CN115337306B - 甲磺酸二氢麦角碱靶向stat3在制备抗炎性疾病和抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲磺酸二氢麦角碱靶向STAT3在制备治疗乳腺癌、肝癌、结肠癌和胃癌等药物中的应用。所述药物为甲磺酸二氢麦角碱，通过直接下调STAT3的表达和活性，减少IL‑1、IL‑6、IL‑8、IL‑10、IL‑12、IL‑23和TNF‑α等炎性细胞因子的表达；并通过抑制Cyclin D1和Bcl‑XL等靶基因的表达，发挥抗肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。该药物比阿霉素、表阿霉素和长春新碱等传统化疗药物的毒副作用小，比索拉菲尼和抗IL‑6抗体等靶向药物的价格低廉，还能够预防或逆转耐药，具有良好的抗肿瘤应用前景和开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及甲磺酸二氢麦角碱靶向STAT3在制备抗炎性疾病及抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,信号转导及转录激活因子3)，是目前研究最透彻的肿瘤相关信号的转录调节因子之一。研究表明，STAT3的异常活化与乳腺癌、肝癌、胃癌和结肠癌等的不良临床预后相关。STAT3信号的组成型激活，可以直接或间接地上调细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B细胞淋巴因子XL(BCL-XL)、多药耐药相关蛋白1(ABCB1，MDR1)和基质金属蛋白酶(MMPs)等诸多癌基因的表达，参与调控增殖、抗凋亡、耐药和转移等肿瘤发生和发展的所有过程(Leslie Kenneth,Cynthia Lang,Geeta Devgan,et al.Cyclin D1 is transcriptionally regulated by and requiredfor transformation by activated signal transducer and activator oftranscription 3.Cancer Res,2006,66(5):2544-2552； Grad J.M.,X.R.Zeng andL.H.Boise.Regulation of BCL-XL:a little bit of this and a little bit ofSTAT.Curr Opin Oncol,2000,12(6):543-549；Soleymani Abyaneh H,Gupta N,Radziwon-Balicka A,et al.STAT3 but not HIF-1alpha is important in mediating hypoxiainduced Chemoresistance in MDA-MB-231,a triple negative breast Cancer cellline.Cancers(Basel).2017；9(10):137；Kamran MZ,Patil P,Gude RP.Role of STAT3 incancer metastasis and translational advances.Biomed Res Int.2013；2013:421821；Daniel E,Rachel A,Jennifer R.Targeting the IL-6/JAK/STAT3 signalling axis incancer.Nature Reviews Clinical Oncology,2018,(6):1-15.)。此外，STAT3是“炎癌转化”的核心转录因子之一。吸烟、酗酒、紫外照射、慢性应激和感染等因素可通过多种途径激活 STAT3，活化的STAT3又通过激活IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α等炎性细胞因子的的正反馈信号通路，加重局部炎症反应，甚至诱发炎-癌转化(Hua Yu,DrewPardoll and Richard Jove.STATs in cancer inflammation and immunity:a leadingrole for STAT3.Cancer. 2009(9):798-809.)。开发靶向STAT3的药物已经成为国际研究的热点。