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CN115397435A - 编码人fus蛋白的核酸和在肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗中的用途 - Google Patents

编码人fus蛋白的核酸和在肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗中的用途 Download PDF

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CN115397435A
CN115397435A CN202180023734.XA CN202180023734A CN115397435A CN 115397435 A CN115397435 A CN 115397435A CN 202180023734 A CN202180023734 A CN 202180023734A CN 115397435 A CN115397435 A CN 115397435A
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CN
China
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seq
fus
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nucleic acid
human
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Application number
CN202180023734.XA
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卢克·杜普伊斯
伊玛库拉达·桑胡安·鲁伊斯
吉娜·皮奇亚雷利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Strasbourg
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Strasbourg
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种编码人FUS蛋白的核酸，所述编码人FUS蛋白的核酸包含与内含子6的序列SEQ ID NO 1具有至少69％序列同一性的序列和/或与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的序列，所述序列位于外显子7的任一侧上，本发明还涉及包含一种编码人FUS蛋白的所述核酸的重组载体，以及它们作为治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物的用途。本发明还涉及一种包含所述核酸和/或载体的药物组合物，用于预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。本发明能够应用于治疗、兽医和诊断医疗技术领域。

Description

编码人FUS蛋白的核酸和在肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的治疗 中的用途
技术领域
本发明涉及一种编码人FUS蛋白的核酸，所述编码人FUS蛋白的核酸包含与内含子6的序列SEQ ID NO 1具有至少69％序列同一性的序列和/或与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的序列，所述序列位于外显子7的任一侧上，本发明还涉及包含一种编码人FUS蛋白的所述核酸的重组载体，以及它们作为治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物的用途。本发明还涉及一种包含所述核酸和/或载体的宿主细胞。本发明还涉及一种包含所述核酸和/或载体的药物组合物，用于预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
本发明可应用于治疗、兽医和诊断医疗技术领域。
在以下描述中，方括号([])中的参考文献是指文本末尾处的参考文献列表。
背景技术
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，也称为运动神经元疾病(MND)或卢伽雷氏病(LouGehrig's disease)，牵涉脑干、脊髓和运动皮质中运动神经元的退化，其发作在60岁左右。运动神经元损失的后果包括肌无力和肌萎缩。根据发作部位，主要症状会影响上肢、下肢或面部和颈部的肌肉。换句话说，患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的人逐渐丧失其引发有效运动的能力，并且这以丧失呼吸能力告终，导致死亡。
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)中牵涉的原因和生物机制是未知的。然而，似乎这种疾病牵涉遗传和环境贡献。具体而言，ALS病例的子集是显性遗传的，证明了在这些所谓的家族性ALS病例(fALS)中的遗传贡献。fALS患者通常会更早发展出运动症状，并且预期寿命短于非家族性(所谓的散发性)患者。大多数受影响的人在约50-60岁时发展出他们的运动症状，但也存在40岁以下发作的病例。在欧洲，该疾病每年每100,000人中新影响约两个到三个人。
一旦受到影响，平均生存时间就为约2年至6年。迄今为止，没有治疗方法和/或任何手段用于治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的病因。目前只有两种治疗方法经监管机构批准。利鲁唑(Riluzole)在延长寿命中具有适度作用，但不会改善功能，而依达拉奉(edaravone)在一小个子集的患者中已经显示出中等保护活性。ALS患者还接受了许多治疗以管理症状的进展，所述治疗可以被认为是舒适护理。开发新的有效药物失败的原因可能依赖于这样的事实：ALS更确切地是病因和机制完全不同，但在终末期趋同于相似临床表现的多种疾病的集成。因此非常需要开发新的治疗策略，例如靶向病因机制的治疗策略。
因此，真实需要克服现有技术的不足、缺点和障碍的化合物和/或方法，特别是用于治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的化合物和/或方法。
发明内容
本发明允许通过提供编码人FUS蛋白的核酸来克服现有技术的缺点和不便，所述核酸包含：与内含子6的序列SEQ ID NO 1具有至少69％序列同一性的序列和/或与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的序列，和/或在序列SEQ ID NO 1或SEQ IDNO 2内的能够结合人FUS蛋白的至少一个保留RNA基序。
发明人已经令人惊讶且出乎意料地证明，根据本发明的核酸可用于治疗患有ALS的人。具体而言，发明人已经令人惊讶地证明，本发明的核酸允许治疗和治愈肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，尤其是受到与FUS基因中的突变有关的严重青少年形式的ALS影响的患者的肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
具体而言，发明人已经令人惊讶地证明，本发明能够同时地减少突变蛋白并充满正常、生理活性的野生型蛋白，同时避免野生型蛋白的过量毒性产生。
具体而言，已知FUS基因中的突变导致生理核突变的FUS蛋白的细胞质积聚。FUS的细胞质积聚是大多数ALS病例(Tyzack 2019)以及患有额颞叶痴呆的病例的一个大子集(Urwin 2010)中的广泛现象，但是与种系突变不相关。在具有种系突变的病例中，已经证明突变的毒性起因于细胞质FUS的积聚和核FUS的同时损失。实际上，细胞质FUS的毒性已经得到重复证明(例如Scekic-Zahirovic EMBO J 2016)，并且核FUS的损失导致许多对神经元和突触总体上具有毒性的转录异常。
发明人已经证明，对于FUS突变介导的ALS的有效治疗不仅应该矫正核功能的丧失，而且还应该防止细胞质积聚增加。FUS蛋白通过cDNA驱动的过表达系统的简单过表达原则上可以挽救功能丧失，但是预计不能避免来自突变等位基因的毒性细胞质FUS的积聚，并且最重要的是，已经证实对神经元具有高度毒性(Mitchell JC,2013“Overexpression ofhuman wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age-and dose-dependent fashion”Acta Neuropathologica第125卷，第273–288页(2013DOI:10.1007/s00401-012-1043-z[12])。
发明人已经令人惊讶地证明，编码人FUS基因的核酸，优选编码人FUS基因的全长核酸，能够协同地防止突变FUS的细胞质积聚，恢复细胞核中的FUS，没有任何毒性。具体而言，本发明不会引起与传统使用的过表达系统相反的任何毒性。
发明人已经令人惊讶地证明，提供核酸足以完全挽救携带同源Fus突变的小鼠的围产期致死率(图1)，并且挽救在杂合Fus突变小鼠中观察到的运动缺陷(图2)。令人惊讶地且有利地，挽救与细胞质FUS积聚的完全逆转相关，如通过核和细胞质级分的生物化学分级分离、免疫组织化学和免疫荧光所判断的那样(图3)。特别明显且令人惊讶的是，在经过治疗的转基因小鼠中没有观察到毒性，直到两岁由cDNA驱动的野生型FUS蛋白过表达本身具有高度毒性时为止(Mitchell JC,2013“Overexpression of human wild-type FUScauses progressive motor neuron degeneration in an age-and dose-dependentfashion”Acta Neuropathologica第125卷，第273–288页(2013DOI:10.1007/s00401-012-1043-z[12])。发明人证明，没有毒性是由于这样的事实：所提供的核酸包括基因组构建体，从而允许对FUS基因的自动调节并且避免不受控制的FUS水平的有害影响。
在本发明中，根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸可以包含与内含子6的序列SEQID NO 1具有至少69％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的核酸序列。所述核酸可以是例如序列SEQ IDNO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO.19的核酸。
在本发明中，当根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸包含与内含子6的序列SEQ IDNO 1具有至少69％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的核酸序列时，与内含子6的序列SEQ ID NO 1具有同一性的所述序列可以位于外显子7之前。
在本发明中，根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸可以包含与序列SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的核酸序列。所述核酸可以是例如序列SEQ ID NO5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 20的核酸序列。
在本发明中，当根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸包含与序列SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的核酸序列时，与序列SEQ ID NO 2具有同一性的所述序列可以位于外显子7之后。
在本发明中，根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸可以包含在序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2内的能够结合人FUS蛋白的至少一个保留RNA基序。有利地，该至少一个保留RNA基序可以位于外显子7之前或之后。如果存在一个以上的保留RNA基序，则至少一个保留RNA基序可以位于外显子7之前，并且至少一个保留RNA基序可以位于外显子7之后。基序可以是具有约180个核酸至约450个核酸的序列的核酸。基序可以是例如具有约198个至396个核酸的序列的核酸。例如，当基序处于内含子6的序列SEQ ID NO 1内时，该基序可以选自由以下项组成的组：序列SEQ ID NO 54和SEQ ID NO 55，或与所述序列具有至少90％同一性的序列，只要该序列保持结合人FUS蛋白的能力即可。当基序处于内含子7的序列SEQ ID NO2内时，该基序可以选自由以下项组成的组：序列SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO58和SEQ ID NO 59，或与所述序列具有至少90％同一性的序列，只要该序列保持结合人FUS蛋白的能力即可。本发明的核酸中的基序数目可以是1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10或更多。有利地，本发明的核酸中的基序数目介于1至6之间。
有利地，根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸除了FUS结合的RNA基序之外，还可以包含在外显子两侧上的一些序列，例如在内含子6开始处的99个核苷酸，和/或在内含子6末端的136个核苷酸，和/或在内含子7开始处的76个核苷酸，和/或在内含子7末端的125个核苷酸。不想受特定作用机制的束缚，这些序列可以是FUS的调控序列，这些调控序列对于其自动调节可能很重要。
在本发明中，根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸可以包含选自以下的至少一个序列：与内含子6的序列SEQ ID NO 1具有至少69％序列同一性的序列，与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的序列，和在序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2内的能够结合人FUS蛋白的至少一个保留RNA基序，所述至少一个序列位于外显子7的任一侧上。
在本发明中，根据本发明的编码人FUS蛋白的核酸可以包含与内含子6的序列SEQID NO 1具有至少69％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的序列和与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的序列，和在序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2内的能够结合人FUS蛋白的至少一个保留RNA基序，所述序列位于外显子7的任一侧上。所述核酸可以例如是编码序列SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ IDNO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ IDNO 42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ IDNO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52和SEQ ID NO 53的人FUS蛋白的核酸。
在本发明中，在编码人FUS蛋白的核酸中的核酸序列(例如序列SEQ ID NO 1和/或2)的定位可以指序列从5'到3'方向的位置。
在本发明中，编码人FUS的基因意指非突变的和/或野生型人类FUS基因。I序列SEQID NO 10位于染色体16上(基因ID：2521)。如本文所用，术语“野生型”是指当从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中最频繁观察到的并且因此任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式的基因或基因产物。
在本发明中，编码人FUS的突变基因意指与编码野生型形式相比携带具有任何变异的一级序列的人FUS蛋白的基因的任何形式。它可以是可以产生突变的人FUS蛋白，例如在蛋白的C端区域中具有突变的人蛋白FUS(例如与疾病相关)的任何突变。
除非上下文另外要求，否则在本说明书和权利要求书的全篇，词语“包含(comprise)”及其变型(例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)应以开放、包括性意义进行解释，即解释为“包括但不限于”。
“由……组成”意指包括且限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其他要素。
“基本上由……组成”意指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于公开内容中对于所列要素所指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，但是其他元件是任选的，并且根据它们是否影响所列要素的活性或作用而可以存在或者可以不存在。
在本发明中，如本文所用的术语“分离的”及其语法等同成分是指将核酸从其天然环境中取出。
在本发明中，如本文所用的术语“纯化的”及其语法等同成分是指无论是从自然界取出的(包括基因组DNA和mRNA)还是在实验室条件下合成的(包括cDNA)和/或扩增的，纯度都已经增加的分子或组合物，其中“纯度”是相对术语，而不是“绝对纯度”。然而，应理解，核酸和蛋白质可以用稀释剂或佐剂配制，并且仍然出于实际的目的可以进行分离。例如，当用于引入细胞中时，核酸可以与可接受的载剂或稀释剂混合。
在本发明中，如本文所用的术语“基本上纯化的”及其语法等同成分是指基本不含，即超过约50％不含、超过约70％不含、超过约90％不含该核酸、多肽、蛋白质或其他化合物天然缔合的多核苷酸、蛋白质、多肽和其他分子。
在本发明中，如本文所用的“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”或任何语法等同成分是指任何长度的核苷酸或核酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括例如通过甲基化和/或通过封端修饰的和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的或合成的核苷酸以及核苷酸类似物的分子。本文公开或考虑到的核酸序列和载体可通过例如转染、转化或转导引入细胞中。
在本发明中，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞内。它可以是本领域技术人员已知的任何转染和/或转化和/或转导适用方法。它可以是例如磷酸钙DNA共沉淀(参见例如Murray E.J.(编辑)，Methodsin Molecular Biology，第7卷，Gene Transfer and Expression Protocols,HumanaPress(1991)[1])；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990)[2])；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人，Mol.CellBiol.,7:2031-2034(1987))。感染性粒子在合适的包装细胞中生长后，可将噬菌体、病毒或非病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。在一些实施方案中，脂质转染、核转染或临时膜破坏(例如，电穿孔或变形)可以用于将一个或多个外源多核苷酸引入宿主细胞中。
在本发明中，如本文所用的“保留RNA基序”是指与人FUS基因呈现出相同序列并且能够结合在人FUS蛋白上的序列。
