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CN115353562A - 一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途 - Google Patents

一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途 Download PDF

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CN115353562A
CN115353562A CN202210747456.9A CN202210747456A CN115353562A CN 115353562 A CN115353562 A CN 115353562A CN 202210747456 A CN202210747456 A CN 202210747456A CN 115353562 A CN115353562 A CN 115353562A
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monoclonal antibody
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solution
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张倡埼
朱高茂
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Beijing Reyan Biotechnology Co ltd
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Beijing Reyan Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途。本发明针对H5N1HA蛋白开发了特异性的单克隆抗体，所述抗体能够高亲和力的结合HA蛋白，并且具有严格的特异性。将所述单克隆抗体制备成为ELISA检测试剂盒后能够以极低的检测下限检测靶标，具有较好的应用前景。

Description

一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途
技术领域
本申请涉及生物领域，涉及一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途。
背景技术
禽流感(Avianinfluenza,AIorbirdflu)是禽流行性感冒的简称,它是指由禽流感病毒引起的一种动物传染病,常发生在禽,有时也发生在低等哺乳类动物,至今在人仅有偶发病例。禽流感病毒(AvianinfluenzaVirus,AIV),根据其对鸡致病性的不同分为高致病性、中致病性和低Π非致病性的,而不是对人而言。高致病性的为H5和H7亚型病毒中一些毒株,中致病性的主要指H9N2和H6N8亚型毒株。其他的毒株均为低Π非致病性的。禽流感病毒不仅会给养禽、畜牧业带来灾难性的破坏,而且对公共健康也构成了严重威胁。因此,禽流感的危害已引起世界各国普遍关注。
人感染禽流感，是由禽流感病毒引起的人类疾病。禽流感病毒，属于甲型流感病毒，根据禽流感病毒对鸡和火鸡的致病性的不同，分为高、中、低/非致病性三级。由于禽流感病毒的血凝素结构等特点，一般感染禽类，当病毒在复制过程中发生基因重配，致使结构发生改变，获得感染人的能力，才可能造成人感染禽流感疾病的发生。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、 H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。其中，高致病性H5N1亚型和2013年3 月在人体上首次发现的新禽流感H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成了人类的伤亡，同时重创了家禽养殖业。尤其自2003年以来,国内外媒体不断报道了人间禽流感事件,并自1997年以来,一些人一直认为高致病性禽H5N1流感病毒即将会造成世界性流感大流行而担忧,人类将面临1918年西班牙流感悲剧的重演。
禽流感的种类很多。至今已调查过的低等动物将近30余种:猪、马、牛、骡、驴、狗、猫、兔、鹿、绵羊、山羊、实验小鼠、野鼠、水貂、树、老虎、猴、蛇、穿山甲、鸡、野鸡、鸽、鹅、家鸭、野鸭、海鸥、黑脸琵鹭、油罐、草鹂、小、红脚鹬、斑头雁、鱼雁等。已分离到的禽流感病毒有:H2N3、H3N1、H3N3、 H3N6、H3N7、H3N8、H3N9、H4N2、H4N5、H4N6、H4N7、H4N8、H4N9、H5N1、H5N4、 H5N8、H6N2、H6N4、H6N5、H6N8、H7N7、H9N2、H9N9、H10N3、H10N5、H10N9、 H11N2、H11N6、H11N9和H12N9等,即至今已发现的甲型流感病毒9个N亚型及 16个H亚型中绝大多数均已分离到。
