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CN115436634A - 用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学免疫传感器及检测方法 - Google Patents

用于非小细胞肺癌cyfra21-1检测的电化学免疫传感器及检测方法 Download PDF

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CN115436634A CN202211134176.7A CN202211134176A CN115436634A CN 115436634 A CN115436634 A CN 115436634A CN 202211134176 A CN202211134176 A CN 202211134176A CN 115436634 A CN115436634 A CN 115436634A
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Abstract

本发明提供了一种用于非小细胞肺癌CYFRA21‑1检测的电化学免疫传感器，将PCN222(Fe)/AuNPs用于构建免疫传感器来检测CYFRA21‑1，显示出较强的信号放大作用。本发明生物传感器以MB为电活性物质，以KB/PEI‑AuNPs为传感界面，一方面增加了电极的导电性，另一方面能固载更多的捕获探针，与信号探针通过Ab1‑Ag‑Ab2特异性结合构建三明治夹心型传感器，通过类芬顿反应破坏MB，实现对CYFRA21‑1的高灵敏检测。本发明检测方法具有线性范围宽、特异性强、分析时间短，稳定性和重现性好等优点，适合大面积推广应用。

Description

用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器及检 测方法
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及以金纳米粒子修饰的锆基金属有机框架、CYFRA21-1电化学免疫传感器的制备方法及检测方法。
背景技术
原发性支气管肺癌（Primary bronchial lung cancer）简称肺癌（Lung Cancer），是指原发于气管、支气管和肺的恶性肿瘤。据流行病学调查研究显示，肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，多好发于男性，且发病率和病死率均居首位；而在女性人群中，其发病率仅次于乳腺癌居第2位，病死率仍位居首位。肺癌根据其分化程度、形态特征和生物学特点主要分为小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）两种主要亚型。而大约85%的肺癌被归类为非小细胞肺癌(NSCLC)，主要包括鳞状细胞癌(SCC)、肺腺癌(LAD)和大细胞癌(LCC)。肺癌是所有癌症中死亡率最高的，且肺癌的预后很差，由于75％的患者在就诊时已是晚期，故三年生存率低于20％。因此，针对非小细胞肺癌采取有效的早期诊断方法具有重要意义。
目前，检测 NSCLC的方法主要包括基因诊断、放射性核素扫描 、计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）、超声内镜检查纵隔镜、胸腔镜的检查痰细胞学检查等。然而，这些方法通常需要专门的大型仪器、专业的操作人员、高费用和长时间，这限制了在初级医疗机构和发展中国家对NSCLC的早期诊断。因此，需要寻找一种快速、简便和经济的方法辅助诊断肺癌，提高肺癌的确诊率。
研究发现，细胞角蛋白片段19抗原21-1 CYFRA21-1在非小细胞肺癌早期诊断中具有临床意义。在血清CYFRA21-1水平＞3.3 ng/mL即可诊断为NSCLC。电化学免疫传感器是利用抗原和抗体间的高度特异性结合的原理，将免疫分析法和电化学传感技术相结合构建而成的一项新方法，因为传感器具有灵敏度高、分析速度快、操作简便、低成本、低能耗等特点，被广泛应用于临床诊断领域。现今，基于免疫分析法结合免疫传感器的研制成为检测肿瘤标志物的技术。大量研究用于研发操作简便易行的传感器。寻求一种更加简便，灵敏度更高，选择性更好的检测方法仍然是现代医学检验和生物医学研究领域的研究热点。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器，其特征在于，
所述构建用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器的方法为：将MB/PEI溶液滴加到清洁的玻碳电极表面上，室温干燥后再将KB/PEI-AuNPs分散液滴加到电极表面，室温干燥，将Ab1滴加在电极上，4-5℃冰箱过夜孵育12-13h；用DEPC水冲洗干净后滴加1% 牛血清蛋白（BSA）溶液4-5℃孵育40-45 min；最后将获得的电极用DEPC水冲洗干净后，滴加PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液于室温孵育1-2h，即得到用于CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器；
