CN115386000B - 一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法，首先取适量禽血球加工副产物，加入0.01‑1.5 mol/L的酸溶液，在密闭反应釜中加热至50‑120℃进行水解，水解时间为0.5‑6 h，反应液冷却至室温；然后再进行分离提取：根据禽血球副产物中脱色肽、血红素肽的等电点不同调控水解液的pH值，多次分离提取得到血红素肽与脱色肽。本发明制备方法简单，步骤易于操作，采用热酸水解不仅促进了苦味物质的降解还能够促进血红素总量的释放，脱色肽和血红素肽的分离提取为禽血球加工副产物的综合利用提出了新的解决方法。
Description
技术领域
本发明属于农副产品加工技术领域，具体涉及一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法。
背景技术
我国是家禽消费大国，禽血是家禽屠宰过程中的重要副产物之一，年产量超百万吨。禽血球是禽血的重要组成部分，约占禽血总量的35％。尽管禽血球营养价值丰富、产量大、价格低，但其资源利用仍处于极低水平，禽血球生产加工核心生产技术和高端加工设备处于落后状态，高值化加工和转换科学研究相对不足，加工产品局限于血球粉或低分子肽等低端低值产品。血球经酶解提取低分子量肽残余的大分子混合物为血球加工副产物，该副产物粗蛋白含量高达88％以上，分子量主要分布在1.35-17kDa和>670kDa区间内，富含微量元素铁，但因苦味重、色泽差、难以溶解和胃肠消化吸收率低等缺点，制约了该类加工副产物的进一步开发利用和精深加工。
禽血球加工副产物的苦味是影响其开发利用的重要因素，苦味主要由疏水性苦味蛋白或多肽产生，味蕾主要识别低分子量蛋白或多肽(低于6kDa)，苦味阈值受到疏水性多肽的氨基酸组成、序列、立体结构、相对分子质量等因素影响。一般而言，苦味蛋白或多肽中疏水性氨基酸含量占比越高，对应的苦味值越大；苦味蛋白或肽水解释放游离疏水性氨基酸，对应的苦味降低。
禽血球加工副产物中蛋白质含量达85％，富含血红素，但禽血球加工副产物喷雾干燥样品呈黑红色，苦味重，由于色泽也会限制其综合利用，因而需要脱色处理并对血红素肽进行富集和分离。
发明内容
本发明要解决的技术问题是目前禽血球加工的副产物苦味重、色泽差影响后续应用的问题，提供了一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法。
本发明采用如下技术方案：一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法，包括如下步骤：
(1)酸水解处理：取适量禽血球加工副产物，加入0.01-1.5mol/L的酸溶液，在密闭反应釜中加热至50-120℃进行水解，水解时间为0.5-6h，反应液冷却至室温；
(2)分离提取处理：根据禽血球副产物中脱色肽、血红素肽的等电点不同调控水解液的pH值，多次分离得到血红素肽与脱色肽。
进一步的，将步骤(1)中的水解液调节pH值至3-6，静置30-60min后离心分离得到上清液和沉淀，收集上清液后使用微米膜浓缩，经过喷雾干燥后得到脱色肽A；
将上述步骤中离心后的沉淀加水溶解，调节溶液pH值至11-13，充分搅拌，静置30-60min后离心分离，取上清液，调节上清液pH值至3-6，静置后离心得到上清液和沉淀，上清液为脱色肽B，沉淀物为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽。
进一步的，将步骤(1)中的水解液调节pH值至11-13，充分搅拌，静置30-60min后离心分离得到上清液和沉淀，收集上清液，调节上清液pH值至3-6，静置30-60min后离心，分离上清液和沉淀，上清液使用微米膜过滤浓缩，经过喷雾干燥后得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽。
进一步的，制备得到的脱色肽采用0.01-20μm的微米膜串联超滤浓缩，膜通量为1.0-10L/min，收集滞留液。
进一步的，所述喷雾干燥时喷雾干燥设备的进风口温度170-180℃，所述喷雾干燥设备出风口温度75-85℃。
进一步的，所述酸溶液为盐酸、磷酸、乙酸或乳酸。
进一步的，所述离心是在室温条件下，离心转速为10000rpm，离心时间为10min。
进一步的，所述血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1％甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5mL，最大吸收波长设为405nm，收集该波长对应的峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
脱苦原理：在本发明中的禽血球加工副产物经酸水解不仅能够促进蛋白大分子降解，还能够降低反应液中肽段疏水氨基酸含量，降低了禽血球副产物的苦味实现了副产物中脱苦的效果，同时热酸水解还能够进一步促进被包裹覆盖的血红素裸露出来，从而提高血红素含量。
脱色肽与血红素肽的分离原理：在本发明的禽血球加工副产物中，pH 3-6时禽血球加工副产物中的血红素类物质能够形成沉淀，能够与脱色肽分离，当pH值为11-13时，血红素肽的溶解度最大。因此本发明通过调节禽血球加工副产物酸水解液的不同pH值，实现脱色肽与血红素肽的提取。
本发明的优点具体如下：
(1)本发明制备方法简单，步骤易于操作，采用热酸水解不仅促进了苦味物质的降解还能够促进血红素总量的释放，有利于脱色肽和血红素肽的分离提取；
(2)采用等电点调控的方法分离得到脱色肽和血红素肽，该方法成本低且通过微米膜超滤浓缩能够对酸碱溶液回收进行重复利用，降低了生产成本；
