CN115436622B - 一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用，涉及生物检测领域，本发明通过光交联等反应将传统双抗夹心结构转化为高稳定性的共价复合物，利用链霉亲和素标记的高荧光颗粒和生物素标记的双抗夹心结构之间的高亲和力反应，将单分子双抗夹心结构转化为单个的高荧光颗粒信号，建立新型高稳定性无需酶扩增荧光信号的单分子免疫反应体系，克服了传统检测方法由于灵敏度限制，实现了临床样本中低丰度蛋白的高灵敏度检测，为将来新型生物标志物的研究与开发、更深层次的单细胞水平、单分子水平的研究提供了必须的新型研究方法。

Description

一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用。

背景技术

免疫检测在各种疾病检测领域发挥着重要作用，现有的化学放光技术不可能实现单分子免疫检测，而单分子免疫检测技术是在微流控技术的基础上发展起来的超灵敏蛋白检测技术。

微流控技术(Microfluidics)是一种在微纳米尺度空间中对流体进行精确操控的技术。它能够把化学、生物、医学分析过程的样本制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上。相较于传统实验方法，微流控芯片具有微型化、集成化、自动化、反应灵敏和样品消耗少等优点。2010年，David Walt等人使用微流控芯片技术，提出了“Digital ELISA”的概念，通过免疫标记的方法，利用抗体捕获和识别抗原，进行酶联标记，通过单分子酶促反应实现的单分子级别蛋白分子的检测，开发了SiMoA单分子免疫检测技术，具体操作流程如图1所示。

SiMoA通过磁珠酶联免疫反应与微孔阵列芯片的结合，实现单分子蛋白检测。其操作流程如下：(1)利用表面标记有捕获抗体的磁珠捕获样品中的抗原；(2)使用生物素(Biotin)标记的检测抗体对被捕获的抗原进行标记；(3)加入链霉亲和素—半乳糖苷酶复合物，与检测抗体上的Biotin结合；(4)将反应洗净后的磁珠与底物混合，加载到含有微孔阵列的检测芯片中，利用磁场使磁珠落入与其尺寸完全匹配的微孔中(3μm左右)，加入油相，使得微孔之间物理隔离；(5)含有半乳糖苷酶的微孔由于酶分子催化底物产生荧光产物；(6)对微孔阵列进行荧光成像，通过对发出荧光信号的微孔个数对照标准曲线来实现定量检测。

SiMoA系统实际上沿用了数字PCR中的单分子信号放大的方法，通过酶联免疫进行抗原分子酶联标记，再通过酶催化荧光底物的方法替代数字PCR技术中PCR来实现信号放大。根据目前Quanterix官方公布的数据，SiMoA系统是当前全球范围内检测灵敏度最高的免疫检测系统，其cTnI检测下限达到了0.05ng/mL，且是唯一官方公布能兼具蛋白检测与核酸分子检测通用技术平台。SiMoA单分子免疫检测技术的检测灵敏度超过了传统检测方法灵敏度近20000倍，然而，SiMoA系统存在很明显的一些缺点：(1)检测流程过于复杂；(2)成本较高，需要加工精度高的微孔阵列；(3)检测耗时长，通常需要长达1小时以上。

SMC系统是设备依赖型的单分子检测技术。与SiMoA通过降低反应单元体积，浓缩荧光产物的思路不同，SMC采取的是更为直接的通过激光聚焦的形式提高免疫标记的少数几个荧光染料分子的光子产量，来实现单分子的计数检测。其操作流程如图2所示。