所述PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液的制备方法为：向PCN222(Fe)/AuNPs分散液中加入的CYFRA21-1的多克隆抗体Ab2，冰浴搅拌 12-13 h形成复合物，离心和洗涤后将复合物重新溶解在PBS溶液中，形成PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液；
所述PCN222(Fe)/AuNPs分散液的制备方法为：PCN222(Fe)溶解于超纯水中，超声至分散均匀，加入AuNPs，置于搅拌器上常温搅拌4-5 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，得到PCN222(Fe)/AuNPs分散液；
所述PCN222(Fe) 的制备方法为：DMF中加入氯化锆、冰醋酸和H2O，再加入Fe-TCPP，室温下保持磁力搅拌10-12分钟，将得到的溶液转移到反应釜中，然后在120-130 ℃下反应18-20小时；然后在10000-12000转/分的条件下离心10-12分钟，然后用乙醇洗涤，60℃烘箱中干燥，得到棕色的粉末为PCN222(Fe)；
所述KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液的制备方法为：将AuNPs溶液加入到KB/PEI分散液中，然后在室温下搅拌4-5 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，得到KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液；
所述KB/PEI溶液的制备方法为: 将KB加入超纯水中，超声溶解后加入1%的PEI溶液，磁力搅拌4-5 h后，用超纯水离心、洗涤两次后，得到分散均匀的KB/PEI溶液。
所述AuNPs的制备方法为：将1% HAuCl4溶液加入至超纯水中煮沸，然后加入1% 柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金 (AuNPs)。
一种用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器，其特征在于，所述构建用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器的方法包括如下步骤：
（1）信号探针的制备；
1）PCN222(Fe)：在2mL DMF中加入10 mg氯化锆、240 μL冰醋酸和50 μL H2O；然后，加入10 mg的Fe-TCPP，在室温下保持磁力搅拌10分钟；将得到的溶液转移到反应釜中，然后在120℃下加热反应18小时；在10000转/分的条件下离心10分钟，然后用乙醇洗涤3次，最后在60摄氏度烘箱中干燥，得到棕色的粉末；
2）AuNPs的制备：将1 mL 1% HAuCl4溶液加入至100 mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5 mL 1% 柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金 (AuNPs)；
3）PCN222(Fe)/AuNPs：取1 mg步骤1）制备的PCN222(Fe)溶解于1mL超纯水中，超声至分散均匀后加入500 ul步骤2）制备的AuNPs，置于搅拌器上常温搅拌4 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1 mL超纯水中，得到PCN222(Fe)/AuNPs分散液；
4）PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2: 向1 mL步骤3)制备的PCN222(Fe)/AuNPs分散液中加入10 ug/ml的CYFRA21-1的多克隆抗体Ab2 100ul冰浴搅拌 12 h，使其充分锚定在复合材料表面形成信号探针；离心和洗涤后，将复合物重新溶解在 1 mL PBS溶液中，并在 4 ºC 下储存备用；
（2）基底材料的制备；
1）MB/PEI: 取0.2 mg的MB加入1 mL超纯水中，超声至分散均匀后加入1%的PEI溶液100 ul，磁力搅拌2 h后得到分散均匀的MB/PEI溶液；
2）KB/PEI: 取1 mg的KB加入1 mL超纯水中，简单超声后加入1%的PEI溶液200 ul，磁力搅拌4 h后，用超纯水离心、洗涤两次后，得到分散均匀的KB/PEI溶液；