在本发明中，如本文所用的“多肽”、“肽”及其语法等同成分中是指氨基酸残基的聚合物。
在本发明中，“功能蛋白”是具有生物活性，并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白而言典型的糖基化或其他修饰的蛋白质。
本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可以包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。它可以是本领域技术人员已知的任何合成氨基酸，它可以是例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、a-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反-3-羟基脯氨酸和反-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、a-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、l,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、Ν',Ν'-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、a-氨基环戊烷羧酸、a-氨基环己烷羧酸、a-氨基环庚烷羧酸、a-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和a-叔丁基甘氨酸。
在本发明中，多肽和蛋白质可以包含本领域技术人员已知的任何翻译后修饰。它可以包含例如具有翻译后修饰的一个或多个氨基酸。一个或多个氨基酸的翻译后修饰可以是例如磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括N-连接的和O-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、吡咯烷酮羧酸的添加、二硫桥的形成、硫酸化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、香叶基化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化和碘化。
在本发明中，当核酸和/或核酸序列天然或人工源自某一核酸序列时，可以认为核酸和/或核酸序列“同源”。
在本发明中，当蛋白质和/或蛋白质序列天然或人工源自某一核酸序列时，蛋白质和/或蛋白质序列“同源”。例如，如本文所述的蛋白质可以通过本领域技术人员已知的任何可用的适用诱变方法来修饰。例如当表达时，诱变的核酸编码与原始核酸所编码的蛋白质同源的多肽。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于建立同源性的序列之间的同一性精确百分比因讨论的核酸和蛋白质而变化，它可以是例如至少25％的序列同一性百分比，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
序列同一性百分比可以通过本领域技术人员已知的任何方法测定。可以例如通过使用BLASTP和BLASTN，例如使用默认参数来测定。
在本发明中，同源分子中也可以称为同源物。
在本发明中，如本文所用的术语“同一”及其语法等同成分和/或在两个核酸序列或多肽的两个氨基酸序列的上下文中的“序列同一性”是指当进行比对以在至少20个连续核酸或氨基酸的序列长度上获得最大对应性时序列中相同的残基。它可以是例如当进行比对以在至少约50个、至少约200个连续核酸或氨基酸的序列长度上获得最大对应性时相同的两个序列。在将两个序列最佳比对之后，可以通过将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较来测定序列的同一性。
可以用本领域技术人员已知适用的任何方法和/或过程来进行一个序列与参考序列的同一性测定和/或比较。它可以是例如用于比较的序列比对方法，例如使用以下的序列比对方法：Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.,2:482(1981)[4]；使用Needleman和Wunsch的比对算法，J.Mol.Biol.,48:443(1970)[5]；使用Pearson和Lipman的相似性检索方法，Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.,85:2444(1988)[6]；使用这些算法的计算机化实现方式，例如Intelligences(Mountain View Calif)的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics软件包(Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.,Madison,Wis.,U.S.A.)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。比对常常也通过检查和手动比对来进行。
在本发明中，核酸可以通过本领域技术人员已知适用的任何方法产生和/或获得。例如，核酸可以是使用BigDyeTM终止子v3.1循环测序试剂盒(thermofisher，4337454)合成的。
本发明的另一个目的是一种包含编码人FUS蛋白的核酸的重组载体，所述核酸包含与内含子6的序列SEQ ID NO 1具有至少69％序列同一性的序列和/或与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的序列，和/或在序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2内的能够结合人FUS蛋白的至少一个保留RNA基序，如以上所解释的。
根据本发明，载体可以是本领域技术人员已知的适于核酸表达的任何载体。它可以是例如选自目录http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm[10]或http://www.qiagen.com/pendantview/qiagenes.aspx？gaw＝PROTQIAgenes0807&gkw＝mammalian+expression[11]，或其他http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php？type＝pCruzTM％20Expression％20Vectors[12]中列出的载体的任何载体。它可以例如是文件中WO 83/004261[13]描述的表达载体。载体可以是例如腺相关病毒(AAV)载体、质粒、酵母人工染色体(YAC)或细菌人工染色体(BAC)。
载体可以是本领域技术人员已知的任何适用的腺相关病毒(AAV)载体和/或是可商购适用的。它可以是例如以下文献中公开的任何适用AAV：Naso等人2017,“Adeno-Associated Virus(AAV)as a Vector for Gene Therapy”,BioDrugs.2017年8月；31(4):317-334.doi:10.1007/s40259-017-0234-5和/或Zincarelli 2008“Analysis of AAVSerotypes 1–9Mediated Gene Expression and Tropism in Mice After SystemicInjection”Mol Ther.2008年6月；16(6):1073-80.doi:10.1038/mt.2008.76.Epub 2008年4月15日。它可以是例如选自包括以下项的组的腺相关病毒(AAV)载体：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10(AAVrh.10)，优选AAV9。
载体可以是本领域技术人员已知的和/或可商购的任何适用质粒。它可以是例如选自包括以下项的组的质粒：pMX、pUC19、pHP45-CmR、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.3-TOPO、pcDNA3.4-TOPO、pFastBac1、pET100/D-TOPO、pET151/D-TOPO、pRSET A、pYes2.1V5-HisTOPO、pDONR221、pGEX-3X，优选pcDNA3.1(+)。
载体可以是本领域技术人员已知的任何适用的酵母人工染色体。它可以是例如选自包括pYAC-RC、pYAC3的组的酵母人工染色体。
载体可以是本领域技术人员已知的任何适用的细菌人工染色体。它可以是例如选自包括pUvBBAC、pCC1BAC、pBAC 108L的组的细菌人工染色体。
载体可以包含多核苷酸序列，例如表达盒，该多核苷酸序列按照5'至3'顺序包含以下：
启动子序列；
本发明的编码人FUS的核酸序列；和
聚腺苷酸化(polyA)序列。
启动子可以是本领域技术人员已知的任何启动子。它可以是例如管家基因的启动子、病毒基因的启动子、组织特异性启动子、靶向神经元的启动子、靶向肌肉的启动子。
它可以是例如选自包括以下项的组的管家基因的启动子：
它可以是例如选自包括CMV启动子的组的病毒基因的启动子。
它可以是例如组织特异性启动子，例如神经组织和/或神经细胞特异性启动子。它可以是例如选自包括NSE、Camk2a、Thy1、Fezf2、Crym启动子的组的启动子。它可以是例如组织特异性启动子，例如肌肉组织和/或肌肉细胞特异性启动子。它可以是例如选自包括myoD、myf5、MyoG、肌间线蛋白(Desmin)启动子的组的启动子。
载体还可包含编码标签蛋白的核酸序列。它可以是例如本领域技术人员已知的编码标签蛋白的任何核酸序列。例如，它可以是Parkinson J1,Blaxter M.“Expressedsequence tags:an overview.”Methods Mol Biol.2009；533:1-12.doi:10.1007/978-1-60327-136-3_1中公开的任何标签。
载体还可包括可选择性地标记转基因蛋白的附加序列，例如也称为标签，例如允许产生HA(序列：YPYDVPDYA SEQ ID NO 39)、myc(EQKLISEEDL SEQ ID NO 40)或FLAG(DYKDDDDK SEQ ID NO 41)标签的序列。
可以根据所选宿主细胞选择载体。考虑到其技术知识，本领域技术人员将根据宿主细胞调整载体。
宿主细胞可以是适于表达本发明的核酸或载体的任何宿主。例如，它可以是哺乳动物细胞、大肠杆菌(E.coli)、巴斯德毕赤酵母(Pischia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或昆虫细胞，例如昆虫细胞-杆状病毒系统，例如用于杆状病毒表达系统的SF9昆虫细胞。
本发明的另一个目的是用作治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物的核酸和/或重组载体和/或宿主细胞。
用作治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物的核酸可以是如上定义的本发明的任何核酸。
用作治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物的载体可以是如上定义的本发明的任何载体。
用作治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物的宿主细胞可以是如上定义的本发明的任何宿主细胞。
在本发明中，术语“治疗”是指防治和/或疗法，特别地其中所述目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，诸如肌肉病症的发展和/或进展和/或运动神经元的失活和/或破坏。有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病范围的缩小、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分还是完全)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指与如果不接受治疗的预期存活期和/或生活质量相比，延长存活期和/或增加生活质量。有利地，治疗可以包括以下中的任一种：运动神经元的改变(例如运动神经元的失活和/或降解)减少，肌肉强度的改善，肌肉大小的改善，行走、说话和/或呼吸能力的改变减少，肌束震颤和/或痛性痉挛减少和/或行走、说话、发热和/或呼吸能力改善，体重减轻，上部运动神经元症状(诸如强直、反射亢进、情绪不稳)减少。
“受试者”包括哺乳动物，例如人，包括需要治疗疾病或病症的哺乳动物，诸如已经被诊断患有疾病或病症或确定处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物。
本发明的另一个目的是包含本发明的核酸和/或载体和/或宿主细胞的药物组合物。
药物组合物中的核酸可以是如上定义的本发明的任何核酸。
药物组合物中的载体可以是如上定义的本发明的任何载体。
药物组合物中的宿主细胞可以是如上定义的本发明的任何宿主细胞。
药物组合物可以呈可以施用于人或动物的任何形式。
施用可以直接进行，即是纯的或基本上纯的，或在本发明的核酸和/或载体和/或宿主细胞与药学上可接受的载剂和/或培养基混合之后进行。根据本发明，药物组合物可以是糖浆或可注射溶液。根据本发明，药物组合物可以是用于口服施用的药物组合物，该药物组合物选自包括以下项的组：液体制剂、口服泡腾剂型、口服散剂、多颗粒系统、或口分散剂型。例如，当药物组合物用于口服施用时，其可呈选自包括以下项的组的液体制剂的形式：溶液、糖浆、悬浮液、乳液和口服滴剂。当药物组合物呈口服泡腾剂型的形式时，其可呈选自包括以下项的组的形式：片剂、颗粒剂和散剂。当药物组合物为口服散剂或多颗粒系统的形式时，其可呈选自包括以下项的组的形式：珠粒、颗粒剂、小片和微粒。当药物组合物为口分散剂型的形式时，其可呈选自包括以下项的组的形式：口分散片剂、冻干糯米纸囊剂、薄膜、咀嚼片、片剂和胶囊、医用口香糖。根据本发明，药物组合物可以用于颊和舌下途径，例如选自包括以下项的组：颊或舌下片剂、粘膜粘附制剂、锭剂或口粘膜滴剂和喷雾剂。根据本发明，药物组合物可以用于局部透皮施用，例如选自包括以下项的组：软膏剂、霜剂、凝胶、洗剂、贴剂和泡沫。
根据本发明，药物组合物可以用于鼻施用，例如选自包括以下项的组：鼻滴剂、鼻喷雾剂、鼻散剂。根据本发明，药物组合物可以用于直肠施用，例如栓剂或硬明胶胶囊。根据本发明，药物组合物可以用于肠胃外施用，例如皮下、肌内、静脉内施用。本领域技术人员清楚地理解，如本文所用的术语“形式”是指用于其实际使用的药物制剂。
药学上可接受的载剂可以是根据受试，用于向人或动物施用寡核苷酸/载体和或宿主细胞的任何已知药物载剂。例如，药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂包括但不限于任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。例如，该载剂可以选自如Krützfeldt J,Rajewsky N,Braich R,Rajeev KG,Tuschl T,Manoharan M,StoffelM.Nature.2005年12月1日；438(7068):685-9.Epub 2005年10月30日[7]中描述的组。
可以对于待治疗的人或动物选择药物组合物的形式。
在另一方面，本发明提供治疗患有肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，尤其是青少年肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的受试者的方法。该方法可以包括向所述受试者施用本发明的核酸和/或载体和/或宿主细胞的步骤。
本发明的核酸和/或载体和/或宿主细胞以及可用的制剂如上文所定义。施用可以通过使用技术人员已知的并且可用于施用核酸和/或载体和/或宿主细胞的任何制药方式来进行。上文提供了药物的可施用形式的实例。
对于本领域的技术人员而言在阅读以非限制性说明的方式给出的以下实例后，参考附图，其他特征和优点将进一步变得显而易见。
附图说明
图1A是育种策略的方案，在该方案中Fus+/+意指包含Fus基因的野生型拷贝的小鼠，FusΔNLS/+意指包含无核定位序列(ΔNLS)的Fus基因的拷贝和Fus基因的野生型拷贝的小鼠，hFUS意指表达人野生型FUS基因的拷贝的小鼠。图1B是表达或不表达人野生型FUS基因的拷贝的Fus+/+小鼠、FusΔNLS/+小鼠、FusΔNLS/ΔNLS小鼠的蛋白质印迹(Westernblot)的照片。在该照片中，ΔNLS显示ΔNLS蛋白的迁移线，wt显示野生型小鼠Fus蛋白的迁移线并且hFUS显示野生型人Fus蛋白的迁移线。图1C是表示不同小鼠基因型的KaplanMeier存活曲线的图解：Fus+/+小鼠、FusΔNLS/+和FusΔNLS/+；hFUS，纵坐标表示存活百分比而横坐标表示以天数计的时间。图1D是表示不同小鼠基因型的Kaplan Meier存活曲线的图解：Fus+/+小鼠、FusΔNLS/ΔNLS和FusΔNLS/ΔNLS；hFUS，纵坐标表示存活百分比而横坐标表示以天数计的时间。
图2表示包括曲线的图解，所述曲线表示在有或无hFUS转基因的Fus+/+和FusΔNLS/+小鼠的四肢导线倒置格栅试验中平均悬挂时间(秒)(图2A)和保持脉冲(N s)(图2B)的年龄依赖性变化。
图3表示对FUS蛋白的细胞定位的分析。图3A表示在1月龄时在有(hFUS)或无hFUS(无Tg)转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS(Δ/Δ)小鼠的皮质中的FUS蛋白质亚细胞定位的免疫印迹分析的照片。使用靶向FUS(N-Ter FUS)的N端部分(N-Ter)、C端(C-Ter)NLS FUS(C-Ter FUS)、小鼠FUS或人FUS的不同抗体的代表性结果。SOD1和HDAC1分别用作细胞质和细胞核蛋白提取级分的负载对照。图3B表示直方图，所述直方图表示在有(hFUS)或无hFUS(无Tg)转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS(Δ/Δ)小鼠中的细胞质和细胞核级分中的N-ter FUS、C-ter FUS、小鼠FUS和人FUS蛋白质水平的定量，在图中通过ANOVA，接着通过Tukey检验，对比Fus+/+小鼠*意指p<0.05，***意指p<0.001，对比标明的小鼠基因型#意指p<0.05且###意指p<0.001。图3C表示在有(hFUS)或无hFUS(无Tg)转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS(Δ/Δ)小鼠中在22月龄时脊髓腹侧角中的美国免疫组织化学分析的照片。图3D表示使用抗FUS和抗ChAT抗体在22月龄的小鼠的脊髓腹侧角中的运动神经元标志物ChAT和FUS(N端部分)的双重免疫染色的照片。
图4表示细胞质不对称脱甲基化(ADMA)FUS的积聚分析及细胞质和细胞核级分中ADMA-FUS蛋白质水平的定量。图4A表示在1月龄时使用识别不对称精氨酸二甲基化FUS(ADMA-FUS)的抗体对有或无hFUS转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠皮质的细胞质和细胞核级分上的不对称精氨酸二甲基化FUS的免疫印迹分析的照片，抗HDAC1抗体用作细胞核级分的负载对照且抗SOD1抗体用作细胞核级分或细胞质级分的负载对照。图4B表示对应于有或无hFUS转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠的细胞质和细胞核级分中的ADMA-FUS蛋白质水平的定量的直方图。在图中，通过ANOVA分析，接着通过Tukey检验，**意指对比Fus+/+，p<0.01；#意指对比标明的基因型，p<0.05。图4C表示在有或无hFUS转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠的脊髓腹侧角中运动神经元标志物ChAT(红色)和/或ADMA-FUS(C，绿色)的免疫染色的照片。图4C表示在有或无hFUS转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠的脊髓腹侧角中运动神经元标志物ChAT(红色)和/或泛素(D，→)的免疫染色的照片。