一些STAT3信号抑制剂如Siltuximab、AZD9150、WP1066、TTI101、OPB-31121和OPB-51602等已进入临床测试阶段(Orlowski,R.Z.et al.A phase 2,randomized,doubleblind,placebo-controlled study of siltuximab(anti-IL-6mAb)and bortezomibversus bortezomib alone in patients with relapsed or refractory multiplemyeloma.Am.J.Hematol.2015(90)：42–49；Hong,D.,et al.,AZD9150,a next-generationantisense oligonucleotide inhibitor of STAT3 with early evidence of clinicalactivity in lymphoma and lung cancer.Sci Transl Med,2015,7(314):314ra185；Sau,S.,et al.,Combination of cationic dexamethasone derivative and STAT3inhibitor(WP1066)for aggressive melanoma:a strategy for repurposing a phase Iclinical trial drug.Mol Cell Biochem,2017.436(1-2):119-136；Bharadwaj,U.,etal.,Small-molecule inhibition of STAT3 in radioresistant head and necksquamous cell carcinoma.Oncotarget,2016.7(18):26307-26330；Hayakawa,F.,et al.,A novel STAT inhibitor,OPB-31121,has a significant antitumor effectionleukemia with STAT-addictive oncokinases.Blood Cancer J,2013.3:e166；Ogura,M.,et al.,Phase I study of OPB-51602,an oral inhibitor of signal transducer andactivator of transcription 3,in patients with relapsed/refractoryhematological malignancies.Cancer Sci,2015.106(7):896-901.)。然而，这些化合物往往由于治疗优势不明显或成药性不好而开发受限。目前尚无靶向STAT3的药物成功上市。
甲磺酸二氢麦角碱(Dihydroergotoxine)，是一种α受体阻断剂，对GABAA受体具有高结合活性。甲磺酸二氢麦角碱可以起舒张血管平滑肌和增强神经递质传递的功能，并能抑制 ATP酶和腺苷酸环化酶的活性，减少ATP的分解，提高神经细胞对葡萄糖的氧化利用，改善脑细胞的血流和能量供应。主要用于治疗血管性痴呆和脑血管病后遗症。目前，甲磺酸二氢麦角碱在治疗STAT3靶点相关的炎性疾病和肿瘤等方面的应用还没有报道。
发明内容
针对现有技术中对STAT3抑制剂的开发尚未获得成功，缺少相应的临床药物等存在的问题，本发明提供一种药代和毒理作用已知、副作用少、价格低廉且具有良好开发应用前景的二氢麦角碱，靶向STAT3在制备治疗肿瘤药物中的应用，旨在解决临床化疗药物容易耐药，导致肿瘤复发，现有的靶向STAT3化合物的成药性差的技术问题。
为了达到上述目的，本发明公开了甲磺酸二氢麦角碱靶向STAT3在制备治疗炎性疾病及肿瘤药物中的应用；所述药物为甲磺酸二氢麦角碱及其衍生物。
具体采取了以下技术方案：本发明前期通过构建基于STAT3转录活性的报告分子载体(购自上海权阳生物科技有限公司)和Luciferase Assay System试剂盒(购自 Promega公司)对1321种中药单体化合物(购自MCE)进行高通量筛选。发现甲磺酸二氢麦角碱能够抑制STAT3的转录活性。