3) KB/PEI-AuNPs: 取AuNPs溶液500 μL加入步骤2）制得的KB/PEI分散液中，然后在室温下搅拌4 h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1 mL超纯水中，即得到KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液；
（3）构建用于检测非小细胞癌CYFRA21-1的电化学免疫传感器：
1）用0.1M PBS（pH=7）缓冲液室温下处理捕获抗体Ab1 ，以及目标蛋白CYFRA21-1，储存备用；
2）将玻碳电极用食人鱼洗液（98% H2SO4/30% H2O2 = 3:1, v/v）浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用；
3）将步骤2）得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；
4）将步骤3）得到的电极在0.5 M H2SO4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；
5）将10 μL的 MB/PEI溶液滴加到步骤4）清洁的玻碳电极表面上，室温干燥后，再将15 μL的KB/PEI-AuNPs滴加到电极表面，室温干燥；
6）将10 μL步骤1）制得的Ab1，滴加在步骤5）制备得到的电极上4℃冰箱过夜孵育12h；
7）将步骤6) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加10 μL 1% 牛血清蛋白（BSA）溶液4 ℃孵育40 min；
8) 将步骤7) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加不同浓度的CYFRA21-1于电极表面，于4℃下孵育2h；
9）将步骤8) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后，滴加20 μL的PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液于室温孵育1.5 h，即得到用于CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器。
本发明还提供一种利用上述电化学免疫传感器检测CYFRA21-1的方法。
一种利用上述电化学免疫传感器检测CYFRA21-1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）向所述的传感器电极上滴加不同浓度的目标物细胞角蛋白片段19抗原21-1（CYFRA21-1）；
2) 将电极置于0.1 M PBS（pH=7.0）溶液中进行表征，测量其电化学信号；
3) 将步骤2) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后，在电极表面滴加20μLH2O2孵育30min后，再用DEPC水冲洗干净后，测量其电化学信号。
4）根据步骤3）所得电流变化差值与CYFRA21-1浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；
5）将待测样品用所述的传感器检测，将得到的电流变化差值通过步骤3）制得的工作曲线计算得到待测样品中的CYFRA21-1浓度。
与现有技术相比，本发明的一种检测CYFRA21-1的电化学免疫传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：
本发明制备了金纳米粒子（AuNPs）修饰的锆基金属有机框架（PCN222(Fe），二者通过静电吸附结合在一起，然后通过金属粒子与氨基的键合作用装载大量二抗Ab2,最终制备了PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2的信号探针溶液。本发明PCN222(Fe)具有稳定的三维结构，可以有效地阻止了卟啉中心的自二聚，降低了扩散阻力。本发明PCN-222(Fe)能在温和的条件下引发类Fenton反应，通过产生羟基自由基来降解电活性的亚甲基蓝（MB)，导致电流信号的降低。另外，本工作以MB为电活性物质，KB/PEI-AuNPs作为传感界面，捕获大量的一抗Ab1，进一步实现信号放大。通过上述手段，所制备的电化学免疫传感器成功的用于CYFRA21-1的超灵敏检测。与传统的CYFRA21-1检测方法相比，本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，操作方便，设备材料价格低廉，无污染，从而为CYFRA21-1的检测提供了新的检测方法。
本发明的有益效果是：
1）本发明将PCN222(Fe)/AuNPs用于构建免疫传感器来检测CYFRA21-1，显示出较强的信号放大作用。