(3)制备得到的脱色肽分子量分布在<17kDa和17-44kDa两个范围取件，小分子量的脱色肽更易溶解且胃肠消化吸收率高，有利于禽血球加工副产物中回收的脱色肽的综合开发利用；
(4)分离得到的血红素肽中血红素含量为10.02-12.42％，血红素提取率为72-93％，制备得到的血红素肽消化率高，溶解性相对血红素纯品提高了20-35％，具有良好的生物利用度。
附图说明
图1为本发明中禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法的流程图。
图2为本发明中禽血球加工副产物及脱色肽粉胃消化微观结构图。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1：
一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法，包括如下步骤：
(1)酸水解脱苦方法：取适量禽血球加工副产物，按禽血球加工副产物与酸溶液的质量比为1:20加入酸溶液，在密闭反应釜中加热50℃水解，水解时间为6h，水解结束后，反应液自然冷却至室温；酸溶液为0.1mol/L的盐酸溶液；
(2)将步骤(1)中的水解溶液调整pH至3，水解溶液与酸溶液的的质量比为1:50，静置40min后离心分离，收集上清液后采用10μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥制备得到脱色肽A，
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解，调节pH值至11使沉淀充分溶解，其中沉淀与碱溶液的料液比为1:80，静置30min后离心，收集上清液，调节反应溶液pH值至3，静置40min，离心分离得到上清液和沉淀，上清液采用10μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥后，制备得到脱色肽B，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
(4)将步骤(1)中水解后的溶液调整至pH值至11，充分搅拌，控制水解溶液与碱溶液的质量比为1:120，静置30min后离心，收集上清液，在上清液中加入酸溶液调节溶液pH值至6，静置60min后离心，分离得到上清液和沉淀，上清液采用10μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥，制备得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽。
喷雾干燥时喷雾干燥设备的进风口温度175℃，喷雾干燥设备出风口温度80℃。
血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1％甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5mL，最大吸收波长设为405nm，收集该波长对应的峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
实施例2：
一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法，包括如下步骤：
(1)酸水解脱苦方法：取适量禽血球加工副产物，按禽血球加工副产物与酸溶液的质量比1:30加入酸溶液水解，在密闭反应釜中加热至80℃水解，水解时间为3h，水解结束后，反应液自然冷却至室温；酸溶液为1mol/L的磷酸溶液；
(2)将步骤(1)中水解后的水解液调整pH至4，料液比为1:50，静置40min后离心，分离得到上清液和沉淀，收集上清液后采用10μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥制备得到脱色肽A；
(3)将步骤(2)中的沉淀加入酸溶液溶解，调节pH值至13使沉淀充分溶解，该沉淀为血红素肽的粗产物，其中沉淀与碱溶液的料液比为1:80，静置30min后离心，分离得到上清液和沉淀，调节上清液pH值至4，静置40min，离心分离，得到上清液和沉淀，采用10μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥后，制备得到脱色肽B，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
(4)将步骤(1)中水解后的溶液调整至pH值至13，充分搅拌，料液比为1:120，静置30min后离心，收集上清液，加入酸溶液调节反应溶液pH值至4，静置60min后离心得到上清液和沉淀，收集上清液，采用10μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥，制备得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽。
喷雾干燥时喷雾干燥设备的进风口温度175℃，喷雾干燥设备出风口温度80℃。
血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1％甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5mL，最大吸收波长设为405nm，收集该波长对应的峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
实施例3：
一种禽血球加工副产物制备脱色肽和血红素肽的方法，包括如下步骤：