关于高致病性禽H5N1病毒是否已突破人宿主的屏障存在着不同的看法:一些人认为已突破,1997年从患者所分离出的H5N1毒株是由AΠ鹅Π广东Π1Π96(H5N1)毒株与其他禽H5N1毒株基因重配而来,突破了人宿主的屏障。显然这种推断缺乏科学依据。前面已提到,高致病性禽H5N1于1959年首发于苏格兰,1990年在英格兰火鸡中也分离到高致病性的H5N1毒株。1997年3月中国香港新界3个鸡场发生了H5N1流感暴发,其病毒的基因特性与从患者所分离的非常相似,而且中国香港于1979年从鸭中就已分离到H5N3毒株,其他国家在野鸟和鸭中也早已分离到H5N1毒株。而1996年广东鹅H5N1毒株,除H基因与1997 年香港H5N1毒株相似外,其余7个基因节段明显不同于1997年H5N1毒株, 同时我们曾用1996年鹅毒株,通过鼻腔和口腔大剂量感染4～6周龄小鸡,小鸡不发病、不排毒并无抗体应答。因此,主观地认为1997年人群中禽H5N1流感就是与1996年广东鹅H5N1病毒有关,与其余的均无关,这是缺乏科学依据的。事实已清楚表明,2003年以来的H5N1毒株并不是由1997年香港H5N1毒株演变而来。迫使一些人不得不改变观点,认为高致病性H5N1毒株的抗原性和基因特性具有地区性差异。另一些人认为,时至今日,高致病性禽H5N1毒株尚未突破人宿主的屏障。首先从流行病学角度来分析,如果已突破人宿主屏障,为何自1997年5月以来,全世界确诊病例还不到200例。其次从病原分子生物学方面来分析:至今从患者Π死者中所分离出的H5N1毒株基因组8个节段均属禽流感病毒,不含有任何人流感病毒节段；它们的受体特异性为禽流感病毒；它们HA蛋白分子上连接肽含一串碱性氨基酸。因此,可认为受袭击者可能性很大为一些遗传异常或免疫能力低下者。
目前针对禽流感的主要以预防为主。检测便是最好的预防方式。传统的免疫诊断检测技术是进行病毒的分离培养，通过血凝试验、血凝抑制试验、琼脂扩散试验进行分型，再依靠实验动物确定毒株的强弱。病毒分离采用鸡胚尿囊扩增法和超速离心纯化法，用HI抗原试验检测分离病毒的血凝性，用制备好的16种标准HA抗血清进行HI抗原抑制试验确定亚型。琼脂扩散试验常用于检测A型流感共同抗原核蛋白(NP)或基质蛋白(MP)，常用的方法有双向双扩散试验(IDD)，免疫单辐射扩散试验(SRD)和对流免疫电泳。此法简便、快捷，既可定性，又可定量。现在已研制成功准确的McAb诊断技术，进行荧光抗体标记、酶联免疫吸附试验(ELISA)，其灵敏度高，可标准化操作，结果易于分析。如采用竞争性ELISA法检测禽流感的HA抗体，灵敏度达到96.2％，使用琼脂免疫扩散法 (AGID)检测HA抗体，灵敏度达到90％。但是，目前针对检测H5的ELISA检测方法还不够多。提供的可选择途径也不够丰富。而且，针对接种了相应疫苗检测是否产生了相应的抗体的研究也不够多。
发明内容
本发明提供了一种特异性结合H5N1的单克隆抗体。
进一步的，所述单克隆抗体是特异性针对H5N1的HA蛋白的单克隆抗体。
进一步的，所述单克隆抗体是H5-3F5，所述重链可变区的氨基酸序列为
Figure BDA0003717346080000031
所述轻链可变区的氨基酸序列为
Figure BDA0003717346080000032
进一步的，本发明的单克隆抗体的轻重链可变区可以采用保守性取代，在保持重链可变区与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列95％以上同源性，保持轻链可变区与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列95％以上同源性的基础上保证抗体活性不变。
进一步的，本发明的单克隆抗体的轻重链可变区可以采用保守性取代，在保持重链可变区与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列90％以上同源性，保持轻链可变区与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列90％以上同源性的基础上保证抗体活性不变。
进一步的，本发明的单克隆抗体的轻重链可变区可以采用保守性取代，在保持重链可变区与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列85％以上同源性，保持轻链可变区与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列85％以上同源性的基础上保证抗体活性不变。
进一步的，本发明的单克隆抗体的轻重链可变区可以采用保守性取代，在保持重链可变区与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列80％以上同源性，保持轻链可变区与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列80％以上同源性的基础上保证抗体活性不变。