2）本发明制备的新型复合物PCN222(Fe)/AuNPs与二抗Ab2混合搅拌，通过Au-N键结合制得示踪标记物，方法简单，且本发明采用新型复合物PCN222(Fe)/AuNPs制备的示踪标记物可应用于各种不同生物传感器。
3）本发明生物传感器以MB为电活性物质，KB/PEI-AuNPs为传感界面，一方面增加了电极的导电性，另一方面能固载更多的捕获探针，与信号探针通过Ab1-Ag-Ab2特异性结合构建三明治夹心型传感器，通过类芬顿反应破坏MB,实现对CYFRA21-1的高灵敏检测。并且，本发明制得的生物传感器还具有线性范围宽、特异性强、分析时间短，稳定性和重现性好等优点。
4）本发明生物传感器用于目标物的识别具有高度的特异性，可提高传感器的选择性，从而为微量CYFRA21-1的检测提供了新的研究方向和分析方法。
5）本发明涉及的材料均可在实验室条件下合成，具有操作简单，原材料价格低廉，毒性低、环境友好，而且每次使用量极少，降低了实验成本。
6）本发明整个检测分析方法步骤清晰简便，灵敏度高，信号响应迅速。检测限可达fg/mL。
7）本方法制备的电化学免疫传感器可为CYFRA21-1的检测提供新方法。
附图说明
图1为不同浓度CYFRA21-1对数值与传感器DPV响应电流差值的校准曲线。
图2 是传感器稳定性检测结果。其中,图A为1 ng/mLCYFRA21-1孵育的传感器在连续扫描50圈循环伏安曲线后得到的短期稳定性检测图。图B为1 ng/mLCYFRA21-1孵育的传感器20天后得到的电流时间图。
图3 是五支不同玻碳电极同时孵育100 pg/mL CYFRA21-1所得的传感器在相同条件下扫描后得到的重现性结果。
图4 为不同修饰电极在5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中电压范围从-0.6到0.2V以100 mV/s的扫描速率得到的循环伏安表征图。
图5是CYFRA21-1免疫传感器的特异性检测图，其中干扰物为多巴胺 (DA, 100ng/ml)、抗坏血酸 (AA , 100ng/ml) 和葡萄糖 (Glu, 100 ng/ml)，人血清蛋白（HSA，100ng/mL），前列腺特异性抗原（PSA，100 ng/mL）, 以及混合物（DA+AA+Glu+HSA+CYFRA21-1+PSA，100ng/mL）。
具体实施方式
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
本发明实施例中用到的主要化学试剂如下：
科琴黑（KB）购自日本狮王公司，细胞角蛋白片段19抗原21-1（CYFRA21-1）购自武汉云克隆科技股份有限公司（中国武汉）。ZrCl4、 meso-四(4-羧基苯基)卟吩氯化铁购自阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海），亚甲基蓝(MB)、苯甲酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购自麦克林生化科技有限公司（中国上海）。牛血清蛋白（BSA）购自J＆K Scientific Ltd（中国北京）、氯金酸(HAuCl4)，购自Sigma(USA)。聚(乙烯亚胺)(PEI)购自Alfa Aesar Co(USA)。乙醇购自川东化工集团有限公司。过氧化氢（30%）购自成都科隆化工有限公司。
所用设备及技术参数：
仪器：电化学检测采用三电极系统：修饰后的玻碳电极(直径4mm)作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。使用Metrohm Autolab B.V.电化学工作站（瑞士Modular仪器）进行差分脉冲伏安法（DPV）测定。用CHI 660E电化学工作站(中国上海辰华仪器)进行循环伏安法(CV)测定。pH计监测pH值(MP 230，Mettler-Toledo，瑞士)。循环伏安曲线（CV）是由电化学三电极系统在5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中以100mV/s扫描。差分脉冲伏安曲线(DPV)是在由电化学三电极系统0.1MPBS(PH 7.0)中以100mV/s的扫描速率从-0.6～0.2V扫描完成。
实施例1
按照如下步骤操作：
（1）信号探针的制备；
1）PCN222(Fe)：在2mLDMF中加入10 mg氯化锆、240μL冰醋酸和50μL H2O。然后，在上述溶液中进一步加入10 mg的Fe-TCPP，在室温下保持磁力搅拌10分钟。将得到的均匀溶液转移到反应釜中，然后在120℃下加热18小时。在10000转/分的条件下离心10分钟，然后用乙醇洗涤3次（10000rpm/min,10min)，最后在60摄氏度烘箱中干燥，得到棕色的粉末。
