CN115335079A

CN115335079A - 基于外泌体递送nf-kb抑制剂的用途

Info

Publication number: CN115335079A
Application number: CN202180024099.7A
Authority: CN
Inventors: 崔哲熙; 崔暻善; 俞在光
Original assignee: Elias Biological Products Co ltd
Current assignee: Elias Biological Products Co ltd
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2022-11-11
Also published as: WO2021198961A1; JP2023519700A; JP7498293B2; AU2021247253A1; AU2021247253B2; KR20220149781A; EP4127136A1; KR20210124180A; KR102852789B1; CA3173845A1; EP4127136A4

Abstract

本公开涉及使用包含NF‑κB抑制剂的外泌体治疗急性肾损伤的方法。本公开涉及使用包含NF‑κB抑制剂的外泌体治疗脓毒症诱导的疾病的方法。

Description

基于外泌体递送NF-KB抑制剂的用途

技术领域

本公开涉及使用包含NF-κB抑制剂的外泌体治疗急性肾损伤的方法。本公开涉及使用包含NF-κB抑制剂的外泌体治疗脓毒症诱导的疾病的方法。

背景技术

AKI不仅促进短期不良结果，而且生存者可能要遭受慢性肾病(CKD)并且甚至是终末期肾病(ESRD)。作为发病机制中最重要因素之一，NF-κB的系统性抑制影响AKI的严重程度。由叶酸诱导的疾病模型中，NF-κB的抑制通过降低RelA和NF-κB2的活化来缓解AKI损伤。

已知超过800种合成和天然材料部分地涉及调节NF-κB活化。一些研究已经显示NF-κB信号转导阻断，诸如肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)阻断或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)阻断剂，能够缓解肾脏损伤。然而，他们的作用机制是多向性的并且缺乏特异性。纳米技术的最近进展使得产生特异性基因序列或者纳米颗粒以靶向NF-κB信号转导成为可行。然而，尚没有商业上批准用于人类使用的NF-κB抑制剂。

失控性炎症是脓毒性反应的显著特征。由Toll样受体(TLR)调控的宿主-病原相互作用刺激促炎症细胞因子、趋化因子和免疫激活分子的产生。该促炎症反应之后是涉及到免疫细胞的各种数量上和功能上缺陷的补偿性免疫抑制反应。病原诱导细胞修饰伴随着宿主基因表达的显著变化，核因子κB(NF-κB)转录因子在调控这些变化上起着首要作用。包括肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1的几种受NF-κB调节控制的细胞因子能够诱导转录因子的进一步激活，导致炎症反应和脓毒性休克的加强。此外，NF-κB涉及细胞凋亡反应，主要通过增强抗凋亡基因诸如Bcl-x_L、A1和A20的转录。因此，通过促炎症介质的增加表达和被激活产生促炎症分子并且直接参与急性炎症过程的细胞群体诸如中性粒细胞的延长的生命周期的两种相互作用机制能够加重与NF-κB激活相关的炎症。

存在脓毒症引发的多种疾病，诸如肺炎、细胞因子风暴综合征、呼吸窘迫综合征和器官衰竭。脓毒症是由于急性微生物感染而激活先天性免疫系统从而引发的全身炎症反应综合征，并且一直是重症监护室中死亡的主因。而且，由脓毒症引发的各种疾病具有截然不同的症状，有些症状是致命性的。很不幸，脓毒症的一般治疗(即抗生素)可能对于治疗由脓毒症引起的不同疾病，诸如细胞因子综合征和受损器官没有效果。当前，对于由脓毒症引起的疾病并没有临床有用的治疗。因此，迫切需要有效的替替代治疗的开发。尽管已经报告有超过700种NF-κB的抑制剂，目前尚无抑制剂被批准作为治疗剂。而且，已知各种甾族和非甾族抗炎剂阻滞NF-κB，但是他们抑制NF-κB的作用并没有特异性。

成功的基因和药物递送需要选择合适的载体，以用于稳定地递送靶分子至作用部位，且不引起接受者的不良反应。据报道，包括重组腺病毒、脂质体、配体缀合纳米颗粒和超声微泡的各种类型的载体对药物递送有效，得益于其稳定性和高的载荷能力。然而，他们的应用仍涉及一些担忧和受限。尽管他们能够被网状内皮系统快速识别和清理，他们的不一致的粒度尺寸和非特异性的摄取模式限制了他们作为生物载体的应用。腺病毒载体的高免疫原性在给药后可能引发免疫应答，并且病毒本身在大剂量时可能有毒。脂质体的应用也可能诱导不利的免疫原性反应和非IgE介导的超敏反应。