图5表示直方图，所述直方图表示用RT-qPCR测定的脊髓中的基因表达。图5A是表示在1月龄时脊髓中的内源性小鼠Fus mRNA(左)、人FUS转基因(中)和外显子7缺失的内源性Fus mRNA(右)的表达结果的直方图。图5B是表示在22月龄时脊髓中的内源性小鼠FusmRNA(左)、人FUS转基因(中)和外显子7缺失的内源性Fus mRNA(右)的表达结果的直方图。
图6表示包括曲线的图解，所述曲线表示在有或无hFUS转基因的Fus+/+、FusΔNLS/+小鼠及具有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠的四肢导线倒置格栅试验中平均悬挂时间(秒)(图6A)和保持脉冲(N s)(图6B)的年龄依赖性变化。
图7表示直方图，所述直方图表示用RT-qPCR测定的额皮质中的基因表达。图7A是表示在1月龄时脊髓中的内源性小鼠Fus mRNA(左)、人FUS转基因(中)和外显子7缺失的内源性Fus mRNA(右)的表达结果的直方图。图7B是表示在22月龄时脊髓中的内源性小鼠FusmRNA(左)、人FUS转基因(中)和外显子7缺失的内源性Fus mRNA(右)的表达结果的直方图。
图8表示对应于在1月龄或22月龄的具有hFUS的FusΔNLS/+小鼠中的脊髓(图8A)或额皮质(图8B)中，与缺失外显子7的内源性Fus mRNA水平相比，人FUS转基因的表达水平(纵坐标)的图解。
图9是质粒载体pMX的示意图。
图10显示内含子6或内含子7的插入允许转染的HEK293细胞中的FUS自动调节。A：使用的DNA构建体：Myc外显子是编码N端有Myc表位标签的不间断的人FUS ORF(外显子1至15：E1-15)的表达质粒；HA-i6是编码N端有HA表位标签且被介于外显子6(外显子1至6：E1-6)与外显子7(外显子7至15：E7-15)之间的人内含子6间断的人FUS ORF的表达质粒；HA-i7是编码N端有HA表位标签且被介于外显子7(外显子1至7：E1-7)与外显子8(外显子8至15：E8-15)之间的人内含子7间断的人FUS ORF的表达质粒。B：用空质粒或Myc-外显子、HA-i6和HA-i7构建体转染并且在转染后24小时收获的HEK293细胞。FUS蛋白(@FUS)、HA表位(@HA)和Myc表位(@Myc)的代表性免疫印迹。蛋白质负载显示为对应蛋白质印迹的总蛋白质染色，以展示相等的负载。第一孔显示分子量标记。所有三种转基因蛋白均以高水平表达。虽然Myc外显子转染的细胞中总FUS蛋白水平增加，但是在HA-i6和HA-i7构建体转染后，FUS水平没有变化。
图11显示在转染48小时后HA-i7诱导内源性FUS内含子6保留。A：用Myc-外显子或HA-i7载体转染24小时或48小时的HEK293细胞中保留内含子6的内源性Fus mRNA。B：用Myc-外显子、HA-i6载体转染24小时或48小时的HEK 293细胞中保留内含子6的内源性Fus mRNA。
图12显示在转染24小时和48小时后，在HEK293细胞中对于FUS而言替代性HA质粒构建体以预期分子量翻译。A：使用的DNA构建体：HA-1、2和7是编码N端有HA表位标签并且被介于外显子6与外显子7之间的内含子6中的人RNA保留基序间断的不间断的人FUS ORF(外显子1至15：E1-15)的表达质粒。HA-3至6和HA-8是编码N端有HA表位标签并且被介于外显子7与外显子8之间的内含子7中的人RNA保留基序间断的不间断的人FUS ORF(外显子1至15：E1-15)的表达质粒。HA-9至12是编码N端有HA表位标签并且被内含子6和内含子7中的人RNA保留基序间断的不间断的人FUS ORF(外显子1至15：E1-15)的表达质粒。RNA保留基序基于Zhou等人(“ALS-associated FUS mutations result in compromised FUS alternativesplicing and autoregulation”。2013年10月，第9卷，第10期，e1003895)，显示了FUS内含子6-外显子7-内含子7区域中的CLIP标签的作图。B：HEK293细胞在用空的Myc-外显子和HA-1至12载体独立转染3次的24小时和48小时期间的HA蛋白质水平。
具体实施方式
等效方案
以下代表性实施例旨在帮助说明本发明并非旨在，也不应将其解释为限制本发明的范围。实际上，除了本文显示和描述的那些之外，本发明的各种修改及其许多其他实施方案对于本领域的技术人员从本文件的全部内容(包括以下实施例)以及参考本文引用的科学和专利文献将变得显而易见。应当进一步理解，那些引用的参考文献的内容通过引用并入本文，以帮助说明当前技术水平。
以下实施例含有重要的附加信息、范例和指导，可以适用于本发明在各种实施方案和其等效方案中的实践。
范例
本发明及其应用可以通过说明一些实施方案的实施例得以进一步说明，通过这些实施方案可以减少实践本发明产品和医疗用途。然而，应当理解，这些实施例不限制本发明。现在已知或进一步开发的本发明的变型被认为是落在本文所述的以及下文所要求保护的本发明的范围内。
实施例
实施例1：核酸和包含所述核酸的载体
如来自thermofisher scientific的GeneArt基因合成产物和服务中公开的那样，制备和获得核酸和重组载体。
使用的核酸是SEQ ID NO 1至20。制备核酸并且如有必要，该核酸包括限制位点Not1(GCGGCCGC)和Xba1(TCTAGA)的序列以与质粒连接。制备的核酸是5μg冻干质粒DNA。
使用的载体是质粒载体pMX，该质粒载体在图9中表示并且在Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning:powerful tools in functionalgenomics.Exp Hematol.2003年11月；31(11):1007-14.Kitamura T,Koshino Y,ShibataF,Oki T,Nakajima H,Nosaka T,Kumagai H.Retroviral vector designed forexpression cloning and efficient gene transfer中有描述。pMX载体带有5长末端重复序列(LTR)和源自MFG的延伸包装信号序列，随后是适合cDNA文库构建的多克隆位点(MSC)和MMLV的3LTR。
将10ng DNA在冰上与50μl感受态细胞(Invitrogen，18265-017)一起孵育30分钟。在水浴中在42℃下进行20秒的热休克。然后将试管置于冰上2分钟，然后在37℃下以225rpm与培养基一起孵育1小时。此后，在37℃下进行含抗生素的琼脂培养过夜。将单个菌落接种在含抗生素的液体培养物中，在37℃、225rpm下过夜，然后将质粒midi试剂盒使用制造商的推荐(Qiagen，12643)进行。
实施例2：用编码人FUS蛋白内含子6和/或序列内含子7的核酸对FUS-ALS的小鼠模 型进行体内处理
材料和方法
小鼠模型和基因分型
小鼠实验根据参考编号2016111716439395得到斯特拉斯堡大学当地伦理委员会(CREMEAS)的批准。
使用的载体是包含编码SEQ ID NO 10的人FUS的核酸序列的BAC。转基因小鼠如Scekic-Zahirovic等人2016[10]和Scekic-Zahirovic 2017[11]中所述那样生成，并且在查尔斯河动物设施中进行培育并安置在斯特拉斯堡大学医学院中，具有12/12小时的光/暗循环(在上午7:00照亮)，处于恒定条件(21±1℃；60％湿度)且不受限制地获得食物和水。
小鼠在21天断奶并通过尾部活检的PCR进行基因分型。使用以下引物序列对小鼠进行基因分型：
hTLS FUS-正向：GAATTCGTGGACCAGGAAGGTC(SEQ ID NO 21)
hTLS FUS-反向：CACGTGTGAACTCACCGGAGTCA(SEQ ID NO 22)
FUS-正向：GATTTGAAGTGGGTAGATAGTGCAGG(SEQ ID NO 23)
FUS-反向：CCT-TTC-CAC-ACT-TTA-GTT-TAG-TCA-CAG(SEQ ID NO24)
使缺乏PY-NLS的杂合Fus敲入小鼠与从完整的、能自动调节的人类基因表达人野生型FUS的小鼠杂交以获得以下基因型：Fus+/+、FusΔNLS/+、FusΔNLS/ΔNLS、Fus+/+:hFUS、FusΔNLS/+:hFUS、FusΔNLS/ΔNLS:hFUS。本研究中使用的所有小鼠的遗传背景是C57Bl6/J。
小鼠行为
存活率
在出生后的前几个小时内研究存活率，并且对死亡的新生小鼠进行基因分型。在21天对其他小鼠进行基因分型并且随后每周一次直至死亡或当它们达到以下终点时使用氯胺酮-甲苯噻嗪杀死：自残、重量减轻大于初始重量的10％以及当它们在侧卧后10秒内无法再次转身。
倒置格栅
如先前所述，运动性能表现较弱(Jelena Acta Neuropathol 2017[8])。线栅悬挂时间(或“悬挂时间”)被定义为小鼠从倒置格栅落下所花的时间量并且在视觉上用秒表测量。在5分钟期间重复该程序3次。保持脉冲对应于用小鼠重量和重力归一化的悬挂时间。
组织学技术
腹膜内注射100mg/kg氯胺酮盐酸盐和5mg/kg甲苯噻嗪麻醉小鼠，然后灌注PFA4％。在解剖之后，将脊髓包括在琼脂4％中，并用振动切片机制备40μm厚的连续切块。
过氧化物酶免疫组织化学分析
对于过氧化物酶免疫组织化学分析，将内源性过氧化物酶用H2O2 3％灭活10分钟，然后将载玻片用PBS洗涤1次并且在室温下用兔抗FUS抗体(ProteinTech，11570-1-AP，1:100)孵育过夜。在PBS中冲洗后，将抗兔生物素化(Jackson，711-067-003，1/500)在室温下孵育2小时。在1小时期间使用ABC试剂盒(Vectastain ABC试剂盒，PK-6100，VectorLaboratories Inc.)进行染色。用磷酸盐缓冲液盐水(PBS)洗涤3次后，将载玻片在水中冲洗并固定在DPX(Sigma，O6522)中。
免疫荧光
将切片在封闭溶液中(8％山羊血清、0.3％牛血清白蛋白、0.3％Triton、PBS-0.02％硫柳汞)在室温(即25℃)下孵育过夜，然后在4℃下一抗：兔抗FUS抗体(ProteinTech，11570-1-AP，1:100)、山羊抗ChAT(Milliport，AB144P，1/50)、大鼠抗ADMA(自制，德国，1/100)或兔抗Ubi(Abcam，ab179434，1/100)。在PBS中3次冲洗后，将切片在室温(即25℃)下与Hoechst(Sigma，B2261，1/50.000)和二抗：Alexa-488缀合的抗兔二抗(Jackson，711-547-003，1/500)或Alexa-594缀合的抗山羊二抗(Molecular Probes，A11058，1/500)一起孵育2小时。最后，将切片随后用PBS(3x10分钟)洗涤并固定在DPX(Sigma，O6522)中。
电子显微镜检查
腹膜内注射100mg/kg氯胺酮盐酸盐和5mg/kg甲苯噻嗪麻醉小鼠，并且经心脏灌注戊二醛(2.5％在pH 7.4的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中)。解剖脑部并浸入相同固定剂(即戊二醛)中过夜，即12小时。在二甲胂酸盐缓冲液(EMS，11650)中冲洗3次后，在室温下将肌肉在二甲胂酸盐缓冲液中的0.5％锇和0.8％亚铁氰化钾中后固定1小时。最后，将组织在分级乙醇系列中脱水(25％、50％、70％、95％、100％)，并且包埋在Embed 812(EMS，13940)中。用超微切片机(Leica，EM UC7)切割超薄切片(50nm)，用乙酸铀酰(1％(w/v)于50％乙醇中)对其进行复染并且用Hitachi 7500透射电子显微镜(Hitachi High TechnologiesCorporation,Tokyo,Japan)进行观察，该显微镜配备有AMT Hamamatsu数字照相机(Hamamatsu Photonics,Hamamatsu City,Japan)。
组织分级分离和蛋白质印迹
将组织在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤1次并在Syn-PER突触蛋白提取液(ThermoScientific，87793)中根据制造商的说明裂解。蛋白质提取物通过BCA测定法(Interchim，UP95424A,UP95425A)进行计量。此后，将蛋白质变性并且在标准TGX无染剂凝胶4-20％(Biorad，5678094)上以10μg蛋白质(对于细胞质蛋白而言)和30μg蛋白质(用于核蛋白而言)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS page)。使用半干Transblot Turbo系统(BioRad,France)将蛋白质印迹在硝酸纤维素膜上并在1小时内用10％脱脂乳封闭。一抗(兔抗hFUS(自制，#14080，1/2000)、兔抗mFUS(自制，#14082，1/4000)、大鼠抗FUS ADMA(自制，德国，1/500)、兔抗FUS293(Bethyl，A-300-293A，1/2000)、兔抗FUS 294(Bethyl，A300-294A，1/2000)、绵羊抗SOD1(Calbiochem，574597，1/1000)、兔抗HDAC1(Bethyl，A300-713A，1/1000)在4℃下在3％脱脂乳中孵育过夜(即12小时)。用洗涤缓冲液(Tris pH 7.4 1M，NaCl 5M，吐温20 100％)进行洗涤并将二抗(抗兔HRP(PARIS，BI2407，1/5000)、抗绵羊HRP(Jackson，713-035-147，1/5000)在室温(即25℃)下孵育1小时30分钟。在连续洗涤，即3次洗涤之后(其中用PBS洗涤1次)，使用ECL Lumina Forte(Millipore,France)和化学发光检测器(Bio-Rad,France)用化学发光法使蛋白质可视化。以无染剂凝胶容量(Biorad，5678094)检测总蛋白并用于归一化。
使用的抗体是以下的：
-兔抗hFUS(自制，#14080，1/2000)，
-兔抗mFUS(自制，#14082，1/4000)
-大鼠抗FUS ADMA(自制，德国，1/500)
-兔抗FUS 293(Bethyl，A-300-293A，1/2000)
-兔抗FUS 294(Bethyl，A300-294A，1/2000)
-山羊抗SOD1(Calbiochem，574597，1/1000)
-兔抗HDAC1(Bethyl，A300-713A，1/1000)
-抗兔HRP(PARIS，BI2407，1/5000)
-抗山羊HRP(Jackson，713-035-147，1/5000)
RNA提取和RT-qPCR
在100μl的
Figure BDA0003860342170000161
试剂(生命技术公司(Life Technologies)中使用组织裂解剂(Qiagen)，从脊髓和额皮质中提取总RNA。
用iScriptTM逆转录法使用制造商条件(Biorad，1708841)逆转录1μg RNA。使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)进行定量聚合酶链反应，并且使用制造商条件用Bio-Rad软件进行定量。通过使用肌动蛋白、TBP和pol2基因根据GeNorm软件(Vandesompe等人2002)计算归一化因子对基因表达进行归一化。
引物序列如下：
肌动蛋白：F-CCACCAGTTCGCCATGGAT(SEQ ID NO 25),
R-GGCTTTGCACATGCCGGAG(SEQ ID NO 26)
TBP:F-CCAATGACTCCTATGACCCCTA(SEQ ID NO 27),
R-CAGCCAAGATTCACGGTAGAT(SEQ ID NO 28)
Pol2:F-GCTGGGAGACATAGACCA(SEQ ID NO 29),
R-TTACTCCCCTGCATGGTCTC(SEQ ID NO 30)
hFUS:F-GCCAGAACACAGGCTATGGA(SEQ ID NO 31),
R-CGATTGGGAGCTCTGGCTAC(SEQ ID NO 32)
T-FUS:F-TTATGGACAGACCCAAAAACACA(SEQ ID NO 33)
R-TGCTGCCCATAAGAAGATTG(SEQ ID NO 34)
FUSΔNLS:F-GCAAGATGGACTCCTAGTGTTAAT(SEQ ID NO 35),
R-ACCTCTACAAATGTGGTATGGC(SEQ ID NO 36)
Fus_外显子6-8:F-CGGCATGGGGTCCTCGG(SEQ ID NO 37),
R-CCTAGGCCTTGCACGAAGAT(SEQ ID NO 38)
统计
分析的所有结果呈现为平均值±平均值的标准误差(SEM)，并且当p<0.05时，认为差异显著。显著性如下呈现：*p<0.05，**p<0.01，及***p<0.001。为了两组比较，将双尾非配对学生t检验与F检验组合使用，以确认组间方差没有显著不同。多于两组的比较使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey或Bonferroni多重比较事后检验进行。通过使用GrapPad Prism 6.0版分析数据。
结果
人野生型FUS转基因挽救纯合FusΔNLS小鼠的围产期致死率
最近已经生成并表征了表达来自BAC的野生型FUS的人野生型FUS转基因小鼠(hFUS小鼠)(Lopez-Erauskin J,Tadokoro T,Baughn MW等人ALS/FTD-Linked Mutationin FUS Suppresses Intra-axonal Protein Synthesis and Drives Disease WithoutNuclear Loss-of-Function of FUS.Neuron 2018；100(4):816-30e7[9])。这些小鼠表达略微增加的FUS水平，主要是人类来源，并且未显示出与并行生成和表征的人突变FUS转基因系相反的ALS相关表型(Lopez-Erauskin J,Tadokoro T,Baughn MW等人ALS/FTD-LinkedMutation in FUS Suppresses Intra-axonal Protein Synthesis and Drives DiseaseWithout Nuclear Loss-of-Function of FUS.Neuron 2018；100(4):816-30e7[9])。使hFUS小鼠与FusΔNLS小鼠杂交(Scekic-Zahirovic J,Sendscheid O,El Oussini H等人Toxic gain of function from mutant FUS protein is crucial to trigger cellautonomous motor neuron loss.EMBO J 2016；35(10):1077-97[10])，我们先前证实杂合形式的FusΔNLS小鼠会发展出轻度、迟发性运动神经元疾病(Scekic-Zahirovic J,Oussini HE,Mersmann S等人Motor neuron intrinsic and extrinsic mechanismscontribute to the pathogenesis of FUS-associated amyotrophic lateralsclerosis.Acta Neuropathol 2017；133(6):887-906[11])，而纯合FusΔNLS小鼠死于围产期(Scekic-Zahirovic J,Sendscheid O,El Oussini H等人Toxic gain of functionfrom mutant FUS protein is crucial to trigger cell autonomous motor neuronloss.EMBO J2016；35(10):1077-97[10])。在两个育种步骤之后，获得目标基因型，包括有或无hFUS转基因的杂合和纯合FusΔNLS小鼠(图1A)。值得注意的是，所有小鼠均处于C57Bl/6遗传背景，并且这里仅分析来自F2代的小鼠，从而避免遗传背景异质性的大部分可能混杂效应。如果发生在1月龄之前，则在1月龄或死亡时对小鼠进行基因分型。如图1中所示，物hFUS的D FusΔNLS/ΔNLS小鼠在出生后的前几个小时内死亡，并且我们在1月龄时未观察到具有这种基因型的小鼠(图1C)。对比地，人野生型FUS转基因的添加允许大多数纯合FusΔNLS小鼠存活至成年期(图1B、图1D)。观察到与野生型动物相比，所有FusΔNLS组的死亡率略微但非统计显著性增加(图1D)。
