胶层以阻止细胞培养区10内的细胞进入因子检测区9。其中，细胞培养区10、凝胶隔离区11和因子检测区9均为微结构通道的一部分，以实现对细胞的培养、隔离以及对细胞因子的检测。
类器官与免疫细胞进入细胞培养区10，并在细胞培养区10构建免疫微环境，细胞培养区10内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区11中的凝胶层进入因子检测区9，在所述因子检测区9对细胞因子进行检测。
需要说明的是，该微流控芯片是基于微流控技术制作而成。微流控技术的出现为细胞受控共培养和实时监测相互作用奠定了可能性。微流控技术能促进肿瘤类器官与免疫细胞在连续灌注室中的共培养，并且传感器和致动器可以与微流体设备集成，以实现精确监测和控制。该实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片能够通过在细胞培养区10设计微结构高效率地捕获类器官，并基于凝胶隔离的方法形成凝胶隔离区11，将在不影响类器官构建免疫微环境的情况下实时监测多种因子，从而较好地实现实时监测类器官的免疫杀伤的目的。
在本申请实施例中，在细胞培养区10构建免疫微环境，并通过荧光染色的方式在荧光显微镜下对细胞培养区10中免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定，从而实现对类器官免疫杀伤进行实时监测。另外，凝胶隔离区11对细胞培养区10中的细胞进行隔离，并可允许细胞因子穿过凝胶隔离区11进入因子检测区9进行检测，对细胞因子的检测过程不影响细培养区的免疫微环境，避免对细胞产生影响，有助于保证检测结果的准确性。
另外，该微流控芯片实现了培养与检测的集成化与自动化。所有操作全部在一片芯片上完成，避免了样品在不同腔室间的转移带来的不可预计的损失。而且，从样品注入微流控芯片到检测完成，整个过程自动化，大大减少了人工操作，节省了大量的人力和时间。
示例性地，细胞培养区10包括入口通道、培养通道和出口通道，培养通道的两端分别连接入口通道和出口通道，且入口通道连通培养进样口3，出口通道连通培养出样口8，培养通道的宽度大于入口通道和出口通道的宽度，从而能够实现在细胞培养区10构建一个稳定的免疫微环境。
可选地，所述微结构通道层1上设置有培养进样口3、培养出样口8、隔离进样口4、隔离出样口7、检测进样口5和检测出样口6；
所述细胞培养区10的一端与所述培养进样口3连通，另一端与所述培养出样口8连通；所述凝胶隔离区11的一端与所述隔离进样口4连通，另一端与所述隔离出样口7连通；所述因子检测区9的一端与所述检测进样口5连通，另一端与所述检测出样口6连通。
在上述实施方式中，有助通过培养进样口3向细胞培养区10通入含有类器官与免疫细胞的培养基，培养基可从培养进样口3流出，从而实现免疫微环境的构建；还有助于通过隔离进样口4向凝胶隔离区11通入凝胶，以形成凝胶层以阻止细胞等向因子检测区9渗透；还有助于通过检测进样口5通入检测凝珠和捕获凝珠，以实现对细胞因子的检测，结构设计合理，不对细胞产生影响，保证了检测结果的准确性。
可选地，沿所述细胞培养区10内液体的流动方向间隔设置有多排第一定位单元12，相邻排的第一定位单元12之间相互交错，所述第一定位单元12的形状为开口朝向所述培养进样口3的V型，所述第一定位单元12用于细胞的捕获定位。
在上述实施方式中，第一定位单元12能够对一团细胞进行精确的捕获定位，从而在细胞培养区10形成稳定的免疫微环境。
可选地，所述第一定位单元12包括多个第一微柱，多个第一微柱构成V字型，相邻的第一微柱之间形成间隙。第一定位单元12能够对类器官与免疫细胞进行准确的捕获，相邻的第一微柱之间的间隙有助于降低含有的类器官与免疫细胞的培养基在细胞培养区10的流阻，有助于保持免疫微环境的稳定性。
可选地，所述第一定位单元12的高度为20-500微米，每个第一定位单元12的第一微柱的数量为10-30个；所述第一微柱为圆柱，直径为10微米；相邻的第一微柱之间的间隙为5微米。这使得第一定位单元12的结构设计合理，便于对一团细胞进行捕获，同时也进一步地减少了含有的类器官与免疫细胞的培养基在细胞培养区10的流阻。
可选地，沿所述因子检测区9内液体的流动方向间隔设置有多排第二定位单元13，相邻排的第二定位单元13之间相互交错，所述第二定位单元13为由三个第二微柱构成的V字型，所述第二定位单元13的开口朝向所述检测进样口5，且相邻的第二微柱之间形成间隙；所述第二定位单元13用于捕获微珠的捕获定位；
