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CN115397556A - 用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统和方法 - Google Patents

用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统和方法 Download PDF

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CN115397556A
CN115397556A CN202180025017.0A CN202180025017A CN115397556A CN 115397556 A CN115397556 A CN 115397556A CN 202180025017 A CN202180025017 A CN 202180025017A CN 115397556 A CN115397556 A CN 115397556A
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impedance
cells
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CN202180025017.0A
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李楠
姚欣
方龙斌
孔令波
叶齐挺
杨彩霞
B·拉玛什
王小波
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Original Assignee
Agilent Technologies Inc
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Abstract

本发明提供了一种用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统，所述系统包括：多孔板，所述多孔板具有被配置为接收多个生物样品的多个孔，所述孔中的每个孔具有一组电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；照明模块，所述照明模块被配置为照亮所述孔；托架，所述托架被配置为接收所述多孔板，所述托架在底部上具有开口，所述开口暴露所述孔的所述透明窗口；以及光学成像模块，所述光学成像模块能够跨同一多孔板的不同孔移动以通过所述窗口捕获图像。

Description

用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统和方法
本申请要求2020年3月29日提交的美国专利申请16/833,651号的优先权权益，其全部内容通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明整体涉及用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统和方法，并且更具体地涉及在单个孔中实时地以电子和光学的方式连续监测同一生物样品的系统和方法。
背景技术
基于细胞的测定提供了治疗剂在人类生物学方面的作用的初步评价。许多基于细胞的测定是限于单个时间点的终点测定，而被称为细胞基质阻抗监测的技术允许连续监测细胞。细胞基质阻抗监测评估细胞与电极之间的相互作用，其中细胞在电极上的附着、生长、形态和运动性的变化导致可检测的变化。为此，细胞基质阻抗监测是评估细胞增殖和细胞溶解的有力工具。
虽然细胞基质阻抗监测技术可揭示细胞对潜在治疗剂的响应动力学，但是它具有自身局限性。特别地，其限于检测在电极表面上培养细胞时发生的变化。因此，需要开发扩展细胞基质阻抗监测评价治疗剂对细胞生物学的作用的能力的其他进展。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了一种用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统，所述系统包括：多孔板，所述多孔板具有被配置为接收多个生物样品的多个孔，所述孔中的每个孔具有一组电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；照明模块，所述照明模块被配置为照亮所述孔；托架，所述托架被配置为接收所述多孔板，所述托架在底部上具有开口，所述开口被配置为暴露所述孔的所述透明窗口；以及光学成像模块，所述光学成像模块能够跨同一多孔板的不同孔移动以经由所述开口底部通过所述窗口捕获图像。在一些实施方案中，所述一组电极被配置用于监测细胞基质阻抗。
尽管所述照明模块可以是单个灯，但是优选地，所述照明模块包括被配置为独立地照亮所述孔中的一个或多个孔的多个灯。更优选地，所述照明模块包括发光二极管(LED)阵列。最优选地，每个LED被布置成照亮单个孔。在优选的实施方案中，所述照明模块是明场照明模块。
所述托架被配置为接收并优选地覆盖所述多孔板，并因此可以提供铰接盖。优选地，所述照明模块接合到所述盖的内表面。所述托架可以包括感测对所述板的接收的接触传感器。在一些实施方案中，所述托架以电子的方式接合所述多孔板以与所述多组电极进行电子通信，并且接合所述照明模块以传送照明指令。
由于所述托架的所述开口底部暴露所述孔的所述透明窗口，因此所述光学成像模块可以定位在所述托架下方并且被配置为从孔移动到孔以通过对应的透明窗口捕获图像。在一些实施方案中，所述光学成像模块被配置为一次从单个孔捕获一个或多个图像。在一些实施方案中，在对孔的明场照明下捕获图像，诸如用于确定细胞计数或细胞汇合度参数(例如，百分比汇合度)。在其他实施方案中，在分子激发后捕获图像，诸如荧光图像。所述光学成像系统自身可以包括激发光源，所述激发光源被配置为激发细胞内或细胞表面上的一个或多个分子，诸如与抗体或抗体片段缀合以结合到生物分子诸如蛋白质、多肽或核酸的荧光分子。激发光源的例子可以包括选自紫外光、紫光、蓝光、绿光、黄光、橙光和红光中的一种或多种光。
在一些实施方案中，所述光学成像模块包括相机，所述相机能够以足够短的时间间隔连续地捕获一系列细胞图像以示出细胞运动。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获至少30张图像。在其他实施方案中，所述相机每秒捕获至少60张图像。在任一个或两个实施方案中，所述光学成像模块可以包括相机、带通滤光片、镜筒透镜和物镜。高速成像不仅允许可视地示出细胞移动，而且还允许叠加来自不同光源(例如，明场照明和不同波长的多个光源(每个光源用于激发荧光分子以产生单色荧光图像))的图像，从而揭示在移动期间发生的细胞变化。在一些实施方案中，来自明场照明和三色或更多色荧光的捕获图像被叠加以形成每个时间点的单个图像。根据这种成像，可以确定细胞计数或细胞参数以及荧光的不存在或存在、总荧光强度和平均荧光强度，其进一步揭示详细的细胞动力学。
所述系统还可以包括或耦接计算机处理器，所述计算机处理器通信地耦接到：所述托架，以用于选择性地操作所述多组电极中的每一组电极，任选地以用于以电子的方式监测一个或多个孔内的细胞基质阻抗；所述照明模块，以用于选择性地照亮所述一个或多个孔；以及光学成像模块，以用于其选择性的移动以及从所述一个或多个孔捕获并接收图像。在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为响应于所述一个或多个孔达到或遵循来自所述电子监测的设定的基于阻抗的值或参数而经由所述光学成像模块从所述一个或多个孔捕获图像。在一些实施方案中，所述计算机处理器被配置为以电子的方式监测细胞基质阻抗并以光学的方式监测同一孔，并且被配置为对阻抗和光学数据配对以供显示或分析。在一些实施方案中，所述计算机处理器被配置为在两次连续的电子阻抗测量/监测之间在包括特定时间间隔的时间段内以电子的方式监测细胞基质阻抗；以及在用于电子监测的时间段内的或在与电子监测不同的时间段内的一时间段内以光学的方式监测同一孔。示例性阻抗监测时间段可以被编程为短至数分钟至长达数小时、数天或甚至数周。两次连续的阻抗测量之间的阻抗监测时间间隔可以被指定或编程为短至数秒或小于一秒至长达一分钟、数分钟、一小时甚至数小时。光学监测时间段可以被编程在与一个或多个阻抗监测时间段相同的时间段内、外或与之相关。
虽然所述系统可以与单个板一起使用，但是所述系统还可以包括两个另外的多孔板，每个多孔板具有被配置为接收多个样品的多个孔，所述孔中的每个孔具有一组电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；两个另外的照明模块，所述两个另外的照明模块被配置为照亮所述两个另外的多孔板的所述孔；以及两个另外的托架，所述两个另外的托架被配置为接收所述两个另外的多孔板，所述两个另外的托架各自具有开口底部，所述开口底部暴露所述两个另外的多孔板的所述孔的所述透明窗口；并且其中所述光学成像模块能够跨所有孔移动以经由所暴露的底部通过所有窗口捕获图像。
所述系统还可以包括未被配置用于电子监测的细胞或组织培养容器，其中所述光学成像模块被配置为捕获所述细胞或组织培养容器内的图像。作为示例性实施方案，所述系统可以包括多孔板，所述多孔板具有被配置为接收多个生物样品的多个孔，所述孔中的每个孔具有透明的底表面；照明模块，所述照明模块被配置为照亮所述孔；托架，所述托架被配置为接收所述多孔板，所述托架在底部上具有开口，所述开口被配置为暴露所述孔的所述透明的底表面中的全部；以及光学成像模块，所述光学成像模块能够跨同一多孔板的不同孔移动以经由所暴露的底部通过所述窗口捕获图像。