2）AuNPs的制备：将1 mL 1% HAuCl4溶液加入至100 mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5 mL 1% 柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金 (AuNPs)
3）PCN222(Fe)/AuNPs：取1mg步骤1）制备的PCN222(Fe)溶解于1mL超纯水中，超声至分散均匀后加入500ul步骤2）制备的AuNPs，置于搅拌器上常温搅拌4h,离心、洗涤，再将沉淀物分散在1mL超纯水中，得到PCN222(Fe)/AuNPs分散液。
4）PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2: 向1mL步骤3)制备的PCN222(Fe)/AuNPs分散液中加入10ug/ml的CYFRA21-1的多克隆抗体Ab2100ul冰浴搅拌 12 h，使其充分锚定在复合材料表面形成信号探针。离心和洗涤后，将复合物重新溶解在 1 mL 超纯水中，并在 4 ºC 下储存备用。
（2）基底材料的制备；
1）MB/PEI: 取0.2mg的MB加入1mL超纯水中，超声至分散均匀后加入1%的PEI溶液100ul，磁力搅拌2h后得到分散均匀的MB/PEI溶液。
2）KB/PEI: 取1mg的KB加入1mL超纯水中，简单超声后加入1%的PEI溶液200ul，磁力搅拌4h后，用超纯水离心、洗涤两次后，得到分散均匀的KB/PEI溶液。
3) KB/PEI-AuNPs: 取AuNPs溶液500μL加入步骤2）制得的KB/PEI分散液中，然后在室温下搅拌4h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1mL超纯水中，即得到KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液。
（3）构建用于CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器；
1）用0.1M PBS（pH=7）缓冲液室温下处理捕获抗体Ab1 ，以及目标蛋白CYFRA21-1，储存备用；
2）将玻碳电极用食人鱼洗液（98% H2SO4/30% H2O2 = 3:1, v/v）浸泡30 min后用超纯水冲洗干净备用；
3）将步骤2）得到的电极分别用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；
4）将步骤3）得到的电极在0.5 M H2SO4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；
5）将10 μL的 MB/PEI溶液滴加到步骤4）清洁的玻碳电极表面上，室温干燥后，再将15 μL所述的基底材料KB/PEI-AuNPs滴加到电极表面，室温干燥。
6）将10 μL步骤1）制得的Ab1，滴加在步骤5）制备得到的电极上4℃冰箱过夜孵育12h；
7）将步骤6) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加10 μL 1% 牛血清蛋白（BSA）溶液4℃孵育40min；
8) 将步骤7) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加不同浓度的CYFRA21-1于电极表面，于4℃下孵育2h；
9）将步骤8) 获得的电极用DEPC水冲洗干净后，滴加20 μL的 PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液于4℃冰箱孵育1.5 h，即得到用于CYFRA21-1检测的电化学适体传感器。
采用实施例1构建的电化学免疫传感器检测CYFRA21-1，按照如下步骤操作
一、绘制标准曲线
1）将实施例1步骤（3）中步骤4）至步骤9）的修饰电极置于0.1 M PBS（pH=7.0）溶液中进行表征，测量不同浓度CYFRA21-1的DPV响应值。将测量后的电极用DEPC水冲洗干净后，在电极表面滴加20μLH2O2孵育30min后，再用DEPC水冲洗干净后，测量其电化学信号。根据所得电流变化差值与不同CYFRA21-1浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；
本发明传感器对不同浓度CYFRA21-1的检测结果如图1所示。图1为不同浓度CYFRA21-1的对数值与传感器DPV电流响应差值的校准曲线，检测结果表明CYFRA21-1浓度对数值与传感器DPV电流响应差值两者在10fg/mL-100ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9983，检测限为0.62 fg/mL。
2）将实施例1步骤（3）中步骤4）至步骤9）的修饰电极分别置于5 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行CV。测量其电流响应信号，结果如图4所示：（a）裸玻碳电极；（b）滴加MB/PEI/KB/PEI-AuNPs复合材料；（c）孵育Ab1；（d）滴加BSA；（e）孵育目标物。