随后，我们通过体外细胞株和小鼠体内试验两方面研究了甲磺酸二氢麦角碱靶向STAT3 蛋白和抑制肿瘤生长的作用。通过实验发现，甲磺酸二氢麦角碱能够下调STAT3、p-STAT3 (Tyr705)和STAT3的下游靶基因Cyclin D1、Bcl-XL和Survivin的表达，抑制乳腺癌、肝癌、胃癌和结肠癌等细胞株的体外增殖，诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡；甲磺酸二氢麦角碱抗肿瘤细胞增殖的作用与STAT3抑制剂Stattic的活性相当，而应用GABAA受体的选择性竞争性拮抗剂GABAzine几乎没有抑瘤活性，进一步表明了甲磺酸二氢麦角碱通过靶向STAT3而不是GABAA受体发挥抑瘤作用。
作为本发明的另一个发明点，甲磺酸二氢麦角碱与阿霉素、索拉菲尼等化疗药物联用，可以下调P-gp的表达，增强乳腺癌和肝癌对化疗药的敏感性，逆转肝癌耐药细胞的化疗抗性，在体内发挥更强的协同抗肿瘤作用。
所述甲磺酸二氢麦角碱抑制的肿瘤细胞具体可以为4T1、MDA-MB-231、MDA-MB-468、CT-26、 HGC-27、HepG2、HuH-7、HepG2-R和HuH-7-R。所述的甲磺酸二氢麦角碱在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述药物为甲磺酸二氢麦角碱、甲磺酸二氢麦角碱衍生物、含有甲磺酸二氢麦角碱的组合物或含有甲磺酸二氢麦角碱衍生物的组合物的一种；所述药物的给药方式为口服或注射。
附图说明
图1.甲磺酸二氢麦角碱与STAT3蛋白相互作用的计算机模拟结构分析。A.配体甲磺酸二氢麦角碱与STAT3的活性“口袋”的结合；B.甲磺酸二氢麦角碱与STAT3结合的3D结构示意图；C.甲磺酸二氢麦角碱与STAT3之间的作用模式和亲和力的二面角图。
图2.双荧光素酶活性分析法检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱对STAT3报道分子的转录活性的抑制作用。
图3.实时荧光定量PCR法检测甲磺酸二氢麦角碱对4T1(A)和HuH-7-R(B)细胞中STAT3 及其下游靶基因的mRNA表达水平的影响。
图4.Western blot法检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱对4T1(A)和HuH-7-R(B)细胞中STAT3、p-STAT3、STAT3的下游靶基因及凋亡和耐药相关蛋白的mRNA表达水平的影响。
图5.实时荧光定量PCR法检测甲磺酸二氢麦角碱对HuH-7细胞中炎性细胞因子的mRNA 表达水平的影响。
图6CCK-8法检测甲磺酸二氢麦角碱在不同的肿瘤细胞系中抑制增殖的IC50值。
图7.流式细胞术检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱对4T1(A和B)和HuH-7(C和D)细胞的周期进程的影响和定量分析。
图8.流式细胞术检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱对4T1(A)和HuH-7(B)细胞凋亡的影响。
图9.CCK-8法检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱和不同浓度的化疗药联用对4T1细胞增殖的影响。A.甲磺酸二氢麦角碱和阿霉素的配比；B.甲磺酸二氢麦角碱和长春新碱的配比； C.甲磺酸二氢麦角碱和表阿霉素的配比。
图10.CCK-8法检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱和不同浓度的化疗药联用对HuH-7细胞增殖的影响。A.甲磺酸二氢麦角碱和阿霉素的配比；B.甲磺酸二氢麦角碱和表阿霉素的配比；C.甲磺酸二氢麦角碱和索拉菲尼的配比。
图11.CCK-8法检测不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱和不同浓度的化疗药物联用对HuH-7-R 细胞增殖的影响。A.甲磺酸二氢麦角碱和阿霉素的配比；B.甲磺酸二氢麦角碱和表阿霉素的配比；C.甲磺酸二氢麦角碱和索拉菲尼的配比。
图12甲磺酸二氢麦角碱和化疗药物联用的联合指数(CI)。
图13.甲磺酸二氢麦角碱和阿霉素单用及联用对4T1小鼠皮下移植瘤生长情况的影响。A. 各组小鼠移植瘤体积的时间变化曲线；B.与溶剂对照组相比，甲磺酸二氢麦角碱和阿霉素单用或联用组对小鼠移植瘤重量的影响(p<0.05；p<0.01)；C.各组小鼠移植瘤的大体形态。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1、甲磺酸二氢麦角碱与STAT3蛋白相互作用的计算机模拟结构分析。