(1)酸水解脱苦方法：取适量禽血球加工副产物，按料液比1.5mol/L加入酸溶液，于120℃密封加热水解，水解时间为0.5h，水解结束后，反应液自然冷却至室温；酸溶液为1.5mol/L的磷酸溶液；
(2)为分离得到澄清透明的脱色多肽，将步骤(1)中水解后的溶液调整pH至6，料液比为1:50，静置30min后离心分离，收集上清液，采用20μm的微米膜浓缩，经喷雾干燥制备得到脱色肽A，
(3)将步骤(2)中的沉淀溶解，对其中不同分子量的肽进行分离制备，调节反应液pH值至13，充分搅拌，料液比为1:80，静置30min后离心，收集上清液，调节反应溶液pH值至6，静置60min，离心收集上清液，采用20μm的微米膜浓缩，经喷雾干燥，制备得到脱色肽B，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
(4)将步骤(1)中水解后的溶液调整至pH值至13，充分搅拌，料液比为1:120，静置60min，离心收集上清液，调节反应溶液pH值至6，静置60min,离心收集上清液，采用20μm的微米膜浓缩，经喷雾干燥后制备得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
喷雾干燥时喷雾干燥设备的进风口温度170℃，喷雾干燥设备出风口温度75℃
血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1％甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5mL，最大吸收波长设为405nm，收集该波长对应峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
对上述实施例1-3中得到的脱色肽A、脱色肽B、脱色肽C进行测定。
1、苦味分析：称取1g干燥的禽血球加工副产物、水解液的冻干粉及制备的脱色肽，加入去离子水并调pH至中性，充分溶解，定容到1L，离心(8000rpm，10min，室温)，取上清液，用味觉分析系统(SA402B)电子舌测定样品的苦味味觉感官指标。每个样品进行3次平行测定。
结果如表1所示。
表1禽血球加工副产物、水解液的冻干粉及制备的脱色肽的苦味值
由结果可知：禽血球加工副产物经酸水解可以促进蛋白或肽的降解，经过酸水解后的水解液冻干粉的苦味值与原苦味值相比大大降低，采用本发明制备得到的脱色肽A、脱色肽B和脱色肽C与原禽血球加工副产物相比苦味值也有大幅度降低，三种脱色肽苦味值降低后应用范围更广。
2、分子量分布分析：样品20-40mg，加入2mL含15％二甲基亚砜的2mol/L脲溶液,振荡溶解，用配备紫外检测器的安捷伦高效液相色谱仪测定样品的分子量分布。色谱柱为TSK-Gel-3000SW(7.8×300mm，粒径5μm)，流动相A 0.1mM磷酸缓冲盐，pH 6.7，流动相BH2O，流速为0.7mL/min,柱温为30℃，进样体积为50μL。分子量分布的标准蛋白曲线用标准蛋白混合物得到，紫外检测波长280nm，其数据分析用凝胶渗透色谱软件处理。结果如表2所示。
表2分子量分布图
由结果可知：采用本发明制备方法得到的脱色肽A、脱色肽B和脱色肽C的分子量主要分布在<17kDa范围内，分子量小的脱色肽更易吸收且应用范围更广。
3、游离疏水型氨基酸含量分析：称取实施例2制备的脱色肽为样品，样品50mg，加入5mL 10％三氯乙酸溶液，混匀，4℃静置2h，离心(4℃，10000rpm,10min),取2mL上清液调pH至2，加pH为2的三氯乙酸溶液定容至10mL，经0.22μm有机膜过滤器过滤，待上机。结果如表3所示。
表3游离疏水型氨基酸含量
由结果可知：水解后产物以及脱色肽A、脱色肽B和脱色肽C液中的疏水氨基酸含量均有增加，蛋白或肽中疏水性氨基酸的含量的增加，进一步减轻了苦味阈值。
4、脱色肽的胃消化模拟
分别取0.2g禽血球加工副产物、脱色肽A、脱色肽B、脱色肽C加入2mL胃消化液(pH＝2的盐酸溶液，含胃蛋白酶4000U/mL)，在温度为37℃下，离心200rpm，消化120min。消化后的结果如图所示。
由图1可知，A-D分别为禽血球加工副产物、脱色肽A、脱色肽B、脱色肽C对应的消化上清液微观结构图，使用体式显微镜(×100倍)，禽血球加工副产物对应的消化上清液可见的颗粒比较密集，而制备三种脱色肽液较均匀，颗粒少且细小，胃肠消化吸收接近100％，具有良好的体外抗氧化性。
禽血球加工副产物中提取的血红素肽的最佳沉淀范围为3-6，沉淀率高于90％，采用该等电点多次沉降，可以将水解液中的其他成分和血红素肽分离。
对纯化后的血红素肽进行分析：通过液相得到的血红素肽，经减压蒸馏回收乙腈，残留液经干燥制备血红素肽，制备得到的血红素肽干燥后外观呈豆沙色细腻粉末状，氨基酸组成分析结果表示，血红素肽里含有必需氨基酸占总氨基酸含量为43％，血红素肽分子量分布在小于17kDa区间。禽血球加工副产物中血红素含量为0.2-0.5％左右，酸水解促进了蛋白的降解，削弱了蛋白与血红素的结合力，使得血红素的含量提升为1.2-2.4％，经等电点调控，血红素的总提取率达到72-93％。采用本发明的纯化方法，与原血球加工副产物相比，血红素的纯度为12％，纯度提升了24-60倍。
Claims (3)
1.一种禽血球加工副产物的分离提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）酸水解脱苦方法：取适量禽血球加工副产物，按禽血球加工副产物与酸溶液的质量比为1:20加入酸溶液，在密闭反应釜中加热50℃水解，水解时间为6 h，水解结束后，反应液自然冷却至室温；酸溶液为0.1 mol/L的盐酸溶液；