SMC进行单分子免疫检测的具体步骤：(1)利用标记有捕获抗体的酶标板或磁珠捕获抗原(2)使用标记有数个荧光染料分子的检测抗体对抗原进行荧光标记(3)将抗原与荧光标记的检测抗体使用专用洗脱液洗脱，转移至检测孔中(4)使用设备进行单分子计数。目前，SMC系统有两代检测设备，如图3所示，SMC系统第一代检测设备是Erenna，是一种流动式的荧光分子扫描系统。进行荧光分子扫描时，需要使溶液中的洗脱下来的荧光分子逐个通过极小的检测窗口。在检测窗口中，利用激光聚焦技术将高功率激光聚焦到微米尺度，一方面可以避免出现多个抗原标记的荧光分子出现信号叠加的问题，另一方面可以在光学极限尺度下尽可能提高检测窗口激发光源的能量，提高单一抗原标记的仅有的少数几个荧光分子的光子产量，确保单分子信号与背景噪音区分开。然而，这种检测方法带来了几个问题：(1)由于检测窗口很小，几十微升甚至上百微升体积的洗脱液要全部流过检测窗口将花费大量时间(数十分钟)，且由于操作环境的干扰，检测窗口的液体通道极易堵塞，需要使用专门过滤处理过的洗脱溶液(2)微米尺度的光学聚焦已经接近光学衍射的极限，这使得设备对光学系统的调校精准程度和设备操作环境的稳定性都有着极为严苛的要求。为了解决该问题，Merck公司推出了第二代SMC设备SMCxPRO。第二代SMC系统兼容磁珠与多孔板的抗原捕获方式，但是为了降低反应背景和避免磁珠本身透光度有限造成的光源或发射光遮挡的问题，依然必须进行荧光分子的洗脱，并使用专用检测孔装载检测液检测。SMCxPRO改变流动式扫描荧光分子的形式，改为通过旋转光源，在检测孔中对三维尺度的洗脱液进行扫描，从而显著提高分子计数的效率。该检测方法严格意义上已经脱离了单分子绝对计数的概念。由于溶液中的荧光分子存在布朗运动，分子运动轨迹不可预测，这使得检测过程中存在分子重复计数或漏检的可能性，一定程度上降低了检测灵敏度，理论上需要算法辅助校正。与一代设备相比，在单次完整检测耗时上，二代SMC系统尽管已经在一代系统的基础上进行了显著改善，但是单次检测依然需要超过4个小时。综合来看，SMCxPRO依然只能用于科研级别检测分析(事实上Merck公司对SMC技术的定位也仅限于科研领域)，尽管该系统检测灵敏度远超目前主流的各大化学发光技术平台，但其他方面的特性远未达到医疗诊断产品的要求。

目前还有一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，该方法具体操作流程为：(1)将捕获抗体预先修饰于检测基板上；(2)将被测样品稀释后滴加到检测基板上，被检测物与预先修饰的捕获抗体结合；(3)待反应完成后冲洗检测基板，滴加免疫荧光探针(修饰有检测抗体的上转换荧光纳米材料)；(4)冲洗检测基板，将处理后的检测基板置于荧光显微镜下，对免疫荧光探针数目进行计数，所得数目即为被检测物的数目。该方法通过高浓度稀土掺杂上转换发光纳米颗粒作为免疫荧光探针的基础，结果在荧光显微镜下肉眼即可读出，并通过免疫荧光探针数目进行定量，适用于病原体、微生物、大分子抗原或抗体，可检测范围广。然而，开放式的反应与后处理，难以避免待测样品的污染，导致假阳性的出现。同时，该方案所需要的成本较高且合成探针步骤繁琐冗长，不利于其应用的普及与推广。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单分子蛋白的检测方法及其试剂盒和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了试剂组合在制备单分子蛋白的检测试剂盒中的应用，所述试剂组合包括：用于产生检测信号的标记物、能够结合待测物的捕获抗体和能够结合待测物的检测抗体，所述捕获抗体固定于固相载体的表面上，所述捕获抗体上修饰有第一光交联剂，所述检测抗体上修饰有第二光交联剂和生物素，所述标记物上标记有链霉亲和素。

第二方面，本发明实施例提供了一种单分子蛋白的检测试剂盒，其包括如前述实施例所述的组合物。

第三方面，本发明实施例提供了一种单分子蛋白的检测方法，其包括采用如前述实施例所述的单分子蛋白的检测试剂盒对待测样本进行检测。

本发明具有以下有益效果：

1.检测时间短：通过磁珠载体的高比表面积增大靶蛋白与捕获抗体的接触概率，将常规ELISA反应所需要的时间减少，降低了抗原抗体结合所需的时间，将反应时间大幅缩短，30min左右即可完成检测。

2.检测灵敏度高：通过光交联剂的共价交联，增加ELISA反应的结合力，将测量溶液整体光学特性的变化转化为单个高荧光颗粒的识别，将检测的灵敏度提升至单分子级别。

3.成本低：无需使用精密加工的设备，具有易集成、试剂耗材少和成本低等优点。

4.对检测设备要求低：使用纳米尺度荧光微球，将单分子信号转化为单荧光微球信号实现信号放大，降低了检测设备对光学系统的要求。

5.应用范围广泛：适用于绝大部分的免疫检测系中，在细胞生物学、免疫学和临床医学等领域都具有广泛的应用潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为SiMoA技术原理(左)，SiMoA HD-1Analyzer设备图(右)；