我们首先通过分子对接验证甲磺酸二氢麦角碱与靶标STAT3的有效结合。甲磺酸二氢麦角碱的3D结构来自PubChem Substance数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在 ChemBioDraw 3D模块中将结构能最小化。STAT3的晶体结构来自PDB数据库 (https://www.rcsb.org/)。受体结构由AutodockTools 1.5.6 21修改(去水加氢)，导出为pdbqt格式。在受体蛋白的活性位点上定义网格后，对接程序由AutoDock-Vina 1.1.2执行，输出分数显示为kcal/mol。PyMOL 2.3.0和BIOVIA Discovery Studio 2016被应用于结果处理和可视化。
虚拟对接的结果显示配体分子甲磺酸二氢麦角碱能够与STAT3的活性口袋结合，并具有极低的结合势能(图1A)。配体分子能够与STAT3的支链氨基氢CYS418和ARG423形成稳定的氢键(图1B)。此外，配体能够与STAT3的氨基残基形成范德华力、碳氢键和烷基。因此，甲磺酸二氢麦角碱能够与STAT3蛋白形成较强的相互作用，抑制STAT3的表达和活化。
实施例2、甲磺酸二氢麦角碱抑制STAT3报道分子的转录活性。
将4T1细胞接种于12孔板，每孔细胞数量1.0×105个，置37℃培养箱孵育24h；弃去培养液，并用1ml的PBS清洗细胞2遍。用无血清的DMEM培养基(购自Hyclone)稀释STAT3- 荧光素酶报告质粒(购自上海权阳生物科技有限公司)和pRL-TK海肾质粒(购自Promega)质粒与脂质体(Lipofectamine TM 2000，购自Thermo Fisher)。按每孔250μl无血清的DMEM 培养基稀释4μg质粒，轻轻吹打混匀。每孔取250μl无血清培养基稀释10μg脂质体，轻轻吹打混匀，室温静置5min。将稀释好的质粒加入到稀释好的脂质体中，轻轻吹打，室温静置20min。将混合物慢慢滴加到细胞培养孔中，轻轻混匀，置37℃孵育4h后，每孔更换 1ml含10％FBS的新鲜培养基，于37℃培养箱继续培养60h。用不同浓度(0、2.5μM、5 μM和10μM)的甲磺酸二氢麦角碱分别处理4T1细胞各48h。弃去上清，用PBS清洗细胞一次。用5×PLB裂解液200μL室温裂解20min。将细胞裂解液转入1.5ml Ep管中。按1： 50的比例加入双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自Promega,US，E1910)检测缓冲液，于多功能酶标仪(购自VarioskanFlash,Thermo Fisher,US)分别检测萤火虫和海参荧光素酶的活性。根据公式计算相对荧光强度(Relative fluorescence，RF)＝萤火虫荧光值/海肾荧光值，并与空白对照组的荧光强度比较。如图2，实验结果表明，与仅加DMSO(1μl/ml) 的对照孔相比，采用2.5μM的甲磺酸二氢麦角碱处理48h后，可以显著下调STAT3报道分子的RF值(p<0.05)；而应用5μM或10μM的甲磺酸二氢麦角碱处理48h后，STAT3报道分子的活性更明显地被抑制(p<0.0001)。因此，甲磺酸二氢麦角碱可以从转录水平抑制STAT3 的活性，并具有剂量梯度依赖性。
实施例3、甲磺酸二氢麦角碱抑制STAT3及其下游靶基因的mRNA表达水平。
取6孔板，每孔分别接种4T1和HuH-7-R细胞1×106个。待细胞培养过夜后，甲磺酸二氢麦角碱(0和5μM)处理48h。按照TRIzol一步法提取细胞总RNA，并测定浓度。以提取的总RNA为模板，按Promega公司的反转录试剂盒说明书合成cDNA。通过实时定量PCR 扩增检测STAT3及其靶基因，以ACTB为内参照。所用引物见表1。
表1定量PCR所用STAT3及其靶基因的引物信息。
实时定量PCR反应体系:
每组样品设3个复孔。
反应条件：95℃预变性5min；变性，95℃，15sec；退火，60℃，15sec，延伸，72℃30sec。
扩增40个循环，以ACTB的CT值作为初始值进行数据分析。