在本发明的一个相关方面，提供了一种监测细胞的方法，所述方法包括以电子的方式监测多孔板中的孔内的细胞，所述孔中的每个孔具有一组细胞基质阻抗监测电极，和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；以及通过所述透明窗口从正被以电子的方式监测的至少一个孔捕获图像。在一些实施方案中，所述图像在两次连续的图像捕获之间以固定时间间隔定期捕获或在所述电子监测时间段内的一时间段内不定期捕获，所述方法任选地包括在两次连续的图像捕获之间以与所述细胞的两次连续的电子测量之间的时间间隔相同的时间间隔捕获所述图像。
在一些实施方案中，在所述从所述至少一个孔捕获图像的步骤之前，所述电子监测从所述至少一个孔输出满足设定值的结果，所述结果指示所述光学成像模块从所述至少一个孔捕获所述图像。设定值的例子可以包括预先确定的基于阻抗的值。
在一些实施方案中，所捕获的图像是所述细胞的明场图像。在这种实施方案中，所述方法还可以包括根据所述明场图像对细胞进行计数，以及任选地根据所述明场图像导出细胞汇合数量或参数(例如，百分比汇合度)。
在其他实施方案中，所捕获的图像包括所述细胞的荧光图像。在这种实施方案中，所述方法可以包括根据所述图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种。对于每种颜色例如蓝色、绿色和红色的荧光图像，分别计算或确定所述荧光参数。
在其他实施方案中，所捕获的图像包括所述细胞的明场图像和所述细胞的荧光图像。在这种实施方案中，所述方法还包括根据所述明场图像导出细胞汇合数量或参数，以及任选地根据所述明场图像对细胞进行计数；根据所述荧光图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；以及任选地，针对所述孔中的一个或多个孔叠加所述明场图像和一种或多种颜色的荧光图像。
在一个相关方面，提供了一种监测细胞的方法，所述方法包括在一时间段内以电子的方式监测多孔板中的孔内的细胞，所述孔中的每个孔具有一组细胞基质阻抗监测电极，和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；以及在用于电子监测的所述时间段内或外的一时间段内通过所述透明窗口捕获图像。用于电子监测的所述时间段可以与用于图像捕获的所述时间段相同，或者与用于图像捕获的所述时间段不同。用于电子监测和光学监测的这些时间段可以被指定或编程为短至小于一分钟至长达数小时、数天或甚至数周。在电子监测的所述时间段内，电子监测可以在两次连续的电子测量之间以指定固定时间间隔连续。光学监测可以在两次连续的图像捕获之间在所述时间段内以指定固定时间间隔连续。这些时间间隔可以被指定或编程为短至数秒或小于一秒至长达一分钟、数分钟、一小时甚至数小时。
在一些实施方案中，所捕获的图像是所述细胞的明场图像。在这种实施方案中，所述方法还可以包括根据所述明场图像对细胞进行计数，以及任选地根据所述明场图像导出细胞汇合数量或参数(例如，百分比汇合度)。
在其他实施方案中，所捕获的图像包括所述细胞的荧光图像。在这种实施方案中，所述方法可以包括根据所述图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种。对于每种颜色例如蓝色、绿色和红色的荧光图像，分别计算或确定所述荧光参数。
在其他实施方案中，所捕获的图像包括所述细胞的明场图像和所述细胞的荧光图像。在这种实施方案中，所述方法还包括根据所述明场图像导出细胞汇合数量或参数，以及任选地根据所述明场图像对细胞进行计数；根据所述荧光图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；以及任选地，针对所述孔中的一个或多个孔叠加所述明场图像和一种或多种颜色的荧光图像。
附图说明
图1A是用于以电子和光学的方式监测生物样品的示例性系统10的照片，其中任选的用户接口200正显示细胞成像数据。图1B描绘了具有五个可使用的托架14的主壳体12。
图2A示出了处于闭合构型的托架14。图2B示出了处于打开构型的托架14。图2C示出了处于打开位置和闭合位置的双托架14。
图3示出了接合到托架盖14的明场照明模块26。
图4描绘了示例性多孔板20。
图5的照片示出了：适于与中心定位的透明窗口44一起使用的一组电极42的示意图(分图A)；来自多孔板20(参照图4)的在底表面上具有一组电极42和在底表面上没有电极42的透明窗口44的孔32的照片(分图B)；以及通过透明窗口44捕获的细胞图像(分图C)。
图6示出了示例性光学成像模块26。
图7是示例性光学成像模块26的横截面。
图8示出了用于图6的成像模块26的示例性光学成像支撑件60，其允许二维线性运动(包括沿着平行于线性轨道66的轴和沿着平行于线性轨道70的另一轴的运动)。
图9A是用NK92细胞在不同效应子:靶标(E:T)比率下处理用表达红色荧光蛋白的慢病毒转染的MCF7乳腺癌细胞之后基于阻抗的图在一时间间隔内随时间的变化。图9B提供了来自同一测定的红色荧光细胞计数(指示活的靶细胞)随时间的变化。图9C至图9E是在明场照明下在具有2.5:1的E:T比率的相同孔内在NK92细胞添加前(左)、NK92细胞添加后12小时(中)以及NK92细胞添加后30小时捕获的图像。
图10示出了示例性的捕获和叠加图像，其中左分图将三个捕获的荧光图像(红色、绿色和蓝色)与捕获的明场照明图像叠加，并且右分图将三个捕获的荧光图像(红色、绿色和蓝色)叠加而没有明场照明。示出了暴露于针对膜联蛋白V(红色)、半胱天冬酶3(绿色)、细胞核(蓝色)的荧光标记的细胞。
图11A至图11B是描绘在一时间段内的细胞基质阻抗监测以实时演示药物诱导的细胞凋亡的图。用MG132(图11A)或星形孢菌素(图11B)滴定A549蓝色细胞。阴性对照为DMSO。误差条表示一式三份运行的样品的标准偏差。尽管以每15分钟一次的时间间隔连续测量阻抗以防止来自相邻时间点的误差条重叠，但是在此处数据点仅每小时示出一次。
图12A至图12C提供了绘制在一时间段内的阻抗监测的图结合阻抗监测时间段内的不同时间点处的活细胞成像。在用DMSO(图12A)、50μm MG132(图12B)或1μm星形孢菌素(图12C)处理A549蓝色细胞后，跟踪阻抗信号和蓝色细胞核的数量。示出了预处理和处理后1小时或20小时的代表性图像。误差条表示一式三份运行的样品的标准偏差。
图13提供了在用5.5μM MG1322处理之前和之后的基于阻抗的曲线图。还示出了处理后0小时、处理后20小时和处理后40小时拍摄的图像。顶部图像各自在明场照明下拍摄，并且底部图像在荧光下拍摄，其中有膜联蛋白V染色(红色)、活化半胱天冬酶3(绿色)和核定位BFP(蓝色荧光蛋白)。箭头表示在其外小叶中含有磷脂酰丝氨酸的大膜泡。
图14A至图14D提供了使用蓝色细胞核的数量(图14A)、％汇合度(图14B)、绿色(半胱天冬酶3活化的)细胞的数量(图14C)和红色(膜联蛋白V结合的)细胞的数量(图14D)示出基于图像地连续跟踪A549蓝色细胞中的MG132诱导的细胞凋亡的图。误差条表示一式三份运行的样品的标准偏差。
图15是示出比较用50μM MG132处理的细胞的不同细胞凋亡现象的相对速率与相对丰度的图。误差条表示一式三份运行的样品的标准偏差。
图16提供了示出使用剂量响应曲线计算EC50的表和图。使用实时阻抗(如由归一化的细胞指数表示的)数据(图11A)和活细胞成像(绿色细胞数量、红色细胞数量和蓝色细胞核数量)数据(图14A至图14C)，计算曲线下方的面积，并且在此处绘制为MG132浓度的函数。将数据拟合到四参数逻辑方程以确定EC50。
具体实施方式
本文所述的系统和方法使得能够从非常不同的视角(即，从实时的电子监测和活细胞成像)连续地并且在同一孔中监测细胞健康和行为。所述系统的流线型工作流程、高重现性和定量动力学使得其对于广泛的基于细胞的测定是理想的，包括但不限于细胞健康监测、增殖、细胞毒性、细胞凋亡、免疫细胞杀伤、细胞受体活化、细胞分化(包括干细胞分化)。
所述系统和方法的连续特性具有两个主要优点。与仅提供过程快照的终点测定形成对比，实时跟踪确保了重要现象不会被遗漏。其次，技术方法的连续特性显著减少了运行测定所需的动手时间量。一旦细胞已经被接种并且添加了任何处理，就不需要进一步的参与。
所述系统和方法优选地用于评估生物样品或对细胞的作用。细胞可以是从任何物种分离的原代细胞，或者可以是细胞系中的细胞。细胞可以是基因工程化细胞。例如，这些包括来自经基因修改的生物体(诸如，来自“基因敲除”生物体)的细胞、或已经被工程化以过表达内源基因或转基因的细胞、或其正常基因表达已经被操纵(例如，通过使用反义分子或沉默RNA)的细胞、已经通过CRISPR和/或其他基因编辑技术修改的细胞、或已经被工程化以表达治疗性蛋白质的细胞(诸如，CHO细胞)。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文所提及的所有专利、申请、公开申请和其他出版物均通过引用以其全文并入本文。如果本节所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本节所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
如本文所用，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。
“电极”是具有高电导率(即，比周围材料的电导率高得多的电导率)的结构。
如本文所用，“电极结构”是指单个电极，特别是具有复杂结构(例如，螺旋电极结构)的电极，或电连接在一起的至少两个电极元件的集合。“电极结构”内的所有电极元件都是电连接的。
如本文所用，“电极元件”是指电极结构的单个结构特征，诸如叉指式电极结构的指状突出部。