捕获微珠和检测微珠由检测进样口5进入所述因子检测区9；其中，捕获微珠为连有细胞因子抗体的不带荧光的直径为15微米的聚苯乙烯微珠，检测微珠为连有细胞因子抗体的带荧光的直径为0.5微米的聚苯乙烯微珠；每个所述第二定位单元13捕获一个所述捕获微珠，所述检测微珠从相邻的第二微柱之间形成的间隙通过。
在上述实施方式中，第二定位单元13设计合理，能够有效地对捕获微珠进行捕获，同时检测微珠能够从相邻的第二微柱之间形成的间隙通过。
当细胞培养区10释放的细胞因子通过凝胶隔离区11渗透到因子检测区9后，捕获微珠与检测微珠形成捕获微珠-抗体-细胞因子-抗体-检测微珠的连接结构，所以第二定位单元13捕获的捕获微珠逐渐带有荧光，通过计数因子检测区9带有荧光的捕获微珠的比例，从而检测到细胞培养区10的细胞因子含量，检测方式比较简单，检测结果比较准确。
可选地，所述第二定位单元13的高度为20-500微米，所述第二微柱为圆柱，直径为10微米；相邻的第二微柱之间的间隙为10微米。这使得第二定位单元13的结构设计合理，能够较好地实现第二定位单元13的功能。
在一个具体的实施方式中，所述微结构通道层1由透明材质制成，透明材质可以为玻璃，也可以为PDMS，从而便于实现对微流控芯片的观测。由于微结构通道层1需要制作各个进样口和出样口，所以需要能够开孔。
可选地，所述凝胶隔离区11设置有两行第三微柱阵列14，行间距为100-500微米；其中一行所述第三微柱阵列14位于所述细胞培养区10与所述凝胶隔离区11之间，另一行所述第三微柱阵列14位于所述凝胶隔离区11与所述因子检测区9之间；
第三微柱的高度为20-500微米，相连的第三微柱之间的间隙为10-50微米。
在上述实施方式中，凝胶隔离区11的第三微柱阵列14能够在凝胶隔离区11通入凝胶时较好地固定凝胶，以形成凝胶层，从而实现对细胞的隔离，而允许细胞因子通过。
在本申请实施例中，该微流控芯片的适用范围较广。第一定位单元12、第二定位单元13和第三微柱阵列14的尺寸可以根据不同的细胞进行调整，灵活程度高，且不增加成本。进一步地，微流控芯片检测的细胞因子可通过改变检测微珠上的抗体种类随意更换，不会影响检测的灵敏度，且不增加成本。同时，检测因子的种类也可通过增加凝胶隔离区11和因子检测区9的个数增加，其不会影响检测的灵敏度，操作非常方便。
可选地，所述细胞培养区10的相对两侧分别设置两个所述凝胶隔离区11，每个所述凝胶隔离区11的远离所述细胞培养区10的一侧均设置有所述因子检测区9。
在上述实施方式中，每个凝胶隔离区11分别连接有隔离进样口4和隔离出样口8，每个因子检测区9分别连接有检测进样口5和检测出样口6，如图1和图2所示，不同的因子检测区9可分别通入不同的检测微珠，由于不同的检测微珠上的抗体种类不同，使得不同的因子检测区9可以检测不同的细胞因子，操作非常简单高效。
在一个实施方式中，玻璃基片2的厚度为2mm。玻璃片的厚度会对显微镜的成像倍数有影响，所以若需对细胞和检测微珠等进行高倍镜成像，可根据需要选择较薄的玻璃基片2。
本申请选择PDMS作为微结构通道层1的材料，是因为PDMS可以很好的兼容基于光刻和腐蚀的微加工工艺，而且加工精度易于控制，从而可以很容易的获得和细胞尺寸相符的捕获阵列。本领域技术人员也可以根据需求选择玻璃、硅等可加工的材料。
例如，微结构通道层1的厚度为3毫米，微结构通道的深度为30微米。第一定位单元12的高度为25微米，并由18个第一微柱排布而成，每个第一微柱为直径10微米的圆柱，相邻的第一微柱之间的间隙为5微米，细胞培养区10共计有77个第一定位单元12。
因子检测区9的第二定位单元13的高度为25微米，其由3个第二微柱排布而成，每个第二微柱为直径10微米的圆柱，相邻的第二微柱之间的间隙为10微米，因子检测区9共计有200个第二定位单元13。
凝胶隔离区11设置有两行第三微柱阵列14，行间距为100微米，第三微柱的高度为25微米，相邻第三微柱之间的间隙为37微米。当需要处理其它细胞时，可由本领域技术人员自行选择合适的尺寸及微结构数量。
在另一个实施方式中，微结构通道层1的厚度为2毫米，微结构通道的深度为35微米。第一定位单元12的高度为30微米，并由36个第一微柱排布而成，每个第一微柱为直径10微米的圆柱，相邻的第一微柱之间的间隙为5微米，细胞培养区10共计有150个第一定位单元12。
因子检测区9的第二定位单元13的高度为30微米，其由3个第二微柱排布而成，每个第二微柱为直径10微米的圆柱，相邻的第二微柱之间的间隙为10微米，因子检测区9共计有200个第二定位单元13。
凝胶隔离区11设置有两行第三微柱阵列14，行间距为200微米，第三微柱的高度为30微米，相邻第三微柱之间的间隙为45微米。
在本申请中，采用氧等离子辅助键合的方法实现微结构通道层1和玻璃基片2的密封封接。
微流控芯片的制作方法如下：