如图3A和3B是Q-PCR法检测甲磺酸二氢麦角碱(5μM)处理48h后，对4T1和HuH-7-R细胞中STAT3及其下游靶基因的mRNA表达水平的影响。通过Two-Annova进行统计学分析，图3A的结果显示，与溶剂对照相比，甲磺酸二氢麦角碱可以显著下调4T1细胞中STAT3、 SOX2、BC-XL、CTNNB1、CCND1和MMP2基因的mRNA表达水平(“**”表示P<0.01，“****”表示P<0.0001)。图3B的结果表明，在HuH-7-R细胞中，甲磺酸二氢麦角碱可以显著下调STAT3、SOX2、BC-XL、CTNNB1、NANOG、CCND1、MMP2、MMP7和MMP9 基因的mRNA表达水平(“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“****”表示P<0.0001)。因此，甲磺酸二氢麦角碱可以从mRNA水平抑制STAT3及其下游靶基因的表达。
实施例4、甲磺酸二氢麦角碱抑制STAT3、p-STAT3及下游靶基因的蛋白表达水平。
取对数生长期的4T1和HuH-7-R细胞细胞，以胰酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM 培养基制成密度为3.5×105个/mL的单细胞悬液。按每孔2ml细胞悬液接种于6孔细胞培养板中。置37℃、5％CO2孵箱培养过夜，加入浓度为0、2.5μM、5μM和10μM的甲磺酸二氢麦角碱。继续培养48h后，用RIPA裂解液裂解细胞，收集蛋白、定量并进行Western blot 分析。
1、测定蛋白浓度(BCA法)的步骤：
A、1×磷酸盐缓冲液(PBS)稀释蛋白标准品(表2)：
表2蛋白标准品的配制体系。
B、BCA工作液配制：根据标准品和待测样品的个数，计算出总共所需A与B混合工作液的量。按BCA试剂A与B体积比50：1的比例，配制好工作液，涡旋振荡混匀备用。
C、将蛋白标准液和用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释好的样品上清液(10倍稀释)各取25μl 加入到新的96孔板中。然后再分别加入200μl的提前配好的BCA工作液充分混匀。切记不要吹打产生气泡，盖紧96孔板板盖，在37℃恒温箱中反应30min。
D、取出96孔板恢复至室温3-5min，在酶标仪上测定在562nm波长下的吸光度值，并作出标准曲线计算出每个样品的1μl蛋白含量以备蛋白上样。
2、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)
(1)固定制胶板，配制10％的SDS-PAGE分离胶(表3)。
按照下表3配制分离胶：10ml
表3分离胶配方信息。
(2)将混好的分离胶分别加入到2块胶板中，加到离顶部1.0cm的位置，用无水乙醇填满胶板，静置30-45min。
(3)分离胶凝好后，倒出剩余的无水乙醇，并用滤纸将剩余无水乙醇吸干净。
(4)按照表4配制5％浓缩胶5ml
表4浓缩胶配方信息。
(5)将配制好的浓缩胶缓慢地加入胶板中，避免产生气泡，插入样品梳，静置30-45min。
(6)取出蛋白样品，100℃水浴加热5min，转速10000rpm，离心10min。
(7)将胶板固定到电泳槽中，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，拔出样品梳，按照顺序将处理好的蛋白样品加入到样品槽中。
(8)80V电泳40min。
(9)换电压120V电泳大约1.5h直至溴酚蓝跑出胶体；
3、Western-blot转膜
(1)将电泳完毕的SDS-PAGE胶放入TBST缓冲液中漂洗一次，蛋白胶放到转膜缓冲液中浸泡。
(2)将一层海绵垫在膜转移缓冲液中浸湿，用镊子夹到转膜仪上，按照海绵垫，三层滤纸，蛋白胶，聚偏氟乙烯(PVDF)膜，三层滤纸，海绵垫，顺序放好，对齐，夹起放到转膜仪上，操作时，滤纸、海绵垫均要在转膜缓冲液中浸湿。每层之间若有气泡应用玻璃试管轻轻滚动将其赶出。
(3)打开转膜仪，300mA转膜75min。
(4)将膜取出，放入TBST缓冲液中，60rpm水平震荡仪漂洗3次，每次8min。
(5)用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭液20ml，60rpm水平震荡仪室温封闭2h。
(6)用加有3μl一抗(1:1000)的3ml抗体孵育液，4℃60rpm水平震荡仪过夜孵育。
(7)用10ml TBST，常温60rpm水平震荡仪洗涤PVDF膜三次，每次10min。
(8)用加有2μl二抗的20ml抗体孵育液，常温60rpm水平震荡仪孵育PVDF膜2h。
(9)用10ml TBST，常温60rpm水平震荡仪洗涤PVDF膜三次，每次10min。
(10)取化学发光底物试剂溶液A和溶液B各1ml，混匀后涂布在滤膜上。
(11)用滤纸将膜上的液体吸干，用显影仪显色。