如本文所用，“电极阵列”或“电极结构单元”是两个或更多个电极结构，它们被构建为具有使得它们在连接到信号源时可以作为一个单元操作以在所述电极结构周围的空间区域中生成电场的尺寸和间隔。本发明的优选电极结构单元可以测量由于细胞附着到电极表面而引起的阻抗变化。电极结构单元的非限制性例子是叉指式电极结构单元和同心式电极结构单元。电极结构的另外例子还可以包括一对小的测量/记录电极(例如，具有在小至小于10微米的尺寸与大至100微米或数百微米的尺寸之间的直径的圆形微电极)和大得多的参考电极。形成微电极阵列的多个小的记录电极可以共享公共参考电极。通过放大和记录小的记录电极与大得多的参考电极之间的电压信号，这种记录电极可以用于进行细胞外记录。在细胞外记录实施方案中，使用细胞外记录系统(包括电压信号放大器和用于测量电压的其他电子硬件电路加上在软件和/或固件中实施的信号处理算法)而不是阻抗测量系统(例如，阻抗分析仪系统，包括测量电流和电压的电子硬件电路，以及软件和/或固件中的信号和数据处理算法)。
如本文所用，“电极总线”是电极连接单独的电极元件或子结构的一部分。电极总线提供从单独的电极元件或单独的电极子结构到另一电连接的公共传导路径。在本发明的设备中，电极总线可以接触电极结构的每个电极元件，并且提供到通向连接焊盘的电迹线的电连接路径。
如本文所用，“电极迹线”或“导电迹线”或“电迹线”是从电极或电极元件或电极结构朝向设备或装置的一端或边界延伸以用于将电极或电极元件或电极结构连接到阻抗分析仪的导电路径。设备的端部或边界可以对应于设备或装置上的连接焊盘。
如本文所用，“连接焊盘”是装置或设备(例如，多孔板)上的区域，其电连接到装置或设备上的至少一个电极结构内的至少一个电极或所有电极元件，并且其可以操作地连接到外部电路(例如，阻抗测量电路或信号源)。连接焊盘与阻抗测量电路或信号源之间的电连接可以是直接的或间接的，通过任何适当的导电装置，诸如引线或导线。这种导电装置还可以穿过位于装置或设备的其他区域上的电极或导电路径。
如本文所用，“叉指式”意指具有来自一个方向的与来自不同方向的突出部以交叉手的手指的方式交错的突出部(需要注意的是，叉指式电极元件优选地不彼此接触)。
如本文所用，“电极(或电极结构)具有基本上相同的表面积”意指所提及的电极的表面积彼此基本上没有差异，使得由于所提及的电极(或电极结构)中的任一个电极(或电极结构)上的细胞附着或生长而引起的阻抗变化将与由于所提及的电极(或电极结构)中的任何其他电极(或电极结构)上的细胞附着或生长而引起的阻抗变化以相同或相似的程度促成总体可检测的阻抗变化。换句话讲，在电极(或电极结构)具有基本上相同的表面积的情况下，所述电极中的任一个电极可在所述电极上的细胞附着或生长后促成总体的阻抗变化。在大多数情况下，具有“基本上相同的表面积”的最大电极与最小电极之间的表面积比率小于10。
如本文所用，“电极之间或之中的可检测阻抗变化”(或“电极结构之间或之中的可检测阻抗变化”)意指当分子结合反应发生在电极表面上时所述电极(或电极结构)之间或之中的阻抗将具有可由阻抗分析仪或阻抗测量电路检测到的显著变化。阻抗变化是指当细胞附着到电极表面上时和当细胞没有附着到电极表面上时的阻抗值差异，或者当附着到装置的包含电极的表面上的细胞的数量、类型、活性、粘附性或形态发生变化时的阻抗值差异。在大多数情况下，阻抗变化大于0.1％是可检测的。优选地，可检测阻抗变化大于1％、2％、5％或8％。更优选地，可检测阻抗变化大于10％。电极之间或之中的阻抗通常是用于测量所施加的电场的频率的函数。“电极之间或之中的可检测阻抗变化”不需要在所有频率下的阻抗变化都是可检测的。“电极之间或之中的可检测阻抗变化”仅要求在任何单个频率(或多个频率)下的可检测阻抗变化。另外，阻抗具有两个分量：电阻和电抗(电抗可以被分成两类：电容性电抗和电感性电抗)。“电极之间或之中的可检测阻抗变化”仅要求电阻和电抗中的任一者在任何单个频率或多个频率下具有可检测变化。在本公开中，阻抗是电学或电子阻抗。用于测量这种阻抗的方法通过以下实现：(1)以给定频率(或多个频率，或具有特定电压波形)在电极之间或之中施加电压，并且监测在所述频率(或多个频率，或具有特定波形)下通过所述电极的电流，将电压振幅值除以电流振幅值以导出阻抗值；(2)通过所述电极施加单个频率分量(或多个频率，或具有特定电流波形)的电流，并且监测在所述频率(或多个频率，或具有特定波形)下在所述电极之间或之中产生的电压，将电压振幅值除以电流振幅值以导出阻抗值；(3)可以测量或确定电阻抗的其他方法。需注意，在以上对“将电压振幅值除以电流振幅值以导出阻抗值”的描述中，“除法”是针对在相同频率下的电流振幅值和电压振幅值进行的。这种电阻抗的测量是不涉及任何试剂的使用的电子或电学过程。
如本文所用，“至少两个电极具有基本上不同的表面积”意指任何电极的表面积彼此不相似，使得由于在较大电极上的细胞附着或生长而引起的阻抗变化将不会与由于在较小电极上的细胞附着或生长而引起的阻抗变化以相同或相似的程度促成总体可检测的阻抗。优选地，由于在较大电极(通常称为“对电极”)上的细胞附着或生长而引起的任何阻抗变化显著小于由于在较小电极(通常称为“工作电极”或“测量电极”)上的细胞附着或生长而引起的阻抗变化。通常，最大电极与最小电极之间的表面积比率大于10。优选地，最大电极与最小电极之间的表面积比率大于20、30、40、50或100。“至少两个电极具有基本上不同的表面积”的例子包括由Giaver和Keese开发的“电子细胞基质阻抗感测(ECIS)”方法。
如本文所用，“以行列构型排列”意指就电连接而言电极、电极阵列或切换电路的位置由行位置编号和列位置编号两者来标识。
“细胞指数”或“CI”是可以从所测量的阻抗值导出并且可以用于反映阻抗值的变化的参数。有许多用于导出或计算细胞指数的方法。CI先前已详细解释，诸如在US 8,344,742；US 7,470,533；US 7,192,752；PCT/US03/22557和其他专利中。每一者均通过引用以其全文并入本文。通过将给定时间点的细胞指数除以参考时间点的细胞指数来计算所述时间点的“归一化细胞指数”。因此，归一化细胞指数在参考时间点为1。“归一化细胞指数”先前已详细解释，诸如在US 8,344,742；US 7,470,533；US 7,192,752；PCT/US03/22557和其他专利中。每一者均通过引用以其全文并入本文。通过从给定时间点的细胞指数中减去标准时间点的细胞指数来计算给定时间点的“增量细胞指数”。因此，增量细胞指数是细胞指数从初始时间(标准时间点)到测量时间的绝对变化。“增量细胞指数”先前已详细解释，诸如在US 8,344,742；US 7,470,533；US 7,192,752；PCT/US03/22557和其他专利中。每一者均通过引用以其全文并入本文。“细胞变化指数”或“CCI”是从细胞指数导出的参数，并且在一时间点的“CCI”等于细胞指数相对于时间的1阶导数除以在所述时间点处的细胞指数。“CCI”先前已详细解释，诸如在US 8,344,742；US 7,470,533；US 7,192,752；PCT/US03/22557和其他专利中。每一者均通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，“剂量响应曲线”意指细胞对测试化合物的剂量浓度的依赖性响应关系。细胞的响应可以通过许多不同的参数来测量。例如，猜想测试化合物具有细胞毒性并导致细胞死亡。然后，在用测试化合物处理细胞后，可以通过非活(或活)细胞的百分比来测量细胞的响应。将这种非活(或活)细胞的百分比作为测试化合物的剂量浓度的函数进行绘制构建了剂量响应曲线。在本申请中，非活(或活)细胞的百分比可以根据所测量的阻抗值、或根据从阻抗测量导出的细胞指数、或根据细胞变化指数来表示。例如，对于给定的细胞类型并且在特定的细胞生理条件(例如，特定的细胞培养基)下，细胞指数可以被示出为与从来自其中的阻抗测量中导出细胞指数的孔中的活细胞的数量具有线性相关性或正相关性。因此，在本申请中，可以将细胞指数作为测试化合物的剂量浓度的函数进行绘制以构建“剂量响应曲线”。需注意，一般来讲，细胞指数不仅与孔中的活细胞的数量相关，而且与细胞形态和细胞附着相关。因此，绘制细胞指数与剂量浓度的关系不仅提供了关于细胞数量的信息，而且提供了关于它们的生理状态(例如，细胞形态和细胞粘附)的信息。此外，本申请的系统和设备提供的重要优点是，在单个实验中，可以获得多个时间点的“剂量响应曲线”，因为所述系统允许对细胞进行连续监测，并且提供在短至数分钟至长达数天或数周的时间范围内的许多时间点处的阻抗测量。
如本文所用，“每个孔包含基本上相同数量的细胞”意指孔中的最低细胞数量为孔中的最高细胞数量的至少50％。优选地，孔中的最低细胞数量为孔中的最高细胞数量的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％。更优选地，每个孔含有相同数量的细胞。
如本文所用，“每个孔含有相同类型的细胞”意指为了预期目的，每个孔含有相同类型的细胞；每个孔不必含有完全相同类型的细胞。例如，如果预期目的是每个孔含有哺乳动物细胞，则允许每个孔含有相同类型的哺乳动物细胞(例如，人细胞)或不同的哺乳动物细胞(例如，人细胞以及其他非人哺乳动物细胞诸如小鼠、山羊或猴细胞等)。
“已知化合物”是至少一种活性是已知的化合物。在本发明中，已知化合物优选地是对细胞的一种或多种直接或间接作用是已知的化合物。优选地，已知化合物的结构是已知的，但不必是这种情况。优选地，已知化合物对细胞的作用机制是已知的，例如，作为非限制性例子，已知化合物对细胞的一种或多种作用可以是对细胞生存力、细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞形态、细胞周期、IgE介导的细胞活化或刺激、受体-配体结合、细胞数量、细胞质量、细胞循环等的作用。
“阻抗值”是在存在或不存在细胞的孔中测量的电极阻抗。阻抗通常是频率的函数，即阻抗值取决于进行测量的频率。对于本申请，阻抗值是指在单个频率或多个频率下测量的阻抗。此外，阻抗具有两个分量：一个电阻分量和一个电抗分量。本申请中的阻抗值是指电阻分量或电抗分量，或电阻分量和电抗分量两者。因此，当测量或监测“阻抗值”时，我们是指测量或监测电阻或电抗，或电阻和电抗两者。在本申请的方法的许多实施方案中，阻抗值还指代从原始的测量阻抗数据导出的参数值。例如，细胞指数、或归一化细胞指数、或增量细胞指数可用于表示阻抗值。