图2为SMC技术操作流程示意图；

图3为SMC第一代检测设备Erenna与第二代检测设备SMCxPRO；

图4为本发明提供的单分子免疫检测流程图；

图5为抗体上修饰光交联剂的原理图；

图6为光照时间对检测结果的影响；

图7为p-Tau217的检测灵敏度；

图8为IL-10的检测灵敏度；

图9为IL-10的检测特异性。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明通过光交联等反应将传统双抗夹心结构转化为高稳定性的共价复合物，利用链霉亲和素标记的高荧光颗粒和生物素标记的双抗夹心结构之间的高亲和力反应，将单分子双抗夹心结构转化为单个的高荧光颗粒信号，建立新型高稳定性无需酶扩增荧光信号的单分子免疫反应体系；将传统的测量溶液整体光学特性转化为单个高荧光颗粒的识别，通过对单荧光颗粒信号的扫描，从而实现单分子级别的免疫定量检测。

与传统的通过测量溶液整体光学特性实现定量检测的免疫检测方法，例如化学发光、酶联免疫反应相比，本方案所构建的单分子免疫检测体系由于在检测原理层面无需依赖酶分子对荧光底物信号的扩增，实现了原理上的突破，因而其灵敏度、准确性远远超出传统技术，克服了传统检测方法由于灵敏度限制，实现了临床样本中低丰度蛋白的高灵敏度检测。以阿尔茨海默病血液标志物为基础，为将来新型生物标志物的研究与开发、更深层次的单细胞水平、单分子水平的研究提供了必须的新型研究方法。

具体地，本发明实施例提供了试剂组合在制备单分子蛋白的检测试剂盒中的应用，所述试剂组合包括：用于产生检测信号的标记物、能够结合待测物的捕获抗体和能够结合待测物的检测抗体，所述捕获抗体固定于固相载体的表面上，所述捕获抗体上修饰有第一光交联剂，所述检测抗体上修饰有第二光交联剂和生物素，所述标记物上标记有链霉亲和素。

在一些实施例中，所述第一光交联剂与所述捕获抗体的摩尔比为(5～1000)：1；所述第二光交联剂与所述检测抗体的摩尔比为(5～1000)：1。具体地，第一光交联剂或第二交联剂与抗体的摩尔比为5:1、10:1、50：1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1和1000:1中的任意一种或任意两种之间的范围。该摩尔比可以理解为：抗体修饰光交联剂时，采用的光交联剂与抗体的摩尔比；或修饰后，光交联剂与抗体的摩尔比。

在一些实施例中，在捕获抗体上修饰所述第一光交联剂或在所述检测抗体上修饰所述第二光交联剂的步骤包括：将光交联剂与抗体按所述摩尔比混合。

在一些实施例中，所述混合的条件为：室温(5～25℃)反应25～35min，具体可以为5℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃和25℃中的任意一种或任意两种之间的范围；时间可以为25min、26min、28min、30min、32min、34min和35min中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施例中，所述混合的条件为：0～4℃反应1.5～2.5h。具体可以为0℃、1℃、2℃、3℃和4℃中的任意一种或任意两种之间的范围；时间可以为1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2.0h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h和2.5h中的任意一种或任意两种之间的范围。

所述第一光交联剂和所述第二光交联剂均为含有光敏感基团的试剂。在一些实施例中，所述第一光交联剂和所述第二光交联剂独立地选自：含一个或至少两个双吖丙啶官能团的化合物中的任意一种或至少两种的混合物。

具体地，所述化合物选自如下化合物1～4中的至少一种。

在一些实施例中，所述固相载体选自磁珠、板和膜中的至少一种；优选地，所述固相载体为磁珠磁珠的粒径为1-100μm，具体可以为1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm和100μm中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施例中，所述标记物选自荧光染料和纳米颗粒类标记物中的至少一种。

在一些实施例中，所述纳米颗粒类标记物的粒径为20～5000nm。该粒径具体可以为20nm、50nm、100nm、200nm、400nm、600nm、800nm、1000nm、1200nm、1400nm、1600nm、1800nm、2000nm、2200nm、2400nm、2600nm、2800nm、3000nm、3200nm、3400nm、3600nm、3800nm、4000nm、4200nm、4400nm、4600nm、4800nm和5000nm中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施例中，所述荧光染料选自荧光素类染料、罗丹明类染料、Cy系列染料、Alexa系列染料和蛋白类染料中的至少一种。

在一些实施例中，纳米颗粒类标记物包括纳米颗粒和/或胶体，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒中的至少一种，所述胶体选自乳胶、胶体硒、胶体金属、分散型染料和染料标记的微球中的至少一种。