人野生型FUS转基因挽救杂合FusΔNLS小鼠的迟发性肌无力
使用的小鼠是表达Fus+/+、FusΔNLS/+和FusΔNLS/+的H FUS小鼠。使用小鼠的数目为每组N＝10-28。如图2所示，FusΔNLS/+小鼠发展出容易使用倒置格栅试验跟踪的轻度、迟发性肌无力。使用该试验，在2月龄后观察到FusΔNLS/+小鼠中的缺陷，并且该缺陷随年龄而稳定(图2A-图2B)。对比地，在该试验中具有人野生型FUS转基因的FusΔNLS/+小鼠与野生型同窝仔不可区分开来，这表明野生型FUS转基因足以挽救神经肌肉表型(图2A-图2B)。
人野生型FUS转基因挽救FusΔNLS小鼠中FUS蛋白的细胞质错误定位
研究了人野生型FUS转基因的表达对FusΔNLS小鼠中FUS的亚细胞定位的影响。所获得的结果呈现在图3中。如图3A和图3B所示，如使用蛋白质印迹所评估的，FusΔNLS/+小鼠的大脑皮质的细胞质级分展示出比相应野生型同窝仔级分更高水平的FUS。这在使用靶向FUSΔNLS蛋白中不存在的NLS序列的抗体时未观察到，表明这种增加与突变蛋白的错误定位有关。重要的是，如使用小鼠特异性FUS抗体鉴定的小鼠FUS在FusΔNLS/+小鼠的细胞质级分中增加，并且这通过人野生型FUS转基因进行归一化(图3A-图3B)。重要的是，核FUS水平在所有基因型中不变，无论存在FusΔNLS突变还是人野生型FUS转基因。在携带人FUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠中人FUS水平增加，可能补偿小鼠来源的核FUS的损失。为了进一步确认转基因的这种挽救作用，对22月龄的小鼠的脊髓切片进行免疫组织化学分析。如图3C所示，FusΔNLS/+神经元在FUS染色中显示出缺乏核富集，并且这完全受人野生型FUS转基因防止，无论是在FusΔNLS/+小鼠中还是在FusΔNLS/ΔNLS小鼠中。使用FUS和ChAT抗体明确鉴定运动神经元的双重免疫荧光发进一步证实人野生型FUS转基因挽救运动神经元中的FUS错误定位，如图3D所证明和显示的那样。
该结果清楚地证明，本发明的产物(例如核酸和/或载体)允许通过提供野生型蛋白FUS来同时且协同地补偿基因突变，以下调突变蛋白FUS的表达和产生，并调节野生型蛋白FUS的表达和产生。
人野生型FUS转基因挽救杂合FusΔNLS小鼠的ALS相关病理
为了进一步记录人野生型Fus转基因的保护作用，分析由有(hFUS)或无hFUS(无Tg)转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠以及有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS(Δ/Δ)小鼠发展的病理特点。使用小鼠的数目为每组N＝4-8。细胞质不对称脱甲基化(ADMA)FUS的积聚是FUS-ALS典型的，并且先前已在FusΔNLS/+小鼠中观察到。实际上，在具有野生型人FUS转基因的FusΔNLS/+小鼠中，FusΔNLS/+细胞质级分中的ADMA-FUS的大量增加很大程度上得以防止(图4A-图4B)。然而，在保留高水平的细胞质甲基化FUS的携带hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS小鼠中情况不是这样。一致地，虽然ADMA-FUS免疫反应性在FusΔNLS/+小鼠的运动神经元中是弥散的，但人野生型FUS转基因在FusΔNLS/+小鼠中产生更局部化的核周免疫反应性(图4C)。此外，人野生型FUS转基因还防止了在FusΔNLS/+运动神经元中观察到的点状泛素病理(图4D)。因此，人野生型FUS转基因能够挽救FusΔNLS/+小鼠中ALS-FUS病理的典型特点。
该结果清楚地证明，本发明的产物(例如核酸和/或载体)允许协同地消除突变FUS的细胞质积聚，产生野生型蛋白FUS，并且还调节野生型蛋白FUS的产生。另外该结果清楚地证明，本发明的产物(例如核酸和/或载体)允许减少突变FUS蛋白的mRNA的表达并恢复和校正FUS蛋白的功能。
人野生型FUS转基因逆转内源性Fus的过表达并激活外显子7跳跃
为了进一步记录人野生型FUS转基因的保护和/或治疗作用，分析有(hFUS)或无hFUS(无Tg)转基因的Fus+/+(+/+)和FusΔNLS/+(Δ/+)小鼠以及有hFUS转基因的FusΔNLS/ΔNLS(Δ/Δ)小鼠中内皮FUS基因的表达的调节。单只人野生型FUS转基因小鼠具有较低的内源性Fus基因表达15，而FusΔNLS/+小鼠在1月龄和22月龄时在脊髓(图5A-图5B)和额皮质(图7)中展示出Fus mRNA水平略微但显著的增加。这种内源性鼠类基因的过表达由人野生型FUS转基因完全校正。此外，人FUS转基因的表达伴随着没有外显子7(mRNA衰解底物)的Fus的异常剪接mRNA的水平强烈增加(图5A-图5B)。实际上，hFUS表达与内源性小鼠Fus mRNA中外显子7的缺失之间存在强相关性(补充图3)。因此，人野生型FUS转基因的添加导致通过自动调节环的激活而降低毒性蛋白质的表达，并且随后减轻细胞质错误定位的FUS表达的所有下游后果。
该实施例清楚地证明，本发明的产物(例如核酸和/或载体)允许治疗和治愈肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，并且尤其是青少年肌萎缩性缩侧硬化症(ALS)。具体而言，该实施例清除地证明，本发明允许同时减少毒性蛋白质(即突变FUS)的表达，产生人FUS蛋白的功能和同源蛋白，激活突变FUS的自动调节环，激活表达本发明的核酸的自动调节环，从而允许所述核酸的野生型表达，并消除突变FUS的细胞质和/或细胞核积聚/错误定位。因此该实施例清除地证明，令人惊讶且出乎意料地，本发明允许同时“取消”生物学缺陷以及恢复野生型生物机制。
实施例3：哺乳动物细胞中内含子6、内含子7或替代FUS DNA构建体的插入影响
内含子6或内含子7的插入允许转染的HEK293细胞中的FUS自动调节
内含子6或内含子7插入前体mRNA中FUS ORF中的内源性位置(对于内含子6而言介于外显子6与外显子7之间，并且对于内含子7而言介于外显子7与外显子8之间)。包括N端HA标签以允许对转基因蛋白(HA-i6和HA-i7)进行明确检测，并与作为阳性对照的带myc标签的FUS表达质粒(Myc外显子)进行比较(图10A)。
在转染后24小时，我们观察到对于HA-i6和HA-i7构建体，以FUS的预期分子量的HA免疫反应性蛋白的强烈表达(图10B)，显示内含子的插入不损害cDNA的剪接和正确翻译。最重要的是，虽然Myc-外显子表达导致FUS水平的明显上调，但是HA-i6和HA-i7转染的细胞在转染后24小时或48小时显示出正常的FUS水平(图10B)。因此，在FUS ORF中插入内含子6或内含子7避免了在不间断的cDNA表达时观察到的过表达，表明正取自动调节。
在转染48小时后HA-i6诱导内源性FUS内含子7保留
用Myc-外显子或HA-i6转染HEK293细胞，并且测量HA-i6构建体中不包括的内含子7的保留。如图11A所示，转染后24小时与Myc-外显子相比，内源性内含子7的保留在HA-i6转染的细胞中是相同的。然后在HA i6转染的细胞中在转染后48小时观察到内含子7保留水平的增加。类似地，我们观察到在用HA-i7转染的HEK293细胞中与Myc-外显子转染的细胞相比，在转染后48小时，内源性内含子6保留水平增加(图11B)。这些结果提供了HA-i6和HA-i7保证FUS的内源mRNA的自动调节的原理验证。
替代性FUS DNA构建体允许带HA标签的蛋白质翻译
基于HA-i6和HA-i7的修饰制备系列构建体。所有这些构建体允许在转染的HEK293细胞中，特别是对于构建体#9而言，HA免疫反应性条带在FUS的预期分子量下表达。因此，可以进行FUS基因的工程改造以允许构建体的缩短，同时维持FUS蛋白的自动调节和正确表达。
方法
细胞培养
HEK293细胞购自ATCC(
Figure BDA0003860342170000201
CRL-1573TM)。将细胞在含有10％胎牛血清(Fisherscientific，11531831)、1％青霉素-链霉素(Sigma，P4333)的杜尔贝科改良伊戈尔培养基中在37℃下并且在具有5％CO2的培养箱中培养。每两天更换培养基，并且在5-20代之间进行转染。
转染
在24孔板中培养C2C12直至80％融合。使用TransIT-X2(MIR6000，Myrus)根据制造商的说明，在分化培养基中用具有表达质粒和报告质粒进行转染。制备核酸并且如有必要，该核酸包括限制位点Not1(GCGGCCGC)和Xba1(TCTAGA)的序列以与质粒连接。用于转染的表达载体是：
-pCMV空质粒；
-表达无内含子的N端带myc标签的人FUS的pCMV-Myc-FUS；
-表达具有内含子6的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-i6；
-表达具有内含子7的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-i7；
-如SEQ ID NO:42所示，表达在内含子6中具有保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-1。构建如下：Not1-HA-外显子1-外显子2-外显子3-外显子4-外显子5-外显子6-基序1-外显子7-外显子8-外显子9-外显子10-外显子11-外显子12-外显子13-外显子14-外显子15-Xba1。内含子6的基序1的序列对应于SEQ ID NO 54；
-如SEQ ID NO:43所示，表达在内含子6中具有保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-2。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-基序2-E7-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-xba1。内含子6的基序2的序列对应于SEQ ID NO 55；
-如SEQ ID NO:44所示，表达在内含子7中具有保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-3。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-基序3-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-xba1。内含子7的基序3的序列对应于SEQ ID NO 56；
-如SEQ ID NO:45所示，表达在内含子7中具有保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-4。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-基序4-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-xba1。内含子7的基序4的序列对应于SEQ ID NO 57；
-如SEQ ID NO:46所示，表达在内含子7中具有保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-5。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-基序5-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-xba1。内含子7的基序5的序列对应于SEQ ID NO 58；
-如SEQ ID NO:47所示，表达在内含子7中具有保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-6。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-基序6-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1。内含子7的基序6的序列对应于SEQ ID NO 59；
-如SEQ ID NO 48所示，表达在内含子6中具有2个保留RNA基序且在内含子7中具有4个保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-7。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-基序1-基序2-E7-基序3-基序4-基序5-基序6-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1；
-如SEQ ID NO 49所示，(表达在内含子6中具有2个保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-8。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-基序1-基序2-E7-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1；
-如SEQ ID NO 50所示，表达在内含子7中具有4个保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-9。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-基序3-基序4-基序5-基序6-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1；
-如SEQ ID NO 51所示，表达在内含子6和内含子7中具有6个保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-10。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-基序1-基序2-E7-基序3-基序4-基序5-基序6-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1；
-如SEQ ID NO 52所示，表达在内含子6和内含子7中具有4个保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-11。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-基序3-基序4-E7-基序5-基序6-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1。
-如SEQ ID NO 53所示，表达在内含子6和内含子7中具有6个保留RNA基序的带HA标签的人FUS的pCMV-HA-12。构建如下：Not1-HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-基序3-基序4-基序1-E7-基序5-基序6-基序2-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15-Xba1。
转染24小时或48小时后，提取蛋白质和RNA。
蛋白质印迹
将细胞在PBS中洗涤1次并在Syn-PER突触蛋白提取液(Thermo Scientific，87793)中根据制造商的说明裂解。蛋白质提取物通过BCA测定法(Interchim，UP95424A,UP95425A)进行计量。此后，将蛋白质变性并且在标准TGX无染剂凝胶4-20％(Biorad，5678094)上以10μg蛋白质(对于细胞质蛋白而言)和30μg蛋白质(用于核蛋白而言)进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS page)。使用半干Transblot Turbo系统(BioRad,France)将蛋白质印迹在硝酸纤维素膜上并在1小时内用10％脱脂乳封闭。将一抗(兔抗FUS293(Bethyl，A-300-293A，1/2000)、兔抗HA(Cell signaling，3724S，1/1000)、小鼠抗MYC(Sigma，M4439，1/1000))在4℃下在3％脱脂乳中孵育过夜。用洗涤缓冲液(Tris pH 7.41M，NaCl 5M，吐温20 100％)进行洗涤并将二抗(抗兔HRP(PARIS，BI2407，1/5000)、抗小鼠HRP(Jackson，115-035-003，1/5000))在室温下孵育1小时30分钟。在连续洗涤之后，使用ECL Lumina Forte(Millipore,France)和化学发光检测器(Bio-Rad,France)用化学发光法使蛋白质可视化。以无染剂凝胶容量(Biorad，5678094)检测总蛋白并用于归一化。
抗体：
兔抗FUS 293(Bethyl，A-300-293A，1/2000)
兔抗HA(Cell signaling，3724S，1/1000)
小鼠抗MYC(Sigma，M4439，1/1000)
抗兔HRP(PARIS，BI2407，1/5000)
抗小鼠HRP(Jackson，115-035-003，1/5000)
RT-qPCR
使用
Figure BDA0003860342170000221
试剂(Life Technologies)从脊髓和额皮质中提取总RNA。用iScriptTM逆转录法(Biorad，1708841)逆转录1μg RNA。使用Sso Advanced Universal SYBRGreen Supermix(Bio-Rad)进行定量聚合酶链反应，并且用Bio-Rad软件进行定量。通过使用肌动蛋白、TBP和pol2基因根据GeNorm软件(Vandesompe等人2002)计算归一化因子对基因表达进行归一化。
引物序列如下：
人肌动蛋白B：F-GGGCATGGGTCAGAAGGATT(SEQ ID NO 60)，R-TCGATGGGGTACTTCAGGGT(SEQ ID NO 61)
人GAPDH：F-TTCACCACCATGGAGAAGGC(SEQ ID NO 62)，R-AGAGGGGGCAGAGATGATGA(SEQ ID NO 63)
人HPRT1：F-TTGCTTTCCTTGGTCAGGCA(SEQ ID NO 64)，R-ATCCAACACTTCGTGGGGTC(SEQ ID NO 65)
FUSi6e7：F-CCGTTGGAAGCTTCATGTCC(SEQ ID NO 66)，R-TATTGAAGCCACCACGGTCAC(SEQ ID NO 67)
FUSi7e8：F-CTGTGAGCACTTACTTGATATTTT(SEQ ID NO 68)，R-GTGATCCTTGGTCCCGA(SEQ ID NO 69)。
参考文献列表
1.Murray E.J.(ed.),Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transferand Expression Protocols,Humana Press(1991)
2.Johnston,Nature,346:776-777(1990)
3.Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987)
4.Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)
5.Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)
6.Pearson and Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.,85:2444(1988)
7.Krützfeldt J,Rajewsky N,Braich R,Rajeev KG,Tuschl T,Manoharan M,Stoffel M.Nature.2005Dec 1；438(7068):685-9.Epub 2005Oct 30
8.Jelena Acta Neuropathol 2017