如图4A和4B，蛋白免疫印迹的结果显示，随甲磺酸二氢麦角碱的浓度增加，4T1和HuH-7-R细胞中的GAPDH的蛋白表达量不变，而STAT3、p-STAT3(Tyr705)、Cyclin D1、 BCL-XL、Surviving、ABCB1、β-catenin和p-β-catenin(ser552)的表达量均呈下降趋势，而cleaved-PARP的表达增加。因此，甲磺酸二氢麦角碱可以抑制STAT3的蛋白表达和活化及细胞增殖、耐药和抗凋亡相关下游靶基因的蛋白表达。
实施例5、实时荧光定量PCR法检测甲磺酸二氢麦角碱对HuH-7细胞中炎性细胞因子的 mRNA表达水平的影响。
取6孔板，每孔接种HuH-7细胞1×106个。待细胞培养过夜后，甲磺酸二氢麦角碱(0和5μM)处理48h。按照TRIzol一步法提取细胞总RNA，并测定浓度。以提取的总RNA 为模板，按Promega公司的反转录试剂盒说明书合成cDNA。通过实时定量PCR扩增检测 STAT3及其靶基因，以ACTB为内参照。所用引物见表5。
表5定量PCR所用炎性细胞因子的引物信息。
实时定量PCR反应体系:
每组样品设3个复孔。
反应条件：95℃预变性5min；变性，95℃，15sec；退火，60℃，15sec，延伸，72℃30sec。
扩增40个循环，以ACTB的CT值作为初始值进行数据分析。
如图5是Q-PCR法检测甲磺酸二氢麦角碱(5μM)处理48h后，对HuH-7细胞中炎性细胞因子的mRNA表达水平的影响。通过T-test进行统计学分析，图5的结果显示，与溶剂对照相比，甲磺酸二氢麦角碱可以显著下调HuH-7细胞中IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、 IL-23和TNF-α的mRNA表达水平(“****”表示P<0.0001)。因此，甲磺酸二氢麦角碱可以从mRNA水平抑制这些炎症细胞因子的表达。
实施例6、甲磺酸二氢麦角碱可以抑制多种肿瘤细胞系的增殖。
计数并制备单细胞悬液，接种到96孔板中，每孔5000个细胞，每孔100μl，置5％CO2， 37℃孵箱中培养过夜。分别加入梯度剂量(0.1952125μM、0.390625μM、0.78125μM、1.5625 μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM)的甲磺酸二氢麦角碱、Stattic或GABAzine孵育48h，每个实验孔设3个复孔，以不加化合物的细胞培养孔作为对照。通过CCK-8方法测定各培养孔的细胞活力。每孔加入10μl CCK-8试剂，置5％CO2，37℃孵箱培养1小时，于酶标仪测定各孔的450nm吸光度。Stattic为商品化的STAT3抑制剂，购自 MCE公司。GABAzine为GABAA受体的选择性竞争性拮抗剂，购自MCE公司。
试验结果见图6，不同浓度的甲磺酸二氢麦角碱可以抑制肝癌细胞、肝癌耐药细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和胃癌细胞的增殖，其IC50值在4T1细胞最低，在肝癌耐药细胞HepG2-R中低于亲本细胞HepG2，提示化疗耐药的肝癌细胞对甲磺酸二氢麦角碱更敏感。甲磺酸二氢麦角碱与Stattic的抗肿瘤细胞增殖的活性相当，而GABAA受体的选择性竞争性拮抗剂GABAzine几乎没有抑瘤活性，表明甲磺酸二氢麦角碱通过靶向STAT3而不是GABAA受体发挥抑瘤作用。
实施例7、甲磺酸二氢麦角碱可以诱导肿瘤细胞的周期阻滞。
取对数生长期的4T1和HuH-7细胞，消化并计数后接种于12孔板，每孔2×105个细胞，设3个平行对照孔。约16h后，加入浓度为0、2.5μM、5μM和10μM的甲磺酸二氢麦角碱，继续培养48h。用胰酶消化细胞，重悬之后计数，将细胞浓度调整为5×105个。消化完成后离心弃上清，再用PBS洗细胞两遍(2000rpm，离心5min)，之后弃尽上清，每管加入980μl的70％冷乙醇和0.1％BSA，在于4℃冰箱固定过夜。弃固定液，用PBS洗3遍 (6000rpm，离心0.5min)。细胞洗涤完成后，按DNA含量检测试剂盒(北京索莱宝公司产品)的说明书进行后续操作。每个样品分别用100μl Rnase A于37度孵育30min，然后每个样品中加入500μl已经配制好的PI(碘化丙啶)工作液，室温避光孵育30min。最后，通过流式细胞仪测定细胞周期。采用ModFit软件对实验结果进行分析，通过Graphpad prism 8.0进一步分析两种细胞的周期分布的比例。