首先，采用N型4英寸硅片，在光刻出微结构凹槽的平面形状后，采用ICP(感应等离子刻蚀，即使用六氟化硫和四氟化碳的高能等离子来刻蚀硅)干法刻蚀的方法获得25微米高的各个定位单元以及30微米深的流道。将液态PDMS倒入槽中，在80度的烘箱中烘2h将PDMS凝固后脱模取出，切除PDMS多余部分，按照长2厘米，宽1厘米的外形尺寸切成长方形小片，使用打孔器在所需位置打孔，这样就得到了微结构通道层1。
然后，使用氧等离子体处理透明微结构通道层1的底面以及玻璃基片2的顶面并将他们键合在一起，最终制作完成完整的芯片。
需要说明的是，在微流控芯片的基础上，使用聚四氟乙烯管连接泵和各个进样口，需要分析结果时，将芯片放置在可进行荧光成像的倒置荧光显微镜下，在计算机的图像处理软件中进行荧光图像的自动化分析处理，即可完成整套系统的搭建。
根据本发明的第二方面，提供了一种实时监测类器官免疫杀伤的方法，包括如下步骤：
将凝胶以预设流速通入凝胶隔离区11，并在紫外线照射下自发凝固形成凝胶层；其中，凝胶隔离区11将细胞培养区10与因子检测区9隔离，使得细胞培养区10内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区11中的凝胶层进入因子检测区9，并使得细胞培养区10内的细胞在凝胶层的作用下无法进入因子检测区9。
例如，通过泵将凝胶以预设流速通入凝胶隔离区11，凝胶由于粘度被束缚在两排微柱阵列间。然后，凝胶在紫外线照射下自发凝固形成凝胶层。凝胶层允许细胞因子等小分子蛋白渗透通过，不允许细胞等直径大的结构通过，从而将细胞培养区10与因子检测区9有效隔离。
将患者来源的肿瘤类器官与免疫细胞以预设流速通入细胞培养区10，细胞培养区10内的每个第一定位单元12捕获一团细胞，以构建免疫微环境；通过荧光染色的方式在荧光显微镜下对细胞培养区10中免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定。
例如，通过泵将含有的类器官与免疫细胞的培养基通入细胞培养区10，培养基中含有PI与检测caspase9的试剂，可以通过荧光染色在荧光显微镜下对免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定，从而实现对类器官免疫杀伤的实时监测，监测效果较好。
需要说明的是，肿瘤类器官可以是从患者肿瘤中裂解下的肿瘤细胞在凝胶中培养成的3D细胞团，免疫细胞可以是从患者血液中提取的PBMC细胞再经过诱导的肿瘤反应性免疫细胞，将肿瘤类器官与免疫细胞一起通入细胞培养区10并被第一定位单元12捕获。荧光显微镜用于观测因子检测区9中的捕获微珠-抗体-细胞因子-抗体-检测微珠和观测细胞培养区10中的细胞，对类器官的死亡和凋亡染色成像。
将捕获微珠和检测微珠以预设流速通入因子检测区9，因子检测区9内的每个第二定位单元13捕获一个捕获微珠，而检测微珠可穿过第二定位单元13；当细胞培养区10释放的细胞因子通过凝胶隔离区11渗透到因子检测区9后，捕获微珠与检测微珠形成捕获微珠-抗体-细胞因子-抗体-检测微珠的连接结构并被第二定位单元13捕获。
例如，通过泵将捕获微珠和检测微珠以预设流速通入因子检测区9。当细胞培养区10释放的细胞因子通过凝胶隔离区11渗透到因子检测区9后，捕获微珠与检测微珠形成捕获微珠-抗体-细胞因子-抗体-检测微珠的连接结构，所以第二定位单元13捕获的捕获微珠逐渐带有荧光，通过计数因子检测区9带有荧光的捕获微珠的比例，从而检测到细胞培养区10的细胞因子含量，检测方式比较简单，检测结果比较准确。
最后，通过逆向向因子检测区9通液冲掉捕获单元捕获的微珠，再从检测进样口5通入下一批微珠可完成下次检测，操作简单。
在上述实施方式中，实时监测类器官免疫杀伤的方法非常简单，不仅能够通过荧光染色的方式在荧光显微镜下对细胞培养区10中免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定，从而实现对类器官免疫杀伤进行实时监测，而且从样品注入微流控芯片到检测完成，整个过程自动化，大大减少了人工操作，节省了大量的人力和时间。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，包括微结构通道层和玻璃基片，所述微结构通道层设置于所述玻璃基片的上方；
微结构通道层的靠近所述玻璃基片的一侧设置有细胞培养区、凝胶隔离区和因子检测区，所述凝胶隔离区设置于所述细胞培养区与所述因子检测区之间；所述凝胶隔离区中填充有凝胶层以阻止细胞培养区内的细胞进入因子检测区；