9.Lopez-Erauskin J,Tadokoro T,Baughn MW,et al.ALS/FTD-Linked Mutationin FUS Suppresses Intra-axonal Protein Synthesis and Drives Disease WithoutNuclear Loss-of-Function of FUS.Neuron 2018；100(4):816-30e7
10.Scekic-Zahirovic J,Sendscheid O,El Oussini H,et al.Toxic gain offunction from mutant FUS protein is crucial to trigger cell autonomous motorneuron loss.EMBO J 2016；35(10):1077-97
11.Scekic-Zahirovic J,Oussini HE,Mersmann S,et al.Motor neuronintrinsic and extrinsic mechanisms contribute to the pathogenesis of FUS-associated amyotrophic lateral sclerosis.Acta Neuropathol 2017；133(6):887-906。
12.Mitchell JC,2013“Overexpression of human wild-type FUS causesprogressive motor neuron degeneration in an age-and dose-dependent fashion”Acta Neuropathologica volume 125,pages273–288(2013DOI:10.1007/s00401-012-1043-z。
13.Zhou et al.:“ALS-associated FUS mutations result in compromisedFUS alternative splicing and autoregulation.October 2013,Volume 9,Issue 10,e1003895。
序列表
<110> 斯特拉斯堡大学
国立健康与医学研究所
<120> 编码人FUS蛋白的核酸和在
肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的治疗中的用途
<130> BNT226367EP00
<160> 69
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1622
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子6
<400> 1
gtaggtgtct catgagccag ggagtatctt tggtggggag tgtggaggat tgcatgaatc 60
tccctgaagc cagtccctag tgcatggttt agtattcttg ttgtctaggg atctgtgagg 120
gctttgattt gggggcagtg actttctttt tacatcccca ttttattttt gtgagaactt 180
gggagcctga actcccatcc ataccactga atagagattt tgagtaatga tacttgtttc 240
caaaaaaaaa gaaaccatac atagatacgt atggattgga gtcattaata tcctaggcaa 300
gaaacatgga agtgaagact tctttctctg caagggaaac cgatgatccc actcctggga 360
aatagtaggg aaacttggta tgtgtattcc catgtgtcct ctagggagtt ggtaatggtt 420
aacctgactt cagcttccag gaattggcta ctcttcccgt tttctatagt catttgaatc 480
cacgagcttg atttgcacta atttgaccga cattgatttt gtgtgtgact tggtttatgg 540
ggccagctga ctgaagtaag cagacctttt gggcaaaaat atgctttgac agtggtctcc 600
cacctatttg ttccactgtc tgccttcccc tggttactta aaattcatca gcttgtccaa 660
ctggaccttc tttccttcct gctgaagttg atttgaagta aaaccttaga tttgatgtta 720
aaacagttgt caaatctgtt ggtaaataag atttgaagga ccctactctg tctcccttga 780
aaaaggggag gaatgtcagt gttactgttt ttggaaaaag tagattttta aaccgagttt 840
ggaaatggta agtatgcaga ggtgggtggg ggcaatctca aaaacgtgca aaaatgagga 900
aaacaaaaat gaggaaatgt gtgcgtgtgt ttaatgcaaa actttaaaaa gaaaaacaac 960
tgttatgtga ctgttaactt gctctgcatt ttatgtgcca caggtatgaa aggtgacatt 1020
gcaaaatact ccgctcttct cgcagtgtag aaggggtgac cccgggggtt gggggagatc 1080
aaaaacagct cagtagttag gacagagctt agctaagttt gtcttgcttt aaggggaagt 1140
tgcctttggt tttgactttt tatggaatgg ggttgggtct gcttgctgct ttcaaagcaa 1200
aaaccacaaa aatgtgttca aggctacccc agcctggtgt gaaatgtctt ctgggtaaat 1260
tggggtaggg tttttaaacc aactacttgg ttgtcaacca cttgcgacaa gaggaaaaaa 1320
aaacatctgc tccatcggaa gaacgaccaa ggaaaatggg ttattttttt tccagaggaa 1380
atagataacg taacctttta aagcaaaatc tttataaact gtgtctgaga aattgcacac 1440
gtgtgtgtga catgctcaaa ggtcagacaa ggggtggtca ggaagggatg tattttagta 1500
gccacttgta tctttttcca aaaacaccta cccatgtttg gggaatgtta aacaaaatca 1560
aaaaacaacc ttttgtagcc gttggaagct tcatgtcctt tcttctaact tgtcttctcc 1620
ag 1622
<210> 2
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7
<400> 2
gtaagtgaac agagtttcca aaattcccaa ctcccagcaa tgctttgtct gattgttcat 60
ttgcagatgt cttagcgtgt taatttaaat gtcaaaggtt ttgaggtgtc cagaaccacc 120
tccagaaagg ggtagggtag aatgccacct gttgcctggt gtgtgctaac ctggagcagg 180
taggggtaag actcaatagt catcttttac caaatgggtt tgccccaggt taataagagg 240
ggtctagtag gccttggact gggccgttgc cacacctggc acttagtgac catcatcatg 300
agaaactgga gagtgcgtgc tggaacacgt ggtgccatct tggctttagg atccttttga 360
tcgttgtgtc caaggcttgt gtgtgtgtga gtgtgtggga gacaactccg aatgtttaat 420
tctggaagag ggatgtaaca ttgccctgag gatggtgaag ttggtataca tttataaagt 480
acggaatggt gtcaatgaat gcaattctat gtatatggac ttaactgaga tgggcaaata 540
gaaactagct ctgggaagga acatgtgcac tacttcaaga aagattggaa gcatgtgtgg 600
ctcatgggaa ataaccaggt cttaaacagc acaaactgaa ttcgtggacc aggaaggtct 660
taaacagcac aaactgaatt catggaaaaa tgacaaattt gagaagtctc ccagtaagct 720
ggaacttttc tggtttggtt aacaaaaggt ttcttgattt gtttcaagat ttaaagccaa 780
aggtgtgggt tcatgactta ggtgtcattg cgtgtgggta caatatttat atatggcgaa 840
ttcagataaa cattggtcaa agatggtctc tggaaaaaca aaatagaggc tgcattacgg 900
aaataagatt tctggtctgt tccctgggac atgcttaaaa aatacaatag ctattatgta 960
tggtttttat tttcatgtgg tttcggggaa acaacacggt tttaaggatg gtttctaaag 1020
atgaaattaa aaattgttcc acaagggtta agtgtctggt ggtaaagttg ggagaaactg 1080
gatggatgca catcgcatgg ctggtggcga gcccatctct cttctctcgg gtgagagaac 1140
cgggccaagc tgagttggtt tgttcacttt aatgggtctc cgtttcccct gccacctgtg 1200
ctgaggacat ttcccagcct gagctggggg aggcagcatt tgctgaagtg tggagttgtc 1260
tctgtggaga ctcaagttac agatcttaag gggcctgcct agaattttct cctctgggca 1320
ggcgacccag gaaagggttt ggagtgaggc tgtgagcact tacttgatat tttacaagtt 1380
tggatttggt gttaattttt ttccttgtcc gttttttcct gttgactaac ggctcatctt 1440
ttccttgttt ttgttttttt tttgttcttt ttttccatgt cactaaag 1488
<210> 3
<211> 1325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子6Δ1
<400> 3
gtaggtgtct catgagccag ggagtatctt tggtggggag tgtggaggat tgcatgaatc 60
tccctgaagc cagtccctag tgcatggttt agtattcttg ttgtctaggg atctgtgagg 120
gctttgattt gggggcagtg actttctttt tacatcccca ttttattttt gtgagaactt 180
gggagcctga actcccatcc ataccactga atagagattt tgagtaatga tacttgtttc 240
caaaaaaaaa gaaaccatac atagatacgt atggattgga gtcattaata tcctaggcaa 300
gaaacatgga agtgaagact tctttctctg caagggaaac cgatgatccc actcctggga 360
aatagtaggg aaacttggta tgtgtattcc catgtgtgaa gtaaaacctt agatttgatg 420
ttaaaacagt tgtcaaatct gttggtaaat aagatttgaa ggaccctact ctgtctccct 480
tgaaaaaggg gaggaatgtc agtgttactg tttttggaaa aagtagattt ttaaaccgag 540
tttggaaatg gtaagtatgc agaggtgggt gggggcaatc tcaaaaacgt gcaaaaatga 600
ggaaaacaaa aatgaggaaa tgtgtgcgtg tgtttaatgc aaaactttaa aaagaaaaac 660
aactgttatg tgactgttaa cttgctctgc attttatgtg ccacaggtat gaaaggtgac 720
attgcaaaat actccgctct tctcgcagtg tagaaggggt gaccccgggg gttgggggag 780
atcaaaaaca gctcagtagt taggacagag cttagctaag tttgtcttgc tttaagggga 840
agttgccttt ggttttgact ttttatggaa tggggttggg tctgcttgct gctttcaaag 900
caaaaaccac aaaaatgtgt tcaaggctac cccagcctgg tgtgaaatgt cttctgggta 960
aattggggta gggtttttaa accaactact tggttgtcaa ccacttgcga caagaggaaa 1020
aaaaaacatc tgctccatcg gaagaacgac caaggaaaat gggttatttt ttttccagag 1080
gaaatagata acgtaacctt ttaaagcaaa atctttataa actgtgtctg agaaattgca 1140
cacgtgtgtg tgacatgctc aaaggtcaga caaggggtgg tcaggaaggg atgtatttta 1200
gtagccactt gtatcttttt ccaaaaacac ctacccatgt ttggggaatg ttaaacaaaa 1260
tcaaaaaaca accttttgta gccgttggaa gcttcatgtc ctttcttcta acttgtcttc 1320
tccag 1325
<210> 4
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子6Δ2
<400> 4
gtaggtgtct catgagccag ggagtatctt tggtggggag tgtggaggat tgcatgaatc 60
tccctgaagc cagtccctag tgcatggttt agtattcttg ttgtctaggg atctgtgagg 120
gctttgattt gggggcagtg actttctttt tacatcccca ttttattttt gtgagaactt 180
gggagcctga actcccatcc ataccactga atagagattt tgagtaatga tacttgtttc 240
caaaaaaaaa gaaaccatac atagatacgt atggattgga gtcattaata tcctaggcaa 300
gaaacatgga agtgaagact tctttctctg caagggaaac cgatgatccc actcctggga 360
aatagtaggg aaacttggta tgtgtattcc catgtgtcct ctagggagtt ggtaatggtt 420
aacctgactt cagcttccag gaattggcta ctcttcccgt tttctatagt catttgaatc 480
cacgagcttg atttgcacta atttgaccga cattgatttt gtgtgtgact tggtttatgg 540
ggccagctga ctgaagtaag cagacctttt gggcaaaaat atgctttgac agtggtctcc 600
cacctatttg ttccactgtc tgccttcccc tggttactta aaattcatca gcttgtccaa 660
ctggaccttc tttccttcct gctgaagttg atttgaagta aaaccttaga tttgatgtta 720
aaacagttgt caaatctgtt ggtaaataag atttgaagga ccctactctg tctcccttga 780
aaaaggggag gaatgtcagt gttactgttt ttggaaaaag tagattttta aaccgagttt 840
ggaaatggta agtatgcaga ggtgggtggg ggcaatctca aaaacgtgca aaaatgagga 900
aaacaaaaat gaggaaatgt gtgcgtgtgt ttaatgcaaa actttaaaaa gaaaaacaac 960
tgttatgtga ctgttaactt gctctgcatt ctttcaaagc aaaaaccaca aaaatgtgtt 1020
caaggctacc ccagcctggt gtgaaatgtc ttctgggtaa attggggtag ggtttttaaa 1080
ccaactactt ggttgtcaac cacttgcgac aagaggaaaa aaaaacatct gctccatcgg 1140
aagaacgacc aaggaaaatg ggttattttt tttccagagg aaatagataa cgtaaccttt 1200
taaagcaaaa tctttataaa ctgtgtctga gaaattgcac acgtgtgtgt gacatgctca 1260
aaggtcagac aaggggtggt caggaaggga tgtattttag tagccacttg tatctttttc 1320
caaaaacacc tacccatgtt tggggaatgt taaacaaaat caaaaaacaa ccttttgtag 1380
ccgttggaag cttcatgtcc tttcttctaa cttgtcttct ccag 1424
<210> 5
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7Δ3
<400> 5
gtaagtgaac agagtttcca aaattcccaa ctcccagcaa tgctttgtct gattgttcat 60
ttgcagatgt cttagcgtgt taatttaaat gtcaaaggtt ttgaggtgtc cagaaccacc 120
tccagaaagg ggtagggtag aatgccacct gttgcctggt gtgtgctaac ctggagcagg 180
taggggtaag actcaatagt catcttttac caaatgggtt tgcctggaag agggatgtaa 240
cattgccctg aggatggtga agttggtata catttataaa gtacggaatg gtgtcaatga 300
atgcaattct atgtatatgg acttaactga gatgggcaaa tagaaactag ctctgggaag 360
gaacatgtgc actacttcaa gaaagattgg aagcatgtgt ggctcatggg aaataaccag 420
gtcttaaaca gcacaaactg aattcgtgga ccaggaaggt cttaaacagc acaaactgaa 480
ttcatggaaa aatgacaaat ttgagaagtc tcccagtaag ctggaacttt tctggtttgg 540