如本文所用，“液体(流体)样品”是指作为液体或流体(例如，生物流体)天然存在的样品。“液体样品”还指代以非液体状态(例如，固体或气体)天然存在但是被制备成含有固体或气体样品材料的液体、流体、溶液或悬浮液的样品。例如，液体样品可以包括含有生物组织的液体、流体、溶液或悬浮液。
如本文所用，“样品”是指可能含有待使用本申请中的装置、微孔板或方法分离、操纵、测量、定量、检测或分析的部分的任何物质。样品优选地是生物样品，诸如生物流体或生物组织。生物流体的例子包括细胞在培养基中的悬浮液，所述培养基诸如为细胞培养基、尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料中的一种结构材料的细胞(通常具有特定种类)连同与其胞间质的聚集体，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物组织的例子还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单独的细胞。生物样品还可以包括细胞悬浮液、含有生物分子(例如，蛋白质、酶、核酸、碳水化合物、与生物分子结合的化学分子)的溶液。
“测试化合物”是在任何测定中探索其对细胞的活性或直接或间接的一个或多个作用的任何化合物。测试化合物可以是任何化合物，包括但不限于小分子、大分子、分子复合物、有机分子、无机分子、生物分子诸如但不限于脂质、类固醇、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、肽、蛋白质、核酸或这些的任何组合。测试化合物可以是合成化合物、天然存在的化合物、天然存在的化合物的衍生物等。测试化合物的结构可以是已知的或未知的。
作为介绍，从图1A开始，被配置用于实时地以电子或光学的方式连续监测样品的示例性系统10被示出与装载有软件和用户接口200的计算机处理器100通信。通过从单个测定收集和分析不同且清晰的信息流，系统10提供了用于研究细胞活性的多个有利点。这种复用测定的信息丰富性不仅在于其报告的参数的数量，而且在于其提供的视角的清晰度/独特性。本文所述的系统10使得能够从非常不同的实时细胞阻抗和活细胞成像视角同时地并且在同一孔中监测细胞健康和行为。
转到图1B，系统10优选地尺寸被设计为用于放置在用于调节细胞的温度、CO2和湿度条件的可商购获得的细胞培养箱中。也就是说，系统10的尺寸被设计为适于放置在细胞培养箱中，使得培养箱而不是系统10调节细胞培养条件，诸如温度、CO2和湿度。尽管尺寸设计可以根据用户的需要而变化，但是图1A和图1B所示的系统10具有约430mm×445mm×410mm的占有面积。
主壳体12的顶部具体表现为具有五个托架14的平台，其中三个托架14A被配置用于以电子(例如，细胞基质阻抗)和光学的方式监测生物样品，并且两个托架14B用于以光学的方式监测生物样品而没有电子监测。虽然示出了总共五个托架14，但是本领域的普通技术人员将认识到，增加系统10的占有面积可以允许另外的托架14。另外，本领域的普通技术人员将认识到，可能具有比图1所示的那些更少的托架14(例如，4个、3个、2个托架14或单个托架14)，包括被配置用于对生物样品的电子和光学监测两者的相同或更少的“电子”托架14A(例如，3个、2个或1个托架14A)和/或被配置用于对生物样品的仅光学监测的相同或更少数量的“仅光学”托架14B(例如，2个或1个)。
如图2A至图2C更清楚地示出的，每个被配置用于电子监测的托架14A优选地具有铰接盖16，可以使用可移动接合手柄18将其锁定闭合。将盖16锁定闭合确保了电子板20(参照图4)与弹簧针22(参照图2B)之间的紧密贴合以用于电接合，所述电接合连接到阻抗分析仪或阻抗测量电路以用于监测系统10内的阻抗，并且最终与外部计算机处理器100(图1A)通信以用于电子监测。然而，如图2C所示，每个仅被配置用于光学成像的托架14B不需要在板与托架部件之间的电子接合，并且因此不需要用于将盖16锁定闭合的机制。在这两种情况下，铰接盖16的外侧可以标有与添加到托架14的板或容器的预期格式一致的标记24。
在托架内(优选地沿着盖16)的是被配置为照亮托架14的内部的照明模块26。如图3更好地示出的，在优选的实施方案中，照明模块26由发光二极管(LED)阵列组成，所述LED阵列自身由多个分立的LED 28形成，所述多个分立的LED经由电接触部30接收来自计算机处理器100(图1A)的指令。在一些实施方案中，可以诸如针对不同的多孔格式的板(例如，6孔、12孔、20孔、48孔、96孔、384孔)或其他培养容器通过螺钉互换LED阵列。优选地，每个二极管28被分配给96孔板的单个孔32(参照图4至图5)，并且因此被配置为独立地照亮对应的孔32以用于成像。通过在孔32的正上方提供二极管28，系统10清楚地照亮整个孔32以确保优质成像。在优选的实施方案中，照明模块26被配置用于明场照明，这意味着照明模块26发射白光。与常规光学显微镜一致，通过生物样品的白光量的差异提供了足够的对比以根据相机放大率识别细胞组分诸如细胞膜、细胞核和其他精细细节，并且因此可以用于细胞计数和/或细胞汇合度分析或确保细胞在电子监测之前正确地沉降在孔32的底部。成像可以通过用图像增强染料染色生物样品来进一步增强，所述图像增强染料改善在明场照明下对活细胞的对比或识别(例如，死细胞吸收锥虫蓝)以评估细胞毒性、细胞生存力和/或细胞增殖。
通过计算机处理器100来执行对照明的控制。为此，计算机处理器100可以响应于来自对生物样品的电子监测的结果而选择性地照亮一个或多个二极管28。例如，可以使用细胞基质阻抗监测来监测生物细胞以评估细胞生长，并且在达到指示建立的细胞单层或建立的细胞群体的设定值或参数后，计算机处理器100可以指示使用一个或多个LED28照亮一个或多个以电子的方式被监测的孔32以捕获细胞图像。此外，在实验性处理(诸如，施用测试化合物以评估其细胞毒性)期间，计算机处理器100可以选择性地指示在预定义时间点或响应于细胞基质阻抗监测的变化而照亮一个或多个LED 28以用于细胞成像以确认细胞群体减少。更进一步地，计算机处理器100可以使用来自照明模块26的一个或多个二极管28指示明场照明，以在进行电子监测(例如，细胞基质阻抗监测)的同时捕获图像。
回到图2B和图2C，通过生物样品的白光最终通过托架14的开口底部34离开所述托架。“开口”意指底部34不是完全不透明的。如将在随后的段落中更详细地讨论的，所述开口底部34暴露透明窗口(参照图5)，从而提供用于捕获图像的路径。在被配置用于细胞的电子监测的实施方案中，开槽的保护罩36可以横跨开口底部34以用于保护弹簧针22，尤其是在将多孔板22装载到托架14，14A中或从其中卸下所述多孔板期间。
为了完整起见，对适于电子监测的托架14的开发必须克服使用多孔板进行细胞的电子测量所固有的挑战。例如，在对生物样品的常规电子监测中，容器诸如适配有电极的多孔板需要其自身具有复杂的电极选择电路的插接站，所述复杂的电极选择电路用于与板的不同孔中的不同多组电极通信并向其切换测量。用于切换和选择测量电极的许多这种电路必须被移动以提供所需的开口，从而提供通过托架14的底部34的成像。例如，图2B演示了使用弹簧针22(120个被示出为与96孔电子板20通信)作为托架14的外周边的衬里部分。然而，使该电路移动或改变路线以形成所需的开口影响系统10的电特性。特别地，延长电导线以移动所需的电极切换电路远离弹簧针增加了系统的电阻，并且可能导致来自其他电学部件(诸如，图8的系统10中用于驱动线性运动台66和70的电路)的电子噪声的干扰，这将最终影响电子监测的分辨率和精度。这在优选的电极构型中尤其重要，其中用于跨所有孔切换和选择每一组电极的所有导线电阻必须相等或大约相等。另外，对细胞进行电子监测的另一个挑战是电极切换电路增加了系统10中的局部发热，这种发热先前在每个托架内在插接站下方被耗散。因此，将电极切换/选择电路和布线从其常规放置移动或重新配置也影响系统10的发热，这在开发这种系统10时提出了另外的挑战。因此，实现适合于在同一孔中对样品进行电子监测和光学成像两者的系统需要对系统10进行特殊的工程开发，使得电极切换和选择电路可以在系统10内重新定位，而不会导致过多的局部发热，并且不会影响电子监测的性能。
通过许多创新的工程设计步骤，电极切换和选择电路被布置在弹簧针22的附近。电极切换芯片的位置和取向被设计为使芯片之间的距离最大化，尽管可用于使局部发热最小化的空间较小。另外，印刷电路板(PCB板)被设计为在导电平面的不同层上具有适当的电迹线布局，以使弹簧针22与针对跨多孔板上的所有孔的每一组电极的电路切换芯片之间的电极电阻的变化最小化。另外，电信号导线/路线被设计为相对于PCB板上的电接地路线和电接地平面具有适当的关系，以使来自系统中的其他电路的电接口最小化。
现在，参考图2B和图2C，每个托架14可以包括力敏传感器38，当被按压时，所述力敏传感器发出信号通知接收到多孔板20和闭合盖16。在发出信号后，托架14准备好进行电子和/或光学监测。
转到图4至图5，优选地，电子板20的每个孔32具有一组电极42和在孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44。通过提供具有电极42的区域和没有电极42的透明区域，可以在单个孔32中进行至少两种清晰不同的测定。特别地，可以使用所述一组电极42进行电子监测(例如，细胞基质阻抗监测)，并且可以通过托架开口底部34(参照图2B、图2C)并通过透明窗口44聚焦光学成像模块46(图6)来执行光学成像。如图4所示，电子板20优选地为多孔板20，其可以被描述为具有被配置用于电连接或样品的电子监测的“多个孔”。技术人员将理解，除了这些“多个孔”之外，可以存在不具有电连接或不用于电子监测的一个或多个孔32。在这种情况下，缺乏电子监测能力的孔32可以用作对照孔或用作“仅光学成像”孔32。为此，电子监测孔32可以被描述为具有非导电衬底(例如，孔的底部)；由在所述衬底上制造的一组电极42限定的电极阵列；以及在所述衬底上没有电极42的透明观察窗口44。