图7A和7C是用ModFit软件分析甲磺酸二氢麦角碱处理与否，4T1和HuH-7细胞的周期分布的结果。图7B和7D是通过Graphpad prism 8.0对图7A和图7C结果的进一步定量分析。这些结果表明，与溶剂对照组(DMSO)相比，甲磺酸二氢麦角碱可以剂量依赖的方式诱导乳腺癌和肝癌细胞的G1/S期比率显著增加，G2期的比率相应减少。因此，二氢麦角碱可以诱导肿瘤细胞发生周期阻滞。
实施例8、甲磺酸二氢麦角碱可以诱导肿瘤细胞发生凋亡。
取对数生长期的4T1和HuH-7细胞，消化并计数后接种于6孔板，每孔5×105个细胞，设3个平行对照孔。约16h后，加入浓度为0、2.5μM、5μM和10μM的甲磺酸二氢麦角碱，继续培养48h。用不含EDTA的胰酶消化细胞，重悬之后计数，将细胞浓度调整为1×106个。按Annexin V FITC-PI细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝公司产品)的说明书进行用后续操作。具体为：用1×PBS洗细胞2遍(6000rpm，离心0.5min)，用1×Binding buffer 洗细胞1遍(6000rpm，离心0.5min)之后弃尽上清，以300μl的1×Binding buffer重悬细胞，每管加入5μl Annexin V-FITC，避光孵育10min。随后，每管加入5μl的PI，避光孵育5min。避光上机检测。
图8A和8B是流式细胞术检测甲磺酸二氢麦角碱对4T1和HuH-7细胞凋亡的影响。结果显示，与对照孔相比，二氢麦角碱均可以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡率增加。
实施例9、低剂量的甲磺酸二氢麦角碱可以增强4T1细胞对化疗药的敏感性。
用胰酶常规消化4T1细胞，计数并制备单细胞悬液，接种到96孔板中，每孔5000个细胞，每孔100μl，置5％CO2，37℃孵箱中培养过夜。加入梯度剂量的甲磺酸二氢麦角碱(0、2μM和4μM)分别与阿霉素(0、0.0625μM和0.125μM)、长春新碱(0、0.5μM和1μM) 和表阿霉素(0、0.0625μM和0.125μM)单用和联用，孵育48h，每个实验孔设3个复孔。通过CCK-8方法测定各培养孔的细胞活力。每孔加入10μl CCK-8试剂，置5％CO2，37℃孵箱培养1小时，于酶标仪测定各孔的450nm吸光度。
如图9，与不加甲磺酸二氢麦角碱和化疗药的细胞培养孔对比，单加甲磺酸二氢麦角碱 (2μM和4μM)或单加阿霉素(0.0625μM和0.125μM)、长春新碱(0.5μM和1μM)和表阿霉素(0.0625μM和0.125μM)均可以显著抑制4T1细胞增殖；甲磺酸二氢麦角碱(2 μM和4μM)分别与阿霉素(0.0625μM和0.125μM)、长春新碱(0.5μM和1μM)和表阿霉素(0.0625μM和0.125μM)联用，可以进一步显著抑制细胞活力(“****”代表 p<0.0001)。因此，在体外，甲磺酸二氢麦角碱可以增强4T1细胞对乳腺癌的常规化疗药的敏感性。
实施例10、低剂量的甲磺酸二氢麦角碱可以增强HuH-7细胞对化疗药的敏感性。
用胰酶常规消化HuH-7细胞，计数并制备单细胞悬液，接种到96孔板中，每孔5000个细胞，每孔100μl，置5％CO2，37℃孵箱中培养过夜。加入梯度剂量的甲磺酸二氢麦角碱(0、 2μM和4μM)分别与阿霉素(0、0.25μM和0.5μM)、表阿霉素(0、0.25μM和0.5μM) 和索拉菲尼(0、1μM、2μM和4μM)单用和联用，孵育48h，每个实验孔设3个复孔。通过CCK-8方法测定各培养孔的细胞活力。每孔加入10μl CCK-8试剂，置5％CO2，37℃孵箱培养1小时，于酶标仪测定各孔的450nm吸光度。
如图10，与不加甲磺酸二氢麦角碱和化疗药的细胞培养孔对比，单加甲磺酸二氢麦角碱 (2μM和4μM)或单加阿霉素(0.25μM和0.5μM)、表阿霉素(0.25μM和0.5μM)和索拉菲尼(1μM、2μM和4μM)均可以显著抑制HuH-7细胞增殖；甲磺酸二氢麦角碱(2μM 和4μM)分别与阿霉素(0.25μM)、表阿霉素(0.25μM)和索拉菲尼(1μM、2μM和4μ M)联用，可以进一步显著抑制细胞活力(“**”代表p<0.01,“***”代表p<0.001,“****”代表p<0.0001)。单用阿霉素(0.5μM)、表阿霉素(0.5μM)时，对HuH-7细胞的抑制率已达80％，所以联用二氢麦角碱后，作用没有更强，但是也没有减弱。因此，在体外，甲磺酸二氢麦角碱可以增强HuH-7细胞对低剂量的肝癌常规化疗药的敏感性。