ttaacaaaag gtttcttgat ttgtttcaag atttaaagcc aaaggtgtgg gttcatgact 600
taggtgtcat tgcgtgtggg tacaatattt atatatggcg aattcagata aacattggtc 660
aaagatggtc tctggaaaaa caaaatagag gctgcattac ggaaataaga tttctggtct 720
gttccctggg acatgcttaa aaaatacaat agctattatg tatggttttt attttcatgt 780
ggtttcgggg aaacaacacg gttttaagga tggtttctaa agatgaaatt aaaaattgtt 840
ccacaagggt taagtgtctg gtggtaaagt tgggagaaac tggatggatg cacatcgcat 900
ggctggtggc gagcccatct ctcttctctc gggtgagaga accgggccaa gctgagttgg 960
tttgttcact ttaatgggtc tccgtttccc ctgccacctg tgctgaggac atttcccagc 1020
ctgagctggg ggaggcagca tttgctgaag tgtggagttg tctctgtgga gactcaagtt 1080
acagatctta aggggcctgc ctagaatttt ctcctctggg caggcgaccc aggaaagggt 1140
ttggagtgag gctgtgagca cttacttgat attttacaag tttggatttg gtgttaattt 1200
ttttccttgt ccgttttttc ctgttgacta acggctcatc ttttccttgt ttttgttttt 1260
tttttgttct ttttttccat gtcactaaag 1290
<210> 6
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7Δ4
<400> 6
gtaagtgaac agagtttcca aaattcccaa ctcccagcaa tgctttgtct gattgttcat 60
ttgcagatgt cttagcgtgt taatttaaat gtcaaaggtt ttgaggtgtc cagaaccacc 120
tccagaaagg ggtagggtag aatgccacct gttgcctggt gtgtgctaac ctggagcagg 180
taggggtaag actcaatagt catcttttac caaatgggtt tgccccaggt taataagagg 240
ggtctagtag gccttggact gggccgttgc cacacctggc acttagtgac catcatcatg 300
agaaactgga gagtgcgtgc tggaacacgt ggtgccatct tggctttagg atccttttga 360
tcgttgtgtc caaggcttgt gtgtgtgtga gtgtgtggga gacaactccg aatgtttaat 420
tctggaagag ggatgtaaca ttgccctgag gatggtgaag ttggtataca tttataaagt 480
acggaatggt gtcaatgaat gcaattctat gtatatggac ttggaacttt tctggtttgg 540
ttaacaaaag gtttcttgat ttgtttcaag atttaaagcc aaaggtgtgg gttcatgact 600
taggtgtcat tgcgtgtggg tacaatattt atatatggcg aattcagata aacattggtc 660
aaagatggtc tctggaaaaa caaaatagag gctgcattac ggaaataaga tttctggtct 720
gttccctggg acatgcttaa aaaatacaat agctattatg tatggttttt attttcatgt 780
ggtttcgggg aaacaacacg gttttaagga tggtttctaa agatgaaatt aaaaattgtt 840
ccacaagggt taagtgtctg gtggtaaagt tgggagaaac tggatggatg cacatcgcat 900
ggctggtggc gagcccatct ctcttctctc gggtgagaga accgggccaa gctgagttgg 960
tttgttcact ttaatgggtc tccgtttccc ctgccacctg tgctgaggac atttcccagc 1020
ctgagctggg ggaggcagca tttgctgaag tgtggagttg tctctgtgga gactcaagtt 1080
acagatctta aggggcctgc ctagaatttt ctcctctggg caggcgaccc aggaaagggt 1140
ttggagtgag gctgtgagca cttacttgat attttacaag tttggatttg gtgttaattt 1200
ttttccttgt ccgttttttc ctgttgacta acggctcatc ttttccttgt ttttgttttt 1260
tttttgttct ttttttccat gtcactaaag 1290
<210> 7
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7Δ5
<400> 7
gtaagtgaac agagtttcca aaattcccaa ctcccagcaa tgctttgtct gattgttcat 60
ttgcagatgt cttagcgtgt taatttaaat gtcaaaggtt ttgaggtgtc cagaaccacc 120
tccagaaagg ggtagggtag aatgccacct gttgcctggt gtgtgctaac ctggagcagg 180
taggggtaag actcaatagt catcttttac caaatgggtt tgccccaggt taataagagg 240
ggtctagtag gccttggact gggccgttgc cacacctggc acttagtgac catcatcatg 300
agaaactgga gagtgcgtgc tggaacacgt ggtgccatct tggctttagg atccttttga 360
tcgttgtgtc caaggcttgt gtgtgtgtga gtgtgtggga gacaactccg aatgtttaat 420
tctggaagag ggatgtaaca ttgccctgag gatggtgaag ttggtataca tttataaagt 480
acggaatggt gtcaatgaat gcaattctat gtatatggac ttaactgaga tgggcaaata 540
gaaactagct ctgggaagga acatgtgcac tacttcaaga aagattggaa gcatgtgtgg 600
ctcatgggaa ataaccaggt cttaaacagc acaaactgaa ttcgtggacc aggaaggtct 660
taaacagcac aaactgaatt catggaaaaa tgacaaattt gagaagtctc ccagtaagct 720
ggaacttttc tggtttggtt aacaaaaggt ttcttgattt gtttcaagat ttaaagccaa 780
aggtgtgggt tcatgactta ggtgtcattg cgtgtgggaa agatgaaatt aaaaattgtt 840
ccacaagggt taagtgtctg gtggtaaagt tgggagaaac tggatggatg cacatcgcat 900
ggctggtggc gagcccatct ctcttctctc gggtgagaga accgggccaa gctgagttgg 960
tttgttcact ttaatgggtc tccgtttccc ctgccacctg tgctgaggac atttcccagc 1020
ctgagctggg ggaggcagca tttgctgaag tgtggagttg tctctgtgga gactcaagtt 1080
acagatctta aggggcctgc ctagaatttt ctcctctggg caggcgaccc aggaaagggt 1140
ttggagtgag gctgtgagca cttacttgat attttacaag tttggatttg gtgttaattt 1200
ttttccttgt ccgttttttc ctgttgacta acggctcatc ttttccttgt ttttgttttt 1260
tttttgttct ttttttccat gtcactaaag 1290
<210> 8
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7Δ6
<400> 8
gtaagtgaac agagtttcca aaattcccaa ctcccagcaa tgctttgtct gattgttcat 60
ttgcagatgt cttagcgtgt taatttaaat gtcaaaggtt ttgaggtgtc cagaaccacc 120
tccagaaagg ggtagggtag aatgccacct gttgcctggt gtgtgctaac ctggagcagg 180
taggggtaag actcaatagt catcttttac caaatgggtt tgccccaggt taataagagg 240
ggtctagtag gccttggact gggccgttgc cacacctggc acttagtgac catcatcatg 300
agaaactgga gagtgcgtgc tggaacacgt ggtgccatct tggctttagg atccttttga 360
tcgttgtgtc caaggcttgt gtgtgtgtga gtgtgtggga gacaactccg aatgtttaat 420
tctggaagag ggatgtaaca ttgccctgag gatggtgaag ttggtataca tttataaagt 480
acggaatggt gtcaatgaat gcaattctat gtatatggac ttaactgaga tgggcaaata 540
gaaactagct ctgggaagga acatgtgcac tacttcaaga aagattggaa gcatgtgtgg 600
ctcatgggaa ataaccaggt cttaaacagc acaaactgaa ttcgtggacc aggaaggtct 660
taaacagcac aaactgaatt catggaaaaa tgacaaattt gagaagtctc ccagtaagct 720
ggaacttttc tggtttggtt aacaaaaggt ttcttgattt gtttcaagat ttaaagccaa 780
aggtgtgggt tcatgactta ggtgtcattg cgtgtgggta caatatttat atatggcgaa 840
ttcagataaa cattggtcaa agatggtctc tggaaaaaca aaatagaggc tgcattacgg 900
aaataagatt tctggtctgt tccctgggac atgcttaaaa aatacaatag ctattatgta 960
tggtttttat tttcatgtgg tttcggggaa acaacacggt tttaaggatg gtttctaaag 1020
atgaaattaa aaattgttcc acaagggtta agtgtctggt ggtaaagttg ggagaaactg 1080
gatggatgca catcgcatgg ctggtggcga gcccactggg caggcgaccc aggaaagggt 1140
ttggagtgag gctgtgagca cttacttgat attttacaag tttggatttg gtgttaattt 1200
ttttccttgt ccgttttttc ctgttgacta acggctcatc ttttccttgt ttttgttttt 1260
tttttgttct ttttttccat gtcactaaag 1290
<210> 9
<211> 4796
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无3'UTR的完整序列
<400> 9
acttaagctt cgacgcagga ggcggggctg ctcagtcctc caggcgtcgg tactcagcgg 60
tgttggaact tcgttgcttg cttgcctgtg cgcgcgtgcg cggacatggc ctcaaacgat 120
tatacccaac aagcaaccca aagctatggg gcctacccca cccagcccgg gcagggctat 180
tcccagcaga gcagtcagcc ctacggacag cagagttaca gtggttatag ccagtccacg 240
gacacttcag gctatggcca gagcagctat tcttcttatg gccagagcca gaacacaggc 300
tatggaactc agtcaactcc ccagggatat ggctcgactg gcggctatgg cagtagccag 360
agctcccaat cgtcttacgg gcagcagtcc tcctaccctg gctatggcca gcagccagct 420
cccagcagca cctcgggaag ttacggtagc agttctcaga gcagcagcta tgggcagccc 480
cagagtggga gctacagcca gcagcctagc tatggtggac agcagcaaag ctatggacag 540
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<212> DNA
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<220>
<223> 完整序列
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<211> 7932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 完整序列Δ1
<400> 11
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<220>
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tatccatcac ttcatatcat tagcatgaat gagaacatac aaagccactc ttagaaaatt 7920
ttgaaattta tgttatttca gcccttttat gctggaggtt gcaaatgttt tgtgaataat 7980
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<211> 8031
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<213> 人工序列
<220>
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ccaccatgcc cacctagttt ttgcattttt agtggaggtg tggtttcact gtgttggcca 5940
ggctggtctc ttaactcctg acctcaggtg atccacctgc cttggcctcc caaagtgctg 6000
gaattacagg catgagccgc tgcatctggc catcctctca aattttcaag tgttccacaa 6060
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<210> 15
<211> 8031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列Δ5
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atgttacaat tgagtctgtg gctgattact tcaagcagat tggtattatt aagacaaaca 3960
agaaaacggg acagcccatg attaatttgt acacagacag ggaaactggc aagctgaagg 4020
gagaggcaac ggtctctttt gatgacccac cttcagctaa agcagctatt gactggtttg 4080
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cttccagtct catccttttt aaattttttt tttttttttg agacggtctc actctcaccc 6600
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<211> 3707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列Δ1-6 UTR
<400> 18
acttaagctt cgacgcagga ggcggggctg ctcagtcctc caggcgtcgg tactcagcgg 60
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gactcaatag tcatctttta ccaaatgggt ttgcctggaa gagggatgta acattgccct 2280
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aagatttaaa gccaaaggtg tgggttcatg acttaggtgt cattgcgtgt gggtacaata 2460
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agttgggaga aactggatgg atgcacatcg catggctggt ggcgagccca ctgggcaggc 2760
gacccaggaa agggtttgga gtgaggctgt gagcacttac ttgatatttt acaagtttgg 2820
atttggtgtt aatttttttc cttgtccgtt ttttcctgtt gactaacggc tcatcttttc 2880
cttgtttttg tttttttttt gttctttttt tccatgtcac taaaggccct cgggaccaag 2940
gatcacgtca tgactccgaa caggataatt cagacaacaa caccatcttt gtgcaaggcc 3000
tgggtgagaa tgttacaatt gagtctgtgg ctgattactt caagcagatt ggtattatta 3060
agacaaacaa gaaaacggga cagcccatga ttaatttgta cacagacagg gaaactggca 3120
agctgaaggg agaggcaacg gtctcttttg atgacccacc ttcagctaaa gcagctattg 3180
actggtttga tggtaaagaa ttctccggaa atcctatcaa ggtctcattt gctactcgcc 3240