电极42构型可以根据用户的需要或期望而变化，只要可以保留用于样品成像的透明窗口44即可。在一些实施方案中，电极阵列是与如Gaiver和Keese描述的电子细胞基质阻抗感测(ECIS)系统一致的微电极阵列(MEA)，其中单个大的参考电极与多个小的工作或测量电极配对。在ECIS中，在电极阵列上施加小的交流电。这导致了由ECIS仪器测量的电极两端的电势。当细胞被添加到ECIS阵列并附着到测量电极时，它们充当绝缘体，从而增加阻抗。随着细胞生长并覆盖测量电极，电流以与覆盖电极的细胞数量、细胞形态和细胞附着性质相关的方式受到阻碍。当细胞增殖或死亡时，阻抗改变。
先前已描述可替代的并且更优选的方法(例如，US 8,344,742；US 7,470,533；US7,192,752；和其他专利，所列专利中的每一者均通过引用全文并入本文)，其中每个电极阵列包括两个电极结构42A、42B，并且每个电极结构42A、42B包括电极元件42C，但是其中移除了最内部电极元件42C以形成透明窗口44(参照图5所示的示意图，分图A)。电极结构42A、42B电耦接到连接焊盘或接口，所述连接焊盘或接口位于衬底的边缘上并且因此被配置为电连接到托架14上的弹簧针22。整个阵列中的每个电极阵列具有近似均匀的电极电阻。与仅在工作或测量电极处(不在大面积参考电极处)监测细胞基质阻抗的显著变化的ECIS方法形成对比，任何叉指式电极上的细胞附着或生长以与覆盖电极的细胞数量、细胞形态和细胞附着性质相关的可检测方式阻碍电流。也就是说，在这种构型中，所有电极42都充当测量或工作电极。因此，电极阵列可以是两个或更多个电极结构42A、42B，它们被构建为具有使得它们在(诸如，通过计算机处理器100和托架14)连接到信号源时可以作为一个单元操作以在所述电极结构42A、42B周围的空间区域中生成电场的尺寸和间隔。
当电子监测是细胞基质阻抗监测时，电子电路经由托架14将所述一组电极42连接到计算机处理器100。优选地，在这种实施方案中，计算机处理器100与可以完全并入系统10内的阻抗测量电路或阻抗分析仪通信。阻抗分析仪可以包括测量电流和电压的电子硬件电路，以及在固件和/或软件中的信号和数据处理算法。当连接到阻抗分析仪时，系统100可以测量与细胞行为相关的阻抗值差异。例如，系统10可以测量当细胞附着到电极阵列时和当细胞没有附着到电极阵列时的阻抗值差异，或者可以检测当附着到电极42的细胞的数量、类型、活性、粘附性或形态发生变化时的阻抗值差异。特别地，细胞基质阻抗监测可以揭示关于基质上(包括电极42上)的细胞附着或粘附状态(例如，细胞扩散的程度、细胞的附着面积、细胞附着的紧密度、细胞形态)、细胞生长或增殖状态；孔中活细胞和/或死细胞的数量；细胞骨架变化和重组，以及经历细胞凋亡和/或细胞坏死的细胞的数量的信息。
在一些实施方案中，阻抗分析仪能够测量1Hz至1MHz的频率范围内在0.1欧姆与105欧姆之间的阻抗。更优选地，阻抗分析仪能够测量100Hz至100kHz的频率范围内在0.1欧姆与103欧姆之间的阻抗。阻抗分析仪还优选地能够测量阻抗的电阻分量和电抗分量(容抗和感抗)两者。
另外，系统10包括电子开关，其可以接通和断开到多组电极42中的每一组电极的连接以进行选择性监测。这些开关由优选地装载到计算机处理器100中的软件程序控制。所述软件程序引导电极阵列到阻抗分析仪的连接，并且监测来自电极42的细胞基质阻抗。在阻抗监测期间，阻抗分析仪可以在一个频率或多于一个频率下监测阻抗。最经常地，对于给定的测定，在多于一个时间点处执行阻抗监测。因此，所述系统可以将单独的阵列连接到阻抗分析仪，以在一个或多个时间点处监测一个、一些或所有阵列。此外，所述开关允许在每个期望的监测时间点处快速连续地监测所选择的单独阵列。每个监测时间点实际上是在执行阻抗监测的测定中的窄的测量时间范围(例如，从一毫秒到数分钟)。在一些实施方案中，所述软件是可编程的，以引导以选定的时间间隔对包括阵列的板20的任何孔32进行阻抗监测。
为了促进上述内容，系统10可以用于使用从对一个孔32中的阵列的细胞基质阻抗监测数字地切换到对另一孔32(无论是来自同一电子板20还是来自另一电子板20)中的阵列的细胞基质阻抗监测的电路来高效且同时地执行多个测定。在一些实施方案中，在软件控制下的所述系统能够在大约一秒或更短时间内在单个频率下完成对单独的孔32的阻抗测量。在其他的实施方案中，以毫秒分辨率监测细胞基质阻抗。用于以毫秒分辨率进行细胞基质阻抗监测的方法可见于US 10,533,985；US 10,012,636；US 9,709,548；和其他专利中。所列专利中的每一者均通过引用以其全文并入本文。因此，在一些实施方案中，以40ms内的间隔监测两次连续的阻抗测量。在一些实施方案中，以20ms内的间隔监测两次连续的阻抗测量。在一些实施方案中，以10ms内的间隔监测两次连续的阻抗测量。在一些实施方案中，以1ms内的间隔监测两次连续的阻抗测量。在一些实施方案中，以小于1ms内的间隔监测两次连续的阻抗测量。
虽然主要相对于细胞的细胞基质阻抗监测来描述所述系统，但是本领域普通技术人员将认识到，所述系统也可以适于进行细胞外记录。细胞外记录可以通过放大和记录小的记录电极与大得多的参考电极之间的电压信号来进行(需注意，这种小的记录电极和大的参考电极的使用与ECIS中使用的那些相似)。在细胞外记录实施方案中，使用细胞外记录系统(包括电压信号放大器和用于测量电压的其他电子硬件电路加上在软件和/或固件中实施的信号处理算法)而不是阻抗测量系统(例如，阻抗分析仪系统，包括测量电流和电压的电子硬件电路，以及软件和/或固件中的信号和数据处理算法)。
前进到图6至图7，示例性光学成像模块26能够从每个孔32捕获图像。在优选的实施方案中，光学成像模块26位于主壳体12内(参照图1B)并且在托架14下方。示例性光学成像模块26包括在一端的长工作距离物镜48和在相对一端的密封CMOS相机50。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获30张图像。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获40张图像。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获50张图像。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获60张图像。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获70张图像。在一些实施方案中，所述相机每秒捕获多于70张图像。这种高速捕获允许叠加在不同条件或滤光片下拍摄的图像。还示出了用于增强成像的镜筒透镜52A、52B和带通滤光片54。光学成像系统26从计算机处理器100接收指令并向其发送图像。因此，即使当托架14闭合时(参照图2A至图2B)，孔32的明场照明也允许光学成像系统26通过托架14的开口底部34捕获图像。
优选地，光学成像系统26还包括激发光源56，其被示出为一组LED，所述一组LED引导光通过聚焦透镜58或引导对孔32内的分子进行激发，诸如以诱导荧光以用于荧光成像。虽然LED对应于示出的黄色56A、紫外线56B和蓝色56C，但是激发可以包括在一种与七种光之间的任何数量。例如，激发光源56可以包括一种或多种光，所述一种或多种光包括紫外光、紫光、蓝光、绿光、黄光、橙光和红光。因此，系统10被配置为不仅捕获细胞的明场对比图像，而且捕获带荧光标签的标记，诸如带荧光标签的抗体、抗体片段或与细胞结合的其他分子。为此，通过向细胞样品中添加合适的荧光染料或带荧光标签的分子并通过成像模块捕获荧光，所述系统可以提供对细胞增殖、细胞死亡、细胞凋亡、效应子细胞杀伤、细胞间相互作用、细胞结合、DNA/RNA/蛋白质上调、DNA/RNA/蛋白质下调等不同阶段的成像。
作为光学成像系统56的一部分，激发光源56也由装载有软件的计算机处理器100控制。因此，计算机处理器100可以指示每个LED 56A、56B、56C的开/关切换，并且指示经由相机50的高速图像捕获。在对细胞进行光学监测的操作中，一次打开一个LED，并且对应颜色的荧光图像将由单色(黑白)CMOS相机50捕获。例如，黄色LED 56A、紫外线LED 56B和蓝色LED 56C将分别对应于红色、蓝色和红色荧光图像。所捕获的单色图像将被显示为具有伪彩色，以便表示对应的荧光颜色。此外，计算机处理器100可以根据成像确定活细胞的数量，以及确定参数诸如荧光的存在或不存在(+/-)、每个孔中或许多孔中细胞的总荧光强度、一个孔中或更多孔中细胞的平均荧光强度以及其他参数。此外，计算机处理器100可以叠加荧光图像(或单色或多色)和明场照明图像以用于综合分析。
共同转到图5、图6和图8，光学模块56安装到可移动支撑件60以用于跨不同窗口44的移动。通常，仅需要沿着X轴和Y轴的移动，因为透镜调节或计算机控制的聚焦可以考虑孔32之间的微小焦距差异。因此，可移动支撑件60使用X轴电机和同步带62、X轴线缆架64、X轴线性运动导向件66、Y轴线缆架68和Y轴线性运动导向件70在两个方向上移动。磁性线性编码器72帮助识别光学成像模块56的X、Y坐标。
如上文未提及的，监测系统10还可以存储和显示数据。数据可以被显示在屏幕200上、作为打印数据，或两者兼有。优选地，软件可以允许输入和显示实验参数，诸如描述性信息，包括细胞类型、化合物浓度、监测的时间间隔等。此外，数据可以叠加显示，诸如示出来自不同荧光通道(即，不同荧光颜色)的光学成像、明场照明和电子监测数据的组合。
优选地，所述软件还可以分析阻抗数据。在优选的实施方案中，所述软件可以计算一个或多个孔的一个或多个时间点的细胞指数(CI)。在一些优选的实施方案中，所述软件可以根据一个或多个孔的阻抗测量计算细胞变化指数(CCI)。所述软件可以优选地生成阻抗数据和阻抗值(诸如但不限于CI或CCI)相对于时间的曲线图。所述软件也可执行其他分析，诸如根据CI计算细胞数量、基于阻抗数据生成剂量响应曲线、基于阻抗值计算IC值、以及基于阻抗值和阻抗值曲线计算细胞生长或行为的动力学参数。阻抗监测系统的软件还可以存储和显示对数据的分析，诸如计算的阻抗值和从其导出的动力学参数。数据可以被显示在屏幕上、作为打印数据，或两者兼有。