进一步的，本发明的单克隆抗体的轻重链可变区可以采用保守性取代，在保持重链可变区与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列75％以上同源性，保持轻链可变区与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列75％以上同源性的基础上保证抗体活性不变。
进一步的，本发明的单克隆抗体的轻重链可变区可以采用保守性取代，在保持重链可变区与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列70％以上同源性，保持轻链可变区与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列70％以上同源性的基础上保证抗体活性不变。
进一步的，本发明提供了所述的特异性针对H5N1的HA蛋白的单克隆抗体在制备用于诊断H5N1的试剂盒中的用途。
进一步的，本发明提供了所述的特异性针对H5N1的HA蛋白的单克隆抗体在制备用于诊断H5N1的HA蛋白的试剂盒中的用途。
在一些实施例中，可以使用磁珠进行ELISA测定。ELISA测定可以在例如管中进行，例如Eppendorf管。所述珠粒可用作固体载体。至少一种抗体(例如捕获抗体)可以与磁性颗粒缀合。可将包含抗原的生物流体样品加入到包含至少一种与磁珠缀合的抗体的管中。在使抗原与抗体结合之后，可以在分离和/或洗涤步骤中使用磁性装置，例如磁铁。通过将具有结合抗原(抗体-抗原复合物)的抗体吸引到管的一侧，可以使用移液管从管中移除剩余的生物流体样品。可向管中加入洗涤溶液。磁体可以从管中移除，并且抗体-抗原复合物可以分散在洗涤溶液中。再次闭合磁铁与磁珠缀合的抗体将被吸引到管的侧面。任何未结合的抗原存在于洗涤液中，并且包含任何未结合的抗原的洗涤液可使用移液管除去。此外，可将包含第二抗体的流体加入到所述管中。通过除去磁体，抗体-抗原复合物可以分散在流体中。使第二抗体与结合到第一抗体上的抗原结合。一定时间后，使第二抗体与抗原结合后，可将磁铁靠近试管。以类似的方式，如上所述，可以将洗涤溶液加入到管中。任何未结合的第二抗体可从管中除去。第二抗体可以与标记物缀合，例如生物素，并且该标记物可以使用本文所述的技术来检测或测量，例如通过向管中加入与链霉亲和素缀合的HRP，然后加入TMB，可以使用分光光度法，例如通过测量450nm处的吸光度。
进一步的，本申请还提供了一种新的检测方法，所述方法包待检样本分别加入到聚苯乙烯反应板孔内，每孔50μl，然后将诊断膜片放入孔内点样面朝上每孔1片。在微量振荡器上轻微振摇作用1h；吸去孔中液体用Tween20-TBS洗3 次，第1次1min，第2次3min，第3次5min；用Tween20-TBS将H5-3F5单克隆抗体稀释后每孔加入50μl振摇作用50min，洗板；用Tween20-TBS将酶标兔抗鼠IgG作1∶500稀释后加入各孔振摇作用55min，洗板；加入底物液[6.5ml DAB(8mg/10ml)中加2μl H2O2(30％)]每孔65μl振摇作用10min；吸去底物液用TBS洗2次再用蒸馏水洗2次每次1～2min洗完晾干后判读。每次均需设如下对照：阳性和阴性抗原对照TBS对照(无抗体)和底物对照(无酶结合物)。对照试验全部出现正确结果时方可判读。如膜上出现棕黄色斑点为阳性反应；如斑点色泽不清和形状不规则或无斑点为阴性反应。
本公开还涉及鉴定样品中H5N1的方法，所述方法包括以下动作：
a.将样品与一抗孵育；以及
b.向孵育的样品中加入色原缀合的二抗，并进行免疫组织化学分析以鉴定样品中的H5N1病毒。
上述方法对应的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括抗体、包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。
上述20倍浓缩洗涤液为20倍浓缩的含0.05％～0.5％Tween-20的 0.01mol/LpH7.4 PBST；稀释液为含1％～10％BSA、0.05％～0.5％ Tween-20pH7.4的PBS；底物液为可溶性TMB；终止液为1-2mol/L H2SO4溶液。
上述的抗体试剂盒各组成部分的体积或数量如下：包被板2块；EHD-2型单克隆抗体0.3mL；强阳性对照0.6mL；弱阳性对照0.6mL；阴性对照0.6mL；HRP 标记羊抗鼠二抗0.3mL；20倍浓缩洗涤液50mL；稀释液60mL；底物液25mL；终止液25mL；封板纸6张；说明书1份。
进一步的，本公开涉及用于鉴定样品中H5N1的试剂盒，所述试剂盒包括抗 H5N1单克隆抗体以及任选地选自二抗，免疫组织化学分析试剂，药学上可接受的赋形剂和说明书或其任意组合的组分。本公开涉及一种治疗H5N1的方法，所述方法包括给予有此需要的受试者单克隆抗体，任选地与药学上可接受的赋形剂一起的动作。在本公开的一个实施方案中，受试者是包括人的哺乳动物。