类器官与免疫细胞进入细胞培养区，并在细胞培养区构建免疫微环境，细胞培养区内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区中的凝胶层进入因子检测区，在所述因子检测区对细胞因子进行检测。
2.根据权利要求1所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，所述微结构通道层上设置有培养进样口、培养出样口、隔离进样口、隔离出样口、检测进样口和检测出样口；
所述细胞培养区的一端与所述培养进样口连通，另一端与所述培养出样口连通；所述凝胶隔离区的一端与所述隔离进样口连通，另一端与所述隔离出样口连通；所述因子检测区的一端与所述检测进样口连通，另一端与所述检测出样口连通。
3.根据权利要求2所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，沿所述细胞培养区内液体的流动方向间隔设置有多排第一定位单元，相邻排的第一定位单元之间相互交错，所述第一定位单元的形状为开口朝向所述培养进样口的V型，所述第一定位单元用于细胞的捕获定位。
4.根据权利要求3所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，所述第一定位单元包括多个第一微柱，多个第一微柱构成V字型，相邻的第一微柱之间形成间隙。
5.根据权利要求4所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，所述第一定位单元的高度为20-500微米，每个第一定位单元的第一微柱的数量为10-30个；所述第一微柱为圆柱，直径为10微米；相邻的第一微柱之间的间隙为5微米。
6.根据权利要求2所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，沿所述因子检测区内液体的流动方向间隔设置有多排第二定位单元，相邻排的第二定位单元之间相互交错，所述第二定位单元为由三个第二微柱构成的V字型，所述第二定位单元的开口朝向所述检测进样口，且相邻的第二微柱之间形成间隙；所述第二定位单元用于捕获微珠的捕获定位；
捕获微珠和检测微珠由检测进样口进入所述因子检测区；其中，捕获微珠为连有细胞因子抗体的不带荧光的直径为15微米的聚苯乙烯微珠，检测微珠为连有细胞因子抗体的带荧光的直径为0.5微米的聚苯乙烯微珠；每个所述第二定位单元捕获一个所述捕获微珠，所述检测微珠从相邻的第二微柱之间形成的间隙通过。
7.根据权利要求6所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，所述第二定位单元的高度为20-500微米，所述第二微柱为圆柱，直径为10微米；相邻的第二微柱之间的间隙为10微米。
8.根据权利要求2所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，所述凝胶隔离区设置有两行第三微柱阵列，行间距为100-500微米；其中一行所述第三微柱阵列位于所述细胞培养区与所述凝胶隔离区之间，另一行所述第三微柱阵列位于所述凝胶隔离区与所述因子检测区之间；
第三微柱的高度为20-500微米，相连的第三微柱之间的间隙为10-50微米。
9.根据权利要求1所述的实时监测类器官免疫杀伤的微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养区的相对两侧分别设置两个所述凝胶隔离区，每个所述凝胶隔离区的远离所述细胞培养区的一侧均设置有所述因子检测区。
10.一种实时监测类器官免疫杀伤的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将凝胶以预设流速通入凝胶隔离区，并在紫外线照射下自发凝固形成凝胶层；其中，凝胶隔离区将细胞培养区与因子检测区隔离，使得细胞培养区内的细胞因子可穿过所述凝胶隔离区中的凝胶层进入因子检测区，并使得细胞培养区内的细胞在凝胶层的作用下无法进入因子检测区；
将患者来源的肿瘤类器官与免疫细胞以预设流速通入细胞培养区，细胞培养区内的每个第一定位单元捕获一团细胞，以构建免疫微环境；通过荧光染色的方式在荧光显微镜下对细胞培养区中免疫细胞对肿瘤类器官的杀伤进行死活标定；
将捕获微珠和检测微珠以预设流速通入因子检测区，因子检测区内的每个第二定位单元捕获一个捕获微珠，而检测微珠可穿过第二定位单元；当细胞培养区释放的细胞因子通过凝胶隔离区渗透到因子检测区后，捕获微珠与检测微珠形成捕获微珠-抗体-细胞因子-抗体-检测微珠的连接结构并被第二定位单元捕获。
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