同样，所述软件也可以用于分析所捕获的图像。优选地，所述软件可以根据图像执行细胞计数功能，并且可以绘制数据随时间的变化以用于统计分析。优选地，所述软件还可以存储和显示对数据的分析，诸如根据不同波长通道的荧光成像的计数、根据明场照明的计数、以及具有对应电子监测时间点的成对叠加的细胞成像结果。
例如，如果所捕获的图像是细胞的明场图像，则使用所述方法可以包括根据所述明场图像确定细胞汇合数量或参数或对细胞进行计数；或者如果所捕获的图像是细胞的荧光图像，则使用所述方法可以包括根据每种颜色的图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；或者如果所捕获的图像包括细胞的明场图像和细胞的荧光图像，则使用所述方法可以包括根据明场图像导出细胞汇合数量或参数以及任选地根据明场图像对细胞进行计数；根据所述荧光图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；以及任选地，针对所述孔中的一个或多个孔叠加所述明场图像和一种或多种颜色的荧光图像。
观察图11A至图12C(在下面的实施例中更详细地描述)，将细胞的电子监测与活细胞成像相结合的益处尤其明显。特别地，尽管细胞基质阻抗能够检测对A549蓝色细胞的快速的星形孢菌素介导的作用，但是单独使用阻抗不能解释引起这种变化的细胞现象。然而，活细胞成像揭示了大量细胞质收缩，立即表明了对大且快速的阻抗响应的机械解释。同样，阻抗已提供单独通过成像不能获得的洞察力。在一个这种例子中，MG132处理使细胞从电极脱离但保持存在于孔中(保持的细胞汇合度＞50％，(图14B)，其中汇合数量根据明场图像通过图像分析算法导出)，而细胞成像示出了存在于孔内的细胞，仅阻抗(阻抗信号降至零(图11A))揭示了细胞基质附着强度。除了具有两种独立测量技术的益处之外，重要的是注意了阻抗读出的客观性，其被直接报告，而没有来自用户的任何处理或输入。
共同回到图1至图8，现在更详细地描述对同一细胞群体的结合细胞基质阻抗监测和活细胞成像的非限制性用途。也就是说，公开了监测细胞的方法，所述方法包括以电子的方式监测多孔板20的孔32内的细胞，所述孔32中的每个孔具有一组电极42(优选地为一组细胞基质阻抗监测电极42)，和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44；以及通过所述窗口44从正在或已经被以电子的方式监测的至少一个孔32捕获图像。根据该监测，所述方法可以包括根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线(例如，CI曲线)；以及显示基于阻抗的曲线和对应的光学图像。图像可以从明场照明或从荧光激发(例如，附着于抗体、抗体片段或其他结合分子的荧光分子标记的激发)捕获。因此，数据可以提供定量动力学，揭示关于细胞健康、行为和细胞间相互作用的详细信息。
还公开了用于执行细胞增殖测定的方法。在这些测定中，所监测的阻抗的增加指示细胞数量增加，这可以通过对应的实时成像来确认。可以绘制阻抗测量或从阻抗测量导出的阻抗值与时间的关系以获得在多孔板20的孔32中生长的细胞的生长曲线，并且将其与从相同的孔32(特别是从明场照明和/或从与细胞增殖相关联的路径或标记的荧光成像)捕获的细胞成像一起呈现。
相关地，提供了生成至少一条细胞生长曲线的方法，所述方法包括：在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44；监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从同一孔32捕获光学图像；根据所监测的阻抗生成基于阻抗的曲线；以及显示所述基于阻抗的曲线和对应的光学图像。
一种或多种细胞类型的生长曲线与实时细胞成像相结合可以用于确定动力学参数。例如，可以比较不同原代癌细胞的增殖速率，或相同类型但不同等级的原代癌细胞的增殖速率。在另一个例子中，可以比较不同基因型个体的原代细胞。在另一个例子中，可以比较原代或细胞系干细胞的增殖速率。在又一个例子中，可以比较对照细胞和细胞系的经基因修改的细胞的生长曲线或参数。在又一个例子中，可以比较感染病毒的细胞和对照细胞的生长曲线或参数。此外，可以使用系统的成像特征来确认生长，诸如通过经由通过明场照明捕获的图像执行细胞计数或细胞汇合度计算，或者通过计数用荧光分子或带荧光标签的结合分子染色并在荧光成像下捕获的细胞。
系统10也可以用于研究一种或多种测试化合物对细胞的作用。示例性实施方案包括在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44；监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从同一孔32捕获光学图像；将测试化合物添加到所述孔32中的至少一个孔中；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述同一孔32捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示所述基于阻抗的曲线和来自对应孔的光学图像。可以通过比较化合物添加后的结果与化合物添加前的结果和/或通过向具有细胞的另一孔32提供溶媒对照并比较孔32之间的基于阻抗的曲线和/或图像来确定作用的变化。
还公开了比较化合物对两种或更多种细胞类型的作用的方法。示例性方法包括在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极44的透明窗口44，其中所述孔32中的至少一个孔接收一种细胞类型，并且至少另一个孔32接收不同的细胞类型；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的32中的每个孔捕获光学图像；向具有所述细胞类型中的每一种细胞类型的孔32中添加相同的测试化合物；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述具有细胞和测试化合物的孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示针对所述孔32中的每个孔的基于阻抗的曲线和对应的光学图像，以便相互比较。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
还公开了比较两种或更多种不同化合物对细胞的作用的方法。示例性方法包括在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44，其中所述孔32中的至少两个孔接收细胞；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向具有细胞的不同孔32添加不同的测试化合物；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述具有细胞和测试化合物的孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示针对所述孔32中的每个孔的基于阻抗的曲线和对应的光学图像，以便相互比较。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
相关地，还公开了执行测定以测试不同浓度的一种或多种测试化合物对细胞的作用的方法。这种剂量响应关系可以用于导出时间依赖性IC5、IC10、IC20、IC30、IC40、IC50、IC60、IC70、IC80、IC90或IC95，所有这些都可以从剂量响应曲线导出。通常IC50是最让人感兴趣的。确定化合物的时间依赖性IC50的范围提供了有关化合物对细胞的作用何时最大的信息。因此，示例性方法包括在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44，其中所述孔32中的至少两个孔接收细胞；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向具有细胞的不同孔32添加不同浓度的测试化合物；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述具有细胞和测试化合物的孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示针对所述孔32中的每个孔的基于阻抗的曲线和对应的光学图像，以便相互比较，诸如以比较它们的剂量响应曲线或剂量关系或比较从所述剂量响应曲线中的每条剂量响应曲线导出的IC50值。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
还公开了用于执行化合物的实时细胞毒性测定的方法。示例性实施方案包括在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向具有细胞的一个或多个孔32中添加细胞毒性化合物或猜想具有细胞毒性的化合物；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述具有细胞和所添加的化合物的孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示针对所述孔32中的每个孔的基于阻抗的曲线和对应的光学图像，以便相互比较。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