当前的递送治疗蛋白的传统策略包括在合成纳米颗粒内包封该蛋白。最优选的蛋白递送系统是脂质体和聚合物纳米颗粒(PNP)。脂质体是具有在水环境下自组装成各种尺寸和形状的磷脂膜的合成囊泡。PNP是大小在10-1000nm之间的固体胶体颗粒，并且由可生物降解的聚合物制成，其中，货物蛋白可以陷入、封装或附着于纳米颗粒基质。然而，脂质体趋向于相互融合或聚集，导致脂质体货物经过一段时间提前释放。PNP可以比脂质体具有更好的稳定性，但是他们的生物相容性和长期潜在安全性仍旧是个问题。此外，包封蛋白至脂质体和PNP需要合成或重组蛋白的生成以及离体封装过程，而EXPLOR技术需要能够经过天然外泌体生物合成来产生载货物的外泌体的稳定细胞的生成和维持。此外，外泌体具有很多理想蛋白递送系统的期望特征，诸如生物相容性、最小或没有固有毒性、在循环中的长半衰期和靶向组织的内在能力。

近来，外泌体作为用于基因/药物递送的新生物载体已经引起极大关注。外泌体是在细胞-细胞交流中起重要作用的细胞外囊泡(EV)，其细胞交流通过传递生物活性物质到受体细胞或者影响靶细胞的信号通路。相较于其他生物活性剂，外泌体更易于存储并且展示出更大稳定性。外泌体具有克服生物屏障的高能力，并且能够载有靶向特定细胞类型的表面分子，因此，更少地引起脱靶效应。

发明内容

本公开提供治疗有需要的受试者急性肾损伤(AKI)的方法，包括：向所述受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

本公开还提供治疗有需要的受试者的脓毒症引发疾病的方法，包括：向所述受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

附图说明

图1.从HEK293T生产的工程化外泌体的表征

(A)用于生产负载超阻遏物-IκB的外泌体(Exo-srIκB)的DNA构建体的(上)和使用光可逆蛋白质-蛋白质相互作用(被称为EXPLOR技术)生物合成携带货物蛋白外泌体(下)的示意图。(B)Exo-天然

和Exo-srIκB的代表性TEM图像。比例尺：100nm。(C)Exo-天然(上)和Exo-srIκB(下)的浓度和尺寸分布通过Zetaview仪器确定。(D)对HEK293T细胞和HEK293T细胞源性外泌体进行免疫印迹以分析靶蛋白(srIκB、mCherry、CD9和GFP)、外泌体阳性标志物(CD63、TSG101、Alix和GAPDH)和外泌体阴性标志物(细胞器标志物；抗增殖蛋白、钙联蛋白、GM130和核孔蛋白p62)的表达。天然细胞和Exo-天然用作Exo-srIκB的阴性对照。

图2.Exo-srIκB在肾脏IRI后的肾保护作用

(A)肾脏IRI手术和外泌体递送的实验方案。以1h间隔，向每个小鼠组腹腔内注射三次3×10⁹pn Exo-天然或Exo-srIκB(总计9×10⁹pn)。在IRI手术后或者24h或者48h杀死小鼠，并且收集血清和组织用于进一步评价。(B-D)依据处理类型(Exo-天然对比Exo-srIκB)、药物递送时机(预处理对比后处理)和随访时间点(24-h和48-h)的不同组之间的BUN、肌酐和NGAL的血清水平，其显示了Exo-srIκB处理的肾保护作用(预处理24-h，n＝10；预处理48-h，n＝4-5；后处理24-h，n＝5-10；后处理48-h，n＝4-11)。(E)左：来自各组的肾切片中的皮质管状细胞的代表性PAS染色图像。常规近侧管状刷毛缘(*)或刷毛缘缺失(ο)；染色质凝集(黑色箭标)；裸露的基底膜(黑色箭头)；空泡化(黄色箭标)；比例尺，100μM。右：病理性管状损伤；每一组的多份肾脏样品显示Exo-srIκB处理下的管状损伤比Exo-天然处理的管状损伤要少(预处理24-h,n＝5；后处理24-h,n＝5)。使用单向ANOVA以及Bonferroni事后检验评估各个组之间的比较。数据作为平均±SD值呈现。***P<0.001，针对Exo-天然-假处理组与Exo-天然-IRI手术组的比较。#P<0.05和###P<0.001，针对Exo-天然-IRI手术组与Exo-srIκB-IRI手术组的比较。