（2）将步骤（1）中的水解溶液调整pH至3，水解溶液与酸溶液的质量比为1:50，静置40min后离心分离，收集上清液后采用10 μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥制备得到脱色肽A，
（3）将步骤（2）中的沉淀溶解，调节pH值至11使沉淀充分溶解，其中沉淀与碱溶液的料液比为1:80，静置30 min后离心，收集上清液，调节反应溶液pH值至3，静置40 min，离心分离得到上清液和沉淀，上清液采用10 μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥后，制备得到脱色肽B，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
（4）将步骤（1）中水解后的溶液调整至pH值至11，充分搅拌，控制水解溶液与碱溶液的质量比为1:120，静置30 min后离心，收集上清液，在上清液中加入酸溶液调节溶液pH值至6，静置60 min后离心，分离得到上清液和沉淀，上清液采用10 μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥，制备得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1%甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5 mL，最大吸收波长设为405 nm，收集该波长对应的峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
2.一种禽血球加工副产物的分离提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）酸水解脱苦方法：取适量禽血球加工副产物，按禽血球加工副产物与酸溶液的质量比1:30加入酸溶液水解，在密闭反应釜中加热至80℃水解，水解时间为3 h，水解结束后，反应液自然冷却至室温；酸溶液为1 mol/L的磷酸溶液；
（2）将步骤（1）中水解后的水解液调整pH至4，料液比为1:50，静置40min后离心，分离得到上清液和沉淀，收集上清液后采用10 μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥制备得到脱色肽A；
（3）将步骤（2）中的沉淀加入酸溶液溶解，调节pH值至13使沉淀充分溶解，该沉淀为血红素肽的粗产物，其中沉淀与碱溶液的料液比为1:80，静置30 min后离心，分离得到上清液和沉淀，调节上清液pH值至4，静置40 min，离心分离，得到上清液和沉淀，采用10 μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥后，制备得到脱色肽B，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
（4）将步骤（1）中水解后的溶液调整至pH值至13，充分搅拌，料液比为1:120，静置30min后离心，收集上清液，加入酸溶液调节反应溶液pH值至4，静置60 min后离心得到上清液和沉淀，收集上清液，采用10 μm的微米膜浓缩，经过喷雾干燥，制备得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1%甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5 mL，最大吸收波长设为405 nm，收集该波长对应的峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
3.一种禽血球加工副产物的分离提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）酸水解脱苦方法：取适量禽血球加工副产物，按料液比1.5 mol/L加入酸溶液，于120℃密封加热水解，水解时间为0.5 h，水解结束后，反应液自然冷却至室温；酸溶液为1.5mol/L的磷酸溶液；
（2）为分离得到澄清透明的脱色多肽，将步骤（1）中水解后的溶液调整pH至6，料液比为1:50，静置30 min后离心分离，收集上清液，采用20 μm的微米膜浓缩，经喷雾干燥制备得到脱色肽A，
（3）将步骤（2）中的沉淀溶解，对其中不同分子量的肽进行分离制备，调节反应液pH值至13，充分搅拌，料液比为1:80，静置30 min后离心，收集上清液，调节反应溶液pH值至6，静置60 min，离心收集上清液，采用20 μm的微米膜浓缩，经喷雾干燥，制备得到脱色肽B，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
（4）将步骤（1）中水解后的溶液调整至pH值至13，充分搅拌，料液比为1:120，静置60min，离心收集上清液，调节反应溶液pH值至6，静置60 min,离心收集上清液，采用20 μm的微米膜浓缩，经喷雾干燥后制备得到脱色肽C，沉淀为血红素粗品，血红素粗品经色谱柱分离纯化得到血红素肽；
血红素粗品采用色谱柱分离纯化的条件为：制备柱的柱填料为C18，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式，流动相为体积比为55:45的乙腈和0.1%甲酸水溶液，流动相的流速为2-4mL/min，血红素粗品的上样量为5 mL，最大吸收波长设为405 nm，收集该波长对应的峰的洗脱组分经冷冻干燥制备得到血红素肽。
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