在一些实施例中，所述胶体金属选自胶体金和胶体银中的至少一种。

在一些实施例中，所述组合物还包括洗涤剂；优选地，所述洗涤剂包括PBS。

本发明所提供的试剂盒或构建的单分子蛋白检测体系对蛋白没有具体的限定，任意分子量的蛋白均基于本文构建的检测方法完成分子水平的检测。在一些实施例中，所述单分子蛋白的检测试剂盒可以是疾病的生物标志物检测试剂盒。

可以理解的是，本文中所述的单分子蛋白的检测方法所具备的高特异性和高灵敏度等技术效果主要是由于检测体系本身所带来的优势，而并非是依赖抗体。在一些实施例中，所述抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体或抗原结合片段。只要是能够结合待测物的抗体均适用于本发明提出的方法。抗原结合片段可以为：VHH、F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的至少一种，优选为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体中的任意一种。

本发明实施例提供了一种单分子蛋白的检测试剂盒，其包括如前述任意实施例所述的组合物。

此外，本发明实施例提供了一种单分子蛋白的检测方法，其包括采用如前述任意实施例所述的单分子蛋白的检测试剂盒对待测样本进行检测。

在一些实施例中，所述检测包括以下步骤：将待测样本与所述试剂盒中的捕获抗体和检测抗体混合反应，将混合反应后的产物在紫外光的作用下照射，使得第一光交联剂和第二光交联剂发生交联反应；在交联反应后的产物中加入标记物，混合后洗涤去除产物中游离的标记物，并对标记物的信号进行检测。

在一些实施例中，所述紫外光的波长为300～450nm；具体可以为300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、450nm中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施例中，所述照射的时间≥0.5min；优选为0.5～16min，具体可以为0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min、12.5min、13min、13.5min、14min、14.5min、15min、15.5min、16min中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施例中，所述检测采用的仪器包括荧光显微镜。

在一些实施例中，所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种单分子蛋白的检测方法，反应原理参照图4，其包括以下步骤。

(1)首先，在捕获抗体和检测抗体上分别修饰光交联基团Diazirine(双吖丙啶)，原理如图5所示；

过程如下：

将蛋白(抗体)溶解在PBS中，浓度为10mg/mL；

将2mg的交联剂NHS-ester diazirines溶解在888微升的DMSO中，配制成10mM的母液；

将交联剂NHS-ester diazirines加入蛋白溶液中，使得交联剂NHS-esterdiazirines、蛋白的终浓度分别为1mM、20μM；

在室温反应30分钟或者4℃反应2小时；

加入淬灭试剂Tris淬灭反应，终浓度为100mM，室温反应5分钟或者4℃反应15分钟；

用透析袋透析除去未反应的交联剂NHS-ester diazirines，并将蛋白冻干，配成100μM的溶液备用。

(2)将捕获抗体通过EDC/NHS酯化反应修饰于羧基磁珠(苏州为度生物技术有限公司，货号CMP1003CA)表面；

(3)结束后，将步骤(2)中的修饰磁珠多次洗涤(PBS洗涤3次)除去多余的捕获抗体，得到MB@Capture Ab(修饰有捕获抗体的磁珠)；

(4)取10μL步骤(3)中MB@Capture Ab(10mg/mL磁珠)与1μL靶蛋白(不同浓度：1fg/mL、10fg/mL、100fg/mL、1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)、10μL修饰有生物素(Biotin)的检测抗体(10ng/mL)、以及29μL的PBS缓冲溶液混合放置于涡旋震荡仪上进行反应5分钟；

(5)待反应结束后，将反应体系利用PBS洗涤3次以除去多余的检测抗体，得到溶液I；

(6)将溶液I置于紫外光(波长为395nm)下，照射适当时间(3min)，以引发Diazirine与临近的抗体分子上的Diazirine发生交联反应，得到溶液II；

(7)在溶液II中加入链霉亲和素(SA)修饰的荧光纳米颗粒(苏州为度生物技术有限公司，货号：FG0400SA，粒径400nm)，反应完成后(1min)，通过1×PBS洗涤除去多余的荧光纳米颗粒，得到溶液III；

(8)洗涤完成后将溶液III通过荧光显微镜的辅助，对磁珠进行荧光信号的计数(对单位面积上荧光点进行计数)、统计与分析；

(9)处理步骤(8)得到的荧光信号数据，对待测靶蛋白进行单分子层面的精确分析。

试验例1

光照时间对检测结果的影响。

基于实施例1提供的方法，基于不同的紫外光照射时间，设置多组实验组，验证光照时间对检测结果的影响。本试验例中，以待测物为p-Tau217进行示例性验证，捕获抗体为p-Tau217单克隆抗体，检测抗体为生物素修饰的山羊抗兔IgG。实验结果表明，在0-3min内随着照射时间的增加，信号在逐渐增加，3-16min信号保持不变，表明信号已经饱和，因此最佳的光照时间是3min。