图3.Exo-srIκB后处理对IRI诱导的NF-κB激活的抑制

(A)使用来自每个实验小鼠组的肾细胞核提取物进行NF-κB p65表达的蛋白质印迹分析。细胞核提取物与胞质组分生物化学分离，并且通过蛋白质印记分析NF-κB p65和核纤层蛋白B1表达。围手术期的Exo-srIκB处理情况下，IRI诱导的NF-κB信号转导激活被显著抑制。(B)用围手术期的Exo-srIκB处理抑制肾IRI后NF-κB p65的升高的DNA结合活性。(C)左：具有来自每个处理组的NF-κB p65抗体的代表性IHC图像。比例尺，50μM。右：显示每一实验组中的NF-κB p65的免疫组织化学检测的图示。与对照组的NK-κB表达相比，使用Exo-srIκB的处理降低NK-κB表达(预处理24-h,n＝5–8；预处理48-h,n＝4–5；后处理24-h,n＝5–10；后处理48-h,n＝4–11)。使用单向ANOVA以及Bonferroni事后检验评估各个组之间的比较。数据作为平均±SD值呈现。**P<0.01，***P<0.001，针对Exo-天然-假处理组与Exo-天然-IRI手术组的比较。#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，针对Exo-天然-IRI手术组对比与Exo-srIκB-IRI手术组的比较。

图4.Exo-srIκB局部和全身处理负面影响促炎症细胞因子/趋化因子和黏附分子的表达。

(A)来自各实验组的全肾脏裂解物用于qRT-PCR，以测量包括Il-1β、Il-6、Tnf-α、Ccl2、Ccl5和Cxcl2的促炎症细胞因子的表达水平。在肾脏的IR损伤后这些基因的mRNA水平显著地增加，并且使用Exo-srIκB处理缓解该作用。(预处理24-h,n＝5–8；预处理48-h,n＝4–5；后处理24-h,n＝5–10；后处理48-h,n＝4–11)。(B)使用来自每一实验组的血清的多重细胞因子研究也显示，用Exo-srIκB处理的缺血后小鼠组的促炎症细胞因子水平有着相似的降低趋势。(C)qRT-PCR数据显示了在缺血后Exo-天然处理组中增加的Icam-1的mRNA水平和用Exo-srIκB处理的Icam-1的mRNA的显著下降。(D)来自每一组的全肾脏裂解物的蛋白质印迹分析结果展示在使用Exo-srIκB处理的IR损伤肾脏中降低的ICAM-1表达。(E)展示ICAM-1 IHC染色的代表性肾脏切片(左)和ICAM-1 IHC的图示(右)显示Exo-srIκB处理降低C57BL/6J小鼠的缺血后肾脏的ICAM-1表达。比例尺，50μM(B-E:预处理24-h,n＝5；预处理48-h,n＝4–5；后处理24-h,n＝5；后处理48-h,n＝3–6).使用单向ANOVA以及Bonferroni事后检验评估各个组之间的比较。数据作为平均±SD值呈现。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，针对Exo-天然-假处理组与Exo-天然-IRI手术组的比较。#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，针对Exo-天然-IRI组与Exo-srIκB-IRI手术组的比较。

图5.Exo-srIκB处理改善IR诱导的肾脏细胞凋亡。

(A)左：来自每一实验组的肾脏中切割的caspase-3与切割的PARP蛋白的表达相比较的蛋白质印迹分析结果。右：图示显示，与使用Exo-天然处理比较，Exo-srIκB处理降低切割的caspase-3和切割的PARP的水平。(B)左：显示TUNEL染色的代表性图像(FITC标记的)。凋亡细胞是绿色(白色箭标)和用DAPI作为复染色。比例尺，50μM。右：显示来自每一组的肾脏切片中的TUNEL阳性细胞的柱图。Exo-srIκB处理诱导较少数量的凋亡细胞(前处理24-h,n＝5；前处理48-h,n＝4–5；后处理24-h,n＝5；后处理48-h,n＝3–6)。使用单向ANOVA以及Bonferroni事后检验评估各个组之间的比较。数据作为平均±SD值呈现。***P<0.001，针对Exo-天然-假处理组与Exo-天然-IRI手术组的比较。#P<0.05,##P<0.01,以及###P<0.001，针对Exo-天然-IRI与Exo-srIκB-IRI手术组的比较。