实施例11、低剂量的甲磺酸二氢麦角碱可以增强HuH-7-R细胞对化疗药的敏感性。
用胰酶常规消化HuH-7-R细胞，计数并制备单细胞悬液，接种到96孔板中，每孔5000 个细胞，每孔100μl，置5％CO2，37℃孵箱中培养过夜。加入梯度剂量的甲磺酸二氢麦角碱(0、2μM和4μM)分别与阿霉素(0、0.25μM和0.5μM)、表阿霉素(0、0.25μM和 0.5μM)和索拉菲尼(0、1μM、2μM和4μM)单用和联用，孵育48h，每个实验孔设3个复孔。通过CCK-8方法测定各培养孔的细胞活力。每孔加入10μl CCK-8试剂，置5％CO2，37℃孵箱培养1小时，于酶标仪测定各孔的450nm吸光度。
如图11，与不加甲磺酸二氢麦角碱和化疗药的细胞培养孔对比，单加甲磺酸二氢麦角碱 (2μM和4μM)或单加阿霉素(1μM和2μM)、表阿霉素(1μM和2μM)和索拉菲尼(1 μM、2μM和4μM)均可以显著抑制HuH-7细胞增殖；甲磺酸二氢麦角碱(2μM和4μM) 分别与阿霉素(1μM和2μM)、表阿霉素(1μM和2μM)和索拉菲尼(1μM、2μM和4μM) 联用，可以进一步显著抑制细胞活力(“*”代表p<0.05,“***”代表p<0.001,“****”代表 p<0.0001)。因此，在体外，甲磺酸二氢麦角碱可以增强化疗耐药的HuH-7-R细胞对肝癌常规化疗药的敏感性。
实施例12、甲磺酸二氢麦角碱和化疗药联用的联合指数(CI)分析
用CompuSyn软件对图9和图10中的CCK-8检测结果进行分析。Fa代表细胞活力的分数。当0.3<CI<0.7，表示有较强协同作用；当0.7<CI<0.9，表示有轻微协同作用；当0.9<CI<1.1，表示有叠加作用；当CI>1.1，表示有拮抗作用。
结果如图12，2μM的甲磺酸二氢麦角碱在4T1细胞和HuH-7细胞中与阿霉素或索拉菲尼联用的CI值分别约为0.78、0.66和0.84、0.79，表明低剂量的甲磺酸二氢麦角碱分别与阿霉素和索拉菲尼联用有轻微协同作用；而用4μM的甲磺酸二氢麦角碱分别与阿霉素或索拉菲尼联用，CI值分别约为0.49、0.34和0.42、0.37，表明较高剂量的甲磺酸二氢麦角碱分别与阿霉素和索拉菲尼联用有较强的协同作用。
实施例13、动物实验
实验用动物为6周龄的雌性Balb/c小鼠，购自北京维通利华生物技术有限公司，饲养在 SPF级动物实验室。将1×104个4T1细胞接种在小鼠腋下脂肪垫。约一周后，小鼠腋下均出现明显乳白色结节，将小鼠按体重随机分为溶剂对照组(10％DMSO+90％玉米油)、甲磺酸二氢麦角碱(20mg/kg)组、盐酸阿霉素(1mg/kg)组和甲磺酸二氢麦角碱(20mg/kg)+ 盐酸阿霉素(1mg/kg)组，每组4只小鼠。每日腹腔注射给药1次。隔日监测各组小鼠体重及肿瘤大小。给药10天后，处死各组小鼠，取皮下移植瘤，称量瘤重和拍照。
图13A-C结果显示，与溶剂对照组相比，甲磺酸二氢麦角碱(20mg/kg)单用对肿瘤的体积、瘤重和形态无显著抑制作用(可能跟甲磺酸二氢麦角碱的药代周期短，给药频率和给药剂量等需要优化有关)。阳性对照药物盐酸阿霉素(1mg/kg)组，对移植瘤的体积、瘤重和形态有明显抑制作用(“*”代表p<0.05)。而甲磺酸二氢麦角碱(20mg/kg)与盐酸阿霉素(1mg/kg)联用组，小鼠的瘤体积、瘤重和形态大小进一步被抑制(“**”代表p<0.01)。这些结果证明甲磺酸二氢麦角碱在体内可以显著增强阿霉素对乳腺癌细胞的生长抑制作用。
综上结果表明，甲磺酸二氢麦角碱具有良好的STAT3靶向性，能够下调STAT3的基因和蛋白表达、减少STAT3的磷酸化和多种靶基因的表达；抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、 IL-23和TNF-α等炎性细胞因子的表达；阻碍乳腺癌、肝癌、化疗耐药的肝癌、结肠癌和胃癌细胞的增殖；诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡；增强多种肿瘤细胞对阿霉素、表阿霉素、长春新碱和索拉菲尼的体外敏感性；并能增强阿霉素的体内活性，在抗肿瘤方面显示了良好的应用前景。
Claims (2)
1.2μM甲磺酸二氢麦角碱与0.25μM阿霉素联合用药在制备抗肝癌药物中的应用。
2.5μM甲磺酸二氢麦角碱与1μM阿霉素联合用药在制备抗肝癌药物中的应用。
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