检测结果见表1和图6。

表1检测结果

进一步地，验证p-Tau217的检测灵敏度，结果见表2和图7。检测结果表明本方法具有很高的检测灵敏度，检测下限可至0.8fM，适合用于科研和临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

表2检测结果

试验例2

IL-10的检测灵敏度。

基于实施例1提供的方法，以待测物为IL-10进行示例性验证，其中，采用的捕获抗体为白介素10单克隆抗体，检测抗体为生物素修饰的山羊抗兔IgG。实验结果表明，随着浓度的增加，检测到的荧光纳米颗粒越多，信号值越大，而且具有很高的灵敏度，检测下限低至0.1fM。

检测结果见表3和图7。

表3检测结果

备注：Fluoresent particle number为荧光颗粒数量。

验证检测的特异性，靶标浓度均为10fM，检测结果见表4和图9。对靶标10fM的IL-10有很强的信号响应，而10fM的非靶标IL-4、IL-1β、PSA、TNF-α与空白对照的信号接近，基本没信号响应。

表4检测结果

试验例3

验证本发明提供的方法对检测限的影响。

基于实施例1提供的方法，以待测物为IL-10和IL-1β进行示例性验证，与Quanterix的方法对比(参考文献结果，JACS 2020_Ultrasensitive Detection ofAttomolar Protein Concentrations by Dropcast Single Molecule Assays)。具体步骤如下：

a)在每次检测中，将10μL抗体包被珠(总共100000粒)和10μL生物素化检测抗体加入到100μL蛋白质样品中，然后将平板密封并摇动1h，以形成免疫复合物。在BioTek405TS微板洗板机中用系统洗涤缓冲液1(Quanterix)洗涤6次，然后再悬浮在100μL链霉亲和素-DNA结合物中，用5mM EDTA稀释样品。将平板摇动15min，进行免疫复合物的链霉亲和素-DNA标记，再在微型洗板机中用系统洗涤缓冲液1洗涤8次。洗涤后，将珠子转移到新的96孔板上，用200μL系统洗涤缓冲液1再洗涤一次，悬浮在60μL的RCA溶液中。

b)RCA溶液由0.5mM脱氧核苷酸混合物(New England Biolabs)、0.33U/ul phi29DNA聚合酶(Lucigen)、0.2mg/mLBSA、1nM ATTO 647N标记DNA探针(集成DNA技术)和0.1％Tween-20组成，反应缓冲液由50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM(NH₄)₂SO₄和10mM MgCl₂组成。

c)使用Zeba旋转脱盐柱(7K MWCO，Thermo Fisher Science)从制造商提供的phi29聚合酶溶液中除去二硫苏糖醇(DTT)。在37℃下摇板1h后，加入150μL的PBS和5mMEDTA，停止RCA反应。用200μL的滴涂缓冲液(50mMTris-HCl，50mMNaC l，0.1％Tween-20，0.5％BSA)洗涤2次，浓缩到10-15μL，然后再悬浮并滴涂到显微镜载玻片上。将滴涂珠干燥10-15min，形成单层膜，然后再用Quanterix的设备来计数和定量。

实验组和对照组采用的捕获抗体分别为白介素10单克隆抗体、白介素1β单克隆抗体，检测抗体均为生物素修饰的山羊抗兔IgG。

检测结果见表5。结果显示，本方法的检测灵敏度均略高于Quanterix的方法。

表5检测结果

检测时间的对比如下。本方法的检测时间远少与Quanterix的方法。

表6检测结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.试剂组合在制备单分子蛋白的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂组合包括：用于产生检测信号的标记物、能够结合待测物的捕获抗体和能够结合待测物的检测抗体，所述捕获抗体固定于固相载体的表面，所述捕获抗体上修饰有第一光交联剂，所述检测抗体上修饰有第二光交联剂和生物素，所述标记物上修饰有链霉亲和素；所述第一光交联剂与所述捕获抗体的摩尔比为（5~1000）：1；所述第二光交联剂与所述检测抗体的摩尔比为（5~1000）：1；

所述第一光交联剂和所述第二光交联剂为NHS-ester diazirines。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固相载体为磁珠。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标记物为荧光纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述标记物的粒径为20~5000nm。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂组合还包括洗涤剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述洗涤剂包括PBS。

7.一种单分子蛋白的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1~6任一项中所述的试剂组合。