图6.肾缺血-再灌注损伤后外泌体的生物分布。

(a)活体成像和外泌体递送的实验方案。(b)连续活体成像显示用静脉内Exo-srIκB处理的缺血后肾脏中，DiD-标记的外泌体(绿色)摄取进入中性粒细胞(Ly6G⁺,红色)和巨噬细胞(F4/80⁺,蓝色)。白色箭标表示在被吞噬进免疫细胞中的DiD-标记的外泌体。白色虚线表示肾间质。(c)在肾IRI手术后在脾中的DiD-标记的外泌体(绿色)的生物分布显示在外部实质中外泌体被摄取进入中性粒细胞(Ly6G⁺,红色)和巨噬细胞(F4/80⁺,蓝色)中。指示了经过时间。比例尺，20μm。

图7.IR诱导的AKI后Exo-srIκB处理调节肾脏免疫细胞群体。

(A)手术后24h杀死小鼠。使用酶消化、机械破碎和Percoll密度梯度分离技术富集KMNC。使用那些方法确定的总肾脏细胞数量显示实验组之间没有统计学差异。(B)流式细胞仪分析的图示示出，使用酶消化、机械破碎和Percoll密度梯度分离技术的分离的肾脏细胞中，在IRI后肾脏CD45⁺细胞的更高的比例。Exo-srIκB处理缓解缺血后肾免疫细胞的激增。(C)用其他免疫细胞标志物进一步染色的结果显示，在缺血后肾脏中用Exo-srIκB处理降低了在富集的KMNC之中包括中性粒细胞(CD45⁺Ly6G⁺)、促-/抗-炎症单核吞噬细胞(CD45⁺Ly6C⁺/CD45⁺F4/80⁺)和T细胞(CD45⁺CD3⁺)的多系免疫细胞的频率。(D-F)对来自每一实验组的缺血后肾脏进行免疫荧光研究，靶向Ly6G、Ly6C和F4/80。缀合Alexa Fluor 647的二级抗体用于所有免疫荧光实验。数据显示在Exo-srIκB后处理的缺血后肾脏中Alexa Fluor 647染色细胞的降低的频率(白色箭标)，表明在Exo-srIκB处理的肾脏中存在更少的中性粒细胞(Ly6G⁺)和促-/抗-炎症单核吞噬细胞(Ly6C⁺/F4/80⁺)。使用LTL(绿色)和DAPI染色近端管状细胞用作复染色。比例尺，50μM。(每一实验组n＝5)。使用单向ANOVA以及Bonferroni事后检验评估各个组之间的比较。数据作为平均±SD值呈现。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，针对Exo-天然-假处理组与Exo-天然-IRI手术组的比较。#P<0.05，##P<0.01，针对Exo-天然-IRI手术组与Exo-srIκB-IRI手术组的比较。

图8.在缺血性AKI模型中，Exo-srIκB的静脉内递送与腹腔内递送相比较显示出相似的生物效应。

(a)肾脏IRI手术和外泌体递送的实验方案。每一小鼠组在再灌注后1h静脉内注射9×10⁹pn的Exo-天然、Exo-srIκB或者PBS。在IRI手术后24或者48h杀死小鼠，并且收集血清和组织用于进一步评价。(b-d)依据处理类型(PBS对比Exo-天然对比Exo-srIκB)和随访时间点(24-h和48-h)的不同组之间的BUN、肌酐和NGAL的血清水平，其显示Exo-srIκB处理的肾保护作用(每一实验组n＝5)。(e)使用来自每个实验小鼠组的肾细胞核提取物进行NF-κBp65表达的蛋白质印迹分析。细胞核提取物与胞质组分生物化学分离，并且通过蛋白质印记分析NF-κB p65和核纤层蛋白B1表达。术后期的Exo-srIκB处理情况下，IRI诱导的NF-κB信号转导激活被显著抑制。(f)术后期的Exo-srIκB处理抑制肾IRI后NF-κB p65的升高的DNA结合活性。(g)qRT-PCR数据显示了在缺血后Exo-天然处理组中增加的Icam-1的mRNA水平和用Exo-srIκB处理的Icam-1的mRNA的显著下降。(h)来自每一组的全肾脏裂解物的蛋白质印迹分析结果展示，在使用Exo-srIκB处理情况下，IR损伤肾脏中ICAM-1表达降低。使用单向ANOVA以及Bonferroni事后检验评估各个组之间的比较。数据表示为平均±SD值。ns；不显著，**P<0.01,***P<0.001,针对PBS-假处理与Exo-天然-IRI手术组的比较。#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，针对Exo-天然-IRI与Exo-srIκB-IRI手术组的比较。