还公开了用于分析和比较第一化合物和第二化合物对细胞类型的时间依赖性细胞毒性作用的方法。示例性实施方案包括在多孔板20中随时间培养细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向具有细胞的一个或多个孔32中添加第一细胞毒性化合物或猜想具有细胞毒性的第一化合物并向具有细胞的另外一个或多个孔32添加第二细胞毒性化合物或猜想具有细胞毒性的第二化合物；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述具有细胞和所添加的化合物的孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示针对与所述第一化合物和所述第二化合物相关联的孔32的基于阻抗的曲线和对应的光学图像，以便相互比较。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。在一些实施方案中，针对第一化合物在多个剂量浓度下确定时间依赖性细胞毒性响应。在一些实施方案中，针对第二化合物在多个剂量浓度下确定时间依赖性细胞毒性响应。在一些实施方案中，针对第一化合物和第二化合物两者在多个剂量浓度下确定时间依赖性细胞毒性响应。
在一些实施方案中，第一化合物是其细胞毒性作用的机制是已知的化合物，并且第二化合物是其细胞毒性作用的机制是未知的化合物。如果来自第二化合物的时间依赖性细胞毒性响应与第一化合物的相似，则第二化合物的细胞毒性作用可遵循与第一化合物相似的机制。
可以使用各种方法来比较化合物的细胞毒性响应。细胞指数(或细胞数量指数)可以任选地使用获得的阻抗值来计算。在一些实施方案中，可导出化合物的时间依赖性IC50，并且通过基于细胞指数值比较它们的时间依赖性IC50曲线来进行它们的细胞毒性响应之间的比较。如果IC50曲线遵循相似的时间依赖性趋势，则两种化合物可以遵循诱导细胞毒性作用的相似机制。
在一些实施方案中，进行两种化合物的时间依赖性细胞毒性响应的直接比较，其中两种化合物的浓度可以相同或可以不同。时间依赖性细胞毒性响应之间的直接比较可通过分析所测量响应的变化斜率(其等效于响应相对于时间的一阶导数)并比较两种化合物的时间依赖性斜率来进行。在另一种方法中，可以分析时间依赖性细胞毒性响应相对于时间的高阶导数。比较这种高阶衍生物可以提供关于化合物诱导的细胞毒性的机制的另外信息。
在一些实施方案中，分析实时细胞毒性响应可以包括导出化合物对多种细胞类型的时间依赖性IC50值。在一些实施方案中，分析实时细胞毒性响应可以包括导出时间依赖性细胞毒性响应在给定化合物浓度下的变化斜率。在一些实施方案中，分析实时细胞毒性响应可以包括导出时间依赖性细胞毒性响应在给定化合物浓度下相对于时间的高阶导数。
还公开了用于评估所提出的抗癌治疗剂对癌细胞的作用的方法。示例性实施方案包括在多孔板20中随时间培养癌细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极的透明窗口44；向所述孔中添加一种或多种所提出的治疗剂；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向所述孔32中添加优选地来自获得所述癌细胞的同一受试者的效应子细胞；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示基于阻抗的曲线和来自所述孔32的对应的光学图像。在一些实施方案中，所述方法包括添加CAR-T细胞作为效应子细胞。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
还公开了用于评估工程化效应子细胞对癌细胞的细胞溶解的方法。示例性实施方案包括在多孔板20中随时间培养癌细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极42的透明窗口44；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向所述孔32中添加被工程化以显示猜想结合所述癌细胞的结合部分的效应子细胞(优选地来自获得所述癌细胞的同一受试者)；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示基于阻抗的曲线和来自所述孔32的对应的光学图像。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
还公开了用于通过双特异性衔接子评估癌细胞的细胞溶解的方法。示例性实施方案包括在多孔板20中随时间培养癌细胞，其中每个孔32包括一组电极42和在所述孔32的底表面上没有电极的透明窗口44；监测细胞基质阻抗并从所述具有细胞的孔32中的每个孔捕获光学图像；向所述孔32中添加优选地来自与所述癌细胞的同一患者的效应子细胞；添加被配置为将所述效应子细胞桥接到所述癌细胞的双特异性衔接子；继续监测细胞基质阻抗并通过所述窗口44从所述孔32中的每个孔捕获光学图像；根据所监测的阻抗随时间的变化生成基于阻抗的曲线；以及显示基于阻抗的曲线和来自所述孔32的对应的光学图像。如本领域已知的，也可以包括使用溶媒对照的孔32。
如将在随后的实施例中更详细地示出的，本文的系统和方法将实时阻抗监测的简单性、分析敏感性和客观性与活细胞成像的高度特异性读出相结合，以在无与伦比的信息丰富性下连续地跟踪细胞过程。
实施例I
对癌症靶细胞的免疫细胞介导的杀伤的实时监测
用表达红色荧光蛋白的慢病毒(eLenti Red，Cat#8711011)转染MCF7乳腺癌细胞，将其接种在E-Plate(ACEA BIOSCIENCES，圣地亚哥，加利福尼亚州)达25小时，然后用NK92细胞在不同效应子:靶标(E:T)比率下处理。
光学成像与阻抗监测同时执行。如图9A至图9B所示，效应子添加如由阻抗监测(图9A)和光学成像(图9B)所演示的E:T比率依赖性方式的癌细胞死亡。荧光对象计数(图9B)指示活的靶细胞的数量。
图9C至图9E是在2.5:1的E:T比率下的之前拍摄图像(图9C)至30小时拍摄的图像(图9D、图9E)，演示了靶细胞死亡随时间的变化。
实施例II
复用实时阻抗与活细胞成像以跟踪细胞杀伤
在含有10％热灭活FBS(Corning，目录号35016CV)的F-12K培养基(ATCC；目录号30-2004)中在37℃/5％CO2下进行细胞维持与测定。在每15分钟测量阻抗的同时，每小时采集一次图像。在每个孔中，针对每个通道(明场、红色、绿色和蓝色)捕获四个视野。暴露时间如下：红色(300ms)、绿色(300ms)和蓝色(80ms)。稳定表达核定位蓝色荧光蛋白(BFP)的A549蓝色细胞系通过用Agilent eLenti Blue(p/n 8711012)以感染复数1转导A549细胞(ATCC；目录号CCL-185)产生。从感染后第2天至第11天，在生长培养基中加入1μg/mL嘌呤霉素以选择转导子。为了对活化的半胱天冬酶3进行实时可视化，在生长培养基中以5μm的浓度加入Agilent eCaspase 3NucView 488(p/n 8711005)。为了对易位的磷脂酰丝氨酸进行实时可视化，在生长培养基中以0.25μg/mL加入Agilent eAnnexin V Red(p/n 8711007)。还使用Agilent E-Plate VIEW微孔板(p/n 00300601030)。将MG132(Tocris；目录号1748/5)和星形孢菌素(Calbiochem；目录号569396)储液溶解在DMSO中。
将A549蓝色细胞(如上所述)以10,000个细胞/孔的密度接种到E-PATE VIEW中。随着细胞在第一天内增殖，它们在生物传感器阵列上占据扩大的表面积，导致阻抗信号稳定上升(图11A和图11B)。如果不处理，细胞生长以汇合，使生物传感器阵列饱和并获得平稳的阻抗信号。在25小时的时间点添加蛋白酶体抑制剂MG132或泛激酶抑制剂星形孢菌素诱导了阻抗信号以时间和剂量依赖性方式的显著降低。这些药物诱导的响应的动力学和阻抗轨迹的整体形状对于每种化合物是不同的。这与跨越10年的大量文献一致，其已经证明阻抗响应对于每种类型的作用机制通常是唯一的。尽管MG132和星形孢菌素都诱导细胞凋亡，但是它们在细胞死亡过程中引发不同的细胞行为，这在实时阻抗与活细胞成像复用时变得非常清楚。
尽管A549蓝色细胞在26小时的时间点时已经覆盖了大部分孔底部，但是在没有药物的情况下，它们继续增殖达另外50小时，从而以更高的密度将细胞聚集在一起(图12A)。与此一致，阻抗信号在大约30小时达到平稳，而蓝色细胞核的总数量继续增加直到约80小时(图12A)。通过图像处理算法获得蓝色细胞核计数，以统计蓝色荧光图像中蓝色对象的数量。每个蓝色细胞核对应于A549细胞，因为它被转导以表达核定位蓝色荧光蛋白。因此，孔中的蓝色细胞核的数量对应于存在于孔中的活A549蓝色细胞的数量。当A549蓝色细胞用四种最高浓度的MG132(1.9、5.5、16.7和50μm)处理时，蓝色细胞核的总数量随时间以与阻抗下降密切相关的方式减少(图12B；仅示出了针对50μm处理的数据)。相反，用四种最高浓度的星形孢菌素(0.125、0.250、0.500和1μm)处理细胞在最初数分钟内导致阻抗陡然下落，但在随后的60小时内对蓝色细胞核的数量具有温和影响(图12C；仅示出了针对1μm处理的数据)。与其使细胞排出水的能力一致，在添加星形孢菌素后一小时，A549蓝色细胞已经严重收缩，以至于它们的细胞质几乎不可见，并且仅留有蓝色细胞核。尽管随着时间的推移，这些细胞核的尺寸收缩并开始聚簇在一起，但它们很大程度上保持完整，这解释了在图12C中蓝色细胞核的数量保持相当恒定的原因。与单独使用任一种技术可能提供的理解相比，阻抗与成像的上述结合清楚地提供了对药物介导的A549细胞杀伤的更完全和更细微的理解。除了简单的细胞计数之外，我们接着探究了对细胞凋亡杀伤路径特定的生化现象的动力学。
实施例III
从五个不同的视角同时跟踪MG132介导的细胞凋亡