二、传感器稳定性测试：
将实施例1制得的传感器在将制备好的传感器置于4℃储存20天，结果发现储存20天后电流为初始电流的98.39％，表明传感器具有良好的稳定性。
三、传感器重现性测试：
将实施例1采用五支不同玻碳电极孵育相同浓度CYFRA21-1（100 pg/mL）制得的传感器进行测量后（如图3所示），得到相对标准偏差（RSD）为2.81%，表明传感器重现性良好。
四、传感器特异性测试：
为了研究提出的适应传感器的特异性，将对不同干扰物：多巴胺 (DA, 100 ng/ml)、抗坏血酸 (AA , 100ng/ml) 和葡萄糖 (Glu, 100 ng/ml)，人血清蛋白（HSA，100 ng/mL），前列腺特异性抗原（PSA，100 ng/mL）, 以及混合物（DA+AA+Glu+HSA+CYFRA21-1+PSA，100ng/mL）在相同浓度及条件下测定的不同干扰物质置于0.1 M PBS（pH=7.0）溶液中的DPV响应值。结果表明（如图5所示），提出的基于CYFRA21-1的高特异性反应的适体传感器具有良好的特异性。

Claims (5)

1.一种用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器，其特征在于，
所述构建用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器的方法为：将MB/PEI溶液滴加到清洁的玻碳电极表面上，室温干燥后再将KB/PEI-AuNPs分散液滴加到电极表面，室温干燥，将Ab1滴加在电极上，4-5℃冰箱过夜孵育12-13h；用DEPC水冲洗干净后滴加1％牛血清蛋白(BSA)溶液4-5℃孵育40-45min；最后将获得的电极用DEPC水冲洗干净后，滴加PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液于室温孵育1-2h，即得到用于CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器；
所述PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液的制备方法为：向PCN222(Fe)/AuNPs分散液中加入的CYFRA21-1的多克隆抗体Ab2，冰浴搅拌12-13h形成复合物，离心和洗涤后将复合物重新溶解在PBS溶液中，形成PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液；
所述PCN222(Fe)/AuNPs分散液的制备方法为：PCN222(Fe)溶解于超纯水中，超声至分散均匀，加入AuNPs，置于搅拌器上常温搅拌4-5h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，得到PCN222(Fe)/AuNPs分散液；
所述PCN222(Fe)的制备方法为：DMF中加入氯化锆、冰醋酸和H2O，再加入Fe-TCPP，室温下保持磁力搅拌10-12分钟，将得到的溶液转移到反应釜中，然后在120-130℃下反应18-20小时；然后在10000-12000转/分的条件下离心10-12分钟，然后用乙醇洗涤，60℃烘箱中干燥，得到棕色的粉末为PCN222(Fe)；
所述KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液的制备方法为：将AuNPs溶液加入到KB/PEI分散液中，然后在室温下搅拌4-5h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在超纯水中，得到KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液；
所述KB/PEI溶液的制备方法为:将KB加入超纯水中，超声溶解后加入1％的PEI溶液，磁力搅拌4-5h后，用超纯水离心、洗涤两次后，得到分散均匀的KB/PEI溶液。
2.如权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述AuNPs的制备方法为：将1％HAuCl4溶液加入至超纯水中煮沸，然后加入1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金(AuNPs)。
3.如权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述MB/PEI溶液的制备方法为:将MB加入超纯水中，超声至分散均匀后加入1％的PEI溶液，磁力搅拌2h后得到分散均匀的MB/PEI溶液。