图9(1).工程化外泌体的生成和表征

(A)用于生产负载超阻遏物IκB的外泌体(Exo-srIκB)(上)的DNA构建体的示意图。示意图显示融合蛋白和其提出的活性(下)。(B)通过透射电子显微镜(TEM)的Exo-天然和Exo-srIκB的形态表征(C)裂解稳定表达mCherry或srIκB的HEK293T细胞和来自这些HEK293T细胞的外泌体并针对表示的蛋白质进行免疫印迹。

图10(2).Exo-srIκB在内毒素血症和盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的脓毒症中的保护作用

(A)磷酸盐缓冲盐水(PBS)-处理、Exo-天然和Exo-srIκB处理的脓毒症小鼠的存活曲线。脂多糖(LPS)C57BL/6小鼠(n＝5-6/组),LPS BALB/c小鼠(n＝10/组),以及CLPC57BL/6小鼠(n＝14-15/组)。**p<0.01,*p<0.05，与PBS处理的脓毒症组相比。(B)在LPS注射或CLP后24h测量外泌体处理小鼠的血浆中的肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-1β和CCL4/巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β的水平。**p<0.01,*p<0.05，与PBS处理的脓毒症组相比。

与Exo-天然处理的脓毒症组相比。(C)来自假处理、用PBS的CLP、用Exo-天然的CLP和用Exo-srIκB的CLP的小鼠的肾脏切片中的皮质管状细胞的代表性图像。近侧管状的常规刷毛缘(*)或刷毛缘缺失(○)；染色质凝集(白色箭标)；裸露的基底膜(白色箭头)；空泡化(黄色箭标)；比例尺，100μM。(D)每一组的代表性肾脏样品的病理性肾脏损伤得分。*p<0.05，与PBS-处理脓毒症组相比。

与Exo-天然处理的脓毒症组相比。

图11(3).LPS-注射小鼠的外泌体生物分布

在假处理小鼠的肝脏中mCLING-标记的外泌体(红)摄取进入中性粒细胞(LysM^gfp ^/+,绿色；Ly6G⁺,蓝色)的活体成像。(B)在LPS-处理的C57BL/6小鼠的肝脏中在Ly6G⁺中性粒细胞内的mCLING-标记的外泌体(红)的代表性延时成像。(C)在假处理和LPS-处理的LysM^GFP/+小鼠的脾内部流动mCLING-标记的外泌体(红色)的连续成像。指示了经过时间。品红，自发荧光；比例尺，50μm。

图12(4).Exo-srIκB对核因子-κ-B(NF-κB)信号转导的抑制作用

(A)在Exo-天然或者Exo-srIκB 2x10⁵颗粒情况下培养HEK293-NF-κB-荧光素酶细胞(2x10⁴细胞)。24h后，用0.5ng/ml TNF-α再处理细胞18h。测量荧光素酶活性并归一化。(B)Exo-srIκB剂量-依赖性地阻遏NF-κB-荧光素酶细胞中NF-κB活化。(C)用1μg/ml LPS刺激THP-1细胞(5x10⁵细胞)并且然后用Exo-srIκBs 5x10⁶颗粒处理。收集上清液并测定TNF-α和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的生产。使用JSH-23(50μM)作为阳性对照。**p<0.01，(D)在mCLING-标记的Exo-srIκB情况下孵育的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的免疫荧光。示出代表性图像。用Hoechst标记胞核。(E)用300ng/ml LPS刺激HUVEC 24h。将细胞收获至单室悬浮液中并且用特异的藻红蛋白(PE)-缀合的抗人细胞间黏附分子(ICAM)-1抗体经流式细胞仪评估。

图13(S1).外泌体表征

(A)用于生产工程化外泌体的流程示意图。(B)演示在Exo-天然、Exo-mCherry和Exo-srIκB的稀释样品