在本公开的一个实施例中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂，选自造粒剂，粘合剂，润滑剂，崩解剂，助流剂，防粘剂，抗静电剂，表面活性剂，抗氧剂，树胶，包衣剂，着色剂，包衣剂，增塑剂，防腐剂，悬浮剂，乳化剂，植物纤维素材料和球形化剂或其任意组合。
有益效果
本发明针对H5N1 HA蛋白开发了特异性的单克隆抗体，所述抗体能够高亲和力的结合HA蛋白，并且具有严格的特异性。将所述单克隆抗体制备成为ELISA 检测试剂盒后能够以极低的检测下限检测靶标，具有较好的应用前景。
附图说明
图1单抗特异性的结合多肽表位鉴定结果图
图2单抗亚型鉴定结果图
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
实施例1特异性针对禽流感病毒H5的单克隆抗体的制备
6-8周龄的BALB/c小鼠，共5只。以H5N1 HA蛋白(BIOHJSW，货号orb-EHJ075488)作为免疫原，与弗氏完全佐剂按照1:1的比例混匀后，按照 100μg/只的剂量进行首次免疫，间隔3周后，进行二免，与弗氏不完全佐剂按照 1:1的比例混匀后，按照100μg/只的剂量进行免疫；间隔2周后，再进行三免，与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例混匀后，按照100μg/只的剂量进行免疫；采用间接ELISA检测方法，检测多抗效价，效价达到了1:25600的2号小鼠效价最高进行加强免疫，加强免疫为三免后2周进行，与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例混匀后，按照100μg/只的剂量进行用腹腔注射加强免疫。
小鼠加强免疫后5天，脱颈处死后放入事先准备的盛有75％酒精的烧杯中消毒5min。在超净台中用无菌剪刀和镊子剪开表皮，更换第二套剪刀剪开腹腔，取出脾脏放在120目的无菌滤网上，用剪刀剪碎并研磨脾脏，加GNK洗液冲洗，使脾细胞单个滤入无菌小烧杯中，制成单细胞悬液；将脾细胞悬液移入离心管中，补加GNK到40mL，1200r/min，离心10min；弃上清，弹虚细胞团，各加GNK10mL，将脾细胞悬液转入小鼠SP2/0细胞瓶中，加GNK至40mL，1200r/min，离心10min，弃尽上清；将细胞团轻轻打散，滴加融合剂50％PEG-15001mL，逐滴滴加，先慢后快1min内加完，静止90s，然后缓慢滴加15mLGNK终止融合，再于37摄氏度水浴静置5min，补加GNK至40mL后1000r/min，离心10min；弃上清，将细胞团轻轻打散，用含HAT的选择培养基轻轻混匀融合细胞。分散悬浮细胞到96孔细胞培养板中，220μL/孔细胞培养液。培养6天可进行半数换液，10天对杂交瘤细胞上清进行检测，筛选阳性克隆孔。采用间接ELISA法对长有杂交瘤细胞的孔进行阳性克隆孔的筛选，分别设小鼠阳性血清和未融合的细胞孔作为对照组，筛选的包被正筛抗原是H5N1 HA蛋白(BIOHJSW，货号orb-EHJ075488)和反筛抗原H7N9 HA蛋白(货号：40104-V08H，义翘神州)。阳性孔共14个，阳性率10.5％(参见表1)。将筛选出的具有阳性值较高的细胞孔转入含HT培养基的24孔板扩大培养。2天后以同样的方法测其细胞上清抗体效价，选取效价较高富锐阳性反应的细胞株共4株，采用有限稀释法对间接ELISA检测出的强阳性孔进行亚克隆，获得了共筛选出H5-1A3、H5-3F5、H5-4G6 3株抗H5禽流感单克隆杂交瘤细胞株。
表1阳性克隆的筛选结果
Figure BDA0003717346080000071
Figure BDA0003717346080000081
三株单抗的特异性鉴定：包被：将H5 HA、H7 HA、H1 HA、H3 HA分别用CBS 按照5μg/mL浓度稀释，50μL/孔，铺于96孔酶标板，4℃过夜；封闭：PBST洗板2次，彻底甩干洗涤液，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h；加一抗：弃去封闭液，PBST洗板2次，彻底甩干洗涤液，将三株单抗细胞上清液分别依次按照1：200，1：400，1：800-1：25600的比例稀释，每孔50μL，同时，设小鼠1：500稀释的阳性血清为阳性对照，37℃吸附1h；加二抗：弃去一抗，PBST 洗板6次，彻底甩干洗涤液，每孔加入50μL1：20000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃反应30min；显色：弃去二抗，PBST洗板6次，彻底甩干洗涤液， TMB显色液显色，设置空白对照，并根据显色情况适时终止，读数。结果如表2 所示。
表2特异性鉴定结果(OD450)
克隆孔 H5 HA H7 HA H1 HA H3 HA
H5-1A3 2.553 0.262 0.252 0.331
H5-3F5 2.621 0.237 0.231 0.412
H5-4G6 2.701 0.253 0.324 0.289
从表2的结果可以看出，本发明制备的三株单抗均具有较好的特异性，能够特异性的结合H5的HA蛋白，而不与其他亚型的HA蛋白结合。