4.一种用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器，其特征在于，所述构建用于非小细胞肺癌CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器的方法包括如下步骤：
(1)信号探针的制备；
1)PCN222(Fe)：在2mL DMF中加入10mg氯化锆、240μL冰醋酸和50μL H2O；然后，加入10mg的Fe-TCPP，在室温下保持磁力搅拌10分钟；将得到的溶液转移到反应釜中，然后在120℃下加热反应18小时；在10000转/分的条件下离心10分钟，然后用乙醇洗涤3次，最后在60摄氏度烘箱中干燥，得到棕色的粉末；
2)AuNPs的制备：将1mL 1％HAuCl4溶液加入至100mL超纯水中煮沸，然后迅速加入2.5mL1％柠檬酸三钠溶液继续煮沸15分钟，冷却后用超纯水恢复至原体积得透明的酒红色溶液即为纳米金(AuNPs)；
3)PCN222(Fe)/AuNPs：取1mg步骤1)制备的PCN222(Fe)溶解于1mL超纯水中，超声至分散均匀后加入500ul步骤2)制备的AuNPs，置于搅拌器上常温搅拌4h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1mL超纯水中，得到PCN222(Fe)/AuNPs分散液；
4)PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2:向1mL步骤3)制备的PCN222(Fe)/AuNPs分散液中加入10ug/ml的CYFRA21-1的多克隆抗体Ab2 100ul冰浴搅拌12h，使其充分锚定在复合材料表面形成信号探针；离心和洗涤后，将复合物重新溶解在1mL PBS溶液中，并在4℃下储存备用；
(2)基底材料的制备；
1)MB/PEI:取0.2mg的MB加入1mL超纯水中，超声至分散均匀后加入1％的PEI溶液100ul，磁力搅拌2h后得到分散均匀的MB/PEI溶液；
2)KB/PEI:取1mg的KB加入1mL超纯水中，简单超声后加入1％的PEI溶液200ul，磁力搅拌4h后，用超纯水离心、洗涤两次后，得到分散均匀的KB/PEI溶液；
3)KB/PEI-AuNPs:取AuNPs溶液500μL加入步骤2)制得的KB/PEI分散液中，然后在室温下搅拌4h，离心、洗涤，再将沉淀物分散在1mL超纯水中，即得到KB/PEI-AuNPs的基底材料分散液；
(3)构建用于检测非小细胞癌CYFRA21-1的电化学免疫传感器：
1)用0.1M PBS(pH＝7)缓冲液室温下处理捕获抗体Ab1，以及目标蛋白CYFRA21-1，储存备用；
2)将玻碳电极用食人鱼洗液(98％H2SO4/30％H2O2＝3:1,v/v)浸泡30min后用超纯水冲洗干净备用；
3)将步骤2)得到的电极分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末抛光呈镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声处理电极，干燥备用；
4)将步骤3)得到的电极在0.5M H2SO4中进行电化学活化，然后用超纯水冲洗，干燥；
5)将10μL的MB/PEI溶液滴加到步骤4)清洁的玻碳电极表面上，室温干燥后，再将15μL的KB/PEI-AuNPs滴加到电极表面，室温干燥；
6)将10μL步骤1)制得的Ab1，滴加在步骤5)制备得到的电极上4℃冰箱过夜孵育12h；
7)将步骤6)获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加10μL 1％牛血清蛋白(BSA)溶液4℃孵育40min；
8)将步骤7)获得的电极用DEPC水冲洗干净后,滴加不同浓度的CYFRA21-1于电极表面，于4℃下孵育2h；
9)将步骤8)获得的电极用DEPC水冲洗干净后，滴加20μL的PCN222(Fe)/AuNPs/Ab2信号探针溶液于4℃孵育1.5h，即得到用于CYFRA21-1检测的电化学免疫传感器。
5.利用如权利要求1-4任一项所述电化学免疫传感器检测CYFRA21-1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向所述的传感器电极上滴加不同浓度的目标物细胞角蛋白片段19抗原21-1(CYFRA21-1)；
2)将电极置于0.1M PBS(pH＝7.0)溶液中进行表征，测量其电化学信号；
3)将步骤2)获得的电极用DEPC水冲洗干净后，在电极表面滴加20μLH2O2孵育30min后，再用DEPC水冲洗干净后，测量其电化学信号。
4)根据步骤3)所得电流变化差值与CYFRA21-1浓度对数值的线性关系，绘制工作曲线；
5)将待测样品用所述的传感器检测，将得到的电流变化差值通过步骤3)制得的工作曲线计算得到待测样品中的CYFRA21-1浓度。
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