gggcagactt taatcggggt ggtggcaatg gtcgtggagg ccgagggcga ggaggaccca 3300
tgggccgtgg aggctatgga ggtggtggca gtggtggtgg tggccgagga ggatttccca 3360
gtggaggtgg tggcggtgga ggacagcagc gagctggtga ctggaagtgt cctaatccca 3420
cctgtgagaa tatgaacttc tcttggagga atgaatgcaa ccagtgtaag gcccctaaac 3480
cagatggccc aggaggggga ccaggtggct ctcacatggg gggtaactac ggggatgatc 3540
gtcgtggtgg cagaggaggc tatgatcgag gcggctaccg gggccgcggc ggggaccgtg 3600
gaggcttccg agggggccgg ggtggtgggg acagaggtgg ctttggccct ggcaagatgg 3660
attccagggg tgagcacaga caggatcgca gggagaggcc gtattaa 3707
<210> 19
<211> 1127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子6Δ1 et 2
<400> 19
gtaggtgtct catgagccag ggagtatctt tggtggggag tgtggaggat tgcatgaatc 60
tccctgaagc cagtccctag tgcatggttt agtattcttg ttgtctaggg atctgtgagg 120
gctttgattt gggggcagtg actttctttt tacatcccca ttttattttt gtgagaactt 180
gggagcctga actcccatcc ataccactga atagagattt tgagtaatga tacttgtttc 240
caaaaaaaaa gaaaccatac atagatacgt atggattgga gtcattaata tcctaggcaa 300
gaaacatgga agtgaagact tctttctctg caagggaaac cgatgatccc actcctggga 360
aatagtaggg aaacttggta tgtgtattcc catgtgtgaa gtaaaacctt agatttgatg 420
ttaaaacagt tgtcaaatct gttggtaaat aagatttgaa ggaccctact ctgtctccct 480
tgaaaaaggg gaggaatgtc agtgttactg tttttggaaa aagtagattt ttaaaccgag 540
tttggaaatg gtaagtatgc agaggtgggt gggggcaatc tcaaaaacgt gcaaaaatga 600
ggaaaacaaa aatgaggaaa tgtgtgcgtg tgtttaatgc aaaactttaa aaagaaaaac 660
aactgttatg tgactgttaa cttgctctgc attctttcaa agcaaaaacc acaaaaatgt 720
gttcaaggct accccagcct ggtgtgaaat gtcttctggg taaattgggg tagggttttt 780
aaaccaacta cttggttgtc aaccacttgc gacaagagga aaaaaaaaca tctgctccat 840
cggaagaacg accaaggaaa atgggttatt ttttttccag aggaaataga taacgtaacc 900
ttttaaagca aaatctttat aaactgtgtc tgagaaattg cacacgtgtg tgtgacatgc 960
tcaaaggtca gacaaggggt ggtcaggaag ggatgtattt tagtagccac ttgtatcttt 1020
ttccaaaaac acctacccat gtttggggaa tgttaaacaa aatcaaaaaa caaccttttg 1080
tagccgttgg aagcttcatg tcctttcttc taacttgtct tctccag 1127
<210> 20
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7Δ3 ？6
<400> 20
gtaagtgaac agagtttcca aaattcccaa ctcccagcaa tgctttgtct gattgttcat 60
ttgcagatgt cttagcgtgt taatttaaat gtcaaaggtt ttgaggtgtc cagaaccacc 120
tccagaaagg ggtagggtag aatgccacct gttgcctggt gtgtgctaac ctggagcagg 180
taggggtaag actcaatagt catcttttac caaatgggtt tgcctggaag agggatgtaa 240
cattgccctg aggatggtga agttggtata catttataaa gtacggaatg gtgtcaatga 300
atgcaattct atgtatatgg acttggaact tttctggttt ggttaacaaa aggtttcttg 360
atttgtttca agatttaaag ccaaaggtgt gggttcatga cttaggtgtc attgcgtgtg 420
ggtacaatat ttatatatgg cgaattcaga taaacattgg tcaaagatgg tctctggaaa 480
aacaaaatag aggctgcatt acggaaataa gatttctggt ctgttccctg ggacatgctt 540
aaaaaataca atagctatta tgtatggttt ttattttcat gtggtttcgg ggaaacaaca 600
cggttttaag gatggtttct aaagatgaaa ttaaaaattg ttccacaagg gttaagtgtc 660
tggtggtaaa gttgggagaa actggatgga tgcacatcgc atggctggtg gcgagcccac 720
tgggcaggcg acccaggaaa gggtttggag tgaggctgtg agcacttact tgatatttta 780
caagtttgga tttggtgtta atttttttcc ttgtccgttt tttcctgttg actaacggct 840
catcttttcc ttgtttttgt tttttttttg ttcttttttt ccatgtcact aaag 894
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物hTLS FUS-正向
<400> 21
gaattcgtgg accaggaagg tc 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物hTLS FUS-反向
<400> 22
cacgtgtgaa ctcaccggag tca 23
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物FUS-正向
<400> 23
gatttgaagt gggtagatag tgcagg 26
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物FUS-反向
<400> 24
cctttccaca ctttagttta gtcacag 27
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物肌动蛋白
<400> 25
ccaccagttc gccatggat 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物肌动蛋白
<400> 26
ggctttgcac atgccggag 19
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物TBP
<400> 27
ccaatgactc ctatgacccc ta 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物TBP
<400> 28
cagccaagat tcacggtaga t 21
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
223> 正向引物Pol2
<400> 29
gctgggagac atagacca 18
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物Pol2
<400> 30
ttactcccct gcatggtctc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物hFUS
<400> 31
gccagaacac aggctatgga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物hFUS
<400> 32
cgattgggag ctctggctac 20
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物T-Fus
<400> 33
ttatggacag acccaaaaac aca 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物T-Fus
<400> 34
tgctgcccat aagaagattg 20
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物FusΔNLS
<400> 35
gcaagatgga ctcctagtgt taat 24
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物FUSΔNLS
<400> 36
acctctacaa atgtggtatg gc 22
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物Fus外显子6-8
<400> 37
cggcatgggg tcctcgg 17
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物Fus外显子6-8
<400> 38
cctaggcctt gcacgaagat 20
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA标签
<400> 39
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> myc标签
<400> 40
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flag标签
<400> 41
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 42
<211> 2545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-1-E7-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15
<400> 42
acttaagctt cgacgcagga ggcggggctg ctcagtcctc caggcgtcgg tactcagcgg 60
tgttggaact tcgttgcttg cttgcctgtg cgcgcgtgcg cggacatgta cccatacgat 120
gttccagatt acgctgcctc aaacgattat acccaacaag caacccaaag ctatggggcc 180
taccccaccc agcccgggca gggctattcc cagcagagca gtcagcccta cggacagcag 240
agttacagtg gttatagcca gtccacggac acttcaggct atggccagag cagctattct 300
tcttatggcc agagccagaa cacaggctat ggaactcagt caactcccca gggatatggc 360
tcgactggcg gctatggcag tagccagagc tcccaatcgt cttacgggca gcagtcctcc 420
taccctggct atggccagca gccagctccc agcagcacct cgggaagtta cggtagcagt 480
tctcagagca gcagctatgg gcagccccag agtgggagct acagccagca gcctagctat 540
ggtggacagc agcaaagcta tggacagcag caaagctata atccccctca gggctatgga 600
cagcagaacc agtacaacag cagcagtggt ggtggaggtg gaggtggagg tggaggtaac 660
tatggccaag atcaatcctc catgagtagt ggtggtggca gtggtggcgg ttatggcaat 720
caagaccaga gtggtggagg tggcagcggt ggctatggac agcaggaccg tggaggccgc 780
ggcaggggtg gcagtggtgg cggcggcggc ggcggcggtg gtggttacaa ccgcagcagt 840
ggtggctatg aacccagagg tcgtggaggt ggccgtggag gcagaggtgg catggggtag 900
gtgtctcatg agccagggag tatctttggt ggggagtgtg gaggattgca tgaatctccc 960
tgaagccagt ccctagtgca tggtttagta ttctttcctc tagggagttg gtaatggtta 1020
acctgacttc agcttccagg aattggctac tcttcccgtt ttctatagtc atttgaatcc 1080
acgagcttga tttgcactaa tttgaccgac attgattttg tgtgtgactt ggtttatggg 1140
gccagctgac tgaagtaagc agaccttttg ggcaaaaata tgctttgaca gtggtctccc 1200
acctatttgt tccactgtct gccttcccct ggttacttaa aattcatcag cttgtccaac 1260
tggaccttct ttccttcctg ctgaagttga tttgaagtaa aaccttagat ttgatgttaa 1320
aacagttgtc aaatctgttg gtaaataaga tttgaaggac cctactctgt ctcccttgaa 1380
aaaggggagg aggatgtatt ttagtagcca cttgtatctt tttccaaaaa cacctaccca 1440
tgtttgggga atgttaaaca aaatcaaaaa acaacctttt gtagccgttg gaagcttcat 1500
gtcctttctt ctaacttgtc ttctccacgg aagtgaccgt ggtggcttca ataaatttgg 1560
tggtaagtga acagagtttc caaaattccc aactcccagc aatgctttgt ctgattgttc 1620
atttgcagat gtcttagcgt gttaatttaa atgtcaaagg ttttgaggtg tccagaacca 1680
cctccagttt ttcctgttga ctaacggctc atcttttcct tgtttttgtt ttttttttgt 1740
tctttttttc catgtcacta aaggccctcg ggaccaagga tcacgtcatg actccgaaca 1800
ggataattca gacaacaaca ccatctttgt gcaaggcctg ggtgagaatg ttacaattga 1860
gtctgtggct gattacttca agcagattgg tattattaag acaaacaaga aaacgggaca 1920
gcccatgatt aatttgtaca cagacaggga aactggcaag ctgaagggag aggcaacggt 1980
ctcttttgat gacccacctt cagctaaagc agctattgac tggtttgatg gtaaagaatt 2040
ctccggaaat cctatcaagg tctcatttgc tactcgccgg gcagacttta atcggggtgg 2100
tggcaatggt cgtggaggcc gagggcgagg aggacccatg ggccgtggag gctatggagg 2160
tggtggcagt ggtggtggtg gccgaggagg atttcccagt ggaggtggtg gcggtggagg 2220
acagcagcga gctggtgact ggaagtgtcc taatcccacc tgtgagaata tgaacttctc 2280
ttggaggaat gaatgcaacc agtgtaaggc ccctaaacca gatggcccag gagggggacc 2340
aggtggctct cacatggggg gtaactacgg ggatgatcgt cgtggtggca gaggaggcta 2400
tgatcgaggc ggctaccggg gccgcggcgg ggaccgtgga ggcttccgag ggggccgggg 2460
tggtggggac agaggtggct ttggccctgg caagatggat tccaggggtg agcacagaca 2520
ggatcgcagg gagaggccgt attaa 2545
<210> 43
<211> 2347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-2-E7-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15
<400> 43
acttaagctt cgacgcagga ggcggggctg ctcagtcctc caggcgtcgg tactcagcgg 60
tgttggaact tcgttgcttg cttgcctgtg cgcgcgtgcg cggacatgta cccatacgat 120
gttccagatt acgctgcctc aaacgattat acccaacaag caacccaaag ctatggggcc 180
taccccaccc agcccgggca gggctattcc cagcagagca gtcagcccta cggacagcag 240
agttacagtg gttatagcca gtccacggac acttcaggct atggccagag cagctattct 300
tcttatggcc agagccagaa cacaggctat ggaactcagt caactcccca gggatatggc 360
tcgactggcg gctatggcag tagccagagc tcccaatcgt cttacgggca gcagtcctcc 420
taccctggct atggccagca gccagctccc agcagcacct cgggaagtta cggtagcagt 480
tctcagagca gcagctatgg gcagccccag agtgggagct acagccagca gcctagctat 540