实施例2H5-3F5单抗结合位点测定
根据H5N1的氨基酸序列，分别设计不同长度的截短肽，采用ELISA方法进行特异性鉴定，每孔包被截短肽200ng，HRP标记的H5-3F5单抗抗体显色。以空白对照调零,酶标仪测A450nm吸光光度值。H5N1 HA蛋白(BIOHJSW，货号 orb-EHJ075488)和H7N9 HA蛋白(货号：40104-V08H，义翘神州)作为对照。阳性标准为P/N值(阳性/阴性)>2.0,阴性标准为P/N值<0.5。结果如图1所示。
从图1的结果可以看出，H5-3F5单抗特异性的结合H5N1-14号多肽片段，因此，可以判断该抗体的靶位点序列为ELLVLMENERTLDFHDSN。
实施例3H5-3F5单抗亲和力测定
H5-3F5抗体与H5N1 HA蛋白的结合能力的评估利用Biacore8K进行表面等离子共振分析。具体步骤如下：
首先，将抗鼠IgG的抗体以氨基偶联的方式固定在CM5芯片的通道。固定量控制在8,000响应值(RU)左右。然后，以抗体捕获的方式，结合纯化的H5-3F5 抗体。另外，以20mMHEPES，150mM NaCl，pH7.4溶液连续倍比稀释HA蛋白。然后，将连续稀释的HA蛋白依次通过各通道(从低浓度开始逐一上样)。记录 H5-3F5抗体结合HA蛋白的动力学曲线，并利用BIAevaluation software 8K 软件计算动力学常数。结果显示，H5-3F5抗体能够以较高的亲和力结合HA 蛋白，其KD值为4.07E-10(M)，具有极好的结合特性。
实施例4H5-3F5单抗的制备序列鉴定
挑选健康的BALB/c经产母鼠，提前一周采用腹腔注射的方法向小鼠体内接种500μL无菌液体石蜡用于腹水制备，同时将筛选出的阳性杂交瘤细胞H5-3F5 株转至细胞瓶进行扩大培养，待细胞处于对数生长期且状态最佳时，弃去细胞培养液，无菌PBS洗一次，然后使用PBS将细胞吹打下来，1000r/min离心 10min，重悬计数，每只母鼠于腹部接种细胞约5×106个。一周后观察小鼠腹部肿胀情况，直至小鼠腹部肿大、皮肤呈紧绷状态，即可采集腹水。正辛酸-硫酸铵法对单抗腹水进行纯化，采用间接ELISA法对腹水效价进行检测，检测其效价为1:72000。H5-3F5单抗腹水纯化后浓度为4.6mg/mL。并且通过SDS-PAGE 检测纯化后的单抗2个电泳条带清晰，证明纯化后的抗体具有较高的纯度。
依据试剂TriZol说明书，从杂交瘤细胞中分离出总RNA，依据TIANScript 第一链cDNA合成试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，根据特异性引物扩增VH、VL的抗体片段，将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中、测序。将测序进行数据分析后发现H5-3F5单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，H5-3F5单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
实施例5H5-3F5单克隆抗体亚型的鉴定
参照proteintech公司的Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书的步骤，进行亚型的分析。取出Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，室温平衡30min。(将一定量的20×PBST用双蒸水稀释成1×PBST，100倍浓缩体积的羊抗鼠 IgM+IgG-HRP用1×PBST稀释成1×羊抗鼠IgM+lgG-HRP)；将H5-3F5单抗用1 ×PBST按1：20稀释，50uL/孔加入板条中，一个样品对应一个板条；将1×羊抗鼠IgM+IgG-HRP按50L/孔加入样品孔，混匀器上轻轻混匀；盖上封板膜，室温孵育1h；弃去孔内液体，洗涤液洗板3次，拍干；将现配的显色液加入孔中 (显色液配方，A液：B液＝1：100，即10uLA液与1mLB液混匀，立即使用)；室温避光显色10min，100μL/孔加入终止液；通过酶标仪读取OD450，颜色最深或OD450值最高即为相应亚型。
从图2的结果可以看出，H5-3F5单克隆抗体属于IgG2a、κ轻链型。
实施例6ELISA快速检测实验
在聚苯乙烯反应板孔内分别加入H5N1AIV、H7N9AIV、鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒和正常的鸡胚尿囊液各50μl然后将诊断膜片放入孔内点样面朝上每孔1片。在微量振荡器上轻微振摇作用1h；吸去孔中液体用Tween20-TBS洗3次，第1次1min，第2次3min，第3次5min；用Tween20-TBS将H5-3F5单克隆抗体稀释后每孔加入50μl振摇作用50min，洗板；用Tween20-TBS将酶标兔抗鼠IgG作1∶500稀释后加入各孔振摇作用 55min，洗板；加入底物液[6.5ml DAB(8mg/10ml)中加2μl H2O2(30％)] 每孔65μl振摇作用10min；吸去底物液用TBS洗2次再用蒸馏水洗2次每次1～ 2min洗完晾干后判读。每次均需设如下对照：阳性和阴性抗原对照TBS对照(无抗体)和底物对照(无酶结合物)。对照试验全部出现正确结果时方可判读。如膜上出现棕黄色斑点为阳性反应；如斑点色泽不清和形状不规则或无斑点为阴性反应。