连同阻抗和蓝色细胞核计数，MG132对细胞凋亡的诱导也通过细胞百分比汇合度、半胱天冬酶3活化(使细胞发绿色荧光)和磷脂酰丝氨酸易位(使细胞发红色荧光)来跟踪。如图13中所见，药物诱导的阻抗下降与这些细胞凋亡特定标记的时间累积密切相关。在针对20小时和40小时的时间点的分图中的粗体白色箭头突出了在其外小叶中含有磷脂酰丝氨酸的大膜泡。
接着，使用每个基于图像的读出绘制A549蓝色细胞对MG132的连续响应。蓝色细胞核计数(图14A)显示了对药物浓度的依赖性，其密切反映了图11A中所见的阻抗响应。尽管有广泛的细胞凋亡响应，但是在该测定的整个过程中，细胞百分比汇合度从未下降至50％以下(图14B)，其中细胞汇合数量根据明场图像通过图像处理算法导出。这与以下事实一致，即与凋亡细胞及其碎片通过吞噬作用被去除的体内情况不同，在体外，大部分凋亡细胞继续占据孔底部(图12B)。高浓度MG132使阻抗信号下降至零(图11A)而百分比汇合度从未下降至50％以下的事实指示剩余细胞不再附着于板底部。半胱天冬酶3阳性(荧光绿色)对象的数量(图14C)和膜联蛋白V阳性(荧光红色)对象的数量(图14D)随时间增加，并且显示了对MG132浓度的清楚依赖性。考虑到接种的细胞的数量、其生长速率和显示细胞凋亡标记的细胞的百分比(图13)，图14A至图14C中的输出数量与预期一致。为了比较不同细胞凋亡现象的相对速率和相对丰度，将阻抗响应与三个不同的基于图像的读出一起绘制(图15)。如所预期的，蓝色细胞核的数量开始减少的时间(添加MG132后约10小时)与半胱天冬酶3活化和磷脂酰丝氨酸易位变得可检测的时间相同。对于药物处理的前20小时，显示半胱天冬酶3和磷脂酰丝氨酸信号的细胞的数量是相似的，但是在随后的40小时内，半胱天冬酶3活化的细胞的数量超过磷脂酰丝氨酸易位的细胞的数量大约20％。
实施例IV
通过对细胞基质阻抗和光学成像的同时监测来量化药物功效
使用实施例II-IV中呈现的阻抗和基于图像的读出，计算了MG132的EC50。将跨越药物添加时间到药物添加后60小时的曲线下方的面积作为MG132浓度的函数进行绘制，得到图16中所见的剂量响应曲线。对于四个不同读出的拟合质量是相当好的，R2值在0.96至0.98的范围内。所计算的EC50值在0.86μm至3.0μm的范围内，这与文献中报道的值一致。参照Han,Y.H.等人的The Effect of MG132,a Proteasome Inhibitor on HeLa Cells inRelation to Cell Growth,Reactive Oxygen Species and GSH.Oncol.Rep.2009,22(1),215–21。

Claims (25)

1.一种用于以电子和光学的方式监测生物样品的系统，所述系统包括：
多孔板，所述多孔板具有被配置为接收多个生物样品的多个孔，所述孔中的每个孔包括一组电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；
照明模块，所述照明模块被配置为照亮所述孔；
托架，所述托架被配置为接收所述多孔板，所述托架在底部上具有开口，所述开口被配置为暴露所述孔的所述透明窗口；以及
光学成像模块，所述光学成像模块能够跨同一多孔板的不同孔移动以通过所暴露的窗口捕获图像。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物样品包括细胞，任选地包括癌细胞。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述照明模块包括被配置为独立地照亮所述孔中的一个或多个孔的多个灯。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述照明模块包括发光二极管(LED)阵列，每个LED被布置成照亮单个孔。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述照明模块是明场照明模块。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述托架进一步包括铰接盖，其中所述照明模块接合到所述盖。
7.根据权利要求1所述的系统，其中所述托架电接合所述多孔板以与所述多组电极进行电子通信，并且接合所述照明模块以传送照明指令。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学成像模块被配置为一次从单个孔捕获一个或多个图像。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学成像模块位于所述托架下方。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学成像系统进一步包括被配置为激发一个或多个分子的激发光源，所述激发光源任选地包括选自紫外光、紫光、蓝光、绿光、黄光、橙光和红光中的一种或多种光。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学成像模块包括相机。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学成像模块包括相机、带通滤光片、镜筒透镜和物镜。
13.根据权利要求1所述的系统，进一步包括计算机处理器，所述计算机处理器通信地耦接到：
所述托架，以用于选择性地操作所述多组电极中的每一组电极以用于以电子的方式监测一个或多个孔内的细胞基质阻抗；
所述照明模块，以用于选择性地照亮所述一个或多个孔；以及所述光学成像模块，以用于其选择性的移动以及
从所述一个或多个孔捕获并接收图像。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述计算机处理器被编程为响应于所述一个或多个孔达到或遵循来自所述电子监测的设定的基于阻抗的值或基于阻抗的参数而经由所述光学成像模块从所述一个或多个孔捕获图像。
15.根据权利要求13所述的系统，其中所述处理器被编程为以电子的方式监测细胞基质阻抗并以光学的方式监测同一孔，并且被配置为对阻抗和光学数据配对以供显示或分析。
16.根据权利要求1所述的系统，进一步包括：
两个另外的多孔板，每个多孔板具有被配置为接收多个样品的多个孔，所述孔中的每个孔包括一组电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；
两个另外的照明模块，所述两个另外的照明模块被配置为照亮所述两个另外的多孔板的所述孔；以及
两个另外的托架，所述两个另外的托架被配置为接收所述两个另外的多孔板，所述两个另外的托架各自具有开口底部，所述开口底部暴露所述孔的所述透明窗口；
其中所述光学成像模块能够跨所有孔移动以通过所有窗口捕获图像。
17.根据权利要求1所述的系统，进一步包括未被配置用于电子监测的细胞或组织培养容器，其中所述光学成像模块被配置为捕获所述细胞或组织培养容器内的图像。
18.一种监测细胞的方法，所述方法包括：
在连续监测之间以特定时间间隔在一时间段内连续地以电子的方式监测多孔板的孔内的细胞，所述孔中的每个孔包括一组细胞基质阻抗监测电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；以及
通过所述透明窗口从正被以电子的方式监测的至少一个孔捕获图像。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述图像在所述电子监测时间段内的一时间段内被定期或不定期地捕获，所述方法任选地包括在与执行所述细胞的电子测量的相同时间捕获所述图像。
20.根据权利要求18所述的方法，其中在所述从所述至少一个孔捕获图像的步骤之前，所述电子监测从所述至少一个孔输出满足设定值的结果，所述结果指示所述光学成像模块从所述至少一个孔捕获所述图像。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所捕获的图像包括所述细胞的明场图像，并且所述方法进一步包括根据所述明场图像确定细胞汇合数量或参数，以及任选地对细胞进行计数。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所捕获的图像包括所述细胞的荧光图像，所述方法进一步包括根据所述图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所捕获的图像包括所述细胞的明场图像和所述细胞的荧光图像，所述方法进一步包括：
根据所述明场图像导出细胞汇合数量或参数以及任选地根据所述明场图像对细胞进行计数；
根据所述荧光图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；以及任选地，
针对同一孔叠加所述明场图像和一种或多种颜色的荧光图像。
24.一种监测细胞的方法，所述方法包括：
在一时间段内以电子的方式监测多孔板的孔内的细胞，所述孔中的每个孔包括一组细胞基质阻抗监测电极和在所述孔的底表面上没有电极的透明窗口；以及
在用于电子监测的所述时间段内的一时间段内通过所述透明窗口从所述多孔板的至少一个孔捕获图像。
25.根据权利要求24所述的方法，其中：
所捕获的图像是所述细胞的明场图像，所述方法任选地包括根据所述明场图像对细胞进行计数或确定细胞汇合数量或参数；或者
所捕获的图像是所述细胞的荧光图像，所述方法任选地包括根据所述图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；或者
所捕获的图像包括所述细胞的明场图像和所述细胞的荧光图像，所述方法进一步包括：
根据所述明场图像对细胞进行计数，以及任选地根据所述明场图像导出细胞汇合数量或参数；
根据所述荧光图像确定荧光参数，所述荧光参数任选地选自总荧光计数、总荧光强度和平均荧光强度中的一种或多种；以及
任选地，针对所述孔中的一个或多个孔叠加所述明场图像和一种或多种颜色的荧光图像。
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