ggtggacagc agcaaagcta tggacagcag caaagctata atccccctca gggctatgga 600
cagcagaacc agtacaacag cagcagtggt ggtggaggtg gaggtggagg tggaggtaac 660
tatggccaag atcaatcctc catgagtagt ggtggtggca gtggtggcgg ttatggcaat 720
caagaccaga gtggtggagg tggcagcggt ggctatggac agcaggaccg tggaggccgc 780
ggcaggggtg gcagtggtgg cggcggcggc ggcggcggtg gtggttacaa ccgcagcagt 840
ggtggctatg aacccagagg tcgtggaggt ggccgtggag gcagaggtgg catggggtag 900
gtgtctcatg agccagggag tatctttggt ggggagtgtg gaggattgca tgaatctccc 960
tgaagccagt ccctagtgca tggtttagta ttcttttatg tgccacaggt atgaaaggtg 1020
acattgcaaa atactccgct cttctcgcag tgtagaaggg gtgaccccgg gggttggggg 1080
agatcaaaaa cagctcagta gttaggacag agcttagcta agtttgtctt gctttaaggg 1140
gaagttgcct ttggttttga ctttttatgg aatggggttg ggtctgcttg ctgggatgta 1200
ttttagtagc cacttgtatc tttttccaaa aacacctacc catgtttggg gaatgttaaa 1260
caaaatcaaa aaacaacctt ttgtagccgt tggaagcttc atgtcctttc ttctaacttg 1320
tcttctccac ggaagtgacc gtggtggctt caataaattt ggtggtaagt gaacagagtt 1380
tccaaaattc ccaactccca gcaatgcttt gtctgattgt tcatttgcag atgtcttagc 1440
gtgttaattt aaatgtcaaa ggttttgagg tgtccagaac cacctccagt ttttcctgtt 1500
gactaacggc tcatcttttc cttgtttttg tttttttttt gttctttttt tccatgtcac 1560
taaaggccct cgggaccaag gatcacgtca tgactccgaa caggataatt cagacaacaa 1620
caccatcttt gtgcaaggcc tgggtgagaa tgttacaatt gagtctgtgg ctgattactt 1680
caagcagatt ggtattatta agacaaacaa gaaaacggga cagcccatga ttaatttgta 1740
cacagacagg gaaactggca agctgaaggg agaggcaacg gtctcttttg atgacccacc 1800
ttcagctaaa gcagctattg actggtttga tggtaaagaa ttctccggaa atcctatcaa 1860
ggtctcattt gctactcgcc gggcagactt taatcggggt ggtggcaatg gtcgtggagg 1920
ccgagggcga ggaggaccca tgggccgtgg aggctatgga ggtggtggca gtggtggtgg 1980
tggccgagga ggatttccca gtggaggtgg tggcggtgga ggacagcagc gagctggtga 2040
ctggaagtgt cctaatccca cctgtgagaa tatgaacttc tcttggagga atgaatgcaa 2100
ccagtgtaag gcccctaaac cagatggccc aggaggggga ccaggtggct ctcacatggg 2160
gggtaactac ggggatgatc gtcgtggtgg cagaggaggc tatgatcgag gcggctaccg 2220
gggccgcggc ggggaccgtg gaggcttccg agggggccgg ggtggtgggg acagaggtgg 2280
ctttggccct ggcaagatgg attccagggg tgagcacaga caggatcgca gggagaggcc 2340
gtattaa 2347
<210> 44
<211> 2347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-3-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15
<400> 44
acttaagctt cgacgcagga ggcggggctg ctcagtcctc caggcgtcgg tactcagcgg 60
tgttggaact tcgttgcttg cttgcctgtg cgcgcgtgcg cggacatgta cccatacgat 120
gttccagatt acgctgcctc aaacgattat acccaacaag caacccaaag ctatggggcc 180
taccccaccc agcccgggca gggctattcc cagcagagca gtcagcccta cggacagcag 240
agttacagtg gttatagcca gtccacggac acttcaggct atggccagag cagctattct 300
tcttatggcc agagccagaa cacaggctat ggaactcagt caactcccca gggatatggc 360
tcgactggcg gctatggcag tagccagagc tcccaatcgt cttacgggca gcagtcctcc 420
taccctggct atggccagca gccagctccc agcagcacct cgggaagtta cggtagcagt 480
tctcagagca gcagctatgg gcagccccag agtgggagct acagccagca gcctagctat 540
ggtggacagc agcaaagcta tggacagcag caaagctata atccccctca gggctatgga 600
cagcagaacc agtacaacag cagcagtggt ggtggaggtg gaggtggagg tggaggtaac 660
tatggccaag atcaatcctc catgagtagt ggtggtggca gtggtggcgg ttatggcaat 720
caagaccaga gtggtggagg tggcagcggt ggctatggac agcaggaccg tggaggccgc 780
ggcaggggtg gcagtggtgg cggcggcggc ggcggcggtg gtggttacaa ccgcagcagt 840
ggtggctatg aacccagagg tcgtggaggt ggccgtggag gcagaggtgg catggggtag 900
gtgtctcatg agccagggag tatctttggt ggggagtgtg gaggattgca tgaatctccc 960
tgaagccagt ccctagtgca tggtttagta ttcttggatg tattttagta gccacttgta 1020
tctttttcca aaaacaccta cccatgtttg gggaatgtta aacaaaatca aaaaacaacc 1080
ttttgtagcc gttggaagct tcatgtcctt tcttctaact tgtcttctcc acggaagtga 1140
ccgtggtggc ttcaataaat ttggtggtaa gtgaacagag tttccaaaat tcccaactcc 1200
cagcaatgct ttgtctgatt gttcatttgc agatgtctta gcgtgttaat ttaaatgtca 1260
aaggttttga ggtgtccaga accacctcca gccaggttaa taagaggggt ctagtaggcc 1320
ttggactggg ccgttgccac acctggcact tagtgaccat catcatgaga aactggagag 1380
tgcgtgctgg aacacgtggt gccatcttgg ctttaggatc cttttgatcg ttgtgtccaa 1440
ggcttgtgtg tgtgtgagtg tgtgggagac aactccgaat gtttaattct ttttcctgtt 1500
gactaacggc tcatcttttc cttgtttttg tttttttttt gttctttttt tccatgtcac 1560
taaaggccct cgggaccaag gatcacgtca tgactccgaa caggataatt cagacaacaa 1620
caccatcttt gtgcaaggcc tgggtgagaa tgttacaatt gagtctgtgg ctgattactt 1680
caagcagatt ggtattatta agacaaacaa gaaaacggga cagcccatga ttaatttgta 1740
cacagacagg gaaactggca agctgaaggg agaggcaacg gtctcttttg atgacccacc 1800
ttcagctaaa gcagctattg actggtttga tggtaaagaa ttctccggaa atcctatcaa 1860
ggtctcattt gctactcgcc gggcagactt taatcggggt ggtggcaatg gtcgtggagg 1920
ccgagggcga ggaggaccca tgggccgtgg aggctatgga ggtggtggca gtggtggtgg 1980
tggccgagga ggatttccca gtggaggtgg tggcggtgga ggacagcagc gagctggtga 2040
ctggaagtgt cctaatccca cctgtgagaa tatgaacttc tcttggagga atgaatgcaa 2100
ccagtgtaag gcccctaaac cagatggccc aggaggggga ccaggtggct ctcacatggg 2160
gggtaactac ggggatgatc gtcgtggtgg cagaggaggc tatgatcgag gcggctaccg 2220
gggccgcggc ggggaccgtg gaggcttccg agggggccgg ggtggtgggg acagaggtgg 2280
ctttggccct ggcaagatgg attccagggg tgagcacaga caggatcgca gggagaggcc 2340
gtattaa 2347
<210> 45
<211> 2347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA-E1-E2-E3-E4-E5-E6-E7-4-E8-E9-E10-E11-E12-E13-E14-E15
<400> 45
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<210> 56
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7基序3
<400> 56
ccaggttaat aagaggggtc tagtaggcct tggactgggc cgttgccaca cctggcactt 60
agtgaccatc atcatgagaa actggagagt gcgtgctgga acacgtggtg ccatcttggc 120
tttaggatcc ttttgatcgt tgtgtccaag gcttgtgtgt gtgtgagtgt gtgggagaca 180
actccgaatg tttaattc 198
<210> 57
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7基序4
<400> 57
taactgagat gggcaaatag aaactagctc tgggaaggaa catgtgcact acttcaagaa 60
agattggaag catgtgtggc tcatgggaaa taaccaggtc ttaaacagca caaactgaat 120
tcgtggacca ggaaggtctt aaacagcaca aactgaattc atggaaaaat gacaaatttg 180
agaagtctcc cagtaagc 198
<210> 58
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7基序5
<400> 58
tacaatattt atatatggcg aattcagata aacattggtc aaagatggtc tctggaaaaa 60
caaaatagag gctgcattac ggaaataaga tttctggtct gttccctggg acatgcttaa 120
aaaatacaat agctattatg tatggttttt attttcatgt ggtttcgggg aaacaacacg 180
gttttaagga tggtttct 198
<210> 59
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内含子7基序6
<400> 59
tctctcttct ctcgggtgag agaaccgggc caagctgagt tggtttgttc actttaatgg 60
gtctccgttt cccctgccac ctgtgctgag gacatttccc agcctgagct gggggaggca 120
gcatttgctg aagtgtggag ttgtctctgt ggagactcaa gttacagatc ttaaggggcc 180
tgcctagaat tttctcct 198
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
gggcatgggt cagaaggatt 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
tcgatggggt acttcagggt 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
ttcaccacca tggagaaggc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
agagggggca gagatgatga 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
ttgctttcct tggtcaggca 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
atccaacact tcgtggggtc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
ccgttggaag cttcatgtcc 20
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
tattgaagcc accacggtca c 21
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
ctgtgagcac ttacttgata tttt 24
<210> 69
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gtgatccttg gtcccga 17

Claims (13)

1.一种编码人FUS蛋白的核酸，所述编码人FUS蛋白的核酸包含与内含子6的序列SEQID NO 1具有至少69％序列同一性的序列和/或与内含子7的序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的序列，和/或在序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2内的能够结合人FUS蛋白的至少一个保留RNA基序，所述序列位于外显子7的任一侧上。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中与序列SEQ ID NO.1具有至少69％序列同一性的所述序列选自由序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.19组成的组。
3.根据权利要求1所述的核酸，其中与序列SEQ ID NO 2具有至少60％序列同一性的所述序列选自由序列SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 20组成的组。
4.根据权利要求1所述的核酸，其中具有在序列SEQ ID NO 1内的能够结合人FUS蛋白的基序的所述序列选自由序列SEQ ID NO 54和SEQ ID NO 55组成的组。
5.根据权利要求1所述的核酸，其中具有在序列SEQ ID NO 2内的能够结合人FUS蛋白的基序的所述序列选自由序列SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58和SEQ ID NO59组成的组。
6.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，所述序列是选自由以下项组成的组的序列：序列SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ IDNO 14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 42、SEQ IDNO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ IDNO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52和SEQ ID NO 53。
7.一种重组载体，所述重组载体包含根据权利要求1至6中任一项所述的核酸。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于所述载体是腺病毒、质粒、YAC(酵母人工染色体)或BAC(细菌人工染色体)。
9.根据权利要求7和8中任一项所述的载体，其特征在于所述载体是腺病毒。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸，所述核酸用作治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物。
11.根据权利要求7至9中任一项所述的重组载体，所述重组载体用作治疗和/或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物。
12.一种用于预防和/或治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1至6中任一项所述的核酸和/或根据权利要求7至9中任一项所述的载体。
13.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1至4中任一项所述的核酸和/或根据权利要求5至7中任一项所述的载体。
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