结果显示，H5-3F5单克隆抗体只与H5N1 AIV能够产生斑点反应，而与 H7N9AIV、鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒和正常的鸡胚尿囊液均不反应，表明本发明的抗体能够用于H5N1 AIV的鉴定。
通过对最佳抗体包被浓度的Dot-ELISA方阵试验，每块膜片最低吸附兔含蛋白量为3.2×10－9g，高于此含量即能出现明显的斑点颜色。同时，H5N1AIV的最小检测浓度为1.9×10－9g，当膜片上单抗结合的AIV超过此量时，即出现明显的斑点颜色，表明了本发明具有较好的检测下限。
最后应说明的是：本领域技术人员，在基于本申请公开的单克隆抗体的氨基酸序列，采用任何现有方法或将来可能的方法生产制备单克隆抗体，也均应当被涵盖在本申请要求专利保护的范围内。同样地，对本发明单克隆抗体的任何形式的商业化应用，包括但不限于试剂盒、抗体芯片等相应产品，也均应当被涵盖在本申请要求专利保护的范围内。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京热燕生物科技有限公司
<120> 一种单克隆抗体及其制备用于疾病诊断的试剂盒中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Glu Ala
20 25 30
Val Ser Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Cys Asn Asn Arg Ile Pro Phe Tyr Leu Thr Trp Cys Lys Leu
50 55 60
Phe Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Arg Ser Tyr Cys Asn Phe Gln Pro His Pro Asn Gly Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Gln Asn Met Met Trp Ile Pro Ala
20 25 30
Trp Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Asn Gly Glu His Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Met Met Asn Ala Arg Lys Ser
85 90 95
Leu Gln Ala Thr Lys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (5)

1.特异性针对H5N1的HA蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述抗体是H5-3F5，所述重链可变区的氨基酸序列为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSEAVSGWVRQAPGKGLEWVGVCNNRIPFYLTWCKLFRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQRSYCNFQPHPNGWGQGTLVTVSS；
所述轻链可变区的氨基酸序列为AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCGQNMMWIPAWLWYQQKPGKAPKLLIYETNGEHYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCMMMNARKSLQATKFGGGTKVEIK。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测H5N1 HA蛋白或者纯化H5N1 HA蛋白的试剂盒中的用途。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测H5N1或者纯化H5N1的试剂盒中的用途。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述试剂盒是ELISA试剂盒。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述ELISA试剂盒还包括包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。
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