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CN115335701A - 用于检测核酸中基因变异的系统和方法 - Google Patents

用于检测核酸中基因变异的系统和方法 Download PDF

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CN115335701A
CN115335701A CN202080077560.0A CN202080077560A CN115335701A CN 115335701 A CN115335701 A CN 115335701A CN 202080077560 A CN202080077560 A CN 202080077560A CN 115335701 A CN115335701 A CN 115335701A
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Y-H·苏
J·M·宋
V·L·科尔曼
T·M·克莱恩
王炜
I·施图伊芬贝格
G·R·门多萨
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Zeputo Life Technology Co ltd
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Abstract

除其他以外，检测一个或多个查询样品中一种或多种分析物(例如一种或多种基因变体，包括等位基因变体)的存在、不存在、量或其变化的方法，包括提供一个或多个传感器，每个传感器包含布置在一个或多个巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面上的捕获核酸。示例性的操作模式尤其包括通过与捕获核酸的相互作用从传感器表面附近移除或添加磁性颗粒。该方法的特征尤其在于通过基于测定磁性颗粒经过一个或多个传感器前后的磁电阻，来测量一个或多个GMR传感器的磁电阻变化，从而检测一个或多个查询样品中一种或多种分析物的存在。

Description

用于检测核酸中基因变异的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月9日提交的第62/897,561号美国临时专利申请和于2020年1月8日提交的第62/958,510号美国临时专利申请的优先权，每项临时专利申请的全部内容都通过引用方式并入本文。
背景技术
总体来说，本公开尤其涉及用于感测和鉴定一个或多个样品中的分析物(例如核酸和核酸变异)的系统和方法。本公开还涉及分析物和核酸感测装置，例如微流控装置和巨磁电阻(GMR)传感器，以及基于这种微流控装置和巨磁电阻(GMR)传感器的检测方法。
活生物体(例如，动物、植物、微生物、病毒)的遗传信息以脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)编码。遗传信息是代表核酸一级结构的一连串核苷酸或修饰核苷酸。生物体的核酸含量(例如，DNA)通常被称为基因组。在大多数人中，全基因组通常包含位于23对染色体上的约30,000个基因。大多数基因编码特定蛋白质，通过转录和翻译表达后，该蛋白质在活细胞内实现一种或多种生化功能。
许多医学病况是由基因组内的一种或多种基因变异造成的，或者其发生风险受到这些基因变异的影响。一些基因变异可能使个体易患或导致多种疾病中的任何一种，例如糖尿病、动脉硬化、肥胖症、多种自身免疫性疾病和癌症(例如，结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌)。这种基因变异可以采取基因组内一个或多个核苷酸的添加、取代、插入或缺失的形式。
基因变异和/或基因多态性也存在于不同生物体之间，包括密切相关的生物体。可以将这类生物体分类和/或区分为属于相同、相似或不同的分类群，例如给定的域、界、门、纲、目、科、属或种。通常需要从获自受试者或环境的一个或多个样品中鉴定、检测和/或区分密切相关的生物体例如致病生物体，这些生物体在其它方面是密切相关的，例如属于相同或类似的科、属或种。
可以通过核酸分析来鉴定基因变异。基因组的核酸可以通过多种方法进行分析，包括，例如涉及大规模并行测序、微阵列分析和多重连接探针扩增的方法。这种方法可能成本高、耗时长，并且可能需要大量的计算机处理，当需要快速准确地检测已知基因变异(例如，单核苷酸突变)是否存在于疑似患有与该基因变异相关疾病或病况的受试者基因组中时，这种方法会产生问题。
GMR传感器使得能够开发在在紧凑型系统中具有高灵敏度和低成本的多重测定和多重检测方案，例如用于执行多重测定以检测同一查询样品或不同查询样品中多于一种的分析物，并且因此具有提供适用于多种多样应用的平台的潜力。可靠的分析物感测仍然是一个挑战。本公开提供了示例性解决方案。
本文提出的装置和方法为当前的核酸分析技术提供了显著的进步和改进。本文所述的这类进步和改进有助于通过低成本和高灵敏度的方法加速对样品中基因变异的筛查。
本公开总体上涉及一种微流控装置及其用途，以检测一个或多个样品中的分析物和/或基因变异。本文提出的装置和方法还利用了磁性传感器。在一些实施方案中，本文提出的装置和方法还利用了DNA结合蛋白和磁性传感器。在一些实施方案中，本公开涉及包含巨磁电阻(GMR)传感器的微流控装置。
发明内容
在一些方面，本文提出了一种检测靶核酸中第一基因变体的存在的方法，包括(a)使靶核酸与(i)第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸(blocking oligonucleotide)接触，其中，阻断寡核苷酸包含与靶核酸的第二基因变体互补的序列，并且第一和第二引物配置为用于扩增靶核酸；(b)扩增靶核酸，以此提供靶核酸的扩增子；(c)使扩增子与捕获核酸接触，其中捕获核酸包含与靶序列的第一基因变体互补的序列，以此提供包含结合对第一成员的捕获的扩增子；(d)使所捕获的扩增子与包含结合对第二成员的可检测标记物进行接触；和(e)检测可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。在一些实施方案中，该方法包括根据靶核酸中是否存在第一基因变体来检测受试者中是否存在癌症。在一些实施方案中，方法包括当检测到第一基因变体时，对受试者施用适当的治疗。在一些实施方案中，将捕获核酸附着于传感器表面。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测传感器表面上可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。在一些实施方案中，(e)的检测包括动态检测过程。在一些实施方案中，动态检测过程包括提高传感器表面上杂交条件的严格性。在一些实施方案中，动态检测过程包括在(e)的检测期间，升高传感器处或其附近，或者传感器表面处的温度。在一些实施方案中，动态检测过程包括在(e)的检测期间，改变传感器处或其附近，或者传感器表面处盐或阳离子浓度。在一些实施方案中，动态检测过程包括在(e)的检测期间，使流体流过传感器表面。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测与捕获核酸结合的一个或多个扩增子的结合。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测与传感器表面结合的扩增子量的变化。在一些实施方案中，可检测标记物包含磁性颗粒和结合对第二成员。在一些实施方案中，结合对第二成员包含链霉亲和素。在一些实施方案中，第一结合对包含生物素。在一些实施方案中，基因变体包含等位基因变体。在一些实施方案中，基因变体包括在样品中区分一种生物体与另一种生物体的存在的变体。
在一些实施方案中，传感器包含磁性传感器，可检测标记物包含磁性颗粒，并且(e)的检测包括检测磁性传感器表面上或其附近磁性颗粒的存在、不存在或量。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测传感器表面处磁电阻的变化。在一些实施方案中，(e)的检测磁电阻的变化包括在升高温度之前、期间和/或之后检测传感器表面处磁电阻或其变化时，将传感器表面上或其附近的温度升高至少5℃或一段时间。在一些实施方案中，(e)的检测磁电阻的变化包括在升高温度之前、期间和/或之后检测传感器表面处磁电阻或其变化时，将传感器表面上或其附近的温度升高至少20℃或一段时间。在一些实施方案中，根据在(e)中检测到的磁电阻变化来确定靶核酸中第一基因变体的存在。在一些实施方案中，(e)的检测磁电阻的变化包括在改变钠浓度之前、期间和/或之后检测传感器表面处磁电阻或其变化时，将钠离子浓度降低至少50％。在一些实施方案中，磁电阻变化的检测区分了第一基因变体的存在和第二基因变体的存在，或与捕获核酸结合的任何其它基因变体或基因变体混合体的存在。在一些实施方案中，第一基因变体、第二基因变体和任何其它基因变体各自包含等位基因变体。在一些实施方案中，第一基因变体、第二基因变体和任何其它基因变体各自包含在样品中区分一种生物体与另一种生物体的存在的变体。
在一些实施方案中，将第一引物附着于基底或表面，例如扩增室的表面。在一些实施方案中，第一引物包含游离的5'-羟基。
在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含至少75℃、至少80℃或至少85℃的解链温度(Tm)。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸的长度范围为9至30个寡核苷酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸的长度范围为9至20个寡核苷酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含一个或多个锁核苷酸(locked nucleotide)。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含至少3个锁核苷酸。
在一些实施方案中，当与靶核酸的第二等位基因变体杂交时，阻断寡核苷酸基本上阻止包含所述第二变体的靶核酸的扩增。
在一些实施方案中，第一引物包含5'-磷酸核苷酸。
在一些实施方案中，在(b)之后，使扩增子与5'-3'外切核酸酶接触。
在一些实施方案中，捕获核酸的长度范围为9至30个寡核苷酸。在一些实施方案中，捕获核酸包含至少50℃、至少55℃或至少65℃的解链温度。在一些实施方案中，捕获核酸包含一个或多个锁核苷酸。在一些实施方案中，捕获核酸包含至少3个锁核苷酸。
在一些实施方案中，结合对第一成员包含生物素，而结合对第二成员包含链霉亲和素。
在一些实施方案中，(b)的扩增包含聚合酶链式反应。在一些实施方案中，(b)的扩增包含至少40个或至少50个聚合酶链式反应循环。
在一些实施方案中，对从受试者获取的样品实施该方法，其中，样品包含靶核酸。在一些实施方案中，样品获自妊娠雌性动物。
在一些实施方案中，样品包括或疑似包括生物体的至少一种基因变体。在一些实施方案中，样品包括或疑似包括至少一种包含基因变体的生物体。
在一些实施方案中，方法包括使至少一种基因变体区分于另一种基因变体。在一些实施方案中，方法包括使至少一种基因变体区分于另一种基因变体，由此检测和/或区分包含或疑似包含多个生物体的样品中的一个生物体。
在一些实施方案中，根据磁电阻变化来确定靶核酸中基因变体的存在。在一些实施方案中，根据磁电阻变化来确定靶核酸中第一基因变体的存在。在一些实施方案中，根据磁电阻变化来确定靶核酸中至少一个基因变体的存在。在一些实施方案中，在含有或疑似含有至少一个基因变体的样品中存在至少一个基因变体。在一些实施方案中，第一基因变体、至少一个基因变体或多个基因变体包含等位基因变体、至少一个等位基因变体和/或多个等位基因变体。
在一些实施方案中，提供了检测包含或疑似包含至少一种基因变体的样品中包含至少一种靶核酸的至少一种基因变体的方法，该方法包括：提供样品；使该样品与以下接触：(i)多种不同第一引物和(ii)多种不同第二引物，其中每种第二引物包含结合对第一成员，和(iii)聚合酶；扩增至少一种基因变体，由此提供所述至少一种基因变体的扩增子；(c)使扩增子与多种不同捕获核酸接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同基因变体互补的序列，由此提供包含结合对第一成员的可区分的所捕获扩增子；(d)使可区分的所捕获扩增子与包含结合对第二成员的第一可检测标记物接触；和(e)检测第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测传感器表面上第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。在一些实施方案中，(e)的检测包括动态检测过程。在一些实施方案中，动态检测过程包括在(e)的检测期间，升高传感器处或其附近，或者传感器表面处的温度。在一些实施方案中，动态检测过程包括在(e)的检测期间，改变传感器处或其附近，或者传感器表面处盐或阳离子的浓度。在一些实施方案中，动态检测过程包括在(e)的检测期间，使流体流过传感器表面。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测与捕获核酸结合的一种或多种可区分扩增子的结合，由此使一种基因变体区分于另一种基因变体。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测与传感器表面结合的可区分扩增子的量的变化。
在一些实施方案中，传感器包括磁性传感器，第一可检测标记物包括磁性颗粒，并且(e)的检测包括检测磁性传感器表面上或其附近处磁电阻的存在、不存在、量或变化。在一些实施方案中，(e)的检测包括检测传感器表面上磁电阻的变化。在一些实施方案中，根据在(e)中检测到的磁电阻变化来确定靶核酸中至少一种基因变体的存在。在一些实施方案中，(e)的检测包括将传感器表面处至少一种基因变体的存在、不存在或量与传感器表面处另一种基因变体的存在、不存在或量进行区分。在一些实施方案中，(e)的检测包括将传感器表面处至少一种基因变体的存在、不存在或量与传感器表面处另一种核酸的存在、不存在或量进行区分。在一些实施方案中，结合对第一成员包含生物素，而结合对第二成员包含链霉亲和素。在一些实施方案中，对从受试者获取的样品实施该方法，其中，该样品包含或疑似包含至少一种基因变体。在一些实施方案中，该样品包含无细胞DNA。
在一些实施方案中，在(a)之前，使样品与微流体通道接触，其中，将微流体通道可操作地和/或流控地连接到传感器。在一些实施方案中，在(a)之前，使样品与膜接触，该膜被配置为可逆地和/或非特异性地结合样品中的核酸，由此提供结合的核酸，其中将该膜可操作地和/或流控地连接到微流体通道和传感器。在一些实施方案中，在扩增室内进行扩增，该扩增室可操作地和/或流控地连接到微流体通道、传感器，并任选地连接到膜。在一些实施方案中，在(a)之前，该方法包括(i)使样品与(i)细胞裂解溶液、(ii)膜、(iii)任选的洗涤溶液和(iv)洗脱缓冲液接触，其中在与(iv)接触之后，结合的核酸从膜上释放出来。在一些实施方案中，将样品中的核酸通过微流体通道转运到膜，通过微流体通道从膜转运到扩增室，并通过微流体通道从扩增室转运到传感器表面上。
在一些实施方案中，传感器包括巨磁电阻(GMR)传感器。
在一些实施方案中，所述至少一种基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，所述至少一种基因变体包括至少两个单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方案中，所述至少一种基因变体包括单核苷酸突变。在一些实施方案中，所述至少一种基因变体包括至少两种单核苷酸突变。
在一些实施方案中，所述至少一种基因变体包括单核苷酸缺失或插入。在一些实施方案中，所述至少一种基因变体包括至少两种单核苷酸缺失或插入。
在一些实施方案中，所捕获扩增子与缓冲液进流体接触，并且在(e)的检测之前或期间，缓冲液中正电荷阳离子的浓度降低至少50％。在一些实施方案中，正电荷阳离子包括钠、钾、钙或镁。
在一些实施方案中，对至少一种基因变体的检测灵敏度低于每mL样品15个拷贝。
在一些实施方案中，该方法检测样品中浓度低至0.01％的靶序列的至少一种基因变体的存在。
在一些实施方案中，该方法检测样品中浓度低至1％的靶序列的至少一种基因变体的存在。
在一些实施方案中，该方法在微流控装置中进行。
在一些实施方案中，提供了检测靶核酸中第一基因变体的存在的方法，包括：(a)使靶核酸与(i)第一引物、(ii)第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸进行接触，其中阻断寡核苷酸包含与靶核酸的第二基因变体互补的序列，并且第一和第二引物被配置为用于扩增靶核酸，并扩增该靶核酸，由此提供该靶核酸的扩增子，其中在微流控装置的扩增室内进行扩增；(b)使扩增子与多个捕获核酸进行接触，由此提供捕获的扩增子，其中，(i)将捕获核酸附着于磁性传感器的表面，(ii)(b)的接触包括将扩增子通过第一微流体通道转运至磁性传感器，(iii)将第一微流体通道和磁性传感器布置在微流控装置内，和(iv)每个捕获核酸包含与靶核酸的第一基因变体互补的序列；(c)使捕获的扩增子与多个磁性颗粒进行接触，其中将磁性颗粒布置在微流控装置的第一腔室内，并且(c)的接触包括将磁性颗粒通过第二微流体通道从第一腔室转运至传感器；(d)用洗涤溶液清洗传感器，其中将洗涤溶液布置在微流控装置的第二腔室内，并且清洗包括将洗涤溶液通过第三微流体通道从第二腔室转运至传感器；和(e)检测与传感器表面缔合的一个或多个磁性颗粒的存在、不存在、量，其中在(d)之前、期间和/或之后执行检测。
在一些实施方案中，提供了检测包含或疑似包含至少一种基因变体的样品中包含至少一种靶核酸的至少一种基因变体的方法，该方法包括：提供样品；使该样品与以下接触：(i)多种不同第一引物和(ii)多种不同第二引物，其中每种第二引物包含结合对第一成员，和(iii)聚合酶；扩增至少一种基因变体，由此提供所述至少一种基因变体的扩增子，其中在微流控装置的扩增室内进行扩增；(b)使扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同基因变体互补的序列，由此提供可区分的捕获的扩增子，其中，(i)将捕获核酸附着于磁性传感器的表面，(ii)(b)的接触包括将可区分的捕获的扩增子通过第一微流体通道转运至磁性传感器，(iii)将第一微流体通道和磁性传感器布置在微流控装置内，和(iv)每个捕获核酸包含与靶核酸的所述至少一种基因变体互补的序列；(c)使可区分的捕获的扩增子与多个磁性颗粒进行接触，其中将磁性颗粒布置在微流控装置的第一腔室内，并且(c)的接触包括将磁性颗粒通过第二微流体通道从第一腔室转运至传感器；(d)用洗涤溶液清洗传感器，其中将洗涤溶液布置在微流控装置的第二腔室内，并且清洗包括将洗涤溶液通过第三微流体通道从第二腔室转运至传感器；和(e)检测与传感器表面缔合的一个或多个磁性颗粒的存在、不存在、量，其中在(d)之前、期间和/或之后执行检测。
在一些实施方案中，提供了在多重检测方案中检测至少两种不同靶核酸中至少两种不同基因变体的存在的方法，该方法包括：(a)提供在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中，至少两个GMR传感器包含至少两种不同捕获核酸，这些捕获核酸布置在所述至少两个(GMR)传感器的功能化表面上，其中每种不同捕获核酸都与至少两种基因变体中的一种互补；(b)使至少两种不同靶核酸中的每一种与(i)第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸进行接触，其中阻断寡核苷酸包含与靶核酸的基因变体互补的序列，并且将第一和第二引物配置为用于扩增至少两种靶核酸，并扩增所述至少两种靶核酸，由此提供所述至少两种靶核酸的扩增子；(c)使扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同基因变体互补的序列，由此提供包含结合对第一成员的可区分的捕获的扩增子；(d)使可区分的捕获的扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的多个第一可检测标记物进行接触；和(e)检测第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
在一些实施方案中，提供了在多重检测方案中任何检测包含或疑似包含至少一种基因变体的样品中包含至少一种靶核酸的至少一种基因变体的方法，该方法包括：提供在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中至少两个GMR传感器包含至少两种不同捕获核酸，这些捕获核酸被设置在至少两个(GMR)传感器的功能化表面上，其中每种不同捕获核酸都与至少两种基因变体中的一种互补；提供样品；使该样品与以下接触：(i)多种不同第一引物和(ii)多种不同第二引物，其中每种第二引物包含结合对第一成员，和(iii)聚合酶；扩增所述至少一种基因变体，由此提供至少一种基因变体的扩增子；(c)使扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同基因变体互补的序列，由此提供包含结合对第一成员的可区分的所捕获扩增子；(d)使可区分的所捕获扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的多个第一可检测标记物进行接触；和(e)检测第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括检测和/或区分包含基因变异的核酸(例如，靶核酸)，该基因变异在贯穿全文中也可互换地称为基因变体。在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测和/或区分包含基因变异的核酸(例如，靶核酸)，该基因变异包含一个或多个核苷酸缺失、重复、添加、插入、取代、突变、重复序列、基因同源物、基因直系同源物和/或多态性。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测和/或区分包含一种或多种等位基因变体的一种或多种基因变体。在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测和/或区分一种或多种等位基因变体，该等位基因变体包含存在于同一物种的不同成员中的一种或多种多态性。在一些实施方案中，这种等位基因变体产生具有相似但略有不同功能特性的蛋白表达，这使受试者易患或导致某些疾病状态或病况。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含癌基因中突变的等位基因变体。在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含基因中突变的等位基因变体，该基因中的突变在受试者中使其易患和/或导致癌症。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含EGFR基因中突变的等位基因变体。在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含EGFR基因中突变的等位基因变体，这种EGFR基因中突变包括EGFR的外显子21中c.2573T>G(由T变成G)取代。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含KRAS基因中突变的等位基因变体。在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种等位基因变体，该等位基因变体包含在KRAS基因的第35位由G变成T或由G变成A(即，编码第12个氨基酸并分别产生G12D和G12V突变的KRAS基因的密码子)。在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含多态性或突变的等位基因变体，该多态性或突变产生G12D、G12V、G13D、G12C、G12A、G12S、G12R或G13C氨基酸突变中的至少一种。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含KRAS基因中突变的等位基因变体，其包括在该方法中采用以下引物和阻断寡核苷酸中的至少一种：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)
阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)，
其中，“+”表示锁核酸。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含KRAS基因中突变的等位基因变体，其包括在该方法中采用以下引物和阻断寡核苷酸：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)
阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)，
其中，“+”表示锁核酸。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含KRAS基因中突变的等位基因变体，其包括采用以下捕获核酸中的至少一种：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含KRAS基因中突变的等位基因变体，其包括采用以下捕获核酸：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测是否存在，和/或区分一种或多种包含KRAS基因中突变的等位基因变体，其包括在该方法中采用以下捕获核酸、以下引物和阻断寡核苷酸以及捕获核酸：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)
阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)，其中，“+”
表示锁核酸
捕获核酸：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括检测和/或区分存在于不同生物体中的一种或多种同源物或直系同源物。在一些实施方案中，本文描述的方法包括根据对一个或多个样品中一种或多种此类基因变体的检测，来检测和/或区分存在于不同生物体中的一种或多种同源物或直系同源物。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或采用可检测标记物，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或采用可检测标记物，以区分属于或可能以其它方式划分为类群(例如系统发育群和/或分类群)的生物体。在这类实施方案中，提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分属于或可能以其它方式划分为类群(例如系统发育群和/或分类群)的生物体。在一些实施方案中，提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分属于相同或相似分类群的生物体，如相同或相似的目、相同或相似的科、相同或相似的属、相同或相似的亚属或者相同或相似的种。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以便根据一种或多种可区分的特征或性状来区分可划分为类群的生物体，这些特征或性状允许将样品中至少一种这样的生物体与其它生物体区分开来。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或采用可检测标记物，以区分一个或多个样品中的细菌生物体、真菌生物体、原生动物生物体、植物生物体、动物生物体。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或采用可检测标记物，以区分属于以下一个或多个类群的真菌生物体：
1.耳道假丝酵母菌(Candida auris)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、光滑假丝酵母菌(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母菌(Candida krusei)、黑马朗假丝酵母菌(Candida haemulonis)
2.烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)
3.新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)
4.粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、波萨达斯球孢子菌(Coccidioidesposadasii)
5.腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioidis)和串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)
6.耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)
7.皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)
8.荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)
9.米根霉菌(Rhizopus oryzae)、小孢根霉菌(Rhizopus microspores)
10.耳道假丝酵母菌(Candida auris)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物，这些引物包括下列引物中的至少一种，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
反向引物：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)
正向引物：5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQ ID NO:18)；或
正向引物：5Biosg/CATCGGCTTGAGCCGATAGTC(SEQ ID NO:33)
正向引物：5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)
反向引物：/5Phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)
反向引物：/5Phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)
正向引物：5Biosg/CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种引物，这些引物选自由下列引物组成的组，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
反向引物：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)
正向引物：5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQ ID NO:18)；或
正向引物：5Biosg/CATCGGCTTGAGCCGATAGTC(SEQ ID NO:33)
正向引物：5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)
反向引物：/5Phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)
反向引物：/5Phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)
正向引物：5Biosg/CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种捕获核酸，这些捕获核酸包括下列捕获核酸中的至少一种，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:30)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:31)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用多种捕获核酸，这些捕获核酸选自由下列捕获核酸组成的组，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:30)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:31)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用引物或引物组，这些引物或引物组被配置为扩增靶核酸，该靶核酸由此类一种或多种生物体所共有但在此类一种或多种生物体之间具有一个或多个核苷酸差异，因此可用作靶核酸，该靶核酸可用于根据此处和全文公开的方法和装置来区分此类一种或多种生物体。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括提供或采用一种或多种靶核酸，这些靶核酸被配置为捕获一种或多种扩增的靶核酸(在全文中也可互换地称为扩增子和/或可区分的扩增子)，这些扩增的靶核酸由此类一种或多种生物体所共有但在此类一种或多种生物体之间具有一个或多个核苷酸差异，因此可用作靶核酸，该靶核酸可用于根据此处和全文公开的方法和装置来区分此类一种或多种生物体。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分样品中存在或疑似存在的致病生物体。
在一些实施方案中，从生物来源(存活或死亡)获取样品。在一些实施方案中，样品获自受试者，例如哺乳动物受试者，如人类受试者。在一些实施方案中，样品获自患者。在一些实施方案中，从环境来源获取样品。在一些实施方案中，从环境来源获取样品，例如水源，如海洋、湖泊、河流、溪流、沼泽、泻湖、湿地、潮汐池、游泳池、支流、废水设施、废水库、水库、饮用水库、水处理设施和/或诸如此类。在一些实施方案中，从环境中获取样品，例如土壤、泥土、淤泥、粘土、浮渣、堆肥等。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括放大通过执行检测步骤测量的检测信号，包括在执行检测步骤之前：使所捕获扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的第二可检测标记物进行接触，其中第一可检测标记物通过第一和第二可检测标记物的第一和第二结合对之间的相互作用与第二可检测标记物缔合；由此放大在执行检测步骤时测量的检测信号。
在一些实施方案中，第一基因变体和第二基因变体各自包含等位基因变体。在一些实施方案中，至少一种基因变体包含等位基因变体。在一些实施方案中，至少两种基因变体包含等位基因变体。在一些实施方案中，检测到的每一种基因变体都使样品中存在的一种生物体区分于另一种生物体。
在一些方面，本文的实施方案涉及在查询样品中检测靶核酸中第一基因变体的存在的方法，包括：(a)提供传感器和捕获核酸，其中捕获核酸包含与靶序列的第一基因变体互补的序列，其中捕获核酸能够附着于巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面；(b)使靶核酸与(i)第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸接触，其中阻断寡核苷酸包含与靶核酸的第二基因变体互补的序列，并且将第一和第二引物配置为用于扩增靶核酸；(c)扩增靶核酸，以此提供靶核酸的扩增子；(d)使扩增子与捕获核酸进行接触，由此提供包含结合对第一成员的所捕获扩增子；(e)使所捕获的扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的可检测标记物进行接触；(f)将与步骤(e)的可检测标记物接触的所捕获扩增子通过GMR传感器；和(g)检测可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。在一些实施方案中，该方法包括在执行步骤(b)至(e)中的一个或多个步骤之前将捕获核酸附着在传感器的表面上。在一些实施方案中，该方法包括根据靶核酸中是否存在第一基因变体来检测受试者中是否存在癌症。在一些实施方案中，方法包括当检测到第一基因变体时，对受试者施用适当的治疗。在一些实施方案中，检测步骤(f)包括动态检测过程。在一些实施方案中，动态检测过程包括提高传感器表面处杂交条件的严格性。在一些实施方案中，结合对第二成员包含链霉亲和素。在一些实施方案中，第一结合对包含生物素。在一些实施方案中，第一基因变体、第二基因变体和任何其它基因变体各自包含等位基因变体。在一些实施方案中，第一基因变体、第二基因变体和任何其它基因变体各自包含使样品中存在的一种生物体区分于另一种生物体的变体。
在一些方面，本文的实施方案涉及放大传感器表面处信号的方法，用于在查询样品中检测靶核酸中第一基因变体的存在、不存在、量或其变化，包括：(a)提供传感器和捕获核酸，其中捕获核酸包含与靶序列的第一基因变体互补的序列，其中捕获核酸能够附着于巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面；(b)使靶核酸与(i)第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸接触，其中阻断寡核苷酸包含与靶核酸的第二基因变体互补的序列，并且将第一和第二引物配置为用于扩增靶核酸；(c)扩增靶核酸，以此提供靶核酸的扩增子；(d)使扩增子与捕获核酸进行接触，由此提供包含结合对第一成员的所捕获扩增子；(e)使所捕获扩增子与包含结合对第二成员的多个第一磁性颗粒进行接触；(f)将与步骤(e)的多个磁性颗粒接触的所捕获扩增子通过GMR传感器；(g)在步骤之后，使包含结合对第二成员的多个第二磁性颗粒通过传感器，其中，多个第二磁性颗粒的结合对第一成员结合多个第一颗粒的结合对第二成员；和(h)检测第一和第二多个磁性颗粒的存在、不存在、量或其变化，由此放大传感器表面处的信号。在一些实施方案中，该方法包括在执行步骤(b)至(e)中的一个或多个步骤之前将捕获核酸附着在传感器的表面上。在一些实施方案中，这种方法还包括使包含结合对第一成员的一种或多种后续多个磁性颗粒和包含结合对第二成员的一种或多种后续多个磁性纳米颗粒通过GMR传感器。在一些实施方案中，结合对包含链霉亲和素和生物素。在一些实施方案中，结合对第一成员包含链霉亲和素。在一些实施方案中，结合对第二成员包含生物素。在一些实施方案中，该方法包括根据靶核酸中是否存在第一基因变体来检测受试者中是否存在癌症。在一些实施方案中，方法包括当检测到第一基因变体时，对受试者施用适当的治疗。在一些实施方案中，检测步骤(f)包括动态检测过程。在一些实施方案中，动态检测过程包括提高传感器表面处杂交条件的严格性。在一些实施方案中，第一基因变体、第二基因变体和任何其它基因变体各自包含等位基因变体。在一些实施方案中，第一基因变体、第二基因变体和任何其它基因变体各自包含使样品中存在的一种生物体区分于另一种生物体的变体。
在一些方面，本文的实施方案涉及放大检测信号的方法，用于在查询样品中检测靶核酸中第一基因变体的存在，包括：(a)提供一种传感器，该传感器包含布置在巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面上的第一生物分子，该第一生物分子包含用于第二生物分子的条件结合位点，该第二生物分子包含用于磁性颗粒的结合位点；(b)使查询样品通过传感器；(c)使第二生物分子通过传感器；(d)在将查询样品通过传感器之后，使包含结合对第一成员的多个磁性颗粒通过传感器，然后使包含结合对第二成员的多个磁性颗粒通过传感器；和(e)基于测定使磁性颗粒通过传感器前后的磁电阻，通过测量GMR传感器的磁电阻变化来检测查询样品中分析物的存在，其中测定GMR传感器的磁电阻变化包括使用至少一个参考电阻器来执行GMR传感器磁电阻变化的相敏解调(phase-sensitive solution)；由此放大检测信号。
在一些方面，本文的实施方案涉及放大检测信号的方法，用于在查询样品中检测分析物的存在，包括：(a)提供一种传感器，该传感器包含布置在巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面上的第一生物分子，当分析物存在时，该生物分子包含用于磁性颗粒的结合位点；(b)使查询样品通过传感器；(c)在将查询样品通过传感器之后，使包含结合对第一成员的多个磁性颗粒通过传感器，然后使包含结合对第二成员的多个磁性颗粒通过传感器；和(e)基于测定使磁性颗粒通过传感器前后的磁电阻，通过测量GMR传感器的磁电阻变化来检测查询样品中分析物的存在，其中测定GMR传感器的磁电阻变化包括使用至少一个参考电阻器来执行GMR传感器磁电阻变化的相敏解调；由此放大检测信号。
在一些方面，结合对第一成员包含链霉亲和素，而结合对第二成员包含生物素。
在一些方面，结合对第一成员包含生物素，而结合对第二成员包含链霉亲和素。
在一些方面，GMR传感器的磁电阻变化包括放大的磁电阻变化。
在一些实施方案中，提供了在多重检测方案中检测一个或多个查询样品中一种或多种基因变体存在的方法，该方法包括：提供在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中至少两个GMR传感器包含至少两种不同捕获核酸，其中每种捕获核酸都包含与基因变体互补的序列，可以将这些捕获核酸设置在至少两个(GMR)传感器的功能化表面上，(a)使一个或多个查询样品通过传感器，由此，如果存在一种或多种分析物中的至少一种，则允许从至少两个生物分子中切割和移除带有缔合受体的可切割部分；(b)在将一个或多个查询样品通过传感器之后，使磁性颗粒通过传感器；和(c)基于测定使磁性颗粒通过传感器前后的磁电阻，通过测量至少两个GMR传感器中至少一个的磁电阻变化，在一个或多个查询样品中检测一种或多种分析物中至少一种的存在。
在实施方案中，提供了在多重检测方案中检测一个或多个查询样品中一种或多种分析物的存在的方法，包括：(a)提供至少两个在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中至少两个GMR传感器包含至少两种不同基因变体，将这些基因变体布置在至少两个(GMR)传感器的功能化表面上，每种不同生物分子包含：抗原部分，其在抗原结合位点处与抗体结合，该抗体还包含不同于抗原结合位点的部分，其被配置为结合磁性纳米颗粒；(b)使一个或多个查询样品和抗体的混合物通过传感器，其中如果一种或多种分析物存在于一个或多个查询样品中，则抗体的抗原结合位点结合该一种或多种分析物，由此防止抗体与至少两种生物分子中的至少一种的抗原部分结合；(c)在将混合物通过传感器之后，使磁性颗粒通过传感器；和(d)基于测定使磁性颗粒通过传感器前后的磁电阻，通过测量至少两个GMR传感器中至少一个的磁电阻变化，检测查询样品中分析物的存在。
在实施方案中，提供了在多重检测方案中检测一个或多个查询样品中一种或多种分析物存在的方法，包括：(a)提供至少两个在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中至少两个GMR传感器包含布置在GMR传感器的功能化表面上的至少两种不同生物分子，每种不同生物分子包含：结合区，其被配置为结合至少两种不同检测蛋白中的一种，该至少两种不同检测蛋白也能够结合一种或多种分析物中的一种，其中，当至少两种不同检测蛋白中的一种结合一种分析物时，它防止至少两种检测蛋白中的所述一种结合到生物分子的结合区；(b)使至少两种不同检测蛋白通过传感器；(c)使一个或多个查询样品通过传感器；(d)在将一个或多个查询样品通过传感器之后，使至少一种报告蛋白通过传感器，该至少一种报告蛋白能够结合至少两种检测蛋白，并且该至少一种报告蛋白被配置为结合磁性颗粒；(e)在将至少一种报告蛋白通过传感器之后，使磁性颗粒通过传感器；和(f)基于测定使磁性颗粒通过传感器前后的磁电阻，通过测量至少两个GMR传感器的磁电阻变化，检测一种或多种分析物的存在。
在一些实施方案中，将至少两个在空间上布置的GMR传感器布置在GMR传感器芯片的通道中，其中GMR传感器芯片包括至少一个通道。在一些实施方案中，将至少两个在空间上布置的GMR传感器布置在GMR传感器芯片的通道中，其中GMR传感器芯片包括多个通道。在一些实施方案中，将至少两个在空间上布置的GMR传感器分别布置在GMR传感器芯片的不同通道中，其中GMR传感器芯片包括多个通道。
在一些实施方案中，使磁性颗粒通过传感器包括在将报告蛋白通过传感器之后，使包含结合对第一成员的多个磁性颗粒通过传感器，随后使包含结合对第二成员的多个磁性颗粒通过传感器，并且其中GMR传感器的磁电阻变化包括GMR传感器的放大的磁电阻变化。
在一些实施方案中，本文所述方法的一些或全部步骤在微流控装置中进行，该微流控装置包括传感器和多个阀门、腔室、微流体通道和端口，它们被配置为引导样品、磁性颗粒和任选的一种或多种洗涤缓冲液流过传感器的表面。
在一些实施方案中，本文公开的方法在微流控装置中进行。
在一些实施方案中，本文所述的方法在本文所述的微流控装置中进行，其中该装置包括一个或多个微流体通道，其可操作地和/或流控地连接到扩增室和磁性传感器。
在一些实施方案中，本文提供了一种微流控装置，其包括一个或多个微流体通道，这些微流体通道可操作地和/或流控地连接到扩增室和传感器。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于实施本文所述方法的微流控装置，其中，该微流控装置包括：(a)微流体通道；(b)第一腔室，其包含膜；(c)扩增室；(d)3个或更多个微型电磁阀；和(d)传感器，其包括含有多个捕获核酸的表面；其中微流体通道与第一腔室、扩增室、3个或更多个阀门和传感器可操作地连接和/或流控地连接。权利要求47的微流控装置，其中传感器是磁性传感器。
在一些实施方案中，本文提供的微流控装置包括样品端口和一个或多个包含洗涤缓冲液的洗涤室，其中，该样品端口和一个或多个洗涤室可操作地和/或流控地连接至微流体通道和第一腔室。权利要求47至49中任一项的微流控装置，还包括包含磁性颗粒的第二腔室，其中该第二腔室可操作地和/或流控地连接至微流体通道和磁性传感器。在一些实施方案中，将磁性传感器安装在第三腔室内。在一些实施方案中，微流控装置还包括一个或多个废物收集室，其中该一个或多个废物收集室可操作地和/或流控地连接至微流体通道。在一些实施方案中，微流控装置还包括第一热源，其可操作地连接至扩增室。在一些实施方案中，微流控装置还包括冷却源，其可操作地连接至扩增室。在一些实施方案中，微流控装置还包括第二热源，其可操作地连接至磁性磁电阻传感器和/或第三腔室。在一些实施方案中，微流体通道可操作地连接至一个或多个隔膜泵或真空泵。在一些实施方案中，微流控装置包括一个或多个电接触焊盘(electrical contact pad)，其可操作地连接至三个或更多个阀门。在一些实施方案中，微流控装置包括存储芯片。在一些实施方案中，微流控装置的长度为3至10cm，宽度为1至5cm，并且厚度为0.1至0.5cm。在一些实施方案中，微流控装置包括或组成为自备的盒或卡板(cartridge or card)，该筒盒或卡板包含冻干的扩增试剂和冻干的磁珠。
在一些实施方案中，该微流控装置被配置为与控制器和/或计算机集成。例如，在一些实施方案中，微流控装置以可移除的卡板或盒的形式存在。
在其它方面，实施方案涉及被配置为执行前述方法的系统。
根据以下详细描述、附图和所附权利要求书，本公开的其它方面、特征和优点将变得明显。
附图说明
下文将参考附图描述本公开的各种实施方案，其中：
图1是根据本公开实施方案的系统中使用的示例性盒式读取单元的透视图。
图2A是根据本公开的实施方案，系统中使用的示例性盒式组件(assembly)的透视图。
图2B是根据本文的实施方案，图2A的盒式组件的部件分解图。
图2C是根据本文的实施方案，图2A的盒式组件的示意图。
图2D示出了图2A的盒式组件的横截面，显示了样品处理卡与其感测和通信基底之间的连接界面。
图3是根据本公开实施方案的系统的示意图。
图4示出了根据实施方案，当使用本文公开的图3的系统的特征时，用于执行样品中的分析物检测的方法的步骤。
图5A示出了根据实施方案，包括多个GMR传感器的盘旋形通道。
图5B示出了根据实施方案，用于GMR感测的基底上多个通道的排列。
图6A示出了根据实施方案，其中布置有GMR传感器的通道在线性长度上的横截面。
图6B示出了根据实施方案，具有圆形通道扩展(GMR传感器所在处)的通道在线性长度上的横截面。
图6C示出了根据实施方案，具有方形通道扩展(GMR传感器所在处)的通道在线性长度上的横截面。
图6D示出了根据实施方案，具有三角形通道扩展(GMR传感器所在处)的通道在线性长度上的横截面。
图6E示出了根据实施方案，其中布置有GMR传感器的盘旋形通道的剖面图。
图6F示出了根据实施方案，具有布置有GMR传感器的圆形通道扩展的盘旋形通道的剖面图。
图6G示出了根据实施方案，带有分叉并且其中布置有GMR传感器的通道的剖面图。
图7示出了根据实施方案，具有圆形通道扩展(不同GMR传感器所在处)的通道在线性长度上的横截面。
图8A示出了根据实施方案，具有多个通道的GMR传感器芯片，其中在圆形扩展处安装有GMR传感器，并且通过布线将GMR传感器与接触焊盘连接起来。
图8B示出了根据实施方案，圆形通道扩展中GMR传感器周围区域的扩展，其显示了布线网络。
图8C示出了根据实施方案，开关的结构。
图9示出了根据实施方案，圆形通道扩展和存在于其中的GMR(并通过导线附着至接触焊盘)的横截面示意图。
图10A示出了根据实施方案，不含扩展的通道和存在于其中的GMR以及设置在GMR传感器上的生物表面层的横截面表示。
图10B示出了根据实施方案，GMR传感器的基本结构和工作原理。
图11A示出了根据实施方案，消减GMR感测过程的结构状态示意图。
图11B示出了图11A的GMR感测过程的处理流程示意图。
图12A示出了根据实施方案，加性GMR感测过程的结构状态示意图。
图12B示出了图12A的GMR感测过程的处理流程示意图。
图13A示出了根据实施方案，加性GMR感测过程的另一种结构状态示意图。
图13B示出了图13A的GMR感测过程的处理流程示意图。
图13C示出了图13A的GMR感测过程的备选流程示意图。
图14A示出了根据实施方案，加性GMR感测过程的结构状态示意图，在该过程中分析物对结合到生物表面的分子进行修饰。
图14B示出了图14A的GMR感测过程的处理流程示意图。
图15A示出了根据实施方案，加性GMR感测过程的备选结构状态示意图，在该过程中分析物对结合到生物表面的分子进行修饰。
图15B示出了图15A的GMR感测过程的处理流程示意图。
图16A示出了采用示例性“三明治”抗体过程的加性GMR感测过程的结构状态示意图。
图16B示出了图16A的GMR感测过程的处理流程示意图。
图17A示出了GMR传感器用于检测D-二聚体型心脏生物标志物产生的数据图：实线为阳性对照；虚线为样品运行；以“+”表示的线是阴性对照。
图17B示出了使用GMR传感器检测D-二聚体型心脏生物标志物的D-二聚体校准曲线。
图17C示出了GMR传感器用于检测肌钙蛋白心脏生物标志物生成的数据图。
图18示出了根据本教导的实施方案，放大GMR信号的示例。
图19示出了本文描述的示例性方法的示意性概述。在一些实施方案中，将样品导入包含膜的第一腔室(104)内，该膜被配置为可逆地结合核酸。可以通过导入细胞裂解溶液(裂解缓冲液)，在样品室100中裂解存在的任何细胞。可以清洗、洗脱结合到膜上的核酸，并经由微流体通道将其转运到扩增室208。可以将用于扩增的各种试剂导入扩增室208内，如引物、dNTP、阻断寡核苷酸、聚合酶和盐类。这类试剂可以在导入靶核酸之前存在于扩增室中。可以对扩增室进行热循环，从而可以执行PCR。微流控装置上可以存在加热和冷却部件。可以将扩增子通过微流体通道转运到包含外切核酸酶的第二腔室204和/或导向包含捕获核酸的传感器300(例如，GMR传感器)。任选地，可以将外切核酸酶导入扩增室(例如，在产生扩增子后)、相邻腔室或安装有传感器的腔室内。可以将存放在储存室230中的颗粒(例如，磁性珠)导入包含传感器的腔室内。在一些实施方案中，传感器和/或扩增室可操作地连接到一个或多个加热和/或冷却源。可以在传感器300上检测磁电阻和/或磁电阻的变化。
图20示出了使用包含5'-磷酸的第一引物和包含生物素部分的第二引物的扩增过程的示例。第一引物的5'磷酸允许包含5'磷酸的扩增子链由5'-3'外切核酸酶降解。包含锁核苷酸的阻断寡核苷酸的存在被配置为与不具有感兴趣的变异/突变的核酸杂交。阻断寡核苷酸被配置为与非突变模板退火，由此形成具有高解链温度的双链体。由阻断寡核苷酸形成的双链体的高解链温度基本上防止了不具有感兴趣突变的模板的扩增。
图21展示了5'-3'外切核酸酶特异性降解具有5'-磷酸基团的扩增子。包含生物素基团和/或缺少游离5'-羟基的扩增子不会被外切核酸酶消化。
图22展示了在带有捕获核酸的传感器表面上捕获生物素化的扩增子。在一些实施方案中，捕获核酸包含锁核苷酸。将捕获核酸配置成与具有感兴趣的基因变异(例如，突变)的生物素化扩增子的区域特异性退火。捕获核酸中的锁核苷酸的存在增强了杂交的特异性。包含链霉亲和素(S)的磁性珠/颗粒(MNP)与所捕获扩增子上的生物素(B)结合。
图23示出了在检测和/或测量传感器表面处的磁电阻的同时，对磁性传感器表面施加热的过程。与具有同捕获核酸完全互补序列的扩增子相比，与捕获核酸非特异性杂交的扩增子会在较低的温度下从传感器表面释放出来。在较高温度检测到的磁电阻变化更能说明靶核酸中存在感兴趣的特定突变。
图24示出了本文所述检测方法的示例性工作流程图，其发生在包括一个或多个微流体通道105的微流控装置上。在一些实施方案中，阀门120(例如V1-V14)是微型先导式电磁阀(例如Lee公司阀门)，它们可以各自独立地进行卡外(off-card)控制。微流体通道可以可操作地连接到一个或多个隔膜泵或注射泵，这些泵与阀门120相配合，可以控制和引导样品流经该装置。每个阀门和泵可以独立运行或一起运行。
图25示出了包含在盒600上的示例性微流控装置的前视图，其被设计成与计算机/控制器和一个或多个泵集成。盒600可以实现本文所述以及图24中所示的工作流程。
图26示出了盒600的后视图。
图27示出了可以如何使用不同捕获核酸来检测核酸样品中EGFR基因的L858RDNA(即，c.2573T>G突变)，其中每种捕获核酸可以根据其解链温度来区分。图27中显示的数据是使用动态检测过程进行的6次不同实验运行的叠加。捕获核酸SEQ ID NO:6
Figure BDA0003631321900000261
显示为紫色。还测试了另外四种捕获核酸，每种核酸都被配置为与包含T>G突变的相同靶序列杂交，并且每种核酸都具有不同的解链温度。显示最高信号的红线是由直接附着在传感器表面的生物素化探针产生的。黄线代表阴性对照，其中捕获核酸不与样品中的DNA结合。在约1400秒的时间段内(X轴)测量传感器表面处的磁电阻(信号)。Y轴上显示的“信号”本身是无单位的。该信号(Y轴)的计算方法是将任意时刻时传感器处的磁电阻除以基准磁电阻，从而得出信号。在约600秒时，将包含链霉亲和素的磁性珠添加到GMR传感器。磁珠与传感器表面上捕获的生物素化扩增子结合，或与对照探针(红色)结合。在约620秒时，磁性珠的结合引起传感器表面处的信号急剧增加。接下来，通过提高流过传感器表面的缓冲液温度，将传感器处的温度从45℃(在约620秒时)缓慢升高至85℃(在约1400秒时)。随着温度升高，所捕获扩增子开始变性并离开传感器表面。具有较高解链温度的捕获核酸在较高温度变性，并且可以与其它捕获核酸区分开。在此实验中，每种捕获核酸的解链温度(显示在图的顶部)是根据经验确定的，即在峰值信号(Y轴，在约625秒时)降低50％时的点。
图28示出了仅包含EGFR野生型靶序列的生物素化扩增子(即，不存在突变的扩增子)的动态检测。本实验采用捕获核酸SEQ ID NO:6
Figure BDA0003631321900000262
其含有与野生型靶序列错配的核苷酸。本实验证明，通过提高传感器表面处杂交条件的严格性，可以将野生型扩增子与捕获核酸的结合(假阳性)与突变靶序列的结合(真阳性，数据未显示)区分开。在本实验中，链霉亲和素标记的磁性珠在约175秒时与所捕获的生物素化扩增子接触，从而在约180秒时在传感器表面处产生强信号峰。流经传感器表面的缓冲液中的钠离子浓度迅速从约50mM钠变为10mM钠，在约210秒时达到10mM。因为系统是动态的，传感器总是用持续移动的缓冲液冲洗，所以附着在磁性珠上的变性扩增子被洗掉。相应地，这种初始的严格性提高导致信号下降约75％(例如，参见300秒时的信号)。然后，流经传感器表面的缓冲液温度从约300秒时的约45℃缓慢升高至约1000秒时的约85℃。温度的这种升高使剩余的杂交扩增子变性，表明在约550秒时计算的假阳性杂交的解链温度为52℃(10mM Na)，该解链温度比捕获核酸与突变靶序列(真信号，未显示)的解链温度低约15℃。仅仅是钠离子浓度的变化并不影响捕获核酸与突变靶DNA的解链温度(即，67℃，数据未显示)。本实验表明，通过提高传感器表面上杂交条件的严格性(例如，通过动态降低钠离子浓度和升高温度)，可以将假阳性信号(即，错配的扩增子)与真阳性信号(即，完全匹配的扩增子)区分开来。
图29A&29B示出了使用本文描述的包含GMR传感器的微流控装置进行动态检测过程的结果。对从未患癌症的健康受试者获取的样品(图29A)实施本实验，其中样品cfDNA仅含有EGFR基因的野生型靶序列。图29A顶部的序列显示了捕获核酸和来源自受试者野生型DNA的扩增子之间的错配比对，随着时间的推移，传感器表面上的严格性条件提高，检测到的信号较低(蓝线，蓝色实心圆圈)。相应地，图29A的数据(蓝线)显示受试者的EGFR基因中不存在c.2573T>G突变，因此在该受试者中不存在癌症。本实验在一名已知因EGFR基因中c.2573T>G突变而患癌症的受试者上重复进行(图29B)。图29B顶部的序列比对显示了捕获核酸和来源自受试者突变DNA的扩增子之间的完全匹配，随着时间的推移，传感器表面上的严格性条件提高，检测到高信号(蓝线，蓝色实心圆圈)。相应地，图29B示出了在患者的EGFR基因中检测到c.2573T>G突变的阳性，因此证实该受试者中存在癌症。图29B的患者是c.2573T>G突变的杂合体，并且该cfDNA样品包含比例为99:1的错配野生型靶DNA和突变靶序列。相应地，这种测定方法的灵敏度足以在大量野生型序列中检测出少量的突变靶序列。
图30示出了使用本文所述的包含GMR传感器的微流控装置，对从患者获取的样品进行多次重复的动态检测过程的结果，其显示检测出KRAS G12D突变，其中G12D突变低至0.1％。该数据还表明，相同的阻断剂和引物可用于检测单个区域内的多种不同突变。
图31示出了使用本文所述的包含GMR传感器的微流控装置，对游离DNA样品进行动态检测过程的结果，其显示检测出。
发明详述
本文提出了包含传感器的微流控装置，其可用于检测包含核酸的样品(例如，血浆样品)中的基因变异。例如，此类微流控装置包含传感器，如磁性传感器。在一些实施方案中，此类微流控装置包含巨磁电阻(GMR)传感器。
在一些实施方案中，本文所述的装置和方法可以准确检测出在少至1ml血浆中存在的游离DNA中的单点突变。本文提出的装置能够快速、非侵入性和高灵敏度地检测出由基因变异导致的或与基因变异相关的癌症和其它病症。
由附图和以下描述可以明显看出，本公开涉及一种样品处理系统(或如贯穿本公开中提到的“系统”)，其可用于检测样品中一种分析物(或多种分析物)的存在。在一个实施方案中，在图3中描绘为系统300的该系统可以包括(1)样品处理系统或“盒式组件”，其包括样品制备微流体通道和至少一个用于感测测试样品中生物标志物的感测设备(或传感器)，和(2)数据处理和显示设备或“盒式读取单元”，其包括用于处理盒式组件的感测设备的任何感测数据的处理器或控制器，以及用于显示检测事件的显示器。这两个组成部分共同组成了系统。在一个实施方案中，这些组成部分可以包括可变特征，包括但不限于一个或多个试剂筒盒、废物筒盒和流动控制系统(可以是例如气动流动控制器)。
总体来说，为了使盒式组件完成分析物、生物标志物等的检测，并经由盒式读取单元输出，在盒式组件中制备样品的过程如下所示：将原始患者样品加载到卡板上，任选地通过滤膜过滤，之后由卡板外气动装置产生的负压将样品过滤成分离的测试样品(如血浆)。该分离的测试样品通过通道的几何结构在卡板上(on-card)进行定量。在流过传感器/感测设备之前，通过与来自混合物料源(如，塑模包装、储存室、筒盒、孔等)的混合物料(例如，试剂(可以是干的或湿的)、缓冲液和/或洗涤缓冲液、珠子和/或珠子溶液等)的相互作用，在卡板上制备样品。样品制备通道可以被设计成使得任意数量的通道可以垂直堆叠在卡板中，从而允许使用多个患者样品。感测微流控装置也是如此，它们也可以垂直堆叠。作为盒式组件的一部分的样品制备卡板，包括一种或多种提供功能的结构，所述功能选自过滤、加热、冷却、混合、稀释、添加试剂、层析分离及其组合；以及用于在整个样品制备卡板中移动样品的构件/手段。关于这些特征的进一步描述后面在下文中提供。
图1示出了根据一个实施方案，在系统300(参见图3)中使用的盒式读取单元100的示例。例如，可以将盒式读取单元100配置成足够紧凑和/或小巧，以成为手持式便携仪器。盒式读取单元100包括主体或壳体110，其具有显示器120和用于接收盒式组件的盒式接收器130。如果读取部件100被托在操作人员的手中，壳体110可以具有人机工程学设计以获得更大的舒适性。然而，壳体110的形状和设计并非意在受到限制。
例如，盒式读取单元100可以包括界面140和显示器120，用于提示用户输入和/或连接盒式组件200与该单元和/或样品。根据一个实施方案，与所公开的盒式组件200相组合，系统300可以使用传感器(GMR)技术来处理、检测、分析和生成结果报告，例如关于测试样品中多种检测到的生物标志物如五种心脏生物标志物，并且进一步显示生物标志物结果，作为一个过程的一部分。
例如，显示器120可以被配置成向操作人员或用户显示信息。显示器120可以以集成显示屏或触摸屏(例如，具有触觉反馈或触控回馈)的形式提供，例如，在壳体110提供上的LCD屏或LED屏或任何其它平板显示器，并且(任选地)提供输入界面，该输入界面可以被设计为充当终端用户界面(UI)140，操作人员可以使用该界面向单元100输入命令和/或设置，例如，通过将手指触摸到显示器120本身。显示器120的尺寸可以有所不同。更具体地说，在一个实施方案中，显示器120可以被配置为显示控制面板，其上具有按键、按钮、菜单和/或键盘功能，作为终端用户界面的一部分，用于输入系统300的命令和/或设置。在一个实施方案中，控制面板包括功能键、启动和停止按钮、返回或输入按钮以及设置按钮。另外地和/或备选地，在一个实施方案中，尽管图1中未示出，但是盒式读取器100可以包括任意数量的物理输入设备，包括但不限于按钮和键盘。在另一实施方案中，盒式读取器100可被配置为经由另一设备接收输入，例如经由直接或有线连接(例如，使用插头和电源线连接到计算机(PC或CPU)或处理器)或经由无线连接。在又一实施方案中，显示器120可以是显示于集成屏幕，或者可以是外部显示系统，或者可以是两者。经由显示控制单元120，测试结果(例如，来自盒式读取器310，例如参考图3进行描述)可以显示在集成或外部显示器上。在又一实施方案中，用户界面140可以与显示器120分开提供。例如，如果触摸屏UI不用于显示器120，可利用其它输入设备作为用户界面140(例如，遥控器、键盘、鼠标、按钮、操纵杆等)，并且可以与盒式读取器100和/或系统300相关联。相应地，应该理解的是，用于输入到盒式读取器100的设备和/或方法并非意在限制。在一个实施方案中，盒式读取器100和/或系统300的所有功能都可以通过显示器120和/或输入设备来管理，包括但不限于：启动处理方法(例如，通过启动按钮)、选择和/或更改测定和/或盒式组件200的设置、与气动技术相关的选择和/或设置、确认任何输入提示、查看处理测试样品的方法中的步骤、和/或查看(例如，通过显示器120和/或用户界面140)测试结果和由GMR传感器和控制单元/盒式读取器计算的值。显示器120可以视觉显示与样品中分析物检测相关的信息。显示器120可以被配置为显示从控制单元/盒式读取器生成的测试结果。在一个实施方案中，可以在显示器120上显示关于已经由盒式读取单元/控制器确定/处理的测试结果(通过从感测设备接收测量值，该测量值被确定为检测到的分析物或生物标志物的结果)的实时反馈。
任选地，还可以提供扬声器(未示出)作为盒式读取单元100的一部分，用于提供音频输出。可以输出任意数量的声音，包括但不限于语音和/或警报。盒式读取单元100还可以包括或备选地或任选地包括任意数量的连接器，例如LAN连接器和USB连接器，和/或与其相关联的其它输入/输出设备。LAN连接器和/或USB连接器可用于将输入设备和/或输出设备连接到盒式读取单元100，包括可移动存储器或驱动器或其它系统。
根据一个实施方案，盒式接收器130可以是壳体110内的开口(如图1所示)，其中可以插入盒式组件(例如，图2的盒式组件200)。在另一实施方案中，盒式接收器130可以包括托盘，该托盘被配置为在其中接收盒式组件。这种托盘可以相对于壳体110移动，例如从其中的开口移出和移入其中的开口，从而接收盒式组件200并将盒式组件移入(和移出)壳体110。在一个实施方案中，托盘可以是弹簧加压(spring-loaded)托盘，其被配置为相对于壳体110可释放地锁止。稍后将参照图3描述与盒式读取单元100相关的其它细节。
如之前所提到，盒式组件200可以被设计成插入到盒式读取单元100中，如此使得可以制备、处理和分析样品(例如，血液、尿)。图2A-2C展示了根据本文的实施方案，盒式组件200的示例性实施方案。参考这些附图描述了与所公开的盒式组件200相关的一些总体特征。然而，如后面更详细的描述，几种不同类型的盒体卡板和因此的盒式组件可以与盒式读取单元100一起使用，从而作为系统300的一部分来提供。在实施方案中，样品处理系统或盒式组件200可以采用一次性组件的形式，用于进行单次测试。也就是说，正如通过本文的描述将会进一步理解的那样，根据被测试的样品和/或分析物的类型，可以使用不同的盒体卡板配置和/或盒式组件。图2A示出了根据本文的实施方案，盒式组件200的俯视斜视图。盒式组件200包括样品处理卡板210以及感测和通信基底202(另见图2B)。总体来说，样品处理卡板210被配置为接收样品(例如，经由样品端口如注入端口，下文也有描述)，并且一旦被插入到盒式读取单元100中，就处理样品并引导样品流动以产生制备好的样品。卡板210还可以将来自用于制备测试样品的样品和/或流体的废物储存在内部废物室中(未在图2A中示出，但下文将进一步描述)。存储芯片275可以被读取和/或写入，并用于储存例如与盒体应用、传感器校准和所需样品处理相关的信息。在一个实施方案中，存储芯片275被配置为储存气动系统方案，该方案包括用于选择性地向盒式组件200的卡板210施加压力的步骤和设置，并因此实施用于制备样品以递送到传感器(例如，GMR传感器芯片280)的方法。存储芯片可用于防止插入到单元100中的每个盒式组件200出错，因为它包括每次测定的自动化程序(automation recipe)。存储芯片275还包含对制造每个卡板210和/或盒式组件200的可追溯性。感测和通信基底202可被配置为建立和维持与盒式读取单元100的通信，以及接收、处理和感测所制备样品的特征。基底202与盒式读取单元100中的控制器建立通信，如此使得可以检测所制备样品中的分析物。将样品处理卡板210以及感测和通信基底202(例如，参见图2B)组装或组合在一起，以形成盒式组件200。在一个实施方案中，可以任选地使用粘合材料(例如，参见图2D)将卡板210和基底202相互粘附。在一个实施方案中，基底202可以是贴附于样品处理卡板210的薄片层。在一个实施方案中，基底202可设计为层压至样品处理卡板210的柔性电路。在另一实施方案中，样品处理卡板210可以由陶瓷材料制成，其上集成有电路、传感器(传感器芯片280)和流体通道。备选地，卡板210和基底202可以机械对准并连接在一起。在一个实施方案中，基底202的一部分可以从卡板210的边缘或端部延伸出来，如图2A所示。在另一实施方案中，如图2B所示，基底202可以对准和/或调整大小，以使其边缘类似于或小于卡板210。
图2C示意性地展示了根据一个实施方案，盒式组件200的特征。如所示的，一些特征可以在样品处理卡板210上提供，而其它特征可以与基底202相关联。总体来说，为了接收测试样品(例如，血液、尿)(在卡板的主体内)，盒式组件200包括样品注入端口215，其可以在卡板210的顶部提供。作为卡板210的一部分，还任选地提供有过滤器220(在本文中也称为滤膜)、通气口225、阀阵列230(或阀阵列区230)和气动控制口235。在卡板210内提供有连通通道233，以流体连接卡板210的这类特征。气动控制口235是盒式组件200上气动接口的一部分，用于选择性地将加压流体(空气)施加到卡板的连通通道233，以引导其中的流体(空气、液体、测试样品等)流动和/或阀阵列230。任选地，卡板210可以包括连接到指定连通通道233的不同阀控制口535，用于控制阀阵列230中的阀门。卡板210还可以具有一个或多个计量室240、气体渗透膜245和混合通道250，它们通过连通通道233进行流体连接。计量室被设计成经由连通通道233至少在其中接收测试样品(直接或过滤后)。总体来说，样品可以通过端口215注入到盒式组件200中，并且通过使用过滤器(例如，过滤器220)进行过滤、在计量室240中计量、在混合通道250中混合、加热和/或冷却(任选的)以及经由连通通道233、气动控制口235和阀阵列230引导和改变流速来处理。例如，可以使用内部微流体通道(在整个本公开中，通常也称为连通通道233)和阀门，通过气动系统(例如，盒式读取单元100中的系统330，如图3中所示)和气动接口的连接来控制流体的流动，例如在具有气动控制口235或类似连接部件的卡板210上。根据一个实施方案，可以通过加热器259实现对卡板210内测试样品和/或混合物料/流体的任选加热，该加热器可以设置在PCB/基底202的顶侧上，以具有热敏电阻的线轨形式存在。根据一个实施方案，可以通过集成在盒式组件200中(例如，在基底202上)的TEC模块，或者在另一实施方案中，通过集成在盒式读取单元100内部的模块，实现对卡板210内测试样品和/或混合物料/流体的任选冷却。例如，如果冷却模块在单元100中提供，则在需要冷却时，可将其压靠在盒式组件200上。处理过程还可以任选地包括经由卡板210上的任选试剂部件260(和/或塑模包装)和/或经由盒式读取单元100的壳体110中的试剂盒件导入试剂。可以根据分析的样品和盒式组件200处理的需要，释放或混合试剂。此外，在卡板210上可以提供任选的塑模包装265，以便在处理期间通过连通通道233将物料如试剂、洗脱液、洗涤缓冲液、磁性纳米颗粒、珠子溶液或其它缓冲液导入样品中。任选地，还可以在卡板210上提供一个或多个内部废物室(在本文中也称为用于废物储库的废物罐)270，以储存来自样品和试剂的废料。如下文所述，提供输出端口255—也称为传感器递送端口或传感器输入端口—用于将制备的样品从卡板210输出到GMR传感器芯片280，以检测测试样品中的分析物。输出端口255可以流体连接到计量室，用于将测试样品和一种或多种混合物料递送至传感器。相应地，传感器可以配置为通过至少一个输出端口255来接收测试样品和一种或多种混合物料。在实施方案中，提供输入端口257—也称为废物递送端口或传感器输出端口—用于将任何流体或样品从GMR传感器芯片280输出到废物室270。废物室270可以通过连通通道233流体连接到卡板210的其它特征(包括，例如计量室240、输入端口257或二者)。
盒式组件200能够在存储芯片275上储存、读取和/或写入数据，该存储芯片275可以与卡板210或基底202相关联。如前所述，存储芯片275可用于储存与盒体应用、传感器校准和所需样品处理(在样品处理卡板内)有关和/或相关的信息，以及接收基于所制备和处理的样品的额外信息。存储芯片275可位于样品处理卡板210上或基底200上。
正如之前所提到的，根据本文的实施方案，使用本文公开的系统，磁电阻传感器可用于确定测试样品内的分析物(例如，生物标志物)。虽然说明书和附图提到使用特定类型的磁电阻传感器，即巨磁电阻(GMR)传感器，但应该理解的是，本公开并不限于GMR传感器平台。根据一些实施方案，该传感器可以是例如各向异性磁阻(AMR)传感器和/或磁性隧道结(MTJ)传感器。在实施方案中，还可以利用其它类型的磁阻传感器技术。然而，仅出于解释的目的，说明书和附图提及将GMR传感器作为磁阻传感器使用。
盒式组件200的基底202可以是或包括电子界面和/或电路界面，例如PCB(印刷电路板)，其可以具有巨磁电阻(GMR)传感器芯片280和与其相关联的电接触焊盘290(或电接触部分)。在基底202上还可以提供其它部件。根据一个实施方案，GMR传感器芯片280至少是附着在基底202上。例如，GMR传感器芯片280可以放置在基底202上并使用粘合剂附着在基底202上。在一个实施方案中，在GMR传感器280和PCB基底202之间可以使用液体粘合剂或粘合胶带。例如，这种设计可能需要在底部与PCB粘合，并在顶部与处理卡板粘合。备选地，用于将GMR传感器芯片280附着到基底202的其它方法包括但不限于：将GMR传感器通过摩擦适配(friction fitting)安装到PCB，并将GMR传感器芯片280的顶部直接连接到样品处理卡板210(例如，特别是当基底202以层压至(到背面)样品处理卡板210的柔性电路的形式提供时)。GMR传感器芯片280可以被设计成从样品处理卡板210的输出端口255接收制备的样品。相应地，根据卡板210上的输出端口255的位置，可以改变或更改GMR传感器芯片280在基底上的放置(因此，图2B中所示的图示并非意在限制)—反之亦然。在一个实施方案中，GMR传感器芯片280位于基底202的第一侧上(例如，面向卡板210底面的顶侧，如图2B所示)，例如，以便从卡板210底面上输出的输出端口接收制备的样品，并且接触焊盘290位于对侧，即基底的第二侧(例如，在基底202的底侧或底面上，使得当组装完毕以插入盒式读取单元100时，接触焊盘290暴露于盒式组件200的底侧上)。GMR传感器芯片280可包括其自身关联的接触焊盘(例如，金属条或引脚)，这些接触焊盘通过PCB/基底202上的电子连接与设置在其底面的电接触焊盘290进行电子连接。相应地，当盒式组件200插入盒式读取器100中时，电接触焊盘290被配置为充当电子接口并建立电子连接，从而与盒式读取单元100中的电子设备(例如，盒式读取器310)进行电子连接。因此，传感器芯片280中的任何传感器都通过电接触焊盘290和GMR传感器芯片280的接触焊盘连接到盒式读取单元100中的电子设备。
图2D示出了卡板210和基底202的配合或连接界面的示例性横截面视图。更具体地说，图2D展示了根据一个实施方案，卡板210上的输出端口255与基底202的GMR传感器芯片280之间的界面。例如，所示的是根据本文公开的任何实施方案，位于卡板210下方并与其邻近的PCB基底202。基底202可以附着于卡板210的底表面。卡板210在其至少一层中具有通道特征，在此处标记为微流体通道433(它是卡板210内的许多连通通道之一)，其设计用于将卡板210内处理的测试样品引导至导向GMR传感器280的输出端口255。任选地，可以在卡板210的层之间提供粘合材料，例如，可以在卡中具有试剂端口434B的层和具有通道433的层之间提供粘合剂434A。基底202包括GMR传感器芯片280，该芯片的位置与卡板210的通道433和输出端口255邻近。
磁场(来自不同于磁场发生器360的磁性线圈365，下文参考图3进行描述)可以用于激发位于传感器附近的纳米颗粒磁性颗粒。
GMR传感器的灵敏度超过了各向异性磁阻(AMR)或霍尔(Hall)传感器。这一特性使得能够在纳米级别上检测来自磁性材料的杂散磁场。例如，结合在传感器表面上的磁性纳米颗粒产生的杂散磁场将改变磁性层中的磁化，从而改变GMR传感器的磁电阻。相应地，每单位面积上结合到GMR传感器的磁性纳米颗粒的数量变化可以反映在GMR传感器的磁电阻值的变化中。
出于这些原因，根据本文所述的实施方案，盒式组件200中使用的传感器是GMR传感器芯片280。
现在参考图3，示出了系统中提供的特征的概述。特别是，示意性地示出了盒式读取单元100的一些额外特征，以进一步描述盒式读取单元100和盒式组件200如何被配置成一起工作，以提供用于检测样品中一种或多种分析物的系统300。如图所示，盒式组件200可插入盒式读取单元100的壳体110中。总体来说，盒式读取单元100的壳体110还可以包括或包含处理器或控制单元310(贯穿本文也称为“控制器”和/或“盒式读取器”310)、电源320、气动系统330、通信单元340、(任选的)诊断单元350、磁场发生器360和存储器370(或数据存储器)，以及其用户界面140和/或显示器120。任选地，试剂开启器(例如，图6中的穿刺系统533)，例如用于开启插入的盒式组件上的试剂源或用于将试剂导入盒式组件内(例如，如果试剂未包含在特定试剂部件的组件中)，也可以作为盒式读取单元100的一部分来提供。一旦将盒式组件200插入盒式读取单元100的壳体110内，电子和气动系统进行连接，并且可以从盒式组件200读取盒存储芯片275(例如，由单元100中的盒式读取器310/控制单元或PCB单元读取)，以确定气动系统方案，该方案包括用于选择性地向盒式组件200的卡板210施加压力的步骤和设置，从而实施用于制备样品以递送至传感器(例如，GMR传感器芯片280)的方法，因此可以制备、处理和分析放置在组件200中的样品。控制单元或盒式读取器310可以控制用于检测样品中分析物的流程自动化所需的输入和输出。例如，盒式读取器310可以是实时控制器，除其它事项外，其被配置为控制与盒式组件200相关联的巨磁电阻(GMR)传感器芯片280和/或存储芯片275和壳体110内的气动系统330，以及来自用户界面的控制，从而驱动磁场发生器360，以及从/向与盒式组件200相关联的传感器芯片和/或存储器接收和/或发送信号。在一个实施方案中，盒式读取器310以PCB(印刷电路板)的形式提供，该PCB可包括其中的额外芯片、存储器、设备。例如，盒式读取器310可以被配置成与内部存储器单元、系统操作初始化器、信号准备单元、信号处理单元和/或数据存储器(这些均未在附图中示出)进行通信和/或控制它们。例如，盒式读取器310还可以被配置为发送和接收关于通信单元340的信号，从而可以建立网络连接和遥测(例如，利用云端服务器)，并且可以执行非易失性程序。总体来说，通信单元340允许盒式读取单元100使用无线或有线技术传送和接收数据。可以经由电源320向盒式读取单元100供电，该电源320的形式为内部电池或连接器，该连接器经由与其连接的外部电源接收电力(例如，经由电源线和插头)。气动系统330用于通过在样品处理卡板210内部和沿着样品处理卡板210移动和引导流体(例如，经由气动连接件235，通过其通道和与直接弹性阀的连通)来处理和制备放置在盒式组件200中的样品(例如，血液、尿)。气动系统330可以是用于移动流体的系统和/或设备，其可以使用例如与流体接触的柱塞和/或活塞(下文将进一步描述)。磁场发生器360可以是外部磁性线圈或其它磁场发生设备，其安装在单元100中，或者以某种方式与在盒式组件200上提供或在盒式读取单元100的电路板上提供的一个或多个芯片(例如，传感器芯片280)集成。磁场发生器360用于在读取信号的同时激发GMR传感器芯片280附近的磁性纳米颗粒。根据实施方案，第二磁场发生器365可以是线圈或其它场发生设备，它可以作为盒式读取单元100的一部分并提供在壳体110中。例如，根据一个实施方案，第二磁场发生器365可以与磁场发生器360分开并且与其不同。该第二磁场发生器365可以被配置成产生非均匀磁场，使得它可以在样品的制备和处理期间，例如，当移动混合物料(例如来自混合物料源的缓冲液和/或磁性珠)和卡板内的测试样品时，向样品处理卡板210的一部分(例如，顶部、底部、侧面)施加这种磁场。在一个实施方案中，将第二磁场发生器365设置在盒式读取单元的另一端或另一侧(例如，位于单元100的壳体110的顶部)，即离开用于GMR感测的磁场发生器360。在一个实施方案中，相对于磁场发生器360，将第二磁场发生器365设置在盒式读取单元的另一端(例如，第二磁场发生器位于单元100的壳体110的顶部，而将磁场发生器360设置在单元100的底端(如，在盒式接收器130附近))。在一个实施方案中，用于感测生物标志物/分析物的总磁场包括来自磁场发生器360(外部或与传感器芯片集成)的所施加磁场以及来自GMR传感器芯片280附近的磁性纳米颗粒的任何干扰。在样品处理和GMR传感器芯片280的读取期间，试剂开启器任选地用于导入试剂(例如，如果试剂未包含在特定试剂部件的卡板中)。如前所述，用户界面140/显示器120允许操作人员输入信息，控制过程，提供系统反馈，并显示(通过输出显示屏幕，该屏幕可以是触摸屏)测试结果。
图4示出了使用本文公开的系统300在样品中进行分析物检测的方法400的一般步骤。在步骤410，对系统进行初始化。例如，系统的初始化可包括：向系统300(包括盒式读取单元100)通电、确定系统的配置信息、读取计算、确定特征(例如，磁性线圈和携载信号)在线且准备就绪等。在步骤415，将整个测试样品加入或加载入盒式组件200内(例如，将样品注入注入端口215中，如图2C所示)。可以改变步骤410和415的顺序；即，可以在系统初始化之前或之后将整个测试样品添加到组件200中。在步骤420，将盒式组件200插入盒式读取单元100内。任选地，作为方法400的一部分，可以将用户指令通过用户界面/显示器120输入到盒式读取单元100和/或系统300。然后，在步骤425，通过控制单元310启动对样品的处理。这种启动可以包括例如通过用户界面/显示器120和/或连接到读取单元100的系统，经由操作人员或用户接收输入。在另一实施方案中，可以通过将盒式组件200插入盒式读取单元100内并检测其中盒式组件200的存在来自动启动处理(例如，通过组件200上的电接触焊盘290与控制单元310之间的电气连接，并自动从存储芯片275读取指令)。在步骤425，使用气动控制指令(例如，从存储芯片275获取)处理样品，以产生所制备样品。如上文总体描述(并将在下文进一步描述)，样品的处理可能取决于样品的类型和/或插入到读取单元100的盒式组件200的类型。在某些情况下，该处理可以包括在制备样品之前的许多步骤，包括混合、导入缓冲液或试剂等。一旦样品制备完成后，就将制备的样品递送(例如，经由通过气动系统330和控制部件310的气动控制，通过卡板210中的通道并到达输出端口255)至GMR传感器芯片280。在步骤440，在GMR传感器芯片280处，检测制备的样品中的分析物。然后，在步骤445，接收和处理来自GMR传感器芯片280的信号，例如通过盒式读取器310(控制单元；例如，其可以包括一个或多个处理器)。一旦信号经过处理，就可以在450显示测试结果，例如通过显示器120/用户界面。在455，保存测试结果。例如，可以将测试结果保存在云端服务器和/或盒式组件200上的存储芯片275中。在实施方案中，可以将任何流体或样品从GMR传感器芯片280通过输入端口257引导至废物室270。此后，一旦完成所有测试并由感测设备/GMR传感器芯片280读取，盒式组件200就可以从盒式读取单元100中弹出。例如，根据一个实施方案，这可以自动执行，例如盒式读取单元100的壳体110内的机械设备可以将组件200推出壳体110，或者由操作人员手动执行(通过按钮或力)。
在一个实施方案中，本文描述的系统300可以使用气动控制系统，如公开于申请号为PCT/US2019/043720、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR GMR-BASED DETECTION OFBIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504846)并在同一天提交的国际专利申请中，其全部内容在此通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，本文描述的系统300可以使用盒式组件(例如，用于样品制备并递送至传感器)，如公开于申请号为PCT/US2019/043753、名称为“SYSTEM AND METHODFOR SAMPLE PREPARATION IN GMR-BASED DETECTION OF BIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504847)并在同一天提交的国际专利申请中，其全部内容在此通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，本文描述的系统300可以在GMR传感器处感测、检测和/或测量分析物，如公开于申请号为PCT/US2019/043766、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR SENSINGANALYTES IN GMR-BASED DETECTION OF BIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504848)并在同一天提交的国际专利申请中，其全部内容在此通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，本文描述的系统300可以处理GMR传感器处的信号，如公开于申请号为PCT/US2019/043791、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR PROCESSING ANALYTESIGNALS IN GMR-BASED DETECTION OF BIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504850)并在同一天提交的国际专利申请中，其全部内容在此通过引用方式并入本文。例如，如上所述，在步骤445，接收和处理来自GMR传感器芯片280的信号，例如通过盒式读取器310。在一个实施方案中，盒式读取器310被配置为执行处理来自GMR传感器芯片280的结果的功能，其使用样品制备控制部分和信号处理部分，该样品制备控制部分具有存储器读取单元和样品制备控制单元(例如，用于接收指示盒式组件200已插入盒式读取单元100的信号，读取储存在存储芯片275中的信息，并产生气动控制信号并将它们发送到气动系统330)，该信号处理部分适于控制电气元件、准备和收集信号，并处理、显示、储存和/或向外部系统转发检测结果，包括处理测量信号以获得分析物检测的测试结果，如在-0504850号申请中详细描述的那样。本公开后文将更详细地提供与单元100的盒式读取器310和信号处理器有关的另外特征。
应该理解的是，关于图1和2A-2D，所示特征是盒式读取单元100和盒式组件200的代表性示意图，它们是本文公开的用于检测样品中分析物的系统300的一部分。相应地，图示仅具有解释性，而并非意在限制。
回到之前参照图2C论述的样品处理卡板210和盒式组件200的特征，例如，在盒式组件200中的样品处理卡板210上提供的特征的排列、放置、包含和数量可以基于所分析的测试样品和/或所执行的测试(例如，生物标志物的检测、金属的检测等)。此外，在一些实施方案中，可以这样布置卡板210，使得卡板上存在分区，和/或使得特征被设置在不同的层中(然而，这些层不必是具有其主体的不同层；而是在深度或高度上(在Z方向上)相对于彼此进行分层)。根据本文的实施方案，使用激光切割的部件来形成入口、通道、阀区等，并将其做成夹层状和连接/密封在一起，从而可以形成样品处理卡板210。在其它实施方案中，样品处理卡板的一层或多层可以是激光切割、层压、模制等，或由多种工艺组合形成。形成样品处理卡板210的方法并非意在限制。出于本文的说明目的，一些附图包括层的描绘，是为了示出样品处理卡板210的各部分相对于彼此的定位(例如，相对于放置在上方和/或下方的其它特征在卡板内的定位)。提供这样的图示是为了示出样品处理卡板210的主体内的特征(通道、阀门等)的示例性深度或放置，而不是限制性的。
总体来说，当俯视或从顶部观看时，每个卡板210具有沿着纵向中心线A—A(设置在Y方向上)在纵向上延伸的主体214。在一个实施方案中，每个卡板210的尺寸可以由纵向(即，沿着或相对于中心线A—A)延伸的长度、侧向于长度(例如，在X方向上)延伸的宽度以及在Z方向或垂直方向上的高度(或深度或厚度)所定义。在一个非限制性实施方案中，卡板210的主体214可以是基本上矩形的配置。在一个实施方案中，调整盒式读取单元100中的盒式接收器130(和/或任何相关的托盘)的大小，以容纳样品处理卡板210的尺寸，使得卡板210可以插入单元100的壳体内。
本公开的附图中示出的图示结构特征并非意在限制。例如，套组、阀门、计量室、膜、混合通道和/或端口的数量并非意在限于所示的数量。在一些实施方案中，可以提供更多的通道。在一些实施方案中，可以提供更少的通道。阀门的数量也并非意在限制。
尽管本文中将盒式组件200和样品处理卡板210描述为用于试剂和患者或医学血液样品，但应注意，本文公开的盒式组件200不限于用于血液或并非仅用于医学实践。可以分离并与试剂或反应物料组合的其它流体可用于本文公开的盒体中进行测定。其它样品可以来源自唾液、尿、粪便样品、上皮拭子、眼液、活检(固体和液体)如来自口腔、水样品如来自城市饮用水、自来水、污水、海水、湖水等。
感测微流控装置包括一个或多个微流体通道和布置在一个或多个微流体通道内的多个传感器垫。现在参考图5A，图中示出了根据一些实施方案的示例性通道500。通道500在结构上显示为盘旋形，但它在几何结构上不需要如此限制。通道500包括布置在通道主体520内的多个GMR传感器510。GMR传感器510可以完全相同地配置为检测单一分析物，冗余可使检测增强。GMR传感器510也可以全部以不同的方式配置，以检测大量的分析物，或者是不同配置的传感器的组合，具有一些冗余。通道500还包括通道入口530，任何样品、试剂、珠子悬浮液等从该入口进入通道主体520。在通道入口530处的正压下或在通道出口540处施加的真空下，可调节流经通道主体520的流动。
图5B示出了布置在基座550内的多个通道500。每个通道500以通道扩展560为特征，该通道扩展560是围绕每个GMR传感器510的扩大区域(图5A；为清楚起见未在图5B中示出)。在不受理论束缚的情况下，据推测，当物料经过GMR传感器时，通道扩展560提供了一种更好地混合物料的手段。在基座550的外围布置有一对接触焊盘570，其用作位于通道扩展560中的GMR传感器与电路系统其余部分之间的电气管线。GMR传感器510通过布线(未示出)与接触焊盘570进行电子连接。
图6A示出了通道600的横截面，该通道包括在具有直型配置的通道主体620中的多个GMR传感器610。在这类实施方案中，物料的流动方向可以是任一方向。在其它实施方案中，如图6B所示，通道600可以包括类似的多个GMR传感器610，这些GMR传感器610在通道扩展630处整合在通道主体620内，该通道扩展630的形状大致为圆形或椭圆形。在又一些实施方案中，如图6C所示，通道600可以具有布置在大致为正方形或矩形的通道扩展630中的GMR传感器610。尽管未示出，但是也可以布置这样的正方形或矩形通道扩展，使得正方形或矩形的边而不是点是通道扩展630的一部分，而不是顶点。其它配置的通道扩展1030也是可能的，包括图6D中所示的配置，其中通道600具有布置在三角形(或梯形)中的GMR传感器610。通道扩展630可以具有任何几何结构，并且可以针对所需的流动和混合特性以及在GMR传感器610上的停留时间进行选择。
如图6D所示，通道600可以具有盘旋形状的通道主体620，其中GMR传感器610沿着盘旋形路径的长度布置。在一些实施方案中，与线性通道600相比，这种盘旋形结构可允许将更多传感器封装在一个小区域中。如图6F所示，通道600可以包括结构上呈盘旋形以及具有其中存在GMR传感器610的通道扩展630的主体620。图6G中示出了通道1000的其它任选结构特征，该图示出了其中设置有GMR传感器的通道600，并且该通道600具有包括分叉的通道主体620。在一些这样的实施方案中，根据具体应用，可以将流动方向调整为任一方向。例如，当流向图中的左侧时，物料可以分成两条不同的路径。例如，这可以表示沿着两个分叉臂使用不同的GMR传感器610。通道主体620的宽度可以在分叉前后有所不同，并且可以针对特定的流动特征进行选择。
在一些实施方案中，作为非限制性示例参考图6A、6B、6C、6D、6F和6G，提供了多重检测方案，例如，用于执行多重测定以检测相同查询样品或不同查询样品中的超过一种分析物，这可以通过在通道620内空间上布置不同的GMR传感器610来实现，其中每种不同的GMR传感器610配置为具有差异化的标记物和/或包被，使得每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器610与不同分子(例如此处和全文所述的不同捕获核酸、不同探针、不同引物、不同所捕获扩增子、不同可区分的捕获扩增子和/或诸如此类)相互作用，由此允许检测相同样品中的不同分析物，或者不同样品中的不同分析物。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器610与不同捕获核酸相互作用。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器610与不同所捕获扩增子相互作用。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器610与不同的可区分的捕获扩增子相互作用。
现在参考图7，图中示出了通道700，其在通道主体720内包括通道扩展730，在该通道扩展730中布置有不同的GMR传感器710a和710b。尽管图7示出了交替的不同GMR传感器710a和710b，但是它不需要遵循这种模式。例如，所有一种类型的GMR传感器710a可以彼此相邻地聚集在一起，同样，所有另一类型的GMR传感器710b也可以聚集在一起。在一些实施方案中，将这种交替的GMR传感器710a和710b。回到参考图6G，不同的传感器也可以沿分叉的分离线出现。
在一些实施方案中，作为非限制性示例参考图7，提供了多重检测方案，例如，用于执行多重测定以检测相同查询样品或不同查询样品中的超过一种分析物，这可以通过在通道720内空间上布置不同的GMR传感器710a和710b来实现，其中每种不同的GMR传感器710a和710b配置为具有差异化的标记物和/或包被，使得每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器710a和710b与不同分子(例如此处和全文所述的不同捕获核酸、不同探针、不同引物、不同捕获扩增子、不同可区分的捕获扩增子和/或诸如此类)相互作用，由此允许检测相同样品中的不同分析物，或者不同样品中的不同分析物。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器710a和710b与不同捕获核酸相互作用。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器710a和710b与不同捕获扩增子相互作用。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器710a和710b与不同可区分的捕获扩增子相互作用。
图8A、8B和8C示意性地展示了根据本公开的一个实施方案，可以安装在盒式组件200上的GMR传感器芯片280的结构。如图8A所示，GMR传感器芯片280包括：通道810、820和830中的至少一个，其大致布置在芯片的中心；布置在通道内的多个GMR传感器880；电接触焊盘840A、840B，其排列在GMR传感器芯片的两个相对端部上；和金属线850、860、870A、870B、870C、890A、890B、890C，其耦合至电接触焊盘840A、840B。
通道810、820和830各自可以具有盘旋形状，以允许将更多传感器封装在内部。多个通道扩展885可以沿着通道排列，以收纳多个GMR传感器。待测试的流体分别经由通道入口815A、825A、835A和通道出口815B、825B、835B流入和流出通道810、820、830。尽管图8A示出了GMR传感器880排列在8×6传感器阵列中，三个通道810、820、830中的每一个收纳16个传感器，但是也可以使用其它组合来满足待感测分析物的特定需求。
在一些实施方案中，作为非限制性示例参考图8A和8B，多重检测方案，例如用于执行多重测定以检测相同查询样品或不同查询样品中的超过一种分析物，可以通过在通道810、820和830中的一个或多个内空间上布置一个或多个不同的GMR传感器880，或者一组或多组不同的GMR传感器880来实现，其中每种不同的GMR传感器880或每组不同的GMR传感器880配置为具有差异化的标记物和/或包被，使得带有差异化标记物和/或包被的每种GMR传感器880或每组GMR传感器880与不同分子(例如此处和全文所述的不同捕获核酸、不同探针、不同引物、不同捕获扩增子、不同可区分的捕获扩增子和/或诸如此类)相互作用，由此允许检测相同样品中的不同分析物，或者不同样品中的不同分析物。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器880与不同捕获核酸相互作用。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器880与不同捕获扩增子相互作用。在一些实施方案中，每种带有差异化标记物和/或包被的GMR传感器880与不同可区分的捕获扩增子相互作用。在一些实施方案中，从通道810、820和/或830中的每一个，检测同一查询样品或不同查询样品的不同分析物。
电接触焊盘840A、840B包括多个电接触引脚。金属线850、860、870A、870B、870C将GMR传感器连接到相应的电接触引脚(pin)845A、845B、875。电接触焊盘840A、840B继而连接到在盒式组件200上提供的电接触焊盘290。当盒式组件200插入到盒式读取器310时，在GMR传感器芯片280和盒式读取器310之间形成电连接，从而能够将测量信号从GMR传感器发送至盒式读取器310。
图8B示出了GMR传感器的更多细节。例如，每个GMR传感器可由五个并行连接的GMR条组成。在一端，每个GMR传感器由两根主金属线中的一根(即，线850或860)连接到两个公共引脚中的一个(即，引脚845A或845B)。GMR传感器的另一端通过分别的金属线870A、870B、870C连接到电接触焊盘840A或840B上的不同引脚875。
图8A还示出了流体检测金属线890A、890B、890C，它们布置在通道入口和/或出口附近，每根金属线对应于一个通道。流体检测功能由布置在相应流体检测金属线中的开关895A、895B、895C来执行。图8C示出了开关895A的详细结构。相应对流过它的导电流体(例如，血浆)的识别，开关895A可以将一侧的线896A耦合到另一侧的线896B，从而产生流体检测信号。
图8A-C中示出的GMR传感器芯片的结构和布线本质上仅仅是示例性的，对于本领域技术人员来说明显的是，其它结构和布线也是可行的，以实现相同或类似的功能。现在参考图9，图中示出了通道扩展930处通道900的剖视图。布置在通道扩展930内的是GMR传感器910，其上固定有一种或多种生物分子925。通过常规表面化学将生物分子925固定到GMR传感器910(在图14中进一步示出了一些细节)。生物分子925可以是肽或蛋白质、DNA、RNA、低聚糖、激素、抗体、糖蛋白等，这取决于所进行的特定测定的性质。通过线995将每个GMR传感器910连接到位于通道900外部的接触焊盘970。在一些实施方案中，在传感器底部将线995连接至GMR传感器910。
现在参考图10A，图中示出了通道1000的更详细的剖视图，该通道1000具有通道主体1030，其在GMR传感器1010的位置处缺少通道扩展。生物分子1025通过附着到生物表面1045而相对于传感器固定。这种固定化学在本领域中是已知的。例如，参见Cha等人“Immobilization of oriented protein molecules on poly(ethylene glycol)-coatedSi(111),”Proteomics 4:1965-1976,(2004)；Zellander等人“Characterization of PoreStructure in Biologically Functional Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)-Poly(ethylene glycol)Diacrylate(PHEMA-PEGDA),”PLOS ONE 9(5):e96709,(2014)。
在一些实施方案中，生物表面1045包含聚合物组合物，该聚合物组合物包含至少两种用交联剂交联的亲水性聚合物。这种聚合物组合物包含至少两种亲水性聚合物和交联剂，其包含这种聚合物组合物，聚合物组合物和/或生物表面还包括生物分子，如核酸、蛋白质和抗体等，并且交联和/或制备这种聚合物组合物和/或生物表面的方法描述于申请号为62/958,510、名称为“POLYMER COMPOSITIONS AND BIOSURFACES COMPRISING THEM ONSENSORS”、于2020年1月8日提交的美国临时专利申请(代理人案号为026462-0506342)中，其全部内容在此通过引用方式并入。
在一些实施方案中，生物表面1045包含聚合物组合物，该聚合物组合物包含与PHEMA交联的PEG聚合物。
在一些实施方案中，交联剂由式(I)表示：
PA-L-PA(I)
其中每个PA都是光或金属活化基团或活性基团，并且L是连接基团。在一些实施方案中，每个PA独立地选自光活化基团或金属活化基团，并且L是连接基团。在一些实施方案中，每个PA是相同的，而在其它实施方案中，每个PA是不同的。在一些实施方案中，每个PA独立地包含叠氮(-N3)、重氮(-N2)基团、芳基叠氮、酰基叠氮、叠氮甲酸酯、磺酰叠氮、磷酰叠氮、重氮烷、重氮酮、重氮乙酸酯、双吖丙啶、脂肪族偶氮、芳基酮、二苯甲酮、苯乙酮、蒽醌和蒽酮。在一些实施方案中，每个PA独立地包含叠氮(-N3)或重氮(-N2)基团。在一些实施方案中，这种聚合物组合物不包含PEG聚合物和PHEMA聚合物的嵌段共聚物。
在一些实施方案中，PA经光或金属活化以形成能够进行C-H和/或O-H插入的氮宾中间体。例如，参见“Photogenerated reactive intermediates and their properties,”Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology中第2章,ElsevierPress,12:8-24(1983)。在一些实施方案中，PA经金属活化以形成能够进行C-H和/或O-H插入的卡宾或卡宾体中间体。例如，参见Doyle等人“Catalytic Carbene Insertion into C-H Bonds,”Chem.Rev.2:704-724(2010)。
在一些实施方案中，每个PA是叠氮(-N3)部分，并经光活化产生能够进行C-H和/或O-H插入的氮宾中间体，以此介导至少两种亲水性聚合物如PEG和PHEMA聚合物的交联。在一些实施方案中，每个PA都是重氮(-N2)，并经金属催化的分解反应形成能够进行C-H和/或O-H插入的卡宾或卡宾体中间体，由此介导PEG和PHEMA聚合物的交联。叠氮和重氮的制备在本领域中是众所周知的，就叠氮而言，很容易通过叠氮阴离子N3 -与具有离去基团的适当有机部分的SN 2置换反应来制备。
在一些实施方案中，L包括至少一个Y和一个或多个X，其中：(a)每个至少一个Y独立地选自下组：任选地取代的二价亚烷基；任选地取代的亚芳基；和任选地取代的二价杂芳环部分；具有1至20个原子；亚烷基-(CR2)p-，其中p是1至10、1至6或1至4的整数，并且其中R2独立地选自下组：H和低级烷基、C1-C5烷基和C1-C3烷基；和/或具有4至20个碳原子并含有至少一个选自由O、N和S组成的组中的杂原子的二价杂芳环；和(b)每个X独立地选自下组：亚烷基、-NR1-、-O-、-S-、-S-S-、-CO-NR1-、-NR1-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-和一个键，其中R1独立地选自由H和低级烷基组成的组。
在一些实施方案中，交联剂由式(II)表示：
PA-Y1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Y2-PA (II)
其中每个PA是光活化基团或金属活化基团，并且Y1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Y2是连接基团。在一些实施方案中，每个PA独立地包含叠氮(-N3)、重氮(-N2)基团、芳基叠氮、酰基叠氮、叠氮甲酸酯、磺酰叠氮、磷酰叠氮、重氮烷、重氮酮、重氮乙酸酯、双吖丙啶、脂肪族偶氮、芳基酮、二苯甲酮、苯乙酮、蒽醌(anthroquinone)和蒽酮。在一些实施方案中，每个PA独立地包含叠氮(-N3)或重氮(-N2)基团。在一些实施方案中，Y1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Y2是连接基团。在一些实施方案中，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9中的每一个独立地选自于由下列组成的组：亚烷基、-NR1-、-O-、-S-、-S-S-、-CO-NR1-、-NR1-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-和一个键，其中R1独立地选自由H和低级烷基组成的组。在一些实施方案中，Y1和Y2中的每一个各自独立地选自由下列组成的组：任选取代的二价亚烷基；任选取代的亚芳基；和任选取代的二价杂芳环部分；具有1至20个原子；亚烷基-(CR2)p-，其中p是1至10、1至6或1至4的整数，并且其中R2独立地选自由下列组成的组：H和低级烷基、C1-C5烷基和C1-C3烷基；和/或具有4至20个碳原子并含有至少一个选自由O、N和S组成的组中的杂原子的二价杂芳环。
如本文所用的术语“烷基”，单独或组合使用时，指的是含有2至20个碳原子的直链或支链烷基。在一些实施方案中，烷基可以包含2至10个碳原子。在又一些实施方案中，烷基可以包含2至6个碳原子。如下文所定义，烷基可以任选地被取代。烷基(以游离基形式给出)的示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、壬基等。
如本文所用的术语“烯基”，单独或组合使用时，指的是具有一个或多个双键并含有2至20个碳原子的直链或支链烃基。在一些实施方案中，烯基可以包含2至6个碳原子。
术语“亚烯基”指的是在两个或更多个位置附接的碳-碳双键体系，例如亚乙烯基[(--CH＝CH--),(--C::C--)]。合适的烯基的示例包括丙烯基、2-甲基丙烯基、1,4-丁二烯基等。
如本文所用的术语“炔基”，单独或组合使用时，指的是具有一个或多个三键并含有4至20个碳原子的直链或支链烃基。在某些实施方案中，所述炔基包含4至6个碳原子。炔基的示例包括丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-2-基等。
如本文所用的术语“芳基”，单独或组合使用时，意指含有一个、两个或三个环的碳环芳香族，其中这类环可以以侧链方式(pendent manner)附接在一起或稠合在一起。在一些实施方案中，“芳基”包括具有一个或多个5元或6元芳香环的基团。芳基在芳环中不含杂原子。芳基任选地由一个或多个非氢取代基取代。
术语“芳基”包括芳族基，如苄基、苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基、轮烯基(annulenyl)、薁基、四氢萘基和联苯基。
术语“亚芳基”指的是由碳和氢元素组成的二价芳族基。二价芳族基可以包括仅一个苯环或多个苯环，例如，二苯基、萘基或蒽基。
如本文所用的术语“芳烷基”，单独或组合使用时，指的是通过烷基附接到母体分子部分的芳基。
如本文所用的术语“杂芳基”和“杂芳环”指的是并包括具有一个或多个芳香环的基团，其中至少一个环含有杂原子(非碳环原子)。杂芳基包括那些具有一个或两个带有1、2或3个杂原子的杂芳环的基团。杂芳基可以包含5-20个、5-12个或5-10个环原子。杂芳基包括那些具有一个包含杂原子的芳香环和具有一个包含碳环原子的芳香环的基团。杂芳基包括那些具有一个或多个5元或6元芳香杂芳环和一个或多个6元碳芳香环的基团。芳杂环可以在环中包括一个或多个N、O或S原子。杂芳环可以包括那些具有一个、两个或三个N的环，具有一个或两个O的环，以及具有一个或两个S的环，或者具有一个或两个或三个N、O或S的组合的环。具体的杂芳基包括呋喃基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、喹啉基和嘌呤基。
术语“低级烷基”指的是，例如C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基或C1-C2烷基。
术语“任选取代的”意指前述基团可以被取代，也可以不被取代。当被取代时，“任选取代的”基团的取代基可以包括但不限于独立地选自于下列基团或特别指定的基团组中的一种或多种取代基(单独或组合地)：低级烷基、低级烯基、低级炔基、低级链烷酰基(alkanoyl)、低级杂烷基(heteroalkyl)、低级杂环烷基(heterocycloalkyl)、低级卤代烷基、低级卤代烯基、低级卤代炔基、低级全卤代烷基(perhaloalkyl)、低级全卤代烷氧基、低级环烷基、苯基、芳基、芳氧基(aryloxy)、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、氧代(oxo)、低级酰氧基、羰基、羧基、低级烷羰基(alkylcarbonyl)、低级羧酸酯基、低级羧酰胺基、氰基、氢、卤素、羟基、氨基、低级烷氨基(alkylamino)、芳氨基、酰胺基、硝基、硫醇基、低级烷硫基、低级卤代烷硫基(haloalkylthio)、低级全卤代烷硫基(perhaloalkylthio)、芳硫基、磺酸基、磺酸、三取代甲硅烷基(trisubstituted silyl)、N3、SH、SCH3、C(O)CH3、CO2CH3、CO2H、吡啶基、噻吩、呋喃基、低级氨基甲酸酯和低级脲。两个取代基可以连接在一起以形成由0至3个杂原子组成的稠合型五元、六元或七元碳环或杂环，例如形成亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。任选取代的基团可以是未取代的(例如，--CH2CH3)、全取代的(例如，--CF2CF3)、单取代的(例如，--CH2CH2F)或在全取代和单取代之间的任何水平上取代的(例如，--CH2CF3)。在未对取代加以定性的情况下列举取代基时，取代和未取代的形式都包括在内。
当取代基被定性为“取代”时，则特别指定的是取代的形式。此外，可以根据需要来定义特定部分的不同任选取代基组；在这些情况下，任选取代基将如所定义的那样，通常紧跟在短语“任选取代为”之后。如本文所用的术语“低级的”，单独或组合使用时，意指包含1至6个(并包括6个)碳原子。
在一些实施方案中，交联剂包括双[2-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物或二硫代双(叠氮苯)。
在一些实施方案中，式(I)中的L可以是支持每个PA部分存在的任何有机片段。它可以是直链或支链的简单C2-C20烃链。这种烃可以包括具有任何氟取代度的氟化变体。在一些实施方案中，LG可以包括芳香烃，其包括但不限于苯、萘、联苯基、联萘基或芳香结构与C2-C20烃链的组合。因此，在一些实施方案中，LG在结构上可以是烷基、芳基或芳烷基。在一些实施方案中，烷基连接基团在其链中可以有一个或多个碳取代为氧(O)或胺(NR)，其中，R是H或C1-C6烷基。
根据前述实施方案，交联型PEG-PHEMA结构可以由式(III)给出：
PEG-A-L-A-PHEMA
其中，PEG是聚乙二醇部分，每个A是来自叠氮或重氮的催化反应的连接原子，即CH2或NH，并且LG是如上所述的连接基团。
在一些实施方案中，式(I)、式(II)和/或式(III)中的每个A都代表由下列的分解反应中衍生的附接原子，即叠氮(-N3)、重氮(-N2)基团、芳基叠氮、酰基叠氮、叠氮甲酸酯、磺酰叠氮、磷酰叠氮、重氮烷、重氮酮、重氮乙酸酯、双吖丙啶、脂肪族偶氮、芳基酮、二苯甲酮、苯乙酮、蒽醌或蒽酮。
在一些实施方案中，可采用聚合物组合物例如PEG-PHEMA组合物对传感器(例如GMR传感器)表面进行官能化，它可以通过混合下列组分来制备，即，包含例如溶解于合适溶剂(例如异丙醇、丙酮或甲醇和/或水)中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG-NHS(MW 600)的PEG溶液、包含溶解于合适溶剂(例如，异丙醇、丙酮或甲醇和/或水)中的聚羟乙基甲基丙烯酸酯(MW 20,000)的PHEMA溶液和任选的交联剂。可以采用合适的涂覆工艺(例如，缩微印刷、浸渍涂布、旋涂或气溶胶喷涂)将所得溶液涂覆在传感器表面上。在用PEG-PHEMA溶液涂覆表面后，可以使用UV光固化该表面，随后用合适的溶剂如异丙醇和/或水来清洗。在一些实施方案中，将传感器的表面共价附接至一个或多个核酸。在一些实施方案中，涂覆的表面可用于与伯胺结合(例如，附着蛋白质和抗体、抗体的抗原结合部分等)。PEG-PHEMA涂层可以保护传感器表面免受腐蚀。在一些实施方案中，传感器表面包括在申请号为PCT/US2019/043766的国际专利申请中描述的表面。
在图10A中，磁性珠结合实体1015被配置为与生物分子1025或感兴趣的分析物相互作用，例如在抗体-分析物-磁性珠结合抗体的夹心复合物中。在生物表面1045下方是另一隔离层1055。隔离层1055可以与GMR传感器1010直接接触，并且可以包括例如金属氧化物层。生物表面层1045与隔离层1055直接接触。基座1065用作其上方的每个部件，GMR传感器1010、隔离层1055和生物表面层1045的支架。在一些实施方案中，基座1065由硅晶片制成。
图10B示意性地展示了GMR传感器的基本结构和原理。典型的GMR传感器由金属多层结构组成，其中非磁性导电夹层1090夹在两个磁性层1080A和1080B之间。非磁性导电夹层1090通常是薄铜膜。磁性层1080A和1080B可以由铁磁性合金材料制成。
金属多层结构的电阻根据磁性层1080A和1080B的相对磁化方向而变化。平行磁化(如图10B的右半部分所示)产生较低的电阻，而反平行磁化(如图10B的左半部分所示)产生较高的电阻。磁化方向可以由外部施加的磁场来控制。因此，金属多层结构显示出其电阻的变化是外部磁场的函数。
现在参考图11A和12A，图中示出了GMR传感器根据本文所述的多种测定应用进行工作的两种示例性基本模式。在第一种模式中，以图11A为例，在测定开始时，磁性珠1115通过生物表面1165加载在GMR传感器(参见图11A，1010)附近。在测定期间，查询分析物的存在导致磁性珠1115从生物表面1165移位(从而，从GMR传感器移开)；这种模式是所谓的消减模式，因为磁性珠脱离了传感器表面附近。第二种主要工作模式是加性模式，如图12A所示。在这种测定中，当存在查询分析物时，在GMR传感器(见图10A，1010)附近出现磁性珠1215的净增加。无论是消减还是加性模式，都依赖于传感器表面近侧的珠子(1115，1215)数量的变化状态，以此改变GMR传感器系统中的磁电阻。测量磁电阻的变化，并且可以定量确定查询分析物的浓度。
返回参考图11A，图中示出了传感器结构示意图，其显示了整个示例性消减过程中的传感器结构。在该过程开始时，系统处于1100a状态，其中GMR传感器已在其生物表面1165上布置了多个分子(通常是生物分子)1125和缔合的磁性珠1115。生物表面1165上方的容积可以开始是干燥的，也可以存在溶剂。在干燥的情况下，检测过程可以包括使用例如缓冲溶液进行溶剂启动步骤。在导入分析物之后，系统采取状态1100b的形式，其中一些磁性珠1115已经按照与分析物的浓度成比例地从分子1125上移除。状态1100a和1100b的变化提供了可测量的磁电阻变化，这允许对感兴趣的分析物进行定量。在一些实施方案中，分析物可以简单地从分子1125中直接置换出珠子。在其它实施方案中，分析物可以与分子1125发生化学反应，以裂解附着于珠子1115的分子的一部分，由此将珠子1115与分子1125的裂解部分一起释放出来。
在实施方案中，生物表面1165包括聚合物。可以选择特定的聚合物来促进分子1125共价附接到生物表面1165。在其它实施方案中，分子1125可以通过静电相互作用与生物表面1165缔合。例如，可以选择或修饰聚合物涂层，以使用常规的连接化学来共价锚定生物分子。连接化学包括任何包含有机官能团柄状结构(handle)的化学部分，包括但不限于胺类、醇类、羧酸类和硫醇基。共价附接化学包括但不限于形成酯类、酰胺类、硫酯类和亚胺类(它们可以随后进行还原，即还原性胺化)。生物表面1165可以包括表面改性剂，例如表面活性剂，包括但不限于阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。
分子1125可以包括可以附着到生物表面1165的任何数量的受体/配体实体。在一些实施方案中，分子1125包括多种生物分子中的任何一种。生物分子包括DNA、RNA和含有游离胺基的蛋白质，它们可以共价固定在具有功能性NHS基团的GMR传感器表面上。对于免疫测定，对分析物具有特异性的第一抗体(小鼠单克隆IgG)附着在GMR表面上。所有第一抗体都具有多个游离胺基，并且大多数蛋白质都有赖氨酸和/或α-氨基。只要存在游离的赖氨酸伯胺，抗体就会共价固定在GMR传感器上。为了将抗体固定在传感器表面上，使用点样系统(sciFLEXARRAYER,Scienion,Germany)将1.2nL第一抗体(在PBS缓冲液中为1mg/mL)注射到传感器表面上。所有点样表面在4℃、相对湿度约为85％的条件下孵育过夜。用封闭缓冲液(溶于Tris缓冲液中的50mM乙醇胺)洗涤表面三次，并进一步用相同缓冲液封闭30分钟。
在实施方案中，磁性珠1115可以是纳米颗粒，包括球状纳米颗粒。在一些实施方案中，这种纳米颗粒的有效直径范围为约1至约1000纳米(nm)、1nm至约500nm、约5nm至约1000nm、约10nm至约1000nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm、约5nm至约100nm、约2至约50nm、约5至约20nm或约5至约10nm，和/或其间的范围。在一些实施方案中，这种纳米颗粒的有效直径范围可以是约2至约50nm，或约5至约20nm，或约5至约10nm。在实施方案中，可以对磁性珠1115进行涂覆，以促进共价附接至分子1125。在其它实施方案中，可以对磁性珠1115进行涂覆，以促进与分子1125的静电缔合。可以对磁性珠1115进行差异化标记和/或涂覆以促进多重检测方案，例如用于执行多重测定以检测相同查询样品或不同查询样品中的大于一种分析物。在这类实施方案中，差异化标记和/或涂覆被配置成使得不同的珠子与布置在不同GMR传感器上的不同分子相互作用，或者与布置在单个传感器上的不同分子相互作用，在单个传感器上将不同分子在空间上进行组织安排，以产生可寻址信号。
在一些实施方案中，作为非限制性示例参考图5A，实现了多重检测方案，例如用于执行多重测定以检测相同查询样品或不同查询样品中的大于一种分析物，这可以通过在盘旋形通道540内空间上布置不同的GMR传感器510来实现，其中每种不同的GMR传感器510配置有差异化的标记物和/或涂层，使得每种带有差异化标记物和/或涂层的GMR传感器510与不同分子(例如此处和全文所述的不同捕获核酸、不同探针、不同引物、不同捕获扩增子、不同可区分的捕获扩增子和/或诸如此类)相互作用，由此允许检测到相同样品中的不同分析物，或者不同样品中的不同分析物。
在一些实施方案中，作为非限制性示例参考图5B，实现了多重检测方案，例如用于执行多重测定以检测相同查询样品或不同查询样品中的大于一种分析物，这可以通过以下来实现：在一个通道500内空间上布置用一种标记物或涂层来标记和/或涂覆的GMR传感器，并且在不同通道500中布置用不同标记物或涂层来标记和/或涂覆的一个或多个不同GMR传感器，所述一个通道500中的这种GMR传感器与所述一个或多个不同通道500中的GMR传感器和不同的分子相互作用，例如此处和全文所述的不同捕获核酸、不同探针、不同引物、不同捕获扩增子、不同可区分的捕获扩增子和/或诸如此类，由此允许不同样品流经不同通道500，并且由此允许从不同的样品中测量同一分析物或从不同的样品中测量不同的分析物。
返回参考图11B，示出了与图11A的传感器结构示意图相关的处理流程1101。该过程从1120开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1130通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或化学修饰。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。经过系统的运动可由气动控制。步骤1140包括以目标指定流速将经处理的样品发送到GMR传感器。可以选择这种流速来反映GMR传感器表面上的化学动力学。步骤1150提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1160检测磁电阻的变化。最后，步骤1170提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
现在参考图12A，图中示出了传感器结构示意图，其显示了整个示例性加性过程中的传感器结构。在该过程开始时，系统处于1200a状态，其中GMR传感器已在其生物表面1265上布置了多个分子(通常是生物分子)1225。如第二状态1200b所示，选择多个分子1225来结合查询分析物1295。查询分析物1295被配置为结合磁性珠1215。在一些实施方案中，查询分析物1295在经过生物表面1265之前与珠子相缔合。例如，这可能发生在被测样品的预处理过程中。(在其它实施方案中，查询分析物1295可以首先经过生物表面，然后在该分析物结合到生物表面1265之后，可以用磁性珠1215对查询分析物1295进行修饰，如下文参考图13A所述)。在一些实施方案中，给定的查询分析物1295可能需要在结合磁性颗粒1215之前进行化学修饰。在一些实施方案中，可以对磁性珠1215进行修饰，以与查询分析物1295相互作用。通过从状态1200a(其中不存在磁性珠1215)到状态1200b(其中磁性珠1215与生物表面1265相缔合)所测量的磁电阻变化，提供了定量分析物的能力。
图12B示出了与图12A的传感器结构示意图相关的示例性处理流程1201。该过程从1220开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1230通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或化学修饰。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。经过系统的运动可由气动控制。步骤1240包括将经处理的样品发送至反应室，然后在步骤1250中，将珠子导入反应室以修饰查询分析物。如上所述，这种修饰可以直接在传感器表面上进行，而不是在反应室中进行。在步骤1260中，以目标流速将经修饰的样品发送到GMR传感器。可以选择这种流速来反映GMR传感器表面上的化学动力学。步骤1270提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1280检测磁电阻的变化。最后，步骤1290提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
现在参考图13A，图中示出了传感器结构示意图，其显示了在整个示例性加性过程中，传感器结构状态1300a-c。在该过程开始时，系统处于1300a状态，其中GMR传感器已在其生物表面1365上布置了多个分子(通常是生物分子)1325。如第二状态1300b所示，选择多个分子1325来结合查询分析物1395。如状态1300c所示，查询分析物1395被配置为结合磁性珠1315。在一些实施方案中，给定的查询分析物1395可能需要在结合磁性颗粒1315之前进行化学修饰。在其它实施方案中，查询分析物1395可以不经化学修饰而结合磁性纳米颗粒1315。在一些实施方案中，可以对磁性珠1315进行涂覆或者以其它方式进行修饰，以与查询分析物1395相互作用。通过从状态1300a(其中不存在磁性珠1315)到状态1300c(其中磁性珠1315与生物表面1365相缔合)所测量的磁电阻变化，提供了定量查询分析物1395的能力。
图13B示出了与图13A的传感器结构示意图相关的示例性处理流程1301a。该过程从1310开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1320通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或诸如此类。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。在1330，将处理的样品发送至反应室。经过系统的运动可由气动控制。步骤1340包括用试剂修饰样品室中存在的分析物，以允许其与磁性颗粒相互作用。在步骤1350，以目标流速将经修饰的样品发送到GMR传感器。可以选择这种流速来反映GMR传感器表面上的化学动力学。接下来，步骤1360将珠子导入GMR传感器，其现在可以与经修饰的分析物相互作用。在一些实施方案中，也可以对珠子进行修饰，例如使用涂层或一些其它能够与经修饰的分析物相互作用的连接分子。步骤1370提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1380检测磁电阻的变化。最后，步骤1390提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
图13C示出了与图13A的传感器结构示意图相关的备选示例性处理流程1301b。该过程从1302开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1304通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或诸如此类。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。经过系统的运动可由气动控制。在步骤1306，以目标流速将经修饰的样品发送到GMR传感器。可以选择这种流速来反映GMR传感器表面上的化学动力学。步骤1308包括用试剂修饰样品中存在的分析物，以允许其与磁性颗粒相互作用。接下来，步骤1312将珠子导入GMR传感器，其现在可以与经修饰的分析物相互作用。在一些实施方案中，也可以对珠子进行修饰，例如使用涂层或一些其它能够与经修饰的分析物相互作用的连接分子。步骤1314提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1316检测磁电阻的变化。最后，步骤1318提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
现在参考图14A，图中示出了传感器结构示意图，其显示了在整个示例性加性过程中，传感器结构状态1400a-c。在该过程开始时，系统处于1400a状态，其中GMR传感器已在其生物表面1465上布置了多个分子(通常是生物分子)1425。选择多个分子1425，以与查询分析物相互作用(化学反应)。如第二状态1400b所示，这种相互作用修饰分子1425(与分析物浓度成比例)，以提供经修饰的分子1411。如状态1300c所示，经修饰的分子1411被配置为结合磁性珠1415。在一些实施方案中，经修饰的分子1411可能需要在结合磁性颗粒1415之前进一步进行化学修饰。在其它实施方案中，经修饰的分子1411可以不经化学修饰而结合磁性纳米颗粒1415。在一些实施方案中，可以对磁性珠1415进行涂覆，或者以其它方式进行修饰，以与经修饰的分子1411相互作用。通过从状态1400a(其中不存在磁性珠1415)到状态1400c(其中磁性珠1415经由经修饰的分子1411与生物表面1465相缔合)所测量的磁电阻变化，提供了定量查询分析物的能力。注意，在整个过程中，查询分析物仅仅用作对多个分子1425进行化学修饰的试剂，并且一旦它完成了这一功能，就不再继续是该过程的一部分。
图14B示出了与图14A的传感器结构示意图相关的示例性处理流程1401。该过程从1420开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1430通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或诸如此类。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。经过系统的运动可由气动控制。在1440，以指定流速将处理的样品发送至GMR传感器。可以选择这种流速来反映GMR传感器表面上的化学动力学。接下来，步骤1450将珠子导入GMR传感器，其现在可以与生物表面上经修饰的分子相互作用。在一些实施方案中，也可以对珠子进行修饰，例如使用涂层或一些其它能够与生物表面上经修饰的分子相互作用的连接分子。步骤1460提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1470检测磁电阻的变化。最后，步骤1480提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
现在参考图15A，图中示出了传感器结构示意图，其显示了在整个示例性加性过程中，传感器结构状态1500a-c。在该过程开始时，系统处于1500a状态，其中GMR传感器已在其生物表面1565上布置了多个分子(通常是生物分子)1525。选择多个分子1525，以与查询分析物相互作用(化学反应)。如第二状态1500b所示，这种相互作用修饰分子1525(与分析物浓度成比例)，以提供经修饰的分子1511。如状态1500c所示，经修饰的分子1511被配置成防止磁性珠1515的结合，其中磁性珠仅结合未经分析物修饰的分子1525。在一些实施方案中，可以对磁性珠1515进行涂覆或者以其它方式进行修饰，以与分子1525相互作用。通过从状态1500a(其中不存在磁性珠1515)到状态1500c(其中磁性珠1515经由分子1525与生物表面1565相缔合)所测量的磁电阻变化，提供了定量查询分析物的能力。注意，在整个过程中，查询分析物仅仅用作对多个分子1525进行化学修饰的试剂，并且一旦它完成了这一功能，就不再继续是该过程的一部分。
图15B示出了与图15A的传感器结构示意图相关的示例性处理流程1501。该过程从1510开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1520通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或诸如此类。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。经过系统的运动可由气动控制。在步骤1530，以指定流速将处理的样品发送至GMR传感器。可以选择这种流速来反映GMR传感器表面上的化学动力学。接下来，步骤1540将珠子导入GMR传感器，其现在可以与生物表面上未修饰的分子相互作用。在一些实施方案中，也可以对珠子进行修饰，例如使用涂层或一些其它能够与未修饰的分子相互作用的连接分子。步骤1550提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1560检测磁电阻的变化。最后，步骤1570提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
现在参考图16A，图中示出了传感器结构示意图，其显示了在整个示例性加性过程中的传感器结构状态1600a-d，该加性过程采用夹心抗体策略来检测分析物1695(状态1600b)。在该过程开始时，系统处于1600a状态，其中GMR传感器已在其生物表面1665上布置了多个抗体1625。然后，分析物1695经过生物表面1665，使分析物1695与抗体1625结合，如状态1600b所示。然后，通过结合第二抗体1635对分析物1695进行修饰，针对该第二抗体提供了共价连接的生物素部分(B)，如状态1600c所示。然后，加入用链霉亲和素(S)修饰的磁性珠1615，以此允许强生物素-链霉亲和素缔合，以提供状态1600d。在一些实施方案中，链霉亲和素作为磁性珠1615上的涂层提供。
图16B示出了与图16A的传感器结构示意图相关的示例性处理流程1601。该过程从1610开始，将样品注入盒式组件。然后，样品可以在步骤1620通过任何必要步骤进行处理，例如过滤、稀释和/或诸如此类。这些预处理步骤的顺序将取决于待检测样品和查询分析物的性质。经过系统的运动可由气动控制。在步骤1630，以指定流速将处理好的样品发送至GMR传感器。可以选择这种流速来反映生物表面结合的抗体和分析物之间的GMR传感器表面上的化学动力学。接下来，步骤1640将生物素化抗体(Ab)导入GMR传感器。这在两种抗体之间产生了分析物的“夹心”结构。在步骤1650，将链霉亲和素涂覆的珠子导入GMR传感器，其现在可以与生物素结合的抗体相互作用。步骤1660提供了从GMR传感器获取读数，这些读数反映了GMR传感器表面上磁性珠浓度的变化。这些读数允许在步骤1670检测磁电阻的变化。最后，步骤1680提供了基于磁电阻的变化来计算检测结果。
在一些实施方案中，本文描述的微流控装置包括一个或多个膜。微流控装置的膜与核酸非特异性且可逆地结合。任何合适的膜都可用于本文所述的微流控装置或方法。膜的非限制性示例包括二氧化硅、玻璃纤维、赛力特硅藻土(Celite)、改性玻璃和离子交换膜。在一些实施方案中，膜是一种多孔膜。
在一些实施方案中，微流控装置被配置为检测从受试者获得的样品中存在的靶核酸中的基因变异。在一些实施方案中，该装置包括图1-15和24-26所示的一个或多个组成部分。在一些实施方案中，装置包括图1-15和24-26所示的配置或其变型。在一些实施方案中，装置包括一个或多个微流体通道，其可操作地和/或流控地连接到该装置的每个组成部分。
“流控地连接”的部件或部分是与布置在装置内的液体或流体接触和/或可以接触(例如，通过打开或关闭阀门)的装置的部件或部分。不将96孔板的一个孔视为与96孔板中的另一个孔流控地连接。类似地，即使流体可以从一个Eppendorf管转移到另一个Eppendorf管，一个管也不与另一个管流控地连接。术语“可操作地连接”，意指设备的特定部件或部分可以分别进行连通、附接或连接，它们以这种方式相互协作从而实现其意图的一种或多种功能。可操作的“连接”可以是直接的、间接的、物理的或远程的。
在一些实施方案中，现在转到图24、25和26，微流控装置包括选自下列的一种或多种部件：微流体通道(例如，105)、腔室、膜(例如，104)、扩增室(例如，208)、阀门120、传感器(例如，300，如磁性传感器)、冻干试剂、溶解试剂、加热源、冷却源、泵、端口(例如，流量控制口602或样品加载口605)。在一些实施方案中，装置的一些或所有部件可操作地和/或流控地连接(例如，通过相关的微流体通道和阀门)。在一些实施方案中，装置包括选自下列的一个或多个腔室：样品室(例如100)、洗涤室(例如101、102、250)、收集室(例如201)、废物收集室(例如200、400)、混合室(例如206、216)、试剂室(例如204、218)或磁性颗粒室(例如230)。
在一些实施方案中，微流控装置包括一个或多个微流体通道(例如105)。微流体通道可以包括合适的横截面几何结构，其非限制性示例包括圆形、椭圆形、矩形、三角形等或其组合。微流体通道可以包括合适的结构，其非限制性示例包括直形、弯曲、盘旋形和/或凸起，并可包括一个或多个接头，其流控地连接一个或多个微流体通道和本文所述微流控装置的相关部件。在一些实施方案中，微流体通道的平均、均值或绝对内径为约10纳米至1000微米、50纳米至500微米、100纳米至500微米或100纳米至100微米。在一些实施方案中，阀门(120)、腔室(100-103、200、201、204、206、208、210、216、218、230、250)、膜104和/或传感器300中的一个或多个被布置在微流体通道的通道主体内。在一些实施方案中，将膜104和/或传感器300布置在可操作地和/或流控地连接到一个或多个微流体通道的腔室内。在一些实施方案中，微流体通道包括用于将样品或一种或多种试剂导入微流控装置的样品端口。
在一些实施方案中，微流控装置包括样品室和传感器，它们通过一个或多个微流体通道和阀门可操作地和/或流控地连接，从而使得布置在该装置内的流体的流动方向通常是在从样品室向传感器的方向。相应地，作为参照，第二部件近侧的第一部件，指的是参照流体流向传感器的方向，位于第二部件上游的第一部件。同样，第二部件远端的第一部件，指的是参照流体流向传感器的方向，位于第二部件下游的第一部件。
在一些实施方案中，腔室是样品室。在一些实施方案中，样品室包括样品或者被配置为包含样品。在一些实施方案中，样品室包含一种或多种试剂。在一些实施方案中，样品室包含细胞裂解溶液，其可以包含洗涤剂、盐、缓冲剂、离液剂和醇中的一种或多种。在一些实施方案中，可以将细胞裂解溶液从另一个腔室导入样品室，或者通过样品加载口导入。
在一些实施方案中，腔室是洗涤室。洗涤室被配置成容纳合适的洗涤溶液。在一些实施方案中，在洗涤室(例如，101、102、250)内放置洗涤溶液。洗涤溶液通常被配置为洗涤非共价或共价结合到膜(例如，二氧化硅膜)或表面(例如，传感器的表面)的核酸。洗涤室可以包含任何合适的洗涤溶液。在一些实施方案中，洗涤溶液包含缓冲剂(例如，Tris或HEPES)、醇、洗涤剂、螯合剂、盐和/或离液剂中的一种或多种。
在一些实施方案中，腔室是洗脱室。洗脱室被配置成容纳合适的洗脱溶液。洗脱溶液被配置为从膜上去除核酸，其中核酸可逆地且非共价地结合到膜上。在一些实施方案中，在洗脱室内放置洗脱溶液。在一些实施方案中，洗脱溶液包含缓冲剂(例如，Tris)。
在一些实施方案中，样品室(例如100)、一个或多个洗涤室(例如，101、102)和/或洗脱室(例如103)可操作地和/或流控地并行连接到微流体通道(例如105)，其中微流体通道包括可操作地连接到一个或多个腔室的一个或多个阀门(例如，参见图24；V1、V2、V3和V4)。在一些实施方案中，一个或多个腔室(例如，样品室100、洗涤室(101、102)、洗脱室103)中的每一个都位于膜(例如104)的近侧，其中每个腔室可操作地和/或流控地连接到膜。在一些实施方案中，膜容纳在膜室内。在一些实施方案中，将膜布置在微流体通道内。在一些实施方案中，使膜与微流体通道在线(in-line)，从而使放置在装置内的流体流过该膜。在一些实施方案中，将膜(例如104)可操作地和/或流控地连接到位于膜远端(即其下游)的扩增室。
在一些实施方案中，微流控装置包括样品端口，其被配置成将样品导入该装置。在某些实施方案中，样品端口可操作地和/或流控地连接到一个或多个腔室。在一些实施方案中，装置包括样品端口605和样品室100，其中该样品端口位于样品室的近侧。在一些实施方案中，样品端口605被配置为用于将样品导入样品室100内。在一些实施方案中，样品端口位于样品室的近侧。在一些实施方案中，样品端口是样品注入端口。
在一些实施方案中，装置包括废物室(例如200)，该废物室被配置用于收集已经接触过膜(例如104)的流体和洗涤溶液。在一些实施方案中，废物室可操作地和/或流控地连接到膜(例如104)。废物室(例如200)可以位于膜(例如104)的下游，和/或样品室和/或洗涤室的下游，如此使得多余的流体和洗涤缓冲液可以在接触膜之后转移到废物室内(例如，通过打开近侧阀门V5，图24)。在一些实施方案中，废物室(例如200)可操作地连接到能够产生负压的泵(例如，隔膜式泵或注射式泵)，当阀门V5打开时，该负压可以将流体流从膜(例如104)转移到该废物室(例如200)内。
在一些实施方案中，装置包括洗脱收集室(例如201)，其可操作地和/或流控地连接到膜(例如104)和扩增室(例如208)，其中该洗脱收集室位于膜的远端(即，其下游)。在一些实施方案中，洗脱收集室位于扩增室的近侧。洗脱收集室被配置为临时收集从膜104洗脱的核酸。在洗脱室内放置的核酸随后可转移至扩增室。在一些实施方案中，装置包括试剂室(例如204)和/或混合室(例如206)，它们可操作地和/或流控地连接到近侧膜(例如104)和/或近侧洗脱室(例如201)。在一些实施方案中，试剂室(例如204)和/或混合室(例如206)可操作地和/或流控地连接到扩增室(例如104)。在一些实施方案中，试剂室和混合室位于彼此邻近的位置，其中混合室位于试剂室的下游和远端。在一些实施方案中，试剂室和混合室位于膜和扩增室之间。
在某些实施方案中，在试剂室(例如，204、218)内放置试剂。在试剂室内放置的试剂可以是干燥的和/或冻干的。在一些实施方案中，在试剂室内放置的试剂溶解或分散在液体中。在某些实施方案中，当流体进入试剂室时，位于试剂室内的干燥或冻干试剂在与流体(例如，洗脱出的核酸)接触时基本上溶解。下游混合室(例如206)通常有助于溶解过程。在一些实施方案中，以盘旋形配置布置的下游或远端微流体通道有助于溶解(例如，参见图24中的“局部混合1”和“局部混合2”)。相应地，在一些实施方案中，混合室(例如206、216)和/或盘旋形通道位于试剂室(例如204、218)的远端。在一些实施方案中，试剂室(例如，204、218)包含一种或多种试剂，其非限制性示例包括扩增引物、一种或多种阻断寡核苷酸、一种或多种聚合酶(例如，热稳定聚合酶)、外切核酸酶(例如，5'-3'外切核酸酶)、dNTP、盐类、缓冲剂、洗涤剂等及其组合。在一些实施方案中，位于扩增室近侧的试剂室包含聚合酶。在一些实施方案中，位于扩增室远端的试剂室包含外切核酸酶。
在一些实施方案中，装置包括扩增室。扩增室被配置成执行扩增过程(例如，聚合酶链式反应(PCR))。在一些实施方案中，扩增室位于样品室和/或膜的远端(即其下游)，并位于传感器的近侧。在一些实施方案中，扩增室可操作地连接到加热源和/或冷却源。在某些实施方案中，扩增室包含加热源和/或冷却源。任何合适的加热或冷却源均可用于本文所述的装置中。在一些实施方案中，加热或冷却源位于扩增室的近侧，从而可以调节和/或调整进入扩增室的流体的温度。在一些实施方案中，扩增室包含一种或多种扩增试剂(例如，干燥试剂)，其非限制性示例包括引物、阻断寡核苷酸、盐类、缓冲剂、聚合酶、洗涤剂、dNTP等及其组合。在一些实施方案中，扩增室包括设置在扩增室内的表面，其中该表面可操作地和/或流控地连接到装置的一个或多个组分。在一些实施方案中，扩增室的表面包含一种或多种引物或阻断寡核苷酸，它们共价附接到扩增室的表面。例如，在一些实施方案中，第一引物附着于扩增室的表面，并且包含结合对成员的第二引物不附着于该腔室的表面，从而使得源自第一引物的扩增子保留在腔室中。在一些实施方案中，扩增室(例如208)可操作地和/或流控地连接到远端试剂室(例如218)。
在一些实施方案中，微流控装置包括传感器(例如300，如磁性传感器)。任何合适的传感器均可用于本文所述的装置或方法，其非限制性示例包括摄像机(例如，数码摄像机、电荷耦合器件(CCD)摄像机)、光敏二极管、光电管、质谱仪、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、激光扫描细胞仪、磁性传感器(例如，巨磁电阻(GMR)传感器)等及其组合。在一些实施方案中，传感器是磁性传感器。在一些实施方案中，磁性传感器是磁电阻传感器。在一些实施方案中，磁性传感器是巨磁电阻(GMR)传感器。在一些实施方案中，磁性传感器是各向异性磁阻(AMR)传感器和/或磁性隧道结(MTJ)传感器。在一些实施方案中，磁性传感器检测磁电阻、电流和/或电压电位或其变化。在一些实施方案中，磁性传感器检测传感器表面上的磁电阻、电流和/或电压电位或其变化。在一些实施方案中，磁性传感器检测在一段时间内的磁电阻、电流和/或电压电位或其变化，这段时间的非限制性示例包括1纳秒至1小时、1秒至60分钟、1秒至10分钟、1秒至1000秒或其中间时段。在一些实施方案中，磁性传感器根据由磁性传感器检测到的磁电阻、电流和/或电压电位或其变化，来检测与磁性传感器表面结合(例如，间接结合)或相关联的磁性颗粒的存在、不存在或量。在一些实施方案中，磁性传感器根据与磁性传感器表面结合(例如，间接结合)或相关联的磁性颗粒的存在、不存在或量，来检测样品中存在的基因变异的存在、不存在或量。相应地，在一些实施方案中，磁性传感器根据在磁性传感器表面上检测或测量到的磁电阻、电流和/或电压电位或其变化，来检测样品中存在的基因变异的存在、不存在或量。
在一些实施方案中，传感器包含捕获核酸。在一些实施方案中，使用合适的化学将捕获核酸附着(例如共价)到传感器的表面，其非限制性示例包括描述于下列中的化学，即Cha等人(2004)“Immobilization oforiented protein molecules on poly(ethyleneglycol)-coated Si(111)”Proteomics4:1965-1976和Zellander等人(2014)“Characterization of Pore Structure in Biologically Functional Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)-Poly(ethylene glycol)Diacrylate(PHEMA-PEGDA),”PLOSONE 9(5):e96709。
在一些实施方案中，传感器位于扩增室的远端。在一些实施方案中，传感器包括设置在该传感器上的表面。在一些实施方案中，将一个或多个捕获核酸附着(例如，以共价方式)到传感器的表面。在一些实施方案中，装置包括两个或更多个传感器，每个传感器包括含有不同捕获核酸的表面。在一些实施方案中，传感器的表面包括可寻址位置，每个位置包含不同的捕获核酸。在一些实施方案中，在微流体通道内设置传感器。在一些实施方案中，将传感器设置在腔室内，该腔室可操作地和/或流控地连接到装置的其它部件。在一些实施方案中，装置包括加热和/或冷却源。在一些实施方案中，传感器可操作地连接到加热和/或冷却源(例如210)，该加热和/或冷却源被配置成调节、维持、升高和/或降低接触传感器的流体的温度。在一些实施方案中，装置包括位于传感器近侧的加热源和/或冷却源。
在一些实施方案中，装置包括位于传感器近侧(其上游)的颗粒室(例如，磁性颗粒(MNP)室(例如230))。颗粒室通常包含颗粒，其中颗粒通常附着于结合对的成员(例如，链霉亲和素)。容纳在颗粒室内的颗粒可以冻干或分散在流体中。在一些实施方案中，颗粒室可操作地和/或流控地连接到阀门(例如V13)，当该阀门打开时，将颗粒分散到位于传感器上游或近侧的微流体通道内，从而使颗粒进行接触和/或流过传感器。
在一些实施方案中，装置包括位于磁性传感器近侧的磁性颗粒(MNP)室(例如230)。MNP室通常包含磁性颗粒。在一些实施方案中，将MNP室中的磁性颗粒附着于结合对的成员(例如，链霉亲和素)。容纳在MNP室内的磁性颗粒可以冻干或分散在流体中。在一些实施方案中，MNP室可操作地和/或流控地连接到阀门(例如V13)，当该阀门打开时，将磁性颗粒分散到位于磁性传感器上游或近侧的微流体通道内，从而使磁性颗粒进行接触和/或流过磁性传感器。
在一些实施方案中，一个或多个洗涤室(例如，250)位于传感器近侧，其中每个洗涤室(例如，250)包括洗涤缓冲液。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含一种或多种荷正电的离子(例如，Mg++、Ca++、Na+、K+等或其组合)。在一些实施方案中，洗涤室包含选自下列的一种或多种试剂，即盐、缓冲剂、洗涤剂、醇等及其组合。
在一些实施方案中，装置包括一个或多个位于传感器远端的废物室(例如400)。
在某些实施方案中，将微流控装置设置在卡板或盒体上。相应地，在一些实施方案中，微流控装置或者包含本文所述微流控装置的卡板或盒体具有3至10cm的长度、1至10cm的宽度和0.1至1cm的厚度。
在一些实施方案中，微流控装置包括印刷电路板(PCB)502。在一些实施方案中，PCB包括一个或多个电焊盘连接件(例如500)。在一些实施方案中，PCB的一个或多个电焊盘连接件可操作地(例如，以电子方式)连接到微流控装置的一个或多个阀门(例如，120)、传感器和/或一个或多个泵。在一些实施方案中，PCB包括一个或多个部件，其非限制性示例包括样品室(例如100)、膜(例如104)、阀门(例如120)、扩增室(例如208)、传感器、废物室(例如200、400)、洗涤室(例如101、102、250)、控制口(例如602)、磁性颗粒储存室(230)、热区(例如208、210)、混合室(例如206、216)、试剂室(例如204、218)、微流体通道(例如105)等或其组合，其中一个或多个或所有部件通过一个或多个微流体通道和/或相关阀门可操作地和/或流控地相互连接。
在一些实施方案中，将微流控装置设置在盒体或卡板(例如，600)上，该盒体或卡板包括PSB以及选自下列的一种或多种部件，即样品室100、膜104、阀门120、扩增室208、传感器、废物室(例如200、400)、洗涤室(例如101、102、250)、控制口(602)、磁性颗粒储存室(230)、热区(例如208、210)、混合室(206、216)、试剂室(例如204、218)和微流体通道(105)，其中一个或多个或所有部件通过微流体通道和/或相关阀门可操作地和/或流控地相互连接。在一些实施方案中，盒600被配置用于插入或附接到控制器、存储器和/或计算机。在一些实施方案中，控制器包括泵(例如，隔膜型泵或注射型泵)，其可操作地连接到位于盒上的一个或多个流动控制口602。
在一些实施方案中，本文描述的微流控装置、PCB或盒包括下列文件中描述的一种或多种部件、子部件或部分：申请号为PCT/US2019/043720、名称为“SYSTEM AND METHODFOR GMR-BASED DETECTION OF BIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504846)并在2019年7月26日提交的国际专利申请，申请号为PCT/US2019/043753、名称为“SYSTEM AND METHODFOR SAMPLE PREPARATION IN GMR-BASED DETECTION OF BIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504847)并在2019年7月26日提交的国际专利申请，申请号为PCT/US2019/043766、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR SENSING ANALYTES IN GMR-BASED DETECTION OFBIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504848)并在2019年7月26日提交的国际专利申请，或申请号为PCT/US2019/043791、名称为“SYSTEM AND METHOD FOR PROCESSING ANALYTESIGNALS IN GMR-BASED DETECTION OF BIOMARKERS”(代理人案号为026462-0504850)并在2019年7月26日提交的国际专利申请，所有这些文件的全部内容在此通过引用方式并入本文。在一些实施方案中，本文描述的方法利用了以下文件中描述的一种或多种部件、子部件或部分：申请号为PCT/US2019/043720、PCT/US2019/043753、PCT/US2019/043766或PCT/US2019/043791的国际专利申请。在一些实施方案中，本文描述的微流控装置包括以下文件中描述的磁性传感器和/或磁性传感器组件：申请号为PCT/US2019/043720、PCT/US2019/043753、PCT/US2019/043766或PCT/US2019/043791的国际专利申请。
在一些实施方案中，任何一个腔室(例如，00-103、200、201、204、206、208、210、216、218、230、250)和/或容纳膜的腔室或容纳传感器的腔室包括独立选自于下列的容积，即1μl至20ml、1μl至15ml、1μl至5ml、1μl至1ml、1μl至500μl、1μl至100μl及其中间容积。在一些实施方案中，容纳膜的腔室包括10μl至500μl的容积。在一些实施方案中，容纳传感器的腔室包括100μl至1000μl的容积。
以下是根据本文详述的原理，可以实现的分析物感测应用的非限制性列表。
(1)血液或其它生物或环境样品，样品可包括分析物例如核酸，如DNA、RNA等，它们可通过采用此处和全文公开的微流控装置、GMR设备和基因变异检测测定法进行测量。下表1汇总了与此类分析物相关的示例性非限制性的疾病状态，以及可能检测到的分析物。
表1
Figure BDA0003631321900000661
Figure BDA0003631321900000671
(2)本文所述的GMR系统可用于尿分析物检测。尿中的任何蛋白质、核酸(如DNA、RNA等)、金属或其它物质都可以通过本文所述的GMR设备进行测量和/或检测。尿相关的生物标志物包括但不限于先兆子痫、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、肾损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、白细胞介素(IL)-18和脂肪酸结合蛋白(FABP)、核基质蛋白22(NMP22)、BLCA-4和表皮生长因子受体(EGFR)等。药物和/或其主要泌尿代谢物包括对乙酰氨基酚/扑热息痛(APAP)、安非他命(AMP)、甲基安非他命(mAMP)、巴比妥类(BAR)、苯二氮
Figure BDA0003631321900000672
类(BZO)、可卡因(COC)、美沙酮(MTD)、阿片类(OPI)、苯环己哌啶(PCP)、THC和三环类抗抑郁药(TCA)等。
(3)本文描述的GMR系统可以用于唾液分析物检测。唾液或者口腔上皮细胞中的任何蛋白质、DNA、金属或其它物质都可以通过本文所述的GMR设备进行测量和/或检测。示例性生物标志物包括但不限于基质金属蛋白酶(即MMP1、MMP3、MMP9)、细胞因子(即，白细胞介素-6、白细胞介素-8、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、肿瘤坏死因子(TNF)、转铁蛋白和成纤维细胞生长因子)、髓样相关蛋白14(MRP14)、肌动蛋白抑制蛋白(profilin)、分化簇59(CD59)、过氧化氢酶和Mac-2结合蛋白(M2BP)等。药物包括安非他命(AMP)、巴比妥类(BAR)、苯二氮
Figure BDA0003631321900000681
类(BZO)、丁丙诺啡(BUP)、可卡因(COC)、可替宁(COT)、芬太尼(FYL)、K2/合成大麻素(K2)、氯胺酮(KET)、甲基安非他命(MET)、美沙酮(MTD)、阿片类(OPI)、羟考酮(OXY)、苯环己哌啶(PCP)、大麻(THC)和曲马多(TML)。
(4)本文描述的GMR系统可以用于眼液分析物检测。眼液中的任何蛋白质、DNA、金属或其它物质都可以通过本文所述的GMR设备进行测量和/或检测。眼液生物标志物包括但不限于α-烯醇化酶、α1-酸性糖蛋白1、S100A8/钙粒蛋白A、S100A9/钙粒蛋白B、S100A4和S100A11(calgizzarin)、促乳素诱导蛋白(PIP)、脂质运载蛋白-1(LCN-1)、乳铁蛋白和溶菌酶、β-淀粉样蛋白1–40、中性粒细胞防御素NP-1和NP-2等，它们可以根据本文公开的测定法和装置进行测量。
(5)本文公开的实施方案可以采用液体活检作为查询分析物(例如生物标志物)的样品。在一些这样的实施方案中，可以提供用于在患者血液中鉴定癌症的方法。本文描述的方法可用于检测血液中发现的DNA“罕见”突变。来自癌细胞的DNA经常进入血流，然而大多数血液携带的DNA(>99％)将来自健康细胞。本文公开的方法可用于检测这些“罕见”突变并验证结果。本文公开的方法提供了多步骤过程，其使用GMR检测平台在单测定中进行捕获。
在一些这样的实施方案中，可以提供用于检测和/或区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体的方法。本文公开的方法可用于通过采用核酸探针来检测和/或区分一种或多种致病生物体，该核酸探针被设计成根据本文公开的测定法和装置来区分一种或多种致病生物体。可以使用本文公开的测定法和装置从一个或多个样品中检测和/或区分的示例性非限制性生物体包括，例如耳道假丝酵母菌(Candida auris)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、光滑假丝酵母菌(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母菌(Candida krusei)、黑马朗假丝酵母菌(Candida haemulonis)、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、波萨达斯球孢子菌(Coccidioides posadasii)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioidis)、串珠镰孢菌(Fusariummoniliforme)、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、米根霉菌(Rhizopusoryzae)、小孢根霉菌(Rhizopus microspores)和耳念珠菌(Candida auris)。
本文公开的方法包括从血液、唾液、精液或其它生物样品或者从环境样品中提取核酸，例如DNA、RNA和/或诸如此类，根据本文的实施方案，这些方法在盒中自动进行，该盒可以从样品中执行必要的DNA提取和纯化。在一些实施方案中，二氧化硅膜被用作提取过程的一部分，但是本文的方法不限于此。在提取和纯化之后，该方法提供了选择性扩增感兴趣的查询生物标志物。在一些实施方案中，仅扩增癌DNA的方法包括使用锁核酸作为阻断物来防止正常DNA被扩增。其它选择性扩增方法是本领域已知的。该方法的下一步是检测患者样品中是否存在感兴趣的癌DNA生物标志物。在一些实施方案中，这是通过使用外切核酸酶将双链DNA(dsDNA)转化为单链DNA(ssDNA)来实现的。将dsDNA转化为ssDNA的其它方式在本领域中是已知的。该方法继续通过使用点样在生物表面上的互补DNA区段来捕获ssDNA。在一些实施方案中，ssDNA末端附着有生物素，并且此生物素捕获链霉亲和素标记的磁性珠。在一些实施方案中，方法包括验证ssDNA(来自患者)是否与点样探针(合成的DNA区段)完全互补。可以通过加热使两段DNA之间的结合变性来实现验证。与完全结合相比，不完全结合会在更低的温度下变性(或分离)。这允许对信号进行验证，确定信号是由真阳性还是假阳性引起的。通过使用此验证步骤，可以在诊断患者时实现更高水平的准确性。除了加热使DNA变性之外，还有其它方法也是本领域已知的。
本文提供了用于分析核酸的方法和组合物。在一些实施方案中，分析了核酸片段混合物中的核酸片段。可以从任何类型的适当生物标本或样品(例如，测试样品)中分离出核酸。在一些实施方案中，样品包含核酸。样品或测试样品可以是从受试者(例如，哺乳动物、人类)分离或获取的任何标本。标本的非限制性示例包括来自受试者的流体或组织，包括但不限于血液、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜下)、活检样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻腔粘膜、前列腺液、洗出液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳等或其组合。在一些实施方案中，生物样品是血液或血液制品(例如，血浆或血清)。核酸可以来源自一种或多种样品或来源。
在一些实施方案中，使样品与一种或多种合适的细胞裂解试剂接触。裂解试剂通常被配置成裂解全细胞，和/或从污染物(例如，蛋白质、碳水化合物和脂肪酸)中分离出核酸。细胞裂解试剂的非限制性示例包括洗涤剂、低渗溶液、高盐溶液、碱性溶液、有机溶剂(例如，苯酚、氯仿)、离液盐、酶类等或其组合。任何合适的裂解程序都可用于本文所述的方法。
术语“核酸”指的是脱氧核糖核酸(DNA，例如互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)等)和/或核糖核酸(RNA，例如mRNA、短抑制性RNA(siRNA))、DNA或RNA类似物(例如，含有碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA)等及其组合。核酸可以是单链或双链的。在一些实施方案中，核酸是引物。在一些实施方案中，核酸是靶核酸。靶核酸通常是感兴趣的核酸。
在某些实施方案中，可以提供核酸用于实施本文所述的方法，而无需对含有核酸的样品进行处理。在一些实施方案中，在对含有核酸的样品进行处理后，提供核酸用于实施本文所述的方法。例如，可以在本文描述的方法之前、期间或之后，从样品中提取、分离、纯化、部分纯化或扩增核酸。
在一些实施方案中，通过包含核酸扩增的过程来扩增核酸，其中核酸的一条或两条链以酶促方式复制，从而产生核酸链的拷贝或互补拷贝。通过扩增过程产生的核酸拷贝通常被称为扩增子。核酸扩增过程可以线性地或指数地产生具有与模板或靶核酸或其片段相同或基本相同的核苷酸序列的扩增子。可以通过合适的核酸扩增过程来对核酸进行扩增，其非限制性示例包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式(n)PCR、定量(q)PCR、实时PCR、逆转录(RT)PCR、等温扩增(例如，环介导等温扩增(LAMP))、定量核酸序列依赖性扩增(QT-NASBA)等，其变型，以及其组合。在一些实施方案中，扩增过程包括聚合酶链式反应。在一些实施方案中，扩增过程包括等温扩增过程。
在一些实施方案中，核酸扩增过程包括使用一种或多种引物(例如，可以与核酸模板或靶标特异性杂交的短寡核苷酸)。杂交的引物通常可以在核酸扩增过程中由聚合酶延伸。在一些实施方案中，使包含核酸的样品与一种或多种引物进行接触。在一些实施方案中，使核酸与一种或多种引物进行接触。引物可以附着在固体基底上，也可以游离在溶液中。
在一些实施方案中，核酸或引物包含一种或多种可区分的标识物。任何合适的可区分标识物和/或可检测标识物均可用于本文所述的组合物或方法。在某些实施方案中，可区分的标识物可以直接或间接与核酸相关联(例如，结合)。例如，可区分的标识物可以以共价或非共价的方式结合到核酸上。在一些实施方案中，可区分的标识物附着于与核酸共价或非共价结合的结合对成员。在一些实施方案中，可区分的标识物与核酸可逆地缔合。在某些实施方案中，可以使用合适的方法(例如，通过增加盐浓度、变性、洗涤、加入合适的溶剂和/或通过加热)从核酸中去除与核酸可逆地缔合的可区分标识物。
在一些实施方案中，可区分的标识物是一种标记物。在一些实施方案中，核酸包含可检测标记物，其非限制性示例包括放射性标记物(例如同位素)、金属标记物、荧光标记物、发色团、化学发光标记物、电化学发光标记物(例如OrigenTM)、磷光标记物、淬灭剂(例如，荧光团淬灭剂)、荧光共振能量转移(FRET)对(例如，供体和接受体)、染料、蛋白质(例如，酶(如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶))、酶底物、小分子、质量标签、量子点等，或其组合。任何合适的荧光团都可以用作标记物。发光标记物可以通过各种合适的方法进行检测和/或定量，例如，通过光电管、数码摄像机、流式细胞术、凝胶电泳、曝光胶片、质谱、荧光测定分析、荧光显微术、共聚焦激光扫描显微术、激光扫描细胞分析术等及其组合。
在一些实施方案中，可区分的标识物是一种条形码。在一些实施方案中，核酸包含核酸条形码(例如，索引核苷酸、序列标签或“条形码”核苷酸)。在某些实施方案中，核酸条形码包含可区分的核苷酸序列，其可用作标识物以允许在样品、方法或测定中明确识别一种或多种核酸(例如，核酸的子集)。例如，在某些实施方案中，核酸条形码对于某一样品、样品来源、特定核酸属或核酸种、染色体或基因具有特异性和/或唯一性。
在一些实施方案中，核酸或引物包含一个或多个结合对。在一些实施方案中，核酸或引物包含一个或多个结合对的成员。在一些实施方案中，结合对包括至少两个成员(例如，分子)，它们以非共价和特异性方式相互结合。结合对的成员通常可逆地相互结合，例如结合对两个成员的缔合可以通过合适的方法进行解离。任何合适的结合对或其成员都可以用于本文所述的组合物或方法。结合对的非限制性示例包括抗体/抗原、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A或蛋白G、半抗原/抗半抗原、巯氢基/马来酰亚胺、巯氢基/卤乙酰衍生物、胺/异三氰酸酯、胺/琥珀酰亚胺酯、胺/磺酰卤化物、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、受体/配体、维生素B12/内在因子，其类似物、其衍生物、其结合部分等或其组合。结合对成员的非限制性示例包括抗体或抗体片段、抗体受体、抗原、半抗原、肽、蛋白质、脂肪酸、甘油基部分(例如，脂质)、磷酰基部分、糖基部分、泛素部分、凝集素、适配体、受体、配体、金属离子、亲和素、中性抗生物素蛋白、生物素、维生素B12、内在因子，其类似物、其衍生物、其结合部分等或其组合。在一些实施方案中，核酸或引物包含生物素。在一些实施方案中，核酸或引物与生物素共价附接。
在一些实施方案中，核酸或引物以非共价或共价方式附着到合适的固体基底上。在一些实施方案中，将捕获寡核苷酸和/或结合对的成员附着在固体基底上。捕获寡核苷酸通常是被配置为与靶核酸特异性杂交的核酸。在一些实施方案中，捕获核酸是一种附着于固体基底的引物。固体基底的非限制性示例包括由微阵列提供的表面和颗粒例如珠子(如，顺磁性珠、磁性珠、微珠、纳米珠)、微粒和纳米颗粒。固体基底还可以包括，例如，芯片、柱、光导纤维、纸巾(wipe)、滤光片(例如，平面滤光片)、一种或多种毛细管、玻璃和改性或官能化玻璃(例如，可控孔径玻璃(CPG))、石英、云母、重氮化膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、量子点、经涂覆的珠子或颗粒、其它层析材料、磁性颗粒、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、特氟隆TM、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、树脂、二氧化硅或二氧化硅基材料，包括硅、硅胶和改性硅、
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碳、金属(例如，钢、金、银、铝、硅和铜)、无机玻璃、导电聚合物(包括聚合物例如聚吡咯和聚吲哚)；微米结构化或纳米结构化表面，例如核酸嵌合阵列、纳米管、纳米线或纳米颗粒装饰的表面；或多孔表面或凝胶，例如丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维性或链状聚合物。在一些实施方案中，使用含有任何数量的材料(包括聚合物，例如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖)的钝化或化学衍生化涂层，对固体基底进行涂覆。珠子和/或颗粒可以是游离的或彼此连接的(例如烧结的)。在一些实施方案中，固体基底指的是颗粒的集合体。在一些实施方案中，颗粒包含赋予颗粒顺磁性的作用剂。在一些实施方案中，第一固体基底(例如，多个磁性颗粒)非共价地和/或可逆地附接到第二固体基底(例如，表面)。在一些实施方案中，可以对第二基底或表面进行电子磁化，使得当表面磁化时磁性颗粒可逆地附着于第二基底，并且当对第二基底进行去磁化时或者在改变第二基底的磁极性的情况下，磁性颗粒可以释放出来。
在一些实施方案中，核酸是捕获核酸，例如捕获寡核苷酸。在一些实施方案中，捕获核酸是以共价或非共价方式附着在固体基底上的核酸。捕获寡核苷酸通常包含能够与感兴趣的核酸(例如靶核酸)或其一部分特异性杂交或退火的核苷酸序列。在一些实施方案中，捕获核酸包含与靶核酸或其一部分基本上互补的核酸序列。在一些实施方案中，捕获寡核苷酸是附着于固体基底的引物。捕获寡核苷酸可以是天然生成的或合成的，并且可以是基于DNA或RNA的。捕获寡核苷酸可允许例如将靶核酸从样品中的其它核酸或污染物中特异性分离出来。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括使多种核酸(例如样品中的核酸)与至少一种包含结合对成员的引物进行接触。在一些实施方案中，结合对的成员包括生物素。在一些实施方案中，使多种核酸与第一引物和第二引物接触，其中第一或第二引物之一包含生物素。在一些实施方案中，多种核酸包含靶核酸(例如，靶RNA或DNA分子)。靶核酸通常是感兴趣的核酸(例如，基因、转录本或其一部分)。在一些实施方案中，靶核酸包括RNA。在一些实施方案中，通过核酸扩增过程对靶核酸进行扩增。在一些实施方案中，核酸扩增过程包括在促进核酸扩增的合适条件(例如，有助于PCR或等温扩增的条件)下使样品、样品的核酸和/或靶核酸与第一引物、经生物素化的第二引物和聚合酶接触。在一些实施方案中，核酸扩增过程的结果是产生扩增子。在一些实施方案中，扩增子包括DNA扩增子、RNA扩增子或其组合。在一些实施方案中，扩增子包括经生物素化的DNA扩增子、RNA扩增子或其组合。在一些实施方案中，使包含RNA和生物素化DNA的扩增子(例如，RNA/DNA双链体)与核酸酶(例如，RNA外切核酸酶)接触。在一些实施方案中，DNA扩增子以非共价方式附着于包含捕获寡核苷酸的固体基底，其中DNA扩增子或其一部分与捕获寡核苷酸特异性杂交。在一些实施方案中，生物素化的扩增子与包含链霉亲和素或其变体的磁性珠接触和/或附着于该磁性珠。
在一些实施方案中，该方法还包括基于GMR传感器的磁电阻变化计算查询样品中分析物的浓度。
在前述实施方案的一个或多个中，方法包括在将查询样品经过传感器之前，对传感器进行用缓冲液的清洗。
在前述实施方案的一个或多个中，方法包括在将查询样品经过传感器之后但在将磁性颗粒经过传感器之前，对传感器进行用缓冲液的清洗。
在前述实施方案的一个或多个中，方法包括在将磁性颗粒经过传感器之后，对传感器进行用缓冲液的清洗。
在前述实施方案的一个或多个中，查询样品是水。
在前述实施方案的一个或多个中，查询样品来源自受试者的血液。
在前述实施方案的一个或多个中，方法包括测定GMR传感器的磁电阻变化，其包括使用至少一个参考电阻器来执行GMR传感器磁电阻变化的相敏解调。
在前述实施方案的一个或多个中，多个生物分子以约1×109至约5×1010个生物分子/mm2的密度附着在传感器的表面上。
在前述实施方案的一个或多个中，检测的灵敏度极限范围为约1纳摩尔至约10纳摩尔的分析物。
在前述实施方案的一个或多个中，使查询样品经过检测器包括查询样品经过传感器的流速为约1微升/分钟至约20微升/分钟。
在前述实施方案的一个或多个中，将第一引物、第二引物、阻断寡核苷酸、聚合酶、捕获核酸和查询样品的至少一种在经过传感器之前进行混合。
在前述实施方案的一个或多个中，在捕获核酸附着于传感器表面之后，使第一引物、第二引物、阻断寡核苷酸、聚合酶和查询样品中的至少一种经过传感器。
在前述实施方案的一个或多个中，磁性颗粒包括连接链霉亲和素的颗粒。
在一些实施方案中，提供了检测查询样品中分析物例如基因变体的存在的方法，该方法包括提供传感器，该传感器包含布置于巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面上的第一生物分子，该第一生物分子包含用于第二生物分子的条件结合位点，该第二生物分子包含用于磁性颗粒的结合位点，使查询样品经过该传感器，使第二生物分子经过该传感器，在使查询样品经过传感器之后使磁性颗粒经过传感器，并且通过基于测定磁性颗粒经过传感器前后的磁电阻来测量GMR传感器的磁电阻变化，从而检测查询样品中分析物的存在，其中测定GMR传感器的磁电阻变化包括使用至少一个参考电阻器来执行GMR传感器磁电阻变化的相敏解调。
在一些实施方案中，提供了检测查询样品中分析物例如基因变体的存在的方法，该方法包括提供传感器，该传感器包含布置于巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面上的第一生物分子，该第一生物分子包含用于第二生物分子的条件结合位点，该第二生物分子包含用于磁性颗粒的结合位点，使查询样品经过该传感器，使第二生物分子经过该传感器，在使第二生物分子经过传感器之后使包含结合对第一成员的多个磁性纳米颗粒经过传感器，然后使包含结合对第二成员的多个磁性纳米颗粒经过传感器，并通过基于测定磁性颗粒经过GMR传感器前后的磁电阻来测量GMR传感器的放大的磁电阻变化，从而检测分析物的存在。在一些实施方案中，这类方法还包括在将包含结合对第二成员的多个磁性纳米颗粒经过传感器之后，使包含结合对第一成员的多个第二磁性纳米颗粒经过传感器。在一些实施方案中，这类方法还包括在将包含结合对第一成员的多个第二磁性纳米颗粒经过GMR传感器之后，使包含结合对第二成员的多个第二磁性纳米颗粒经过传感器。在一些实施方案中，这类方法还包括使包含结合对第一成员的一种或多种后续多个磁性纳米颗粒和包含结合对第二成员的一种或多种后续多个磁性纳米颗粒通过GMR传感器。在一些实施方案中，结合对包含链霉亲和素和生物素。在一些实施方案中，结合对第一成员包含链霉亲和素。在一些实施方案中，结合对第二成员包含生物素。
在前述实施方案的一个或多个中，分析物的存在阻止了第二生物分子的结合。
在前述实施方案的一个或多个中，分析物的存在使得第二分子能够与第一生物分子结合。
在一些实施方案中，提供了检测查询样品中分析物的存在的方法，该方法包括提供传感器，该传感器包含布置于巨磁电阻(GMR)传感器的功能化表面上的第一生物分子，当分析物存在时该生物分子包含用于磁性颗粒的结合位点，使查询样品经过传感器，在将查询样品经过传感器之后使磁性颗粒通过传感器，并且通过基于测定磁性颗粒经过传感器前后的磁电阻来测量GMR传感器的磁电阻变化，从而检测查询样品中分析物的存在，其中测定GMR传感器的磁电阻变化包括使用至少一个参考电阻器来执行GMR传感器磁电阻变化的相敏解调。
在前述实施方案的一个或多个中，方法还可以包括基于GMR传感器的磁电阻变化来计算查询样品中分析物的浓度。
在前述实施方案的一个或多个中，生物分子包括核酸，例如靶核酸。
在一些实施方案中，提供了配置为执行本文公开的方法的系统，该系统包括样品处理子系统、传感器子系统和气动控制子系统，该传感器子系统包括微流控网络，该微流控网络包括GMR传感器(其具有在该传感器的功能化表面上布置的生物分子)、连接到多个接触焊盘以将信号传送到处理器的多根导线、处理器，该气动控制子系统用于在整个样品处理子系统和传感器子系统中移动样品、试剂和溶剂。
在前述实施方案的一个或多个中，方法还可以包括在将查询样品经过传感器之前，对传感器进行用缓冲液的清洗。
在前述实施方案的一个或多个中，方法还可以包括在将查询样品经过传感器之后但在将磁性颗粒经过传感器之前，对传感器进行缓冲液清洗。
在前述实施方案的一个或多个中，方法还可以包括在将磁性颗粒经过传感器之后，对传感器进行缓冲液清洗。
在一个或多个前述实施方案中，GMR传感器的表面由交联的聚合物组合物进行功能化，该组合物包含至少两种亲水性聚合物，例如PEG-PHEMA聚合物。
在一些实施方案中，采用包含至少两种亲水性聚合物和交联剂的聚合物组合物来对GMR传感器的表面进行功能化。在一些实施方案中，聚合物组合物包含PEG聚合物、PHEMA聚合物和交联剂。
在前述实施方案的一个或多个中，聚合物涂有表面活性剂。
在前述实施方案的一个或多个中，表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵。
在前述实施方案的一个或多个中，传感器还可以包括连接到多个接触焊盘的多根导线，其被配置为将电子信号从传感器传送到处理器。
在前述实施方案的一个或多个中，微流控系统由气动控制。
在前述实施方案的一个或多个中，盒还包括一个或多个硬件芯片，以控制整个微流控系统的流速。
在前述实施方案的一个或多个中，传感器被配置成与多个接触引脚进行电子通信以将电子信号从传感器传送到处理器。
在前述实施方案的一个或多个中，磁性颗粒包括连接链霉亲和素的纳米颗粒。
受试者
受试者可以是任何活的或非存活生物体，包括但不限于人类、非人动物、植物、细菌、真菌、病毒或原生生物。受试者可以是任何年龄(例如，胚胎、胎儿、婴儿、儿童、成年)。受试者可以是任何性别(例如，雄性、雌性或其组合)。受试者可能处于妊娠期。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人类受试者。受试者可以是患者(例如，人类患者)。在一些实施方案中，受试者疑似具有基因变异或者与基因变异相关的疾病或病况。受试者可以是患有或疑似患有疾病或病况的受试者，所述疾病或病况的特征或原因在于受试者中存在一种或多种生物体，例如致病生物体。
样品
本文提供了用于分析样品的方法和组合物。在一些实施方案中，样品是液体样品。在一些实施方案中，液体样品是水性样品。在一些实施方案中，液体样品可以包括悬浮在液体中的细颗粒物质。固体样品(例如土壤或组织)可以用液体洗涤或提取，以获得适于实施本文所述方法的液体样品。
样品可以从任何合适的环境来源或合适的受试者获得。从环境来源分离出的样品有时被称为环境样品，其非限制性示例包括从下列中获取的液体样品，即湖泊、溪流、河流、海洋、水井、径流、自来水、瓶装水、纯化水或处理水、废水、灌溉水、冰、雪、泥土、土壤、废物等及其组合。在一些实施方案中，从制品中分离、获得或提取样品，其非限制性示例包括回收材料、聚合物、塑料、杀虫剂、木材、纺织品、织物、合成纤维、衣服、食品、饮料、橡胶、洗涤剂、油类、燃料等或其组合。
在一些实施方案中，样品是一种生物样品，例如从活生物体或受试者获取的样品。样品可以直接或间接从受试者或其部分中分离或获得。在一些实施方案中，从个体或医学专业人员处间接获得样品，然后由他们提供样品进行分析。样品可以是从受试者或其部分中分离或获得的任何标本。样品可以是从多名受试者中分离或获得的任何标本。生物样品的非限制性示例包括血液或血液制品(例如，血清、血浆、血小板、血沉棕黄层等)、脐带血、绒膜绒毛、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如，肺、胃、腹膜、导管、耳、关节镜下)、活检样品、腔穿刺(celocentesis)样品、细胞(血细胞、淋巴细胞、胎盘细胞、干细胞、骨髓来源细胞、胚胎或胎儿细胞)或其部分(例如线粒体、细胞核、提取物等)、尿、粪便、痰、唾液、鼻腔粘膜、前列腺液、洗出液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、胸腔液(breast fluid)等或其组合。在一些实施方案中，样品是无细胞样品。在一些实施方案中，使用合适的方法从细胞或组织中获得液体样品。组织的非限制性示例包括器官组织(例如，肝、肾、肺、胸腺、肾上腺、皮肤、膀胱、生殖器官、肠、结肠、脾、脑等或其部分)、上皮组织、毛发、毛囊、管、管道、骨、眼睛、鼻、口、咽喉、耳、指甲等，其部分或其组合。在一些实施方案中，对样品进行过滤以去除不溶性物质或碎屑，以获得适于通过本文所述方法进行分析的液体样品。
在一些实施方案中，样品是从受试者获取的流体或液体样品(例如，血液或血浆)。样品可以包括正常的、健康的、患病的(例如感染的)和/或癌性的(例如癌细胞)细胞或组织。从受试者获取的样品可以包含多种生物体的细胞或细胞物质(例如核酸)(例如，病毒核酸、胎儿核酸、细菌核酸、真菌核酸、寄生虫核酸等)。
在一些实施方案中，样品的pH值范围为4至10、6至10、7至10或约6至8.5。在一些实施方案中，将样品的pH值调节至4至10、6至10、7至10或约6至8.5的pH值范围，或者在使样品与传感器接触之前进行调节。
在一些实施方案中，样品包含核酸或其片段。样品可以包含从一名或多名受试者获取的核酸。在一些实施方案中，样品包含从单个受试者获取的核酸。在一些实施方案中，样品包含核酸的混合物。核酸的混合物可以包含两种或更多种核酸种类，它们具有不同核苷酸序列(例如，不同等位基因序列)、不同片段长度、不同来源(例如，基因组来源、细胞或组织来源、癌或非癌来源、不同受试者)等或其组合。
核酸和基因
术语“核酸”指的是一种或多种核酸(例如，核酸的集合或子集)，其非限制性示例包括DNA(例如，cDNA、基因组DNA(gDNA)、游离DNA、线粒体DNA、微生物DNA等或其组合)、RNA(例如，信使RNA(mRNA)、短抑制性RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA、微小RNA)、包含DNA或RNA类似物的核酸(例如，包含碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA)、锁核酸(LNA)等或其组合，所有这些都可以是单链或双链的，并且除非另有限制，可以包括已知的天然核苷酸的类似物，其可以以类似于天然生成的核苷酸的方式发挥作用。在一些实施方案中，核酸指的是基因组DNA。核酸可以是任何长度，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、50个或更多个或者100个或更多个连续核苷酸。核酸通常包含特定的5'至3'顺序的核苷酸，这在本领域中称为序列(例如，核酸序列，如序列)。
在一些实施方案中，核酸是天然核酸(例如，从样品或受试者获取的天然存在的核酸)。在一些实施方案中，核酸是合成的、复制的或更改的(例如，通过技术专家、科学家或本领域技术人员)。在一些实施方案中，核酸是来源自扩增反应(例如，PCR或非热能或置换扩增反应)的扩增子(例如，扩增产物)。扩增子可以是单链或双链的，并且通常代表经过扩增反应的核酸模板的精确拷贝或互补拷贝。寡核苷酸是相对较短的核酸。在一些实施方案中，核酸是寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是长度为约4至150、4至100、5至50或5至约35个核酸或其中间长度的单链核酸。在某些实施方案中，寡核苷酸是引物。引物通常被配置为与选定的互补核酸杂交，并被配置为在杂交后通过聚合酶延伸。“引物对”指的是被配置用于扩增靶核酸的两个引物。
靶核酸是通过本文描述的方法进行分析的核酸。任何感兴趣的核酸都可以是靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸是疑似具有基因变异的核酸。在一些实施方案中，靶核酸包含基因或其一部分(例如，感兴趣的基因)。在一些实施方案中，靶核酸的长度为约20至约100,000个核苷酸、约20至约500个核苷酸、约20至约400个核苷酸、约20至约300个核苷酸、约20至约200个核苷酸、约20至约100个核苷酸或约20至约50个核苷酸。
在一些实施方案中，靶核酸包含感兴趣的基因或其一部分。在某些实施方案中，感兴趣的基因包括或疑似具有与疾病、病况或病症相关的基因变异。在某些实施方案中，感兴趣的基因包括或疑似具有与易患疾病、病况或病症的受试者相关的基因变异。感兴趣的基因可以包含外显子、内含子、5'侧翼区、3'侧翼区、基因的正链和/或负链。
锁核酸
在一些实施方案中，核酸(例如，阻断寡核苷酸、捕获核酸或引物)是锁核酸。在一些实施方案中，锁核酸包含一个或多个被称为锁核苷酸的修饰核苷酸单体。锁核苷酸是经修饰的核苷酸碱基，当其存在于杂交的核酸中时，与仅由天然存在的核苷酸碱基组成的相同双链体的解链温度相比，提高了杂交双链体的解链温度。锁核酸的非限制性示例包括传统的锁核酸(即，LNA，例如双环核酸)、桥联核酸(BNA，例如受约束核酸(constrainednucleic acid))、包含C5修饰的嘧啶碱基(例如，5-甲基-dC、丙炔基嘧啶等)和替代骨架化学的核酸(例如肽核酸(PNA)、吗啉代)等或其组合。相应地，锁核苷酸的非限制性示例包括包含修饰的核糖部分的修饰的RNA核苷酸，带有连接2'氧和4'碳的额外的桥，包含五元、六元或甚至七元桥联结构的BNA单体(例如，包括2',4'-BNANC[NH]、2',4'-BNANC[NMe]和2',4'-BNANC[NBn]的BNA单体)等。提高杂交核酸双链体解链温度的任何合适的锁核苷酸(例如，修饰核苷酸)都可以用于制备本文所用的锁核酸。在一些实施方案中，锁核酸是申请号为2003/0144231的美国专利申请中公开的一种锁核酸，该申请通过引用方式并入本文。在一些实施方案中，锁核酸包含申请号为2003/0144231的美国专利申请中描述的一种或多种锁核苷酸。还可以将非碱基修饰物掺入到锁核酸中以提高Tm(或结合亲和力)，其非限制性示例包括小沟结合物(MGB)、精胺、G形夹(G-clamp)、Uaq蒽醌帽(anthraquinone cap)等或其组合。在锁核酸(例如，阻断寡核苷酸或捕获核酸)中可以使用大于一种类型的Tm提高性修饰，例如锁核苷酸单体和末端MGB基团的组合。许多提高互补核酸Tm的方法是本领域技术人员已知的，并且所有这些修饰的使用都被视为处于本发明的范围内。
在一些实施方案中，锁核酸(例如，阻断寡核苷酸或捕获核酸)包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个锁核苷酸。在一些实施方案中，锁核酸包含1至20个、1至10个或1至5个锁核苷酸。在一些实施方案中，锁核酸的所有核苷酸都是锁核苷酸。在一些实施方案中，锁核酸包含至少5个核苷酸的长度。在一些实施方案中，锁核酸包含5至100、5至30或5至20个核苷酸或其中间范围的长度。在一些实施方案中，当与靶核酸杂交时，锁核酸具有至少50℃、至少52℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃或至少80℃的解链温度。在一些实施方案中，当与靶核酸杂交时，锁核酸具有约40℃至约80℃、约45℃至约80℃、约50℃至约80℃、约55℃至约80℃、约60℃至约80℃或约65℃至约80℃的解链温度。
阻断寡核苷酸
在一些实施方案中，装置或方法包括使用阻断寡核苷酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸是锁核酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个锁核苷酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含1至20个、1至10个或1至5个锁核苷酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸的所有核苷酸都是锁核苷酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含至少5个核苷酸的长度。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含5至100、5至30或5至20个核苷酸或其中间范围的长度。在一些实施方案中，当与靶核酸杂交时，阻断寡核苷酸具有至少50℃、至少52℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃或至少80℃的解链温度。在一些实施方案中，当与靶核酸杂交时，阻断寡核苷酸具有约40℃至约80℃、约45℃至约80℃、约50℃至约80℃、约55℃至约80℃、约60℃至约80℃或约65℃至约80℃的解链温度。
在某些实施方案中，阻断寡核苷酸被配置为与不包含感兴趣的基因变异的靶核酸杂交。在一些实施方案中，被配置为与不包含感兴趣的基因变异的靶核酸杂交的阻断寡核苷酸是包含一个或多个锁核苷酸的寡核苷酸，其包含的核酸序列与不包括感兴趣的基因变异(例如，SNP或感兴趣的突变)的核酸(例如，靶核酸)或其部分的互补序列存在至少98％、至少99％或100％同一性。阻断寡核苷酸通常被配置成基本上阻断扩增反应中可能存在的特定核酸的扩增。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸被配置成基本上阻断扩增反应中可能存在的靶核酸的扩增，其中该靶核酸不包括感兴趣的基因变异。例如，阻断寡核苷酸通常被配置成与靶核酸(例如，不含感兴趣的基因变异的靶核酸)形成杂交的双链体，其中相对于扩增反应中使用的引物，该双链体具有较高的解链温度。
引物
在一些实施方案中，方法或过程包括使用一种或多种引物。在一些实施方案中，核酸扩增过程包括使用一种或多种引物(例如，可以与核酸模板或靶标特异性杂交的短寡核苷酸)。杂交的引物通常可以在核酸扩增过程中由聚合酶延伸。在一些实施方案中，使包含核酸的样品与一种或多种引物进行接触。在一些实施方案中，使核酸(例如靶核酸)与一种或多种引物进行接触。引物可以附着在固体基底上，也可以游离在溶液中。任何合适的引物都可以用于本文所述的方法。
捕获核酸
在一些实施方案中，核酸或引物以非共价或共价方式附着到合适的固体基底上。在某些实施方案中，捕获核酸是以非共价或共价方式附着于固体基底的一种核酸或寡核苷酸。捕获寡核苷酸通常是被配置为与靶核酸或其部分特异性杂交的核酸。在一些实施方案中，捕获核酸是一种附着于固体基底的引物。在一些实施方案中，捕获核酸包含与靶核酸或其部分基本上互补或完全互补的核酸序列。在一些实施方案中，捕获核酸包括与靶核酸或其部分的互补或反向互补序列存在至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，捕获核酸包括与靶核酸或其部分的互补或反向互补序列存在100％同一性的核酸序列。捕获寡核苷酸可以是天然存在的或合成的，并且可以是基于DNA和/或RNA的。在一些实施方案中，捕获核酸是包含一个或多个锁核苷酸的锁核酸。在一些实施方案中，捕获核酸包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个锁核酸。在一些实施方案中，捕获核酸包含1至20个、1至10个或1至5个锁核苷酸。在一些实施方案中，当与靶核酸杂交时，捕获核酸具有至少50℃、至少52℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃或至少80℃的解链温度。在一些实施方案中，当与靶核酸杂交时，捕获核酸具有约40℃至约80℃、约45℃至约80℃、约50℃至约80℃、约55℃至约80℃、约60℃至约80℃或约65℃至约80℃的解链温度。
可检测标记物/颗粒/结合对
在一些实施方案中，本文描述的方法或过程包括使用一种或多种或者多个可检测标记物。在一些实施方案中，该一种或多种可检测标记物包含一个或多个磁性颗粒。在一些实施方案中，引物、探针、阻断寡核苷酸和/或捕获核酸表面包含一个或多个磁性颗粒。在一些实施方案中，结合对的成员包含一个或多个磁性颗粒。在一些实施方案中，磁性颗粒包含结合对的成员。在一些实施方案中，磁性颗粒包含结合对第一成员。在一些实施方案中，磁性颗粒包含结合对第二成员。在一些实施方案中，第一磁性颗粒包含结合对第一成员。在一些实施方案中，第二磁性颗粒包含结合对第二成员。在一些实施方案中，多个第一磁性颗粒包含磁性颗粒，其中多个第一磁性颗粒中的每个成员都包含结合对第一成员。在一些实施方案中，多个第二磁性颗粒包含磁性颗粒，其中多个第二磁性颗粒中的每个成员都包含结合对第二成员。
在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第一或第二磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含链霉亲和素。在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第一或第二磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含生物素。在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第一或第二磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含生物素。在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第一磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含生物素。在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第一磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含链霉亲和素。在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第二磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含生物素。在一些实施方案中，磁性颗粒或者多个第二磁性颗粒的每个成员都包含结合对的成员，该结合对包含链霉亲和素。
合适的磁性颗粒可用于本文所述的组合物、装置或方法。磁性颗粒的非限制性示例包括顺磁性珠、磁性珠、磁性纳米颗粒、重金属微珠、金属纳米珠、重金属微粒、重金属纳米颗粒等或其组合。在一些实施方案中，磁性颗粒包括约1至约1000纳米(nm)、1nm至约500nm、约5nm至约1000nm、约10nm至约1000nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm、约5nm至约100nm、约2至约50nm、约5至约20nm或约5至约10nm和/或其间范围的平均或绝对直径。在一些实施方案中，对磁性颗粒进行涂覆以促进其共价附着到结合对的成员。在其它实施方案中，对磁性颗粒进行涂覆以促进其与分子的静电缔合。在一些实施方案中，磁性颗粒包括不同的形状、尺寸和/或直径以有利于不同的磁量。在一些实施方案中，磁性颗粒基本上是均一的(例如，全都基本上相同；例如相同尺寸、相同直径、相同形状和/或相同磁性)，以便在磁性传感器的表面处进行更准确的检测和/或定量。在一些实施方案中，磁性珠包含结合对的相同或不同成员，以允许对同一查询样品或不同查询样品中的多种不同分析物进行多重检测。在一些实施方案中，相同样品或不同样品中的此类分析物包含一种或多种重金属。在一些实施方案中，通过合适的磁性传感器可以检测和/或定量磁性颗粒的存在、不存在和/或数量。在一些实施方案中，磁性传感器包含表面。
在一些实施方案中，基底、颗粒(例如磁性颗粒)、珠子、蛋白质、抗体、捕获核酸或表面包含结合对的一个或多个成员。在一些实施方案中，捕获核酸包含结合对的一个或多个成员。在某些实施方案中，结合对第一成员可以结合和/或结合到结合对第二成员。在某些实施方案中，结合对第一成员被配置为与结合对第二成员特异性结合。在一些实施方案中，结合对包含至少两个成员(例如分子)，它们以非共价方式彼此特异性结合。结合对的成员通常可逆地相互结合，例如结合对两个成员的缔合可以通过合适的方法解离。任何合适的结合对或其成员都可以用于本文所述的组合物或方法。结合对(例如，第一成员/第二成员)的非限制性示例包括抗体/抗原、抗体/抗体受体、抗体/蛋白A或蛋白G、抗体/GST、半抗原/抗半抗原、巯氢基/马来酰亚胺、巯氢基/卤乙酰衍生物、胺/异三氰酸酯、胺/琥珀酰亚胺酯、胺/磺酰卤化物、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、受体/配体、GST/GT、维生素B12/内在因子，其类似物、其衍生物、其结合部分等或其组合。结合对成员的非限制性示例包括抗体或抗体片段、抗体受体、抗原、半抗原、肽、蛋白质、脂肪酸、甘油基部分(例如，脂质)、磷酰基部分、糖基部分、泛素部分、凝集素、适配体、受体、配体、重金属离子、亲和素、中性抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、维生素B12、内在因子，其类似物、其衍生物、其结合部分等或其组合。
在一些实施方案中，核酸或引物共价附接于结合对的成员上。在一些实施方案中，结合对的成员共价附接于引物。在一些实施方案中，结合对的成员附接(例如，以共价方式)至引物的游离5'羟基。在一些实施方案中，核酸或引物包含生物素。在一些实施方案中，生物素共价附接于引物。在一些实施方案中，生物素附接(例如，以共价方式)至引物的游离5'羟基。
在一些实施方案中，本文描述的方法或过程包括使用一种或多种或者多个磁性颗粒。在一些实施方案中，本文描述的组合物或装置包含一种或多种磁性颗粒。在一些实施方案中，核酸、基底、蛋白质、抗体、第二试剂、珠子、表面和/或MPR包含一个或多个磁性颗粒。在一些实施方案中，结合对的成员包含一个或多个磁性颗粒。在一些实施方案中，磁性颗粒附接于结合对的成员。在一些实施方案中，磁性颗粒包含链霉亲和素或其变体。在某些实施方案中，磁性颗粒直接或间接附接于(例如结合至，如共价或非共价结合至)核酸、基底、抗体、二级试剂、珠子、表面、结合对的成员和/或MPR等。
表面
在一些实施方案中，传感器包括表面。在一些实施方案中，传感器的表面包括一种或多种寡核苷酸或捕获核酸。传感器的表面可以包括合适的材料，其非限制性示例包括玻璃、改性或功能化玻璃(例如，可控孔径玻璃(CPG))、石英、云母、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、特氟隆TM、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、树脂、二氧化硅或二氧化硅基材料，包括硅、硅胶和改性硅、
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碳、金属(例如，钢、金、银、铝、硅和铜)、导电聚合物(包括聚合物例如聚吡咯和聚吲哚)；微米结构或纳米结构化表面、纳米管、纳米线或纳米颗粒装饰的表面；或多孔表面或凝胶，例如丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维性或链状聚合物。在一些实施方案中，使用含有任何数量的材料(包括聚合物，例如葡聚糖、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖)的钝化或化学衍生化涂层，对表面进行功能化。在一些实施方案中，传感器的表面非共价地和/或可逆地附接到寡核苷酸或捕获核酸。在一些实施方案中，传感器的表面共价附接至寡核苷酸或捕获核酸。
在一些实施方案中，传感器的表面包含和/或涂覆有聚合物组合物，该聚合物组合物包含至少两种亲水性聚合物和交联剂。在一些实施方案中，这种聚合物组合物、包含这种聚合物组合物的生物表面、以及根据此处和全文公开的方法和装置使用这种聚合物组合物对传感器表面进行功能化的方法，描述于例如申请号为62/958,510、名称为“POLYMERCOMPOSITIONS AND BIOSURFACES COMPRISING THEM ON SENSORS”、于2020年1月8日提交的美国临时专利申请(代理人案号为026462-0506342)中，其全部内容在此都通过引用方式并入。
在一些实施方案中，传感器的表面包含和/或涂覆有包含交联型PEG-PHEMA聚合物的聚合物组合物。PEG-PHEMA聚合物表面可以通过混合下列组分来制备，即包含溶解于合适溶剂(例如，异丙醇、丙酮或甲醇和/或水)中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG-NHS(MW 600)的PEG溶液、包含溶解于合适溶剂(例如，异丙醇、丙酮或甲醇和/或水)中的聚羟乙基甲基丙烯酸酯(MW 20,000)的PHEMA溶液和任选的交联剂。可以采用合适的涂覆工艺(例如，缩微印刷、浸渍涂布、旋涂或气溶胶喷涂)将所得溶液涂覆在传感器表面上。在用PEG-PHEMA溶液涂覆表面后，可以使用UV光固化该表面，随后用合适的溶剂如异丙醇和/或水来清洗。在一些实施方案中，将传感器的表面共价附接至一个或多个核酸。在一些实施方案中，涂覆的表面可用于与伯胺结合(例如，附着蛋白质)。PEG-PHEMA涂层可以保护传感器表面免受腐蚀。在一些实施方案中，传感器表面包括在申请号为PCT/US2019/043766的国际专利申请中描述的表面。
基因变异/基因变体
在一些实施方案中，采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分样品中存在的或疑似存在的致病生物体。在一些实施方案中，从生物来源(存活或死亡的)获取样品。在一些实施方案中，样品获自受试者，例如哺乳动物受试者，如人类受试者。在一些实施方案中，样品获自患者。在一些实施方案中，从环境来源获取样品。在一些实施方案中，从环境来源获取样品，例如水源，如海洋、湖泊、河流、溪流、沼泽、泻湖、湿地、潮汐池、游泳池、支流、废水设施、废水库、水库、饮用水库、水处理设施和/或诸如此类。在一些实施方案中，从环境中获取样品，例如土壤、泥土、淤泥、泥浆、浮渣、堆肥等。
在一些实施方案中，核酸(例如靶核酸)包含基因变异，该基因变异在全文中也可互换地称为基因变体，其非限制性示例包括一个或多个核苷酸缺失、重复、添加、插入、取代、突变、重复序列、基因同源物、基因直系同源物和/或多态性。
在一些实施方案中，一个或多个基因变体包括一个或多个等位基因变体。在一些实施方案中，等位基因变体包括存在于同一物种的不同成员中的多态性。在一些实施方案中，等位基因变体产生具有相似但略有不同功能特性的蛋白表达，这使受试者易患或导致某些疾病状态或病况。
在一些实施方案中，如此处和全文中使用的基因变体可以包括存在于不同生物体中的同源物或直系同源物，其可以根据本文公开的方法和装置使用，以便根据在一个或多个样品中检测到的一个或多个此类基因变体将一种或多种生物体的存在与其它生物体区分开来。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，采用多个引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的此类一种或多种生物体。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，采用多个引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分属于或可能以其它方式划分为类群(例如系统发育群和/或分类群)的生物体。在一些实施方案中，采用多个引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分属于或可能以其它方式划分为类群(例如系统发育群和/或分类群)的生物体。在一些实施方案中，采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分属于相同或相似分类群的生物体，如相同或相似的目、相同或相似的科、相同或相似的属、相同或相似的亚属或者相同或相似的种。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以便根据一种或多种可区分的特征或性状来区分可划分为类群的生物体，这些特征或性状允许根据此处和全文中公开的方法和装置，将样品中至少一种这样的生物体与其它生物体区分开来。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分一个或多个样品中的细菌生物体、真菌生物体、原生动物生物体、植物生物体、动物生物体。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，采用多种引物或引物组、捕获核酸和/或可检测标记物，以区分属于以下一个或多个组的真菌生物体：
1.耳道假丝酵母菌(Candida auris)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、光滑假丝酵母菌(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母菌(Candida krusei)、黑马朗假丝酵母菌(Candida haemulonis)
2.烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)
3.新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)
4.粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、波萨达斯球孢子菌(Coccidioidesposadasii)
5.腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioidis)和串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)
6.耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)
7.皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)
8.荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)
9.米根霉菌(Rhizopus oryzae)、小孢根霉菌(Rhizopus microspores)
10.耳道假丝酵母菌(Candida auris)
在一些实施方案中，采用包括下列引物中的至少一种的多种引物，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
反向引物：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)
正向引物：5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQ ID NO:18)；或
正向引物：5Biosg/CATCGGCTTGAGCCGATAGTC(SEQ ID NO:33)
正向引物：5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)
反向引物：/5Phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)
反向引物：/5Phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)
正向引物：5Biosg/CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)
在一些实施方案中，采用多种引物，这些引物选自由下列引物组成的组，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
反向引物：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)
正向引物：5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQ ID NO:18)；或
正向引物：5Biosg/CATCGGCTTGAGCCGATAGTC(SEQ ID NO:33)
正向引物：5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)
反向引物：/5Phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)
反向引物：/5Phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)
正向引物：5Biosg/CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)
在一些实施方案中，采用多种捕获核酸，这些捕获核酸包括下列捕获核酸中的至少一种，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:30)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:31)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)
在一些实施方案中，采用多种捕获核酸，这些捕获核酸选自由下列捕获核酸组成的组，以区分一个或多个样品中存在或疑似存在的一种或多种生物体：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:30)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:31)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)
在一些实施方案中，引物或引物组被配置为扩增靶核酸，该靶核酸由此类一种或多种生物体所共有，但在此类一种或多种生物体之间具有一个或多个核苷酸差异，因此可用作靶核酸，该靶核酸可用于根据此处和全文公开的方法和装置来区分此类一种或多种生物体。在一些实施方案中，这种生物体包括致病生物体。
在一些实施方案中，靶核酸被配置为捕获所扩增的靶核酸(在全文中也可互换地称为扩增子和/或可区分的扩增子)，这些所扩增的靶核酸由此类一种或多种生物体所共有，但在此类一种或多种生物体之间具有一个或多个核苷酸差异，因此可用作靶核酸，该靶核酸可用于根据此处和全文公开的方法和装置来区分此类一种或多种生物体。
在一些实施方案中，基因变异如等位基因变体是单核苷酸多态性(SNP)。在某些实施方案中，感兴趣的基因变异包含感兴趣的基因附近(例如，在5'侧翼区、3'侧翼区或内含子中)或内部(例如，在外显子或编码区内)的一个或多个核苷酸取代，其非限制性示例包括A到C、A到G、A到T、C到A、C到G、C到T、T到A、T到C、T到G、G到A、G到C、G到T等。在一些实施方案中，基因变异如等位基因变体，包含一种、两种、三种、四种或更多种单核苷酸多态性。在一些实施方案中，突变是单核苷酸的缺失、插入或取代。在一些实施方案中，基因变异包括靶核酸的一个或多个单核苷酸突变(例如，1、2、3、4或更多个单核苷酸突变)。在一些实施方案中，基因变异(例如突变)是指野生型或参照基因组(例如参照序列、参照基因或其部分)中不存在的靶核酸的核酸序列中的变异。在一些实施方案中，野生型或参照基因组的靶序列包含与疾病或病况(例如，癌症)不相关的核酸序列。在一些实施方案中，基因变异是一种体细胞突变，它可能存在于肿瘤或赘生组织的细胞中，但不存在于受试者的正常或非癌细胞中。在一些实施方案中，突变是一种常染色体突变。在一些实施方案中，突变是常染色体隐性突变或常染色体显性突变。
在一些实施方案中，基因变异是SNP。相应地，本文描述的方法可以检测SNP的预定等位基因变体(例如，第一等位基因变体)的存在或不存在，其中所述等位基因变体的不存在指的是包含SNP的另一等位基因变体(例如，第二、第三或第四变体)的靶核酸。例如，靶核酸中预定等位基因变体或第一等位基因变体的存在可以是G，其中第一等位基因变体的不存在指的是在靶序列的相同位置存在A、T或C。
基因变异可以是哺乳动物受试者一条或两条染色体的靶核酸中的存在或不存在。在一些实施方案中，本文描述的方法检测基因组的一个或两个等位基因中基因变异的存在。在一些实施方案中，本文描述的方法检测基因组的两个等位基因中基因变异的不存在。
感兴趣的基因(每个感兴趣的基因可以包含感兴趣的基因变异)的非限制性示例包括人类基因A2M、AACS、AARSD1、ABCA10、ABCA12、ABCA3、ABCA8、ABCA9、ABCB1、ABCB10、ABCB4、ABCC11、ABCC12、ABCC6、ABCD1、ABCE1、ABCF1、ABCF2、ABT1、ACAA2、ACCSL、ACER2、ACO2、ACOT1、ACOT4、ACOT7、ACP1、ACR、ACRC、ACSBG2、ACSM1、ACSM2A、ACSM2B、ACSM4、ACSM5、ACTA1、ACTA2、ACTB、ACTG1、ACTG2、ACTN1、ACTN4、ACTR1A、ACTR2、ACTR3、ACTR3C、ACTRT1、ADAD1、ADAL、ADAM18、ADAM20、ADAM21、ADAM32、ADAMTS7、ADAMTSL2、ADAT2、ADCY5、ADCY6、ADCY7、ADGB、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ADORA2B、ADRBK2、ADSS、AFF3、AFF4、AFG3L2、AGAP1、AGAP10、AGAP11、AGAP4、AGAP5、AGAP6、AGAP7、AGAP8、AGAP9、AGER、AGGF1、AGK、AGPAT1、AGPAT6、AHCTF1、AHCY、AHNAK2、AHRR、AIDA、AIF1、AIM1L、AIMP2、AK2、AK3、AK4、AKAP13、AKAP17A、AKIP1、AKIRIN1、AKIRIN2、AKR1B1、AKR1B10、AKR1B15、AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4、AKR7A2、AKR7A3、AKTIP、ALDH3B1、ALDH3B2、ALDH7A1、ALDOA、ALG1、ALG10、ALG10B、ALG1L、ALG1L2、ALG3、ALKBH8、ALMS1、ALOX15、ALOX15B、ALOXE3、ALPI、ALPP、ALPPL2、ALYREF、AMD1、AMELX、AMELY、AMMECR1L、AMY1A、AMY1B、AMY1C、AMY2A、AMY2B、AMZ2、ANAPC1、ANAPC10、ANAPC15、ANKRD11、ANKRD18A、ANKRD18B、ANKRD20A1、ANKRD20A19P、ANKRD20A2、ANKRD20A3、ANKRD20A4、ANKRD30A、ANKRD30B、ANKRD36、ANKRD36B、ANKRD49、ANKS1B、ANO10、ANP32A、ANP32B、ANXA2、ANXA2R、ANXA8、ANXA8L1、ANXA8L2、AOC2、AOC3、AP1B1、AP1S2、AP2A1、AP2A2、AP2B1、AP2S1、AP3M2、AP3S1、AP4S1、APBA2、APBB1IP、APH1B、API5、APIP、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOC1、APOL1、APOL2、APOL4、APOM、APOOL、AQP10、AQP12A、AQP12B、AQP7、AREG、AREGB、ARF1、ARF4、ARF6、ARGFX、ARHGAP11A、ARHGAP11B、ARHGAP20、ARHGAP21、ARHGAP23、ARHGAP27、ARHGAP42、ARHGAP5、ARHGAP8、ARHGEF35、ARHGEF5、ARID2、ARID3B、ARIH2、ARL14EP、ARL16、ARL17A、ARL17B、ARL2BP、ARL4A、ARL5A、ARL6IP1、ARL6IP6、ARL8B、ARMC1、ARMC10、ARMC4、ARMC8、ARMCX6、ARPC1A、ARPC2、ARPC3、ARPP19、ARSD、ARSE、ARSF、ART3、ASAH2、ASAH2B、ASB9、ASL、ASMT、ASMTL、ASNS、ASS1、ATAD1、ATAD3A、ATAD3B、ATAD3C、ATAT1、ATF4、ATF6B、ATF7IP2、ATG4A、ATM、ATMIN、ATP13A4、ATP13A5、ATP1A2、ATP1A4、ATP1B1、ATP1B3、ATP2B2、ATP2B3、ATP5A1、ATP5C1、ATP5F1、ATP5G1、ATP5G2、ATP5G3、ATP5H、ATP5J、ATP5J2、ATP5J2-PTCD1、ATP5O、ATP6AP2、ATP6V0C、ATP6V1E1、ATP6V1F、ATP6V1G1、ATP6V1G2、ATP7B、ATP8A2、ATP9B、ATXN1L、ATXN2L、ATXN7L3、AURKA、AURKAIP1、AVP、AZGP1、AZI2、B3GALNT1、B3GALT4、B3GAT3、B3GNT2、BAG4、BAG6、BAGE2、BAK1、BANF1、BANP、BCAP31、BCAR1、BCAS2、BCL2A1、BCL2L12、BCL2L2-PABPN1、BCLAF1、BCOR、BCR、BDH2、BDP1、BEND3、BET1、BEX1、BHLHB9、BHLHE22、BHLHE23、BHMT、BHMT2、BIN2、BIRC2、BIRC3、BLOC1S6、BLZF1、BMP2K、BMP8A、BMP8B、BMPR1A、BMS1、BNIP3、BOD1、BOD1L2、BOLA2、BOLA2B、BOLA3、BOP1、BPTF、BPY2、BPY2B、BPY2C、BRAF、BRCA1、BRCC3、BRD2、BRD7、BRDT、BRI3、BRK1、BRPF1、BRPF3、BRWD1、BTBD10、BTBD6、BTBD7、BTF3、BTF3L4、BTG1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、BTNL2、BTNL3、BTNL8、BUB3、BZW1、C10orf129、C10orf88、C11orf48、C11orf58、C11orf74、C11orf75、C12orf29、C12orf42、C12orf49、C12orf71、C12orf76、C14orf119、C14orf166、C14orf178、C15orf39、C15orf40、C15orf43、C16orf52、C16orf88、C17orf51、C17orf58、C17orf61、C17orf89、C17orf98、C18orf21、C18orf25、C1D、C1GALT1、C1QBP、C1QL1、C1QL4、C1QTNF9、C1QTNF9B、C1QTNF9B-AS1、C1orf100、C1orf106、C1orf114、C2、C22orf42、C22orf43、C2CD4A、C2orf16、C2orf27A、C2orf27B、C2orf69、C2orf78、C2orf81、C4A、C4B、C4BPA、C4orf27、C4orf34、C4orf46、C5orf15、C5orf43、C5orf52、C5orf60、C5orf63、C6orf10、C6orf106、C6orf136、C6orf15、C6orf203、C6orf25、C6orf47、C6orf48、C7orf63、C7orf73、C8orf46、C9orf123、C9orf129、C9orf172、C9orf57、C9orf69、C9orf78、CA14、CA15P3、CA5A、CA5B、CABYR、CACNA1C、CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I、CACYBP、CALCA、CALCB、CALM1、CALM2、CAMSAP1、CAP1、CAPN8、CAPZA1、CAPZA2、CARD16、CARD17、CASC4、CASP1、CASP3、CASP4、CASP5、CATSPER2、CBR1、CBR3、CBWD1、CBWD2、CBWD3、CBWD5、CBWD6、CBWD7、CBX1、CBX3、CCDC101、CCDC111、CCDC121、CCDC127、CCDC14、CCDC144A、CCDC144NL、CCDC146、CCDC150、CCDC174、CCDC25、CCDC58、CCDC7、CCDC74A、CCDC74B、CCDC75、CCDC86、CCHCR1、CCL15、CCL23、CCL3、CCL3L1、CCL3L3、CCL4、CCL4L1、CCL4L2、CCNB1IP1、CCNB2、CCND2、CCNG1、CCNJ、CCNT2、CCNYL1、CCR2、CCR5、CCRL1、CCRN4L、CCT4、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、CCT8L2、CCZ1、CCZ1B、CD177、CD1A、CD1B、CD1C、CD1D、CD1E、CD200R1、CD200R1L、CD209、CD276、CD2BP2、CD300A、CD300C、CD300LD、CD300LF、CD33、CD46、CD83、CD8B、CD97、CD99、CDC14B、CDC20、CDC26、CDC27、CDC37、CDC42、CDC42EP3、CDCA4、CDCA7L、CDH12、CDK11A、CDK11B、CDK2AP2、CDK5RAP3、CDK7、CDK8、CDKN2A、CDKN2AIPNL、CDKN2B、CDON、CDPF1、CDRT1、CDRT15、CDRT15L2、CDSN、CDV3、CDY1、CDY2A、CDY2B、CEACAM1、CEACAM18、CEACAM21、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEL、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、CELSR1、CEND1、CENPC1、CENPI、CENPJ、CENPO、CEP170、CEP19、CEP192、CEP290、CEP57L1、CES1、CES2、CES5A、CFB、CFC1、CFC1B、CFH、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFL1、CFTR、CGB、CGB1、CGB2、CGB5、CGB7、CGB8、CHAF1B、CHCHD10、CHCHD2、CHCHD3、CHCHD4、CHD2、CHEK2、CHIA、CHMP4B、CHMP5、CHORDC1、CHP1、CHRAC1、CHRFAM7A、CHRNA2、CHRNA4、CHRNB2、CHRNB4、CHRNE、CHST5、CHST6、CHSY1、CHTF8、CIAPIN1、CIC、CIDEC、CIR1、CISD1、CISD2、CKAP2、CKMT1A、CKMT1B、CKS2、CLC、CLCN3、CLCNKA、CLCNKB、CLDN22、CLDN24、CLDN3、CLDN4、CLDN6、CLDN7、CLEC17A、CLEC18A、CLEC18B、CLEC18C、CLEC1A、CLEC1B、CLEC4G、CLEC4M、CLIC1、CLIC4、CLK2、CLK3、CLK4、CLNS1A、CMPK1、CMYA5、CNEP1R1、CNN2、CNN3、CNNM3、CNNM4、CNOT6L、CNOT7、CNTNAP3、CNTNAP3B、CNTNAP4、COA5、COBL、COIL、COL11A2、COL12A1、COL19A1、COL25A1、COL28A1、COL4A5、COL6A5、COL6A6、COMMD4、COMMD5、COPRS、COPS5、COPS8、COQ10B、CORO1A、COX10、COX17、COX20、COX5A、COX6A1、COX6B1、COX7B、COX7C、COX8C、CP、CPAMD8、CPD、CPEB1、CPSF6、CR1、CR1L、CRADD、CRB3、CRCP、CREBBP、CRHR1、CRLF2、CRLF3、CRNN、CROCC、CRTC1、CRYBB2、CRYGB、CRYGC、CRYGD、CS、CSAG1、CSAG2、CSAG3、CSDA、CSDE1、CSF2RA、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U1、STAU2、STBD1、STEAP1、STEAP1B、STH、STIP1、STK19、STK24、STK32A、STMN1、STMN2、STMN3、STRADB、STRAP、STRC、STRN、STS、STUB1、STX18、SUB1、SUCLA2、SUCLG2、SUDS3、SUGP1、SUGT1、SULT1A1、SULT1A2、SULT1A3、SULT1A4、SUMF2、SUMO1、SUMO2、SUPT16H、SUPT4H1、SUSD2、SUZ12、SVIL、SWI5、SYCE2、SYNCRIP、SYNGAP1、SYNGR2、SYT14、SYT15、SYT2、SYT3、SZRD1、TAAR6、TAAR8、TACC1、TADA1、TAF1、TAF15、TAF1L、TAF4B、TAF5L、TAF9、TAF9B、TAGLN2、TALDO1、TANC2、TAP1、TAP2、TAPBP、TARBP2、TARDBP、TARP、TAS2R19、TAS2R20、TAS2R30、TAS2R39、TAS2R40、TAS2R43、TAS2R46、TAS2R50、TASP1、TATDN1、TATDN2、TBC1D26、TBC1D27、TBC1D28、TBC1D29、TBC1D2B、TBC1D3、TBC1D3B、TBC1D3C、TBC1D3F、TBC1D3G、TBC1D3H、TBCA、TBCCD1、TBL1X、TBL1XR1、TBL1Y、TBPL1、TBX20、TC2N、TCEA1、TCEAL2、TCEAL3、TCEAL5、TCEB1、TCEB2、TCEB3B、TCEB3C、TCEB3CL、TCEB3CL2、TCERG1L、TCF19、TCF3、TCHH、TCL1B、TCOF1、TCP1、TCP10、TCP10L、TCP10L2、TDG、TDGF1、TDRD1、TEAD1、TEC、TECR、TEKT4、TERF1、TERF2IP、TET1、TEX13A、TEX13B、TEX28、TF、TFB2M、TFDP3、TFG、TGIF1、TGIF2、TGIF2LX、TGIF2LY、THAP3、THAP5、THEM4、THOC3、THRAP3、THSD1、THUMPD1、TIMM17B、TIMM23B、TIMM8A、TIMM8B、TIMP4、TIPIN、TJAP1、TJP3、TLE1、TLE4、TLK1、TLK2、TLL1、TLR1、TLR6、TMA16、TMA7、TMC6、TMCC1、TMED10、TMED2、TMEM126A、TMEM128、TMEM132B、TMEM132C、TMEM14B、TMEM14C、TMEM161B、TMEM167A、TMEM183A、TMEM183B、TMEM185A、TMEM185B、TMEM189-UBE2V1、TMEM191B、TMEM191C、TMEM230、TMEM231、TMEM236、TMEM242、TMEM251、TMEM254、TMEM30B、TMEM47、TMEM69、TMEM80、TMEM92、TMEM97、TMEM98、TMLHE、TMPRSS11E、TMSB10、TMSB15A、TMSB15B、TMSB4X、TMSB4Y、TMTC1、TMTC4、TMX1、TMX2、TNC、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF13B、TNFRSF14、TNIP2、TNN、TNPO1、TNRC18、TNXB、TOB2、TOE1、TOMM20、TOMM40、TOMM6、TOMM7、TOP1、TOP3B、TOR1B、TOR3A、TOX4、TP53TG3、TP53TG3B、TP53TG3C、TPD52L2、TPI1、TPM3、TPM4、TPMT、TPRKB、TPRX1、TPSAB1、TPSB2、TPSD1、TPT1、TPTE、TPTE2、TRA2A、TRAF6、TRAPPC2、TRAPPC2L、TREH、TREML2、TREML4、TRIM10、TRIM15、TRIM16、TRIM16L、TRIM26、TRIM27、TRIM31、TRIM38、TRIM39、TRIM39-RPP21、TRIM40、TRIM43、TRIM43B、TRIM48、TRIM49、TRIM49B、TRIM49C、TRIM49DP、TRIM49L1、TRIM50、TRIM51、TRIM51GP、TRIM60、TRIM61、TRIM64、TRIM64B、TRIM64C、TRIM73、TRIM74、TRIM77P、TRIP11、TRMT1、TRMT11、TRMT112、TRMT2B、TRNT1、TRO、TRPA1、TRPC6、TRPV5、TRPV6、TSC22D3、TSEN15、TSEN2、TSPAN11、TSPY1、TSPY10、TSPY2、TSPY3、TSPY4、TSPY8、TSPYL1、TSPYL6、TSR1、TSSK1B、TSSK2、TTC28、TTC3、TTC30A、TTC30B、TTC4、TTL、TTLL12、TTLL2、TTN、TUBA1A、TUBA1B、TUBA1C、TUBA3C、TUBA3D、TUBA3E、TUBA4A、TUBA8、TUBB、TUBB2A、TUBB2B、TUBB3、TUBB4A、TUBB4B、TUBB6、TUBB8、TUBE1、TUBG1、TUBG2、TUBGCP3、TUBGCP6、TUFM、TWF1、TWIST2、TXLNG、TXN2、TXNDC2、TXNDC9、TYR、TYRO3、TYW1、TYW1B、U2AF1、UAP1、UBA2、UBA5、UBD、UBE2C、UBE2D2、UBE2D3、UBE2D4、UBE2E3、UBE2F、UBE2H、UBE2L3、UBE2M、UBE2N、UBE2Q2、UBE2S、UBE2V1、UBE2V2、UBE2W、UBE3A、UBFD1、UBQLN1、UBQLN4、UBTFL1、UBXN2B、UFD1L、UFM1、UGT1A10、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT2A1、UGT2A2、UGT2A3、UGT2B10、UGT2B11、UGT2B15、UGT2B17、UGT2B28、UGT2B4、UGT2B7、UGT3A2、UHRF1、UHRF2、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULK4、UNC93A、UNC93B1、UPF3A、UPK3B、UPK3BL、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ、USP10、USP12、USP13、USP17L10、USP17L11、USP17L12、USP17L13、USP17L15、USP17L17、USP17L18、USP17L19、USP17L1P、USP17L2、USP17L20、USP17L21、USP17L22、USP17L24、USP17L25、USP17L26、USP17L27、USP17L28、USP17L29、USP17L3、USP17L30、USP17L4、USP17L5、USP17L7、USP17L8、USP18、USP22、USP32、USP34、USP6、USP8、USP9X、USP9Y、UTP14A、UTP14C、UTP18、UTP6、VAMP5、VAMP7、VAPA、VARS、VARS2、VCX、VCX2、VCX3A、VCX3B、VCY、VCY1B、VDAC1、VDAC2、VDAC3、VENTX、VEZF1、VKORC1、VKORC1L1、VMA21、VN1R4、VNN1、VOPP1、VPS26A、VPS35、VPS37A、VPS51、VPS52、VSIG10、VTCN1、VTI1B、VWA5B2、VWA7、VWA8、VWF、WARS、WASF2、WASF3、WASH1、WBP1、WBP11、WBP1L、WBSCR16、WDR12、WDR45、WDR45L、WDR46、WDR49、WDR59、WDR70、WDR82、WDR89、WFDC10A、WFDC10B、WHAMM、WHSC1L1、WIPI2、WIZ、WNT3、WNT3A、WNT5A、WNT5B、WNT9B、WRN、WTAP、WWC2、WWC3、WWP1、XAGE1A、XAGE1B、XAGE1C、XAGE1D、XAGE1E、XAGE2、XAGE3、XAGE5、XBP1、XCL1、XCL2、XG、XIAP,XKR3、XKR8、XKRY、XKRY2、XPO6、XPOT、XRCC6、YAP1、YBX1、YBX2、YES1、YME1L1、YPEL5、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAB、YWHAE、YWHAQ、YWHAZ、YY1、YY1AP1、ZAN、ZBED1、ZBTB10、ZBTB12、ZBTB22、ZBTB44、ZBTB45、ZBTB8OS、ZBTB9、ZC3H11A、ZC3H12A、ZCCHC10、ZCCHC12、ZCCHC17、ZCCHC18、ZCCHC2、ZCCHC7、ZCCHC9、ZCRB1、ZDHHC11、ZDHHC20、ZDHHC3、ZDHHC8、ZEB2、ZFAND5、ZFAND6、ZFP106、ZFP112、ZFP14、ZFP57、ZFP64、ZFP82、ZFR、ZFX、ZFY、ZFYVE1、ZFYVE9、ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIK1、ZKSCAN3、ZKSCAN4、ZMIZ1、ZMIZ2、ZMYM2、ZMYM5、ZNF100、ZNF101、ZNF107、ZNF114、ZNF117、ZNF12、ZNF124、ZNF131、ZNF135、ZNF14、ZNF140、ZNF141、ZNF146、ZNF155、ZNF160、ZNF167、ZNF17、ZNF181、ZNF185、ZNF20、ZNF207、ZNF208、ZNF212、ZNF221、ZNF222、ZNF223、ZNF224、ZNF225、ZNF226、ZNF229、ZNF230、ZNF233、ZNF234、ZNF235、ZNF248、ZNF253、ZNF254、ZNF257、ZNF259、ZNF26、ZNF264、ZNF266、ZNF267、ZNF280A、ZNF280B、ZNF282、ZNF283、ZNF284、ZNF285、ZNF286A、ZNF286B、ZNF300、ZNF302、ZNF311、ZNF317、ZNF320、ZNF322、ZNF323、ZNF324、ZNF324B、ZNF33A、ZNF33B、ZNF341、ZNF347、ZNF35、ZNF350、ZNF354A、ZNF354B、ZNF354C、ZNF366、ZNF37A、ZNF383、ZNF396、ZNF41、ZNF415、ZNF416、ZNF417、ZNF418、ZNF419、ZNF426、ZNF429、ZNF43、ZNF430、ZNF431、ZNF433、ZNF439、ZNF44、ZNF440、ZNF441、ZNF442、ZNF443、ZNF444、ZNF451、ZNF460、ZNF468、ZNF470、ZNF479、ZNF480、ZNF484、ZNF486、ZNF491、ZNF492、ZNF506、ZNF528、ZNF532、ZNF534、ZNF543、ZNF546、ZNF547、ZNF548、ZNF552、ZNF555、ZNF557、ZNF558、ZNF561、ZNF562、ZNF563、ZNF564、ZNF57、ZNF570、ZNF578、ZNF583、ZNF585A、ZNF585B、ZNF586、ZNF587、ZNF587B、ZNF589、ZNF592、ZNF594、ZNF595、ZNF598、ZNF605、ZNF607、ZNF610、ZNF613、ZNF614、ZNF615、ZNF616、ZNF620、ZNF621、ZNF622、ZNF625、ZNF626、ZNF627、ZNF628、ZNF646、ZNF649、ZNF652、ZNF655、ZNF658、ZNF665、ZNF673、ZNF674、ZNF675、ZNF676、ZNF678、ZNF679、ZNF680、ZNF681、ZNF682、ZNF69、ZNF700、ZNF701、ZNF705A、ZNF705B、ZNF705D、ZNF705E、ZNF705G、ZNF706、ZNF708、ZNF709、ZNF710、ZNF714、ZNF716、ZNF717、ZNF718、ZNF720、ZNF721、ZNF726、ZNF727、ZNF728、ZNF729、ZNF732、ZNF735、ZNF736、ZNF737、ZNF746、ZNF747、ZNF749、ZNF75A、ZNF75D、ZNF761、ZNF763、ZNF764、ZNF765、ZNF766、ZNF770、ZNF773、ZNF775、ZNF776、ZNF777、ZNF780A、ZNF780B、ZNF782、ZNF783、ZNF791、ZNF792、ZNF799、ZNF805、ZNF806、ZNF808、ZNF812、ZNF813、ZNF814、ZNF816、ZNF816-ZNF321P、ZNF823、ZNF829、ZNF83、ZNF836、ZNF84、ZNF841、ZNF844、ZNF845、ZNF850、ZNF852、ZNF878、ZNF879、ZNF880、ZNF90、ZNF91、ZNF92、ZNF93、ZNF98、ZNF99、ZNRD1、ZNRF2、ZP3、ZRSR2、ZSCAN5A、ZSCAN5B、ZSCAN5D、ZSWIM5、ZXDA、ZXDB和ZXDC。
在一些实施方案中，本文描述的方法检测EGFR基因中是否存在突变。在一些实施方案中，感兴趣的基因变异包括EGFR的21号外显子中存在c.2573T>G(由T变成G)取代。在一些实施方案中，本文描述的方法检测EGFR的21号外显子中是否存在c.2573T>G(由T变成G)取代。
在一些实施方案中，本文描述的方法检测KRAS基因中是否存在突变。在一些实施方案中，感兴趣的基因变异包括在KRAS基因的第35位存在由G变成T或由G变成A(即，编码第12号氨基酸并分别产生G12D和G12V突变的KRAS基因密码子)。在一些实施方案中，感兴趣的KRAS基因变异包括产生G12D、G12V、G13D、G12C、G12A、G12S、G12R或G13C氨基酸突变的多态性或突变。
在一些实施方案中，本文描述的方法通过在该方法中采用以下引物和阻断寡核苷酸中的至少一种来检测KRAS基因中是否存在突变：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)
阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)，其中“+”表示锁核酸。
在一些实施方案中，本文描述的方法通过在该方法中采用以下引物和阻断寡核苷酸来检测KRAS基因中是否存在突变：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)，其中“+”表示锁核酸。
在一些实施方案中，本文描述的方法通过采用以下捕获核酸中的至少一种来检测KRAS基因中是否存在突变：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本文描述的方法通过采用以下捕获核酸中的至少一种来检测KRAS基因中是否存在一个或多个突变：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本文描述的方法通过在该方法中采用以下捕获核酸、以下引物和阻断寡核苷酸以及捕获核酸来检测KRAS基因中是否存在一个或多个突变：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)
阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)，
其中“+”表示锁核酸
捕获核酸：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
在一些实施方案中，本文描述的方法检测样品中是否存在生物体。在一些实施方案中，本文的方法通过检测一种或多种基因变体来检测样品中或疑似存在于样品中的一种或多种生物体，所述基因变体表征此类一种或多种生物体并将此类一种或多种生物体与另一种生物体(或一类生物体)区分开来。在一些实施方案中，根据所公开的方法采用被配置用于扩增一种或多种靶核酸的引物或引物组，这些靶核酸可用于区分这类基因变体。在一些实施方案中，根据所公开的方法鉴定靶核酸或靶核酸组并对其进行定向检测(例如，通过设计扩增这种靶核酸的引物或引物组)，以便检测和区分一种或多种生物体。在一些实施方案中，捕获核酸或捕获核酸组被配置为捕获扩增子(在全文中也可称为可区分的扩增子)，这些扩增子是根据所公开的方法产生的，它们可被检测到并用于将样品中一种或多种生物体的存在与至少一种其它生物体的存在区分开来。
在一些实施方案中，本文描述的方法确定受试者患有或处于发生疾病或病况的风险中，所述疾病或病况的非限制性示例包括癌症。该技术的一种潜在的实际应用是鉴定癌症中存在的突变，从而可以对患者施用针对该癌症的适当的有效治疗。下表示出了此类癌症的某些非限制性示例及其相关的推荐治疗。
在一些实施方案中，本文描述的方法确定受试者患有或处于发生疾病或病况的风险中，所述疾病或病况的非限制性示例包括癌症。该技术的一种潜在的实际应用是鉴定癌症中存在的突变，从而可以对患者施用针对该癌症的适当的有效治疗。下表2示出了此类癌症的某些非限制性示例及其相关的推荐治疗。
表2
Figure BDA0003631321900001161
Figure BDA0003631321900001171
方法
在某些实施方案中，本文提出了一种检测样品中是否存在基因变异或等位基因变体的方法。在某些实施方案中，方法包括检测靶核酸中是否存在基因变异或等位基因变体。在一些这样的实施方案中，方法包括检测受试者中是否存在癌症。在一些实施方案中，方法或检测过程包括检测在磁性传感器表面处、表面上、表面附近或与之相关联的磁性颗粒的存在、不存在、量或其变化。在一些实施方案中，检测结合到磁性传感器表面的磁性颗粒的存在、不存在、量或其变化。在某些实施方案中，检测过程或检测步骤包括检测一段时间内磁性传感器表面处、表面附近或表面上的磁性颗粒量的变化。
在一些实施方案中，检测过程包括动态检测过程。在某些实施方案中，动态检测过程包括当磁性传感器表面处、表面附近或表面上的条件改变时，检测随着时间的推移，磁性传感器表面处、表面附近或表面上的磁性颗粒的存在、不存在、量或量的变化。在动态检测过程中可以改变的条件的非限制性示例包括温度、盐浓度、阳离子浓度、离子浓度、pH值、洗涤剂浓度、离液剂浓度、离子结构构造剂(ionic kosmotrope)浓度等或其组合。通常，在动态检测过程期间改变条件以提高磁性传感器表面处、表面上或表面附近蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-DNA相互作用的严格性。
在一些实施方案中，动态检测过程包括当在一段时间内升高温度时，检测磁性传感器表面处、表面附近或表面上的磁性颗粒的量随时间的变化。在一些实施方案中，动态检测过程包括当增加或减少阳离子(例如，Na、Ca、Mg、Zn等)的浓度时，检测磁性传感器表面处、表面附近或表面上的磁性颗粒量在一段时间内的变化。在一些实施方案中，动态检测过程包括当升高温度时和/或当增加或减少盐浓度时，检测磁性传感器表面处、表面附近或表面上的磁性颗粒量在一段时间内的变化。
在一些实施方案中，方法包括检测或确定磁性传感器表面上、表面附近或表面处的磁电阻、电流、电压电位或其变化。在一些实施方案中，如本文所述，在磁性传感器与磁性颗粒接触之前、期间和/或之后，一次、连续(例如，在预定的时间段内)或定期地(例如，两次或更多次)确定或检测磁性传感器表面上、表面附近或表面处的磁电阻、电流、电压电位或其变化。在一些实施方案中，当升高磁性传感器表面处的温度时，连续(例如，在预定的时间段内)或定期地(两次或更多次)确定或检测磁性传感器表面上、表面附近或表面处的磁电阻、电流、电压电位或其变化。
在一些实施方案中，在本文所述的微流控装置中执行本文所述方法的一些或所有方面和/或本文所述方法的一些或所有步骤。
在一些实施方案中，方法包括从样品中提取、分离或纯化核酸。在一些实施方案中，通过使样品与合适的细胞裂解溶液接触，从样品中提取、分离或纯化核酸。细胞裂解溶液通常被配置成裂解全细胞，和/或从污染物(例如，蛋白质、碳水化合物和脂肪酸)分离核酸。细胞裂解溶液可以包含一种或多种裂解试剂，其非限制性示例包括洗涤剂、低渗溶液、高盐溶液、碱性溶液、有机溶剂(例如，苯酚、氯仿)、离液盐、酶类等及其组合。
在一些实施方案中，通过使样品与膜(例如，本文所述的微流控装置的膜)进行接触(任选地在样品与细胞裂解溶液接触之后)，从样品中提取、分离或纯化核酸。在一些实施方案中，本文描述的装置执行从样品中提取、分离或纯化核酸的过程，该过程包括使样品与细胞裂解溶液和/或膜进行接触。在一些实施方案中，二氧化硅膜被用作提取过程的一部分。在一些实施方案中，方法包括选择性扩增靶核酸，从而产生靶核酸的一个或多个扩增子(例如，拷贝)。
在某些实施方案中，可以提供核酸用于实施本文所述的方法，而无需对含有核酸的样品进行处理。在一些实施方案中，在对含有核酸的样品进行处理后，提供核酸用于实施本文所述的方法。例如，可以在本文描述的方法之前、期间或之后，从样品中提取、分离、纯化、部分纯化或扩增核酸。
在一些实施方案中，使用合适的方法扩增靶核酸。在一些实施方案中，扩增过程包括这样一个过程，其中核酸的一条或两条链以酶促方式复制，从而产生靶核酸的扩增子(例如，拷贝或互补拷贝)。核酸扩增过程可以线性地或指数地产生具有与模板或靶核酸或其区段相同或基本相同的核苷酸序列的扩增子。在一些实施方案中，通过合适的扩增过程对靶核酸进行扩增，其非限制性示例包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式(n)PCR、定量(q)PCR、实时PCR、逆转录(RT)PCR、等温扩增(例如，环介导等温扩增(LAMP))、基于定量核酸序列的扩增(QT-NASBA)等，其变型，以及其组合。在一些实施方案中，扩增过程包括聚合酶链式反应。在一些实施方案中，扩增过程包括执行至少30个、至少40个、至少45个或至少50个聚合酶链式反应循环。聚合酶链式反应的循环包括至少一个变性步骤和任选的退火步骤，随后是至少一个延伸步骤。在一些实施方案中，使用合适的热稳定聚合酶对靶核酸进行扩增。在一些实施方案中，扩增过程包括等温扩增过程。
在一些实施方案中，扩增过程包括使包含感兴趣的基因变异(例如，感兴趣的等位基因变体)的靶核酸与(i)第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物、(iii)合适的聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸进行接触，其中，阻断寡核苷酸包含与靶核酸的第二等位基因变体互补的序列，并且将第一和第二引物配置为用于扩增靶核酸。在一些实施方案中，将第一引物附着于固体基底或表面(例如扩增室的表面)。在一些实施方案中，第一引物包含游离的5'羟基。可以使用任何合适的结合对成员。在某些实施方案中，结合对第一成员包含生物素。在某些实施方案中，将第一和第二引物配置为扩增靶序列或其部分。
在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含锁核酸。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含一个或多个锁核苷酸(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个锁核苷酸)。
阻断寡核苷酸通常被配置为与不包含感兴趣的基因变异的靶序列特异性退火或杂交。例如，当感兴趣的基因变异是位于靶核酸序列内特定位置处的单核苷酸变体(例如，鸟嘌呤(G))时，备选变体可包括该特定位置处的胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)。相应地，在此示例中，阻断寡核苷酸可以被配置成与包含备选变体之一的靶序列特异性杂交，从而使阻断寡核苷酸在该特定位置处包括C、A或T。此外，在该示例中，可能需要多达三种阻断寡核苷酸来阻断样品中可能存在的三种备选变体中每一种的扩增。通常，当感兴趣的基因变异是已知的单核苷酸取代(例如，与癌症相关的单核苷酸突变)时，阻断寡核苷酸被配置为与野生型变体(即，与癌症无关的变体，例如在健康受试者中发现的变体)杂交。阻断寡核苷酸中存在的锁核苷酸允许阻断寡核苷酸以比用于扩增反应的每种引物更高的解链温度与其靶序列特异性杂交，从而基本上阻断了包括备选或野生型变体(如果存在的话)的靶核酸的扩增。在一些实施方案中，阻断寡核苷酸包含比扩增反应中使用的一种或两种引物更高的解链温度。在一些实施方案中，当阻断寡核苷酸与其互补序列杂交时，其解链温度比扩增反应中使用的一种或两种引物的解链温度高出至少10℃、至少20℃或至少25℃。在一些实施方案中，扩增反应在本文所述微流控装置的扩增室中进行。
在一些实施方案中，将通过扩增反应产生的扩增子与合适的外切核酸酶(例如，合适的5'-3'外切核酸酶)进行接触，从而使得包含游离的5'羟基的扩增子被选择性降解和/或消化。在某些实施方案中，合适的5'-3'外切核酸酶不会降解或消化包含与扩增子的5'羟基缀合的结合对成员(例如生物素)的扩增子。在一些实施方案中，将扩增子通过微流体通道从本文所述装置的扩增室转运到包含合适外切核酸酶的腔室(例如，图24的218、216或210)，其中使扩增子与外切核酸酶进行接触。
在一些实施方案中，使扩增子与本文所述的传感器进行接触。在一些实施方案中，使扩增子与捕获核酸进行接触，其中捕获核酸附着于磁性磁电阻传感器的表面。在一些实施方案中，将扩增子通过微流体通道从本文所述装置的扩增室转运到本文所述装置的传感器，从而使得扩增子接触附着于传感器表面的捕获核酸。在某些实施方案中，捕获核酸与包含感兴趣的基因变异的靶核酸或其扩增子特异性杂交。在某些实施方案中，捕获核酸包含一个或多个锁核苷酸。在某些实施方案中，捕获核酸包含与靶核酸或其互补序列存在至少80％、至少90％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，捕获核酸包含与包括感兴趣基因变异的靶核酸的一部分或其互补序列存在至少80％、至少90％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，捕获核酸包含与靶序列的第一等位基因变体互补的序列，其中第一等位基因变体包括感兴趣的基因变异。一旦扩增子与捕获核酸接触和/或杂交，磁性传感器表面就会包含所捕获的核酸(例如，捕获的扩增子)。在一些实施方案中，捕获的扩增子是包含结合对成员(例如生物素)的扩增子。在一些实施方案中，将包含结合对第一成员(例如生物素)的扩增子与包含结合对第二成员(例如链霉亲和素)的磁性颗粒接触，从而使得结合对的第一和第二成员彼此结合。在传感器表面处捕获扩增子之前、期间或之后，可以使扩增子与带有结合对成员的磁性颗粒进行接触。通过将传感器表面与一种或多种洗涤溶液/洗涤缓冲液接触，可以洗涤传感器上所捕获的扩增子一次或多次，以此去除未结合和/或非特异性结合的核苷酸和/或磁性颗粒。
在一些实施方案中，使所捕获的扩增子与荷正电的离子接触。在一些实施方案中，将包含一种或多种盐或正离子的溶液导入微流体通道，从而使得与所捕获扩增子进行流体接触的荷正电离子的浓度增加或减少。例如，在一些实施方案中，将包含水的溶液或者包含低量盐或正离子的稀释缓冲液导入微流体通道，从而使得与所捕获扩增子进行流体接触的荷正电离子的浓度降至50mM或更低、30mM或更低、15mM或更低、10mM或更低、5mM或更低，或降至1mM或更低。在一些实施方案中，将溶液或缓冲液导入微流体通道，使得与所捕获扩增子进行流体接触的荷正电离子的浓度降至约50mM至0.1mM、约20mM至1mM、约10mM至1mM的范围，或其中间范围。在一些实施方案中，将溶液或缓冲液导入微流体通道，从而使得与所捕获扩增子进行流体接触的荷正电离子的浓度降低约20％、约50％、约100％、约200％或约400％。可以在将扩增子捕获到传感器表面之前、期间或之后，降低与传感器接触的正离子的浓度。
在一些实施方案中，在1秒至30分钟、1秒至10分钟、1秒至5分钟、1秒至1分钟的时间段或其中间范围内，将与传感器表面和/或扩增子(例如，所捕获扩增子)接触的流体的温度升高至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少40℃、至少60℃、或至少80℃。在一些实施方案中，在1秒至30分钟、1秒至10分钟、1秒至5分钟、1秒至1分钟或其中间范围的时间段内，将与传感器表面和/或扩增子(例如，所捕获扩增子)接触的流体的温度从约10℃升高至约120℃、从约10℃升高至约80℃、从约10℃升高至约70℃、从约10℃升高至约65℃、从约10℃升高至约60℃、从约20℃升高至约120℃、从约20℃升高至约80℃、从约20℃升高至约70℃、从约20℃升高至约65℃、从约20℃升高至约60℃、从约25℃升高至约80℃、从约25℃升高至约70℃、从约25℃升高至约65℃、从约25℃升高至约60℃，或它们的中间范围。
在一些实施方案中，方法包括在1秒至30分钟、1秒至10分钟、1秒至5分钟、1秒至1分钟或其中间范围的时间段内，将传感器(例如，包含所捕获扩增子和缔合的磁性颗粒的磁性传感器)表面处的温度升高至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少40℃、至少60℃或至少80℃。在一些实施方案中，方法包括在1秒至30分钟、1秒至10分钟、1秒至5分钟、1秒至1分钟或其中间范围的时间段内，将传感器(例如，包含所捕获扩增子和缔合的磁性颗粒的磁性传感器)表面处的温度从约10℃升高至约120℃、从约10℃升高至约80℃、从约10℃升高至约70℃、从约10℃升高至约65℃、从约10℃升高至约60℃、从约20℃升高至约120℃、从约20℃升高至约80℃、从约20℃升高至约70℃、从约20℃升高至约65℃、从约20℃升高至约60℃、从约25℃升高至约80℃、从约25℃升高至约70℃、从约25℃升高至约65℃、从约25℃升高至约60℃，或它们的中间范围。
在一些实施方案中，方法或检测过程包括检测可检测标记物的存在、不存在或其量。在某些实施方案中，通过传感器检测可检测标记物的存在、不存在或其量。在某些实施方案中，在传感器表面处或其附近检测可检测标记物的存在、不存在或其量。在一些实施方案中，检测结合到传感器表面的可检测标记物的存在、不存在或量。在某些实施方案中，检测过程或检测步骤包括检测传感器表面处、表面附近或表面上的可检测标记物的量随时间的变化。
在一些实施方案中，检测过程包括动态检测过程。在某些实施方案中，动态检测过程包括当传感器表面处、表面附近或表面上的条件改变时，检测随着时间的推移，传感器表面处、表面附近或表面上的可检测标记物的存在、不存在、量或量的变化。在动态检测过程中可以改变的条件的非限制性示例包括温度、盐浓度、阳离子浓度、离子浓度、pH值、洗涤剂浓度、离液剂浓度、离子结构构造剂(ionic kosmotrope)浓度等或其组合。通常，在动态检测过程期间改变条件，以提高存在捕获核酸的传感器表面处、表面上或表面附近杂交条件的严格性。动态检测过程允许区分与捕获核酸具有完全互补匹配的杂交核酸双链体和与捕获核酸具有一个或多个错配的非特异性核酸双链体。这是因为与捕获核酸具有错配的双链体通常会在比与捕获核酸具有完全匹配的双链体低严格性的杂交条件下解链、解离或变性。
在一些实施方案中，动态检测过程包括当在一段时间内升高温度时，检测传感器表面处、表面附近或表面上的可检测标记物的量随时间的变化。在一些实施方案中，动态检测过程包括当降低阳离子(例如，Na、Ca、Mg、Zn等)的浓度时，检测传感器表面处、表面附近或表面上的可检测标记物量在一段时间内的变化。在一些实施方案中，动态检测过程包括当升高温度时和/或当降低阳离子(例如，Na、Ca、Mg、Zn等)的浓度时，检测传感器表面处、表面附近或表面上的可检测标记物量在一段时间内的变化。
在一些实施方案中，方法包括检测或确定磁性传感器表面上、表面附近或表面处的磁电阻、电流、电压电位或其变化。在一些实施方案中，如本文所述，在将所捕获扩增子与磁性颗粒接触之后，一次、连续(例如，在预定的时间段内)或定期地(两次或更多次)确定或检测磁性传感器表面上、表面附近或表面处的磁电阻、电流、电压电位或其变化。在一些实施方案中，当升高磁性传感器表面处的温度时，连续(例如，在预定的时间段内)或定期地(两次或更多次)确定或检测磁性传感器表面上、表面附近或表面处的磁电阻、电流、电压电位或其变化。
在一些实施方案中，本文描述的方法确定受试者基因组中和/或包含获自受试者的核酸的样品中基因变异的存在、不存在或量。在一些实施方案中，当执行本文所述的方法时，根据在磁性传感器表面上、表面附近或表面处检测或测量的磁电阻、电流、电压电位或其变化来确定感兴趣的基因变异的存在、不存在或量。
在一些实施方案中，本文描述的方法不包括对一个或多个核酸进行DNA测序的测序步骤。在一些实施方案中，本文描述的方法不包括核酸测序过程。相应地，在一些实施方案中，本文描述的方法不包括确定核酸的序列。
此外，在一些实施方案中，本文描述的方法不包括连接步骤。在一些实施方案中，本文描述的方法不包括连接过程。相应地，在一些实施方案中，本文描述的方法不包括使用连接酶或将核酸与连接酶接触。
此外，在一些实施方案中，本文描述的方法或装置不包括微阵列或微阵列的使用。
实施例
实施例1
为了证明对示例性生物标志物的检测，将图16A和16B的方案用于心脏生物标志物。结果如图17A-C所示。图17A示出了涉及为检测心脏生物标志物D-二聚体的测试运行中GMR信号(以ppm为单位)随时间(以秒为单位)变化的曲线。为了生成这些数据，通过对传感器表面进行功能化处理(如上所述，通过生物素部分与传感器上聚合物组合物的交联)，并使用2nL溶于含有0.05％叠氮钠的PBS缓冲液中的1mg/mL D-二聚体抗体来点样D-二聚体捕获抗体，从而在传感器上制备生物表面。为了测试潜在的交叉反应性，还通过使用2nL溶于含有0.05％叠氮钠的PBS缓冲液中的1mg/mL肌钙蛋白I抗体溶液，来点样两种组合的捕获抗体，从而用肌钙蛋白I捕获抗体对生物表面进行功能化。此外，将另外两种对照也点样在生物表面上。第一种是阴性对照，通过点样2nL溶于含有0.05％叠氮钠的PBS缓冲液中的0.5％BSA溶液来制备，而第二种是阳性对照，通过点样2nL溶于含有0.05％叠氮钠的PBS缓冲液中的1mg/mL与小鼠IgG缀合的生物素来制备。将点样的传感器整合到心脏测试盒体中，并被配置为使用上文描述的在图16A和16B中的“夹心”测定。
在样品测试中，将120微升的血浆或全血加载入盒中的样品孔内。当将样品从样品孔吸入流动通道时，膜过滤器用于去除血细胞。40微升血浆(或全血的血浆部分)流入计量通道，并将通道中沉积的粉状物(包括抗体/生物素缀合物、阻断物和小鼠IgG)溶解到样品溶液中。当流过传感器区域时，分析物、抗体/生物素缀合物和固定在传感器表面上的抗体形成抗体-分析物-生物素化抗体的夹心结构。根据测试调节流速。对于肌钙蛋白I，样品以1微升/分钟的流速流过传感器20分钟。对于D-二聚体，样品以4微升/分钟的流速流动5分钟。在样品的流动后，导入了涂有链霉亲和素的磁性珠，其允许结合到结合有生物素化抗体的传感器表面处。GMR传感器测量结合的磁性珠，其与样品中分析物的浓度成比例。珠子溶液以4至10微升/分钟的流速流过传感器5分钟。在珠子开始结合后300秒内从峰值读取信号。
如图17A的图所示，仅含有点样的BSA的阴性对照不结合D-二聚体，因此正如预期的那样，信号保持在基线附近。正如预期的那样，含有生物素化小鼠IgG的阳性对照显示出有力的珠子结合。666.6ng/mL的人D-二聚体的实际样品的图出现了峰值检测信号约为750ppm，表明在实际样品中成功检测到D-二聚体。与两种结合的肌钙蛋白I捕获抗体几乎没有交叉反应性(为清楚起见未显示，因为这些线与阴性对照的线非常接近)。
图17B示出了D-二聚体的校准曲线(以ppm为单位的GMR信号相对于D-二聚体浓度)，这是通过运行具有不同、固定浓度的D-二聚体的样品而获得的。校准曲线允许计算未来含有作为查询分析物的D-二聚体的未知样品的浓度。图17C中提供了心脏生物标志物肌钙蛋白I的类似图。总之，这些结果确立了在受试者的血液或血浆样品中检测D-二聚体和肌钙蛋白I的可行性。
实施例2
为了证明用于分析物检测的GMR信号的放大，进行了例如图16A中所示的夹心免疫测定形式。使生物素化的肌钙蛋白I捕获抗体流过独立的GMR传感器，以产生一系列肌钙蛋白I生物表面附着的传感器(通过生物素部分与传感器上聚合物组合物的交联)，从而测试不同浓度的肌钙蛋白I。使含有如下表3所示不同浓度肌钙蛋白I的每个查询样品都流过肌钙蛋白I捕获抗体点样的传感器。然后，使其它生物素化的抗肌钙蛋白I抗体流过传感器。随后，涂有链霉亲和素的磁性纳米颗粒流过每个传感器表面，并与通过生物素-链霉亲和素相互作用结合到表面的生物素化-抗肌钙蛋白I抗体结合。如表3(“初级信号”)所示，记录传感器信号读数(磁电阻的变化)。
随后，使涂有生物素的磁性纳米颗粒流过传感器；这些涂有生物素的磁性纳米颗粒然后与涂有链霉亲和素的磁性纳米颗粒上的游离链霉亲和素基团结合。如表3(“第一增强信号”)所示，记录传感器信号读数(磁电阻的变化)。
随后，使另一个涂有链霉亲和素的磁性纳米颗粒样品流过传感器；这些涂有链霉亲和素的磁性纳米颗粒然后与涂有生物素的磁性纳米颗粒上的游离生物素基团结合。如表3(“第二增强信号”)所示，记录传感器信号读数(磁电阻的变化)。
表3：信号增强前后的人肌钙蛋白I测试数据
Figure BDA0003631321900001261
表3和图18中显示的结果表明，对于低水平(0-125ng/L)的肌钙蛋白I测试，在第一和第二信号增强过程后，所有信号都显著增加。对于空白样品(0ng/L肌钙蛋白I)，每次增强后的信号适度增加(从0.8ppm到2.4和4.4ppm)，表明测定“噪声”略有增加。然而，对于7.8ng/L，在每次后续增强后，SNR(信噪比)从6增加到25和21.5。在31.5和125ng/mL的肌钙蛋白I浓度也实现了显著的信号增强。
磁性(GMR)传感器测量结合的磁性珠，其与样品中分析物的浓度成比例。在结合的珠子量非常低的情况下，GMR传感器的信噪比可能比期望的要低。本文描述的结果表明，通过使涂有生物素的磁性珠(MB-生物素)流动，可以明显提高这种情况下的信噪比，所述涂有生物素的磁性珠由涂有链霉亲和素的初始磁性珠(MB-SA)捕获，所述初始磁性珠被捕获在传感器表面上，而所述传感器在表面上先前已经暴露于含有肌钙蛋白I的样品。然后，MB-SA再次流过传感器表面，并且由于MB-SA随后与传感器上的MB-生物素结合，产生了额外的信号增强。MB-生物素和MB-SA的改变可以重复进行多轮增强，以进一步增加GMR信号。
如上所述的信号放大可用于检测生物标志物以及基因变体和/或等位基因变体的方法，和/或用于区分一个或多个样品中存在或疑似存在的可能的基因和/或等位基因变体。
实施例3
EGFR是编码表皮生长因子受体的基因，它是表皮生长因子家族成员的一种跨膜糖蛋白受体。EGFR的21号外显子中的单核苷酸突变c.2573T>G(由T变成G)导致858位亮氨酸(L)变成精氨酸(R)的氨基酸取代(L858R)，这是肺癌的致病因素和预测因素。具有L858R突变的表皮生长因子受体被持续激活，导致细胞生长和细胞增殖失控。
在获自受试者的含有游离DNA(cfDNA)的血浆样品中，以高灵敏度检测到c.2573T>G突变。该过程是非侵入性的，因为不需要组织活检。而且，该测定方法仅需要cfDNA的存在，并且不需要纯化和裂解从血沉棕黄层级分获得的淋巴细胞。然而，如本实施例所示，通过实施任选的裂解缓冲液步骤，也可以使用该方法分析来自血细胞的DNA。所有以下过程都在本文所述的微流控装置上进行(例如，参见图1-15和24-26)。
简言之，并参照图25和26，将血浆样品导入样品加载口605，在此使它与含有盐酸胍(GuHCl,Sigma:G3272)、pH值为8.0的Tris-HCl、Triton X-100和异丙醇的细胞裂解缓冲液进行接触。将样品通过阀门V1和微流体通道105转运到二氧化硅纤维膜(例如104)，在此处样品中的核酸结合到二氧化硅纤维膜上。通过将洗涤缓冲液从腔室101和/或腔室102通过阀门V2和/或V3导入微流体通道105，对膜进行洗涤。洗涤缓冲液穿过膜，继续通过微流体通道到达阀门V5，并到达提取废物室200，其通过使用隔膜泵1施加负压。洗涤之后，将阀门V1、V2和V3切换到与V4在线，打开阀门V4，关闭V5，并打开V6。将结合至膜的核酸洗脱下来并转移至洗脱收集室201，其通过将储存在腔室103中的洗脱缓冲液经过微流体通道引导至膜104并随后引导至洗脱收集室201，这是通过使用隔膜泵1向腔室201施加负压进行的。
DNA洗脱后，使洗脱产物与储存在腔室204中的冻干扩增试剂进行接触，并将混合物移入混合室206，并通过阀门V7到达扩增室208(参照图6)。扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTP、生物素化的正向引物、包含游离5'-羟基的反向引物、阻断寡核苷酸和热稳定聚合酶(KLEN
Figure BDA0003631321900001281
)。
下文是EGFR基因的突变靶核酸，其中感兴趣的基因变异(突变)以下划线和粗体显示。
Figure BDA0003631321900001282
野生型非突变靶序列如下所示。
CAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGT(SEQ ID NO:2)
SEQ ID NO:2
(CAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGT)的下划线部分与阻断寡核苷酸序列SEQ ID NO:5(5’-TTTGGCCAGC)互补。正向引物和反向引物也如下所示。正向引物含有5'-缀合的生物素部分。反向引物包括5'-磷酸基团。阻断寡核苷酸是一种锁核酸(LNA)，并且阻断寡核苷酸的所有核苷酸都是锁核苷酸。锁核苷酸包含额外的亚甲基桥，其以C3'-内型(β-D-LNA)或C2'-内型(α-L-LNA)构象固定到核糖部分。
正向引物：/5’-Biosg/CAGCCAGGAACGTACTGGTG(SEQ ID NO:3)
反向引物：/5’-Phos/ACTTTGCCTCCTTCTGCATG(SEQ ID NO:4)
阻断寡核苷酸：5’-TTTGGCCAGC(SEQ ID NO:5)
关闭阀门V7、V8和V9，并对扩增室中的核酸和试剂进行>40个循环的热循环，其中在95℃进行变性(解链)步骤，并在58℃进行退火/延伸步骤。扩增室/模块是盘旋形薄塑料PCR微型反应器。通过Peltier冷却模块实现热循环的温度。
阻断寡核苷酸的设计方向与反向引物相同。相应地，在PCR过程中只阻断了一条链。扩增后，预计扩增室包括双链扩增子和单链DNA(例如，参见图20)。
将PCR产物(扩增子)移至含有干燥的5'-3'外切核酸酶的腔室218，对外切核酸酶进行再水合，在混合室216中与扩增子混合，并移至腔室210，在那里使它们与外切核酸酶接触，该外切核酸酶通过仅消化具有5'磷酸的扩增子将双链DNA消化成单链DNA(例如，参见图21)。
然后，通过打开阀门V12，将产生的单链生物素化扩增子移至GMR传感器300。
GMR传感器的表面包括多个表面结合的捕获核酸。捕获核酸的序列如下所示(即，SEQ ID NO:6)。
探针：
Figure BDA0003631321900001291
前面带有“+”符号的核苷酸碱基是锁核苷酸。捕获核酸还包括C65'氨基修饰物，其允许捕获核酸点样在GMR的表面上。捕获核酸被配置为当生物素化扩增子流过传感器时，捕获核酸与包含靶突变(粗体和下划线所示)的生物素化扩增子特异性结合。捕获核酸的设计方向与阻断寡核苷酸和反向引物相同。相应地，阻断寡核苷酸不会与捕获核酸杂交。
通过打开阀门V13，将储存在腔室230中的磁性珠移至GMR传感器。磁性珠是链霉亲和素缀合的，并与GMR传感器表面上捕获的生物素化扩增子紧密结合(例如，参见图22)。磁性珠与传感器的结合或随后磁性珠从传感器的释放会导致传感器表面处的磁电阻发生变化，并对该变化进行检测和定量。
在结合生物素化扩增子和随后结合磁性链霉亲和素珠子之后，通过打开阀门V14洗涤GMR传感器，从而使腔室250中的洗涤缓冲液流过GMR传感器的表面。洗涤缓冲液还将钠离子浓度从50mM降至10mM，这导致杂交条件的严格性提高。在这种情况下，野生型和突变靶序列之间与捕获核酸SEQ ID NO:6
Figure BDA0003631321900001301
的解链温度差异增加。相应地，加入洗涤缓冲液后，野生型和突变序列之间的解链温度差异为15℃。
洗涤后，缓慢加热GMR传感器表面的温度，以在5至20分钟的时间段内将温度从45℃升高至85℃，同时检测并记录GMR传感器表面的磁电阻(例如，参见图27)。由于与突变的EGFR靶序列相比，捕获核酸与野生型EGFR靶序列的解链温度相差15度，因此突变的EGFR靶序列晚一点离开表面。相应地，可以将EGFR基因中存在的靶突变(c.2573T>G突变)从存在可能与捕获核酸非特异性结合的野生型序列中区分出来。
产生并测试了不同的捕获核酸，每种捕获核酸包含不同数量的锁核酸、长度和/或位于不同位置的锁核苷酸。当与突变的靶核酸杂交时，每种捕获核酸具有不同的解链温度，并且可以使用GMR传感器来区分每种捕获核酸与靶标的结合/解链。这些结果(例如，参见图27)表明，可以设计多种捕获探针来检测多种不同的基因组突变，这将允许在单次运行中对多种不同的基因组突变进行多重检测。
在第二种实验中，扩增室中不包含阻断寡核苷酸。因此，PCR反应是在没有阻断寡核苷酸的情况下进行的。在GMR(300)表面上捕获扩增子后，流经磁性传感器的缓冲液中的Na+浓度从50mM降至10mM。结果(图28)显示，代表所捕获野生型DNA的假阳性信号可以与真阳性信号(即，突变的靶序列，数据未显示)区分开，其中野生型序列在较低的温度下和较短的时间内变性并从磁性传感器的表面解离下来(见箭头)，而突变的靶序列直到温度达到约67℃时才变性(图27)。因此，通过降低磁性传感器表面处的正离子浓度并升高温度，提高了测定的特异性和灵敏度。
实施例4
利用实施例3所述的微流控装置和测定法，采用动态检测过程，测试了从健康患者(图29A)和从EGFR基因中具有c.2573T>G突变的癌症患者(图29B)的血浆中获得的cfDNA样品。简言之，将样品导入装置的加载室，使样品暴露于裂解缓冲液以裂解任何可能已存在的全细胞，并使用二氧化硅膜纯化核酸。在存在阻断核苷酸SEQ ID NO:5(5’-TTTGGCCAGC)的情况下，使用引物SEQ ID NO:3(/5’-Biosg/CAGCCAGGAACGTACTGGTG)和SEQ ID NO:4(/5’-Phos/ACTTTGCCTCCTTCTGCATG)来扩增洗脱的核酸。进行了50个循环的扩增，并用5'-3'外切核酸酶消化扩增子。使用捕获核酸SEQ ID NO:6
Figure BDA0003631321900001311
在GMR传感器表面上捕获剩余的生物素化扩增子。在将钠离子浓度降至10mM时，使所捕获扩增子与涂有链霉亲和素的磁性珠接触，并在将温度从45℃升高至80℃时测量传感器表面处的磁电阻。在图29A中，所产生的信号(蓝线)表明受试者中没有癌症。在图29B中，所产生的信号(蓝线)表明受试者中存在癌症。本测定中的检测灵敏度为每mL血浆约15个突变靶序列拷贝。测定灵敏度可以低至每mL血浆1个拷贝或更少的突变靶序列，这取决于患者血浆样品中cfDNA的量。
实施例5
对实施例3中描述的装置进行调整，如此使得GMR传感器替换为用于检测荧光信号的数码摄像机和UV光源。而且，将链霉亲和素-磁性珠替换为涂有链霉亲和素的量子点，该量子点在UV光源激发下发射荧光。省略了外切核酸酶室和外切核酸酶，并将引物SEQ IDNO:4(5’-Phos/ACTTTGCCTCCTTCTGCATG)直接涂覆在PCR室的表面上，从而使得来源自SEQID NO:4(5’-Phos/ACTTTGCCTCCTTCTGCATG)的扩增子永久附着在PCR室上。动态检测过程基本上与实施例1和2的过程相同，除了荧光强度(即信号)是通过传感器表面处的数码摄像机检测的，而不是通过电阻。
实施例6
本实施例展示了从患者获得的样品中进行的多次重复，其表明从G12D突变低至0.1％的样品中检测到KRAS G12D突变。本实施例还表明，相同的阻断物和引物可用于检测单个区域内的多种不同突变。
游离DNA购自Horizon(HD780)。采用实施例3中所述的微流控装置配置、传感器表面功能化和测定方法来检测KRAS G12D突变。KRAS引物、KRAS阻断寡核苷酸如下：
正向引物：/5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)
反向引物：/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)
阻断寡核苷酸：5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)。
其中，“+”表示锁核酸。
GMR传感器的表面包括多个表面结合的捕获核酸。捕获核酸的序列如下所示：
KRAS G12D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，前面带有“+”的核酸是锁核酸。
在加入磁性珠后240秒获取信号读数。采用学生t检验来比较突变体值和野生型值。如图30所示，0.1％突变体和1.0％突变体都具有p值<0.0001，表明该测定法区分突变体和野生型(非突变体)之间差异的特异性强，具有很强的统计学意义。还显示了使用EGFRT790M和EGFRL858R突变的探针作为阴性对照的平行测定。
下表4提供了珠子流过样品后240秒，重复测定的信号强度。
表4
Figure BDA0003631321900001321
为了证明多重能力和更好的临床效用，使用了相同的KRAS阻断寡核苷酸(5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9))以及KRAS正向和反向引物，但使用了下文提供的捕获核酸(即探针)，以检测表5中列出的KRAS突变：
KRAS G12V探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
KRAS G12C探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
KRAS G12A探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)
KRAS G12S探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)
KRAS G12R探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+CGTGGCGTAG(SEQ ID NO:15)
KRAS G13D探针：/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGCTG+GTG+AC+GTAGGCAA
(SEQ ID NO:16)
如图31所示，证明相同的阻断物和引物能够检测KRAS基因第35位的不同突变。KRAS G12V是从G到T的变化，而不是从G到A的变化(其产生KRAS G12D突变蛋白)。结果还表明，在珠子流动后500秒，突变的信号仍然很强，并且产生比用野生型DNA观察到的信号明显更强的信号。阻断物和探针也能够用于检测附近的核苷酸突变KRAS G12C，它是位于第34位的突变，而不是第35位。使用探针检测G13D和G13C突变的扩增子也获得了类似的结果。
表5
突变核苷酸位置 癌症ID 氨基酸变化
35G>A COSM521 G12D
35G>T COSM520 G12V
38G>A COSM532 G13D
34G>T COSM516 G12C
35G>C COSM522 G12A
34G>A COSM517 G12S
34G>C COSM518 G12R
37G>T COSM527 G13C
实施例7
为了证明可用于检测和鉴定一个或多个样品中一个或多个生物体种类的检测基因变体的能力，开发了用于检测一个或多个真菌属的多种探针和引物。在这类方法中，阻断引物不是必需的，因此在测定中未使用。串联使用多种探针来鉴定每个样品中存在哪些真菌属，其中从单一探针来探寻单一突变。
为了鉴定引物和探针以确定在样品中检测到的目标属真菌的属或种，从NCBI上的编制18S真菌基因库的目标属中下载了序列(生物项目数据库PRJNA39195)。使用muscle(v2.27.1；Edgar等人2004)对这些序列进行比对，并根据比对结果构建共有序列。然后，下载NCBI上现有的目标属的所有基因组序列，并将共有序列用作blast搜索中的查询以鉴定每个基因组中的18S基因座(来自NCBI BLAST+软件包[v2.9.0；Camacho等人2009]的blastn，使用dc-megablast设置)。对于每个基因组，使用自定义python脚本选择最佳命中，并且通过使用来自MAFFT软件包的linsi程序比对整个序列集(v7.407；Katoh&Standley2014)。对比对结果进行手动编辑，以删除看似较大的异常值或异常短的序列。然后，使用自定义python脚本鉴定属特异性可变区和保守区。
使用总共10个探针和6个引物来鉴定和区分来自10个不同类别(包括9个属)的真菌和测试样品中的耳道假丝酵母菌(Candida auris)。这10个探针和6个引物允许鉴定至少25种真菌，并将它们分成10个类群。9个类群是以属为基础的，而最后一个类群是耳道假丝酵母菌种。十个类群如下：
1.耳道假丝酵母菌(Candida auris)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)、光滑假丝酵母菌(Candida glabrata)、克鲁斯假丝酵母菌(Candida krusei)、黑马朗假丝酵母菌(Candida haemulonis)
2.烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、土曲霉菌(Aspergillus terreus)
3.新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)
4.粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、波萨达斯球孢子菌(Coccidioidesposadasii)
5.腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioidis)和串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)
6.耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)
7.皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)
8.荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)
9.米根霉菌(Rhizopus oryzae)、小孢根霉菌(Rhizopus microspores)
10.耳道假丝酵母菌(Candida auris)
用于区分和鉴定测试样品中存在和/或不存在来自这十个类群的真菌的探针和引物如下。
引物：
反向引物：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)
正向引物：/5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQ ID NO:18)
正向引物：/5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)
反向引物：/5Phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)
反向引物：/5Phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)
CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)
以下引物，正向引物：在独立实验中，使用5Biosg/CATCGGCTTGAGCCGATAGTC(SEQID NO:33)代替正向引物：5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQ ID NO:18)。发现两个正向引物5Biosg/CATCGGCTTGAGCCGATAGTC(SEQ ID NO:33)和5Biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(SEQID NO:18)都能成功区分和鉴定测试样品中的真菌。
探针：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:
30)
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:
31)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)
6种引物(SEQ ID Nos:17-22)一起用于单个PCR反应。扩增了来自5种不同真菌的DNA。人游离DNA用作阴性对照。如上所述，将用于真菌分类的10种探针(SEQ ID Nos:23-32)以及阳性和阴性对照点样在GMR传感器上，一式三份。
如图32所示，该测定用于区分和检测专利样品中指定的真菌。红色迹线表示来自阳性对照的测量值，而黑色迹线表示来自阴性对照的测量值。当组合分析时，不同的探针正确地鉴定了样品中存在哪些真菌属。阳性和阴性外对照样品用作质量控制样品。
参考文献：
Camacho,C.,Coulouris,G.,Avagyan,V.,Ma,N.,Papadopoulos,J.,Bealer,K.和Madden,T.L.,2009.BLAST+:architecture and applications.BMC bioinformatics,10(1),第421页。
Edgar,R.C.,2004.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracyand high throughput.Nucleic acids research,32(5),第1792-1797页。
Katoh,K.和Standley,D.M.,2014.MAFFT:iterative refinement andadditional methods.In Multiple sequence alignment methods(第131-146页).HumanaPress,Totowa,NJ。
一些实施方案中，在本文所述的微流控装置中执行本文所述方法的所有方面和/或本文所述方法的所有步骤。
应当理解的是，本文公开的所有实施方案可以以任何方式组合，以执行检测分析物的方法，并且可以使用本文公开的描述各种系统组成部分的实施方案的任何组合来执行这类方法。
尽管在上文阐述的说明性实施方案中，已经明确了本公开的原理，但对于本领域技术人员来说明显的是，可以对本公开的实践中所使用的结构、布置、比例、元件、材料和部件进行各种修改。
由此可见，本公开的特征已经完全且有效地实现。然而，应该认识到，为了说明本公开的功能和结构原理，已经示出和描述了前述优选的具体实施方案，并且在不脱离这些原理的情况下，可以进行改变。因此，本公开包括包含在以下权利要求的精神和范围内的所有修改。

Claims (126)

1.一种检测靶核酸中第一基因变体的存在的方法，包括：
(a)使所述靶核酸与(i)第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸进行接触，其中所述阻断寡核苷酸包含与所述靶核酸的第二基因变体互补的序列，并且将所述第一和第二引物配置用于扩增所述靶核酸；
(b)扩增所述靶核酸，以此提供所述靶核酸的扩增子；
(c)使所述扩增子与捕获核酸接触，其中所述捕获核酸包含与所述靶序列的所述第一基因变体互补的序列，以此提供包含所述结合对第一成员的捕获的扩增子；
(d)使所述捕获的扩增子与包含所述结合对第二成员的第一可检测标记物接触；和
(e)检测所述第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
2.权利要求1所述的方法，其中所述捕获核酸附着于传感器表面。
3.权利要求2所述的方法，其中(e)的检测包括检测所述传感器表面处所述第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括动态检测过程。
5.权利要求4所述的方法，其中所述动态检测过程包括在(e)的检测期间，升高所述传感器处或其附近、或者所述传感器表面处的温度。
6.权利要求4或5所述的方法，其中所述动态检测过程包括在(e)的检测期间，改变所述传感器处或其附近、或者所述传感器表面处的盐或阳离子浓度。
7.权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述动态检测过程包括在(e)的检测期间使流体流过所述传感器表面。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括检测与所述捕获核酸结合的一个或多个扩增子的结合。
9.权利要求2至8中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括检测与所述传感器表面结合的扩增子的量的变化。
10.权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述传感器包含磁性传感器，所述第一可检测标记物包含磁性颗粒，并且(e)的检测包括检测所述磁性传感器表面处或其附近磁电阻的存在、不存在、量或变化。
11.权利要求10所述的方法，其中(e)的检测包括检测所述传感器表面处磁电阻的变化。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含一个或多个锁核苷酸。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一引物包含5'-磷酸化核苷酸。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含一个或多个锁核苷酸。
15.权利要求11至14中任一项所述的方法，其中检测磁电阻的变化包括将所述表面的温度升高至少5℃，同时在升高温度之前、期间和/或之后检测所述传感器表面处的磁电阻。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中当与所述第二基因变体杂交时，所述阻断寡核苷酸基本上阻止了所述靶核酸的扩增。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含至少75℃、至少80℃或至少85℃的解链温度。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸的长度范围为9至20个寡核苷酸。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含至少3个锁核苷酸。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在(b)之后，使所述扩增子与5'-3'外切核酸酶接触。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸的长度范围为9至30个寡核苷酸。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含至少50℃、至少55℃或至少65℃的解链温度。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含至少3个锁核苷酸。
24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其中根据在(e)中检测到的磁电阻变化来确定所述靶核酸中所述第一基因变体的存在。
25.权利要求2至24中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括将所述传感器表面处所述第一基因变体的存在、不存在或量相比于所述传感器表面处所述第二基因变体的存在、不存在或量进行区分。
26.权利要求2至25中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括将所述传感器表面处所述第一基因变体的存在、不存在或量相比于所述传感器表面处另一种核酸的存在、不存在或量进行区分。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述结合对第一成员包含生物素，而所述结合对第二成员包含链霉亲和素。
28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中(b)的扩增包括聚合酶链式反应。
29.权利要求28所述的方法，其中(b)的扩增包含至少40个或至少50个聚合酶链式反应循环。
30.权利要求1至29中任一项所述的方法，其中对从受试者获取的样品实施所述方法，其中所述样品包含所述靶核酸。
31.权利要求30所述的方法，其中所述样品包含游离DNA。
32.权利要求30或31所述的方法，其中所述样品获自妊娠雌性。
33.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中在(a)之前，使所述样品与微流体通道接触，其中将所述微流体通道可操作地和/或流控地连接到所述传感器。
34.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中在(a)之前，使所述样品与膜接触，所述膜被配置为可逆地和/或非特异性地结合所述样品中的核酸，由此提供结合的核酸，其中将所述膜可操作地和/或流控地连接到所述微流体通道和所述传感器。
35.权利要求1至34中任一项所述的方法，其中在扩增室内进行(b)的扩增，所述扩增室可操作地和/或流控地连接到微流体通道、所述传感器和任选地连接到膜。
36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中在(a)之前，所述方法包括(i)使所述样品与(i)细胞裂解溶液、(ii)膜、(iii)任选地洗涤溶液和(iv)洗脱缓冲液接触，其中在与(iv)接触之后，结合的核酸从所述膜上释放出来。
37.权利要求33至36中任一项所述的方法，其中将所述样品中的所述核酸通过微流体通道转运到所述膜，通过微流体通道从所述膜转运到所述扩增室，并通过微流体通道从所述扩增室转运到所述传感器表面。
38.权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述传感器包括巨磁电阻(GMR)传感器。
39.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体包含至少一个单核苷酸多态性(SNP)。
40.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体包含至少一个单核苷酸突变。
41.权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体包含至少一个单核苷酸缺失或插入。
42.权利要求1至41中任一项所述的方法，其中使捕获的扩增子与缓冲液进行流体接触，并且在(e)的检测之前或期间，所述缓冲液中正电荷阳离子的浓度降低至少50％。
43.权利要求42所述的方法，其中所述正电荷阳离子包括钠、钾、钙或镁。
44.权利要求1至43中任一项所述的方法，其中对所述第一基因变体的检测灵敏度低于每mL样品15个拷贝。
45.权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述方法检测所述样品中浓度低至所述靶序列的1％的所述第一基因变体的存在。
46.权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述方法在微流控装置中进行。
47.一种用于实施权利要求1至46中任一项所述方法的微流控装置，所述装置包含：
(a)微流体通道；
(b)第一腔室，其包含膜；
(c)扩增室；
(d)3个或更多个微型电磁阀；和
(e)传感器，其包括含有多个捕获核酸的表面；
其中所述微流体通道与所述第一腔室、所述扩增室、所述3个或更多个阀门和所述传感器可操作地连接和/或流控地连接。
48.权利要求47所述的微流控装置，其中所述传感器是磁性传感器。
49.权利要求46或47所述的微流控装置，其还包含样品端口和一个或多个包含洗涤缓冲液的洗涤室，其中所述样品端口和一个或多个洗涤室可操作地和/或流控地连接至所述微流体通道和所述第一腔室。
50.权利要求47至49中任一项所述的微流控装置，其还包含含有磁性颗粒的第二腔室，其中所述第二腔室可操作地和/或流控地连接至所述微流体通道和所述磁性传感器。
51.权利要求47至50中任一项所述的微流控装置，其中所述磁性传感器安装在第三腔室内。
52.权利要求47或51中任一项所述的微流控装置，其还包含一个或多个废物收集室，其中所述一个或多个废物收集室可操作地和/或流控地连接至所述微流体通道。
53.权利要求47或52中任一项所述的微流控装置，其还包含可操作地连接至所述扩增室的第一热源。
54.权利要求47或53中任一项所述的微流控装置，其还包含可操作地连接至所述扩增室的冷却源。
55.权利要求47或54中任一项所述的微流控装置，其还包含第二热源，所述第二热源可操作地连接至所述磁性磁电阻传感器和/或所述第三腔室。
56.权利要求47或55中任一项所述的微流控装置，其中所述微流体通道可操作地连接至一个或多个隔膜泵或真空泵。
57.权利要求47或56中任一项所述的微流控装置，其中所述微流控装置包含一个或多个电接触焊盘，其可操作地连接至三个或更多个阀门。
58.权利要求47或57中任一项所述的微流控装置，其中所述微流控装置包含存储芯片。
59.权利要求47或58中任一项所述的微流控装置，其中所述微流控装置的长度为3至10cm，宽度为1至5cm，并且厚度为0.1至0.5cm。
60.权利要求47或59中任一项所述的微流控装置，其中所述微流控装置包含或组成为自备的盒或卡板，所述盒或卡板包含冻干的扩增试剂和冻干的磁性珠。
61.一种检测样品中的包含至少一种靶核酸的至少一种基因变体的方法，所述样品包含或疑似包含所述至少一种基因变体，所述方法包括：
(a)提供所述样品；
(b)使所述样品与(i)第一引物或多种不同第一引物和(ii)第二引物或多种不同第二引物以及(iii)聚合酶接触，其中每种第二引物包含结合对第一成员；
(c)扩增所述至少一种基因变体，由此提供所述至少一种基因变体的扩增子；
(c)使所述扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同的基因变体互补的序列，由此提供包含所述结合对第一成员的可区分的捕获的扩增子；
(d)使所述可区分的捕获的扩增子与包含所述结合对第二成员的第一可检测标记物接触；和
(e)检测所述第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
62.权利要求61所述的方法，其中(e)的检测包括检测所述传感器表面处所述第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
63.权利要求61或62中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括动态检测过程。
64.权利要求63所述的方法，其中所述动态检测过程包括在(e)的检测期间，升高所述传感器处或其附近、或者所述传感器表面处的温度。
65.权利要求63或64所述的方法，其中所述动态检测过程包括在(e)的检测期间，改变所述传感器处或其附近、或者所述传感器表面处的盐或阳离子浓度。
66.权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述动态检测过程包括在(e)的检测期间，使流体流过所述传感器表面。
67.权利要求61至66中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括检测与每种不同捕获核酸结合的一个或多个可区分扩增子的结合，由此将一种基因变体与另一种基因变体区分开来。
68.权利要求62至67中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括检测与所述传感器表面结合的可区分扩增子的量的变化。
69.权利要求62至68中任一项所述的方法，其中所述传感器包括磁性传感器，所述第一可检测标记物包含磁性颗粒，并且(e)的检测包括检测所述磁性传感器表面处或其附近磁电阻的存在、不存在、量或变化。
70.权利要求69所述的方法，其中(e)的检测包括检测所述传感器表面处磁电阻的变化。
71.权利要求61至70中任一项所述的方法，其中不同第一引物和第二引物中的每一种包含5'-磷酸化核苷酸。
72.权利要求61至71中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含一个或多个锁核苷酸。
73.权利要求70至72中任一项所述的方法，其中检测磁电阻的变化包括将所述表面的温度升高至少5℃，同时在升高温度之前、期间和/或之后检测所述传感器表面处的磁电阻。
74.权利要求61至73中任一项所述的方法，其中在(b)之后，使所述可区分的扩增子与5'-3'外切核酸酶接触。
75.权利要求61至74中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸的长度范围为9至30个寡核苷酸。
76.权利要求61至75中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含至少50℃、至少55℃或至少65℃的解链温度。
77.权利要求61至76中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含至少3个锁核苷酸。
78.权利要求61至77中任一项所述的方法，其中根据在(e)中检测到的磁电阻变化来确定所述靶核酸中所述至少一种基因变体的存在。
79.权利要求62至78中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括将所述传感器表面处所述至少一种基因变体的存在、不存在或量相比于所述传感器表面处另一种基因变体的存在、不存在或量进行区分。
80.权利要求62至79中任一项所述的方法，其中(e)的检测包括将所述传感器表面处至少一种基因变体的存在、不存在或量相比于所述传感器表面处另一种核酸的存在、不存在或量进行区分。
81.权利要求61至80中任一项所述的方法，其中所述结合对第一成员包含生物素，而所述结合对第二成员包含链霉亲和素。
82.权利要求61至81中任一项所述的方法，其中(b)的扩增包含聚合酶链式反应。
83.权利要求82所述的方法，其中(b)的扩增包含至少20个或至少50个聚合酶链式反应循环。
84.权利要求61至83中任一项所述的方法，其中对从受试者获取的样品实施所述方法，其中所述样品包含或疑似包含所述至少一种基因变体。
85.权利要求84所述的方法，其中所述样品包含游离DNA。
86.权利要求61至85中任一项所述的方法，其中在(a)之前，使所述样品与微流体通道接触，其中所述微流体通道可操作地和/或流控地连接至所述传感器。
87.权利要求61至86中任一项所述的方法，其中在(a)之前，使所述样品与膜接触，所述膜被配置为可逆地和/或非特异性地结合所述样品中的核酸，由此提供结合的核酸，其中所述膜可操作地和/或流控地连接至所述微流体通道和所述传感器。
88.权利要求61至87中任一项所述的方法，其中在扩增室内进行(b)的扩增，所述扩增室可操作地和/或流控地连接至微流体通道、所述传感器和任选地连接至膜。
89.权利要求61至88中任一项所述的方法，其中在(a)之前，所述方法包括(i)使所述样品与(i)细胞裂解溶液、(ii)膜、(iii)任选地洗涤溶液和(iv)洗脱缓冲液接触，其中在(iv)的接触之后，结合的核酸从所述膜上释放出来。
90.权利要求87至89中任一项所述的方法，其中将所述样品中的核酸通过所述微流体通道转运到所述膜，通过所述微流体通道从所述膜转运到所述扩增室，并通过所述微流体通道从所述扩增室转运到所述传感器表面。
91.权利要求61至90中任一项所述的方法，其中所述传感器包括巨磁电阻(GMR)传感器。
92.权利要求61至91中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包含至少一个单核苷酸多态性(SNP)。
93.权利要求61至92中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包含至少一个单核苷酸突变。
94.权利要求61至93中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包含至少一个单核苷酸缺失或插入。
95.权利要求61至94中任一项所述的方法，其中使捕获的扩增子与缓冲液进行流体接触，并且在(e)的检测之前或期间，所述缓冲液中正电荷阳离子的浓度降低至少50％。
96.权利要求95所述的方法，其中所述正电荷阳离子包括钠、钾、钙或镁。
97.权利要求61至96中任一项所述的方法，其中对所述至少一种基因变体的检测灵敏度低于每mL样品15个拷贝。
98.权利要求61至96中任一项所述的方法，其中所述方法检测到所述样品中浓度低至所述靶序列的1％的至少一种基因变体的存在。
99.权利要求61至98中任一项所述的方法，其中所述方法在微流控装置中进行。
100.一种检测靶核酸中第一基因变体的存在的方法，包括：
(a)使所述靶核酸与(i)第一引物、(ii)第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸进行接触，其中所述阻断寡核苷酸包含与所述靶核酸的第二基因变体互补的序列，并且所述第一和第二引物被配置为用于扩增所述靶核酸，并扩增所述靶核酸，由此提供所述靶核酸的扩增子，其中在微流控装置的扩增室内进行扩增；
(b)使扩增子与多个捕获核酸进行接触，由此提供捕获的扩增子，其中(i)所述捕获核酸附着于磁性传感器的表面，(ii)(b)的接触包括将所述扩增子通过第一微流体通道转运至所述磁性传感器，(iii)所述第一微流体通道和所述磁性传感器布置在所述微流控装置内，和(iv)每个所述捕获核酸包含与所述靶核酸的所述第一基因变体互补的序列；
(c)使所述捕获的扩增子与多个磁性颗粒进行接触，其中所述磁性颗粒布置在所述微流控装置的第一腔室内，并且(c)的接触包括将所述磁性颗粒通过第二微流体通道从所述第一腔室转运至所述传感器；
(d)用洗涤溶液清洗所述传感器，其中所述洗涤溶液布置在所述微流控装置的第二腔室内，并且所述清洗包括将所述洗涤溶液通过第三微流体通道从所述第二腔室转运至所述传感器；和
(e)检测与所述传感器表面缔合的一个或多个所述磁性颗粒的存在、不存在、量，其中在(d)之前、期间和/或之后执行所述检测。
101.一种检测样品中包含至少一种靶核酸的至少一种基因变体的方法，所述样品包含或疑似包含所述至少一种基因变体，所述方法包括：
(d)提供所述样品；
(e)使所述样品与(i)多种不同第一引物和(ii)多种不同第二引物以及(iii)聚合酶接触，其中每种第二引物包含结合对第一成员；
(f)扩增所述至少一种基因变体，由此提供所述至少一种基因变体的扩增子，其中在微流控装置的扩增室内进行所述扩增；
(b)使所述扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同的基因变体互补的序列，由此提供可区分的捕获的扩增子，其中(i)所述捕获核酸附着于磁性传感器的表面，(ii)(b)的接触包括将所述可区分的捕获的扩增子通过第一微流体通道转运至所述磁性传感器，(iii)所述第一微流体通道和所述磁性传感器布置在所述微流控装置内，和(iv)每种捕获核酸包含与所述靶核酸的所述至少一种基因变体互补的序列；
(c)使所述可区分的捕获的扩增子与多个磁性颗粒进行接触，其中所述磁性颗粒布置在所述微流控装置的第一腔室内，并且(c)的接触包括将所述磁性颗粒通过第二微流体通道从所述第一腔室转运至所述传感器；
(d)用洗涤溶液清洗所述传感器，其中所述洗涤溶液布置在所述微流控装置的第二腔室内，并且所述清洗包括将所述洗涤溶液通过第三微流体通道从所述第二腔室转运至所述传感器；和
(e)检测与所述传感器表面缔合的一个或多个磁性颗粒的存在、不存在、量，其中在(d)之前、期间和/或之后执行所述检测。
102.一种在多重检测方案中检测至少两种不同靶核酸中至少两种不同基因变体的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中至少两个所述GMR传感器包含至少两种不同捕获核酸，所述捕获核酸被布置在所述至少两个(GMR)传感器的功能化表面上，其中不同捕获核酸的每种都与所述至少两种基因变体中的一种互补；
(b)使所述至少两种不同靶核酸中的每一种与(i)第一引物或多种不同第一引物、(ii)包含结合对第一成员的第二引物或多种不同第二引物、(iii)聚合酶和(iv)阻断寡核苷酸进行接触，其中所述阻断寡核苷酸包含与所述靶核酸的基因变体互补的序列，并且所述第一和第二引物被配置为用于扩增所述至少两种靶核酸，并扩增所述至少两种靶核酸，由此提供所述至少两种靶核酸的扩增子，
(c)使所述扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中不同捕获核酸的每种包含与一类基因变体中不同的基因变体互补的序列，由此提供包含所述结合对第一成员的可区分的捕获的扩增子；
(d)使所述可区分的捕获的扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的多个第一可检测标记物进行接触；和
(e)检测所述第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
103.一种在多重检测方案中检测样品中包含至少一种靶核酸的至少一种基因变体的方法，所述样品包含或疑似包含所述至少一种基因变体，所述方法包括：
(a)提供在空间上布置的巨磁电阻(GMR)传感器，其中至少两个所述GMR传感器包含至少两种不同捕获核酸，所述捕获核酸被布置在至少两个(GMR)传感器的功能化表面上，其中所述不同捕获核酸的每种都与至少两种基因变体中的一种互补；
(b)提供所述样品；
(c)使所述样品与(i)多种不同第一引物和(ii)多种不同第二引物以及(iii)聚合酶接触，其中每种第二引物包含结合对第一成员；
(d)扩增所述至少一种基因变体，由此提供所述至少一种基因变体的扩增子；
(c)使所述扩增子与多种不同捕获核酸进行接触，其中每种不同捕获核酸包含与一类基因变体中不同的基因变体互补的序列，由此提供包含所述结合对第一成员的可区分的捕获的扩增子；
(d)使所述可区分的捕获的扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的多个第一可检测标记物进行接触；和
(e)检测所述第一可检测标记物的存在、不存在、量或其变化。
104.根据权利要求1至46和61至103中任一项所述的方法，其还包括放大通过执行检测步骤测量的检测信号，包括在执行所述检测步骤之前：
(a)使所述捕获的扩增子与包含磁性颗粒和结合对第二成员的第二可检测标记物进行接触，其中所述第一可检测标记物通过第一和第二可检测标记物的所述第一和第二结合对之间的相互作用与所述第二可检测标记物缔合；
由此放大在执行所述检测步骤时测量的所述检测信号。
105.权利要求1至60和100中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体和所述第二基因变体各自包含等位基因变体。
106.权利要求61至99、101和103中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包含等位基因变体。
107.权利要求102所述的方法，其中所述至少两种基因变体包含等位基因变体。
108.权利要求1至46和61至107中任一项所述的方法，其中检测到的每种基因变体使样品中存在的一种生物体与另一种生物体区分开来。
109.权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体包括至少两个单核苷酸多态性(SNP)。
110.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体包括至少两个单核苷酸突变。
111.权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述第一基因变体包括至少两个单核苷酸缺失或插入。
112.权利要求61至91中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包括至少两个单核苷酸多态性(SNP)。
113.权利要求61至92中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包括至少两个单核苷酸突变。
114.权利要求61至93中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因变体包括至少两个单核苷酸缺失或插入。
115.权利要求1-46和61至114中任一项所述的方法，其中所述第二引物包含5Biosg/ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC(SEQ ID NO:7)。
116.权利要求1-46和61至115中任一项所述的方法，其中所述第一引物包含/5Phos/AGGCCTGCTGAAAATGACTG(SEQ ID NO:8)。
117.权利要求1-46和61至116中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含5’–C+T+G+G+T+G+G+C+G+T+A-3’(SEQ ID NO:9)。
118.权利要求1-46和61至117中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含下列中的至少一种：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAGCTG+CTGGCGTAG(SEQ ID NO:13)；或
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)。
119.权利要求1-46和61至118中任一项所述的方法，其中多种捕获核酸包括下列中的至少一种：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)。
120.权利要求1-46和61至119中任一项所述的方法，其中多种捕获核酸选自由下列组成的组：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+ATG+GCGTAG(SEQ ID NO:10)，
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CTG+TT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:11)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+TGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:12)
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTTGGAG+CT+AGT+GGC+GTAG(SEQ ID NO:14)。
121.权利要求1-46和61至115中任一项所述的方法，其中所述第一引物包含下列中的至少一种：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)；/5phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)；或5phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)。
122.权利要求1-46、61至115和121中任一项所述的方法，其中所述第一引物选自由下列组成的组：/5Phos/GGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGC(SEQ ID NO:17)；/5phos/CGATAACGAACGAGACCTTAACC(SEQ ID NO:20)；和5phos/CAGGTCTGTGATGCCCTTAG(SEQ ID NO:21)。
123.权利要求1-46、61至117、121和122中任一项所述的方法，其中所述第二引物包含下列中的至少一种：/5biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(Seq 18)；5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)；或5Biosg/CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)。
124.权利要求1-46、61至117、121-123中任一项所述的方法，其中所述第二引物选自由下列组成的组：/5biosg/GGCTTGAGCCGATAGTCCC(Seq 18)；5Biosg/GCCTCAAACTTCCATCGACTTC(SEQ ID NO:19)；和5Biosg/CAATGCTCTATCCCCAGCAC(SEQ ID NO:22)。
125.权利要求1-46、61至117和121-124中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸包含下列中的至少一种：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:30)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:31)；或
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)。
126.权利要求1-46、61至117和121-125中任一项所述的方法，其中所述捕获核酸选自由下列组成的组：
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTGCTGCCAGCGCGCCTCTTG(SEQ ID NO:23)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACCGACCC+ACGT+TTG+TGG(SEQ ID NO:24)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGA+CCCGCGT+CTG+CG(SEQ ID NO:25)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACGAGACCT+CG+GCCCTTAA(SEQ ID NO:26)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACTGACG+GA+GCCAGC(SEQ ID NO:27)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGAGTCTTA+CC+GC+CTTGGC(SEQ ID NO:28)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGCCAGC+AA+GT+T+CATTTCC(SEQ ID NO:29)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACT+TC+C+TT+GGCCGAAAG(SEQ ID NO:30)；
/5AmMC6/AAAAAAAAAACACT+GA+TG+AA+G+TCAGCG(SEQ ID NO:31)；和
/5AmMC6/AAAAAAAAAAGTACATCA+CCTTGG+CCG(SEQ ID NO:32)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115427826A (zh) * 2020-01-17 2022-12-02 泽普托生命技术有限责任公司 基于gmr的生物标志物检测中分析物的传感系统和方法
CN116609525A (zh) * 2023-05-26 2023-08-18 杭州圣域生物医药科技有限公司 基于细胞内aldh3b1蛋白水平以筛选染色质重塑复合体抑制剂的方法
CN119633122A (zh) * 2024-12-24 2025-03-18 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） Slc35e2b在治疗肥胖中的应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022240756A1 (en) * 2021-05-11 2022-11-17 Magarray, Inc. Systems and methods for rapid measurement of magnetic nanoparticles in magnetic biosensors
WO2023003534A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Nucleic acid testing devices including an actuating reagent chamber
US20240401122A1 (en) * 2021-09-13 2024-12-05 Nexgen Cancer Detection Llc Methods for detecting a target polynucleotide in a sample
WO2024168304A1 (en) * 2023-02-09 2024-08-15 Savran Technologies, Inc. Isolation of podocytes from samples
WO2024191817A2 (en) * 2023-03-10 2024-09-19 Nexgen Cancer Detection Llc Methods for enriching and detecting a target polynucleotide in a sample
CN119351541B (zh) * 2024-10-28 2025-12-09 南京市妇幼保健院 一种子痫前期诊疗生物学标志物及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
US20140248612A1 (en) * 2011-08-18 2014-09-04 Nestec S.A. Compositions and methods for detecting allelic variants
US20150176065A1 (en) * 2013-06-28 2015-06-25 Michael J. Powell Detection of pna clamping
US20160011182A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 Zepto Life Technology, LLC Method and system for substance detection with a magnetic sensor
US20160209405A1 (en) * 2014-04-02 2016-07-21 Regents Of The University Of Minnesota Magnetic detection of mercuric ion using giant magnetoresistive based biosensing system

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11560588B2 (en) * 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
EP2248915B1 (en) * 2009-05-05 2013-09-18 Qiagen GmbH Detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction cartridge
US20140193819A1 (en) * 2012-10-31 2014-07-10 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for modulation of amplification efficiency
US10400277B2 (en) * 2014-06-10 2019-09-03 Diacarta Ltd DNA mutation detection employing enrichment of mutant polynucleotide sequences and minimally invasive sampling
SMT202200177T1 (it) * 2014-09-26 2022-05-12 Janssen Pharmaceutica Nv Uso di gruppi di geni mutanti del fgfr nell'identificazione di pazienti affetti da cancro che saranno responsivi al trattamento con un inibitore del fgfr
CN110678557A (zh) * 2017-03-31 2020-01-10 玛赛拉·基亚里 通过管内杂交与通用标签-微阵列的组合的突变的基因分型
CN107513577A (zh) * 2017-10-19 2017-12-26 南京科维思生物科技股份有限公司 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5683875A (en) * 1995-05-04 1997-11-04 Hewlett-Packard Company Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample
US20140248612A1 (en) * 2011-08-18 2014-09-04 Nestec S.A. Compositions and methods for detecting allelic variants
US20150176065A1 (en) * 2013-06-28 2015-06-25 Michael J. Powell Detection of pna clamping
US20160209405A1 (en) * 2014-04-02 2016-07-21 Regents Of The University Of Minnesota Magnetic detection of mercuric ion using giant magnetoresistive based biosensing system
US20160011182A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 Zepto Life Technology, LLC Method and system for substance detection with a magnetic sensor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIOVANNI RIZZI等: "Denaturation strategies for detection of double stranded PCR products on GMR magnetic biosensor array", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 93, 15 July 2017 (2017-07-15), pages 155 - 160, XP055902769, DOI: 10.1016/j.bios.2016.09.031 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115427826A (zh) * 2020-01-17 2022-12-02 泽普托生命技术有限责任公司 基于gmr的生物标志物检测中分析物的传感系统和方法
CN116609525A (zh) * 2023-05-26 2023-08-18 杭州圣域生物医药科技有限公司 基于细胞内aldh3b1蛋白水平以筛选染色质重塑复合体抑制剂的方法
CN116609525B (zh) * 2023-05-26 2023-10-27 杭州圣域生物医药科技有限公司 基于细胞内aldh3b1蛋白水平以筛选染色质重塑复合体抑制剂的方法
CN119633122A (zh) * 2024-12-24 2025-03-18 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） Slc35e2b在治疗肥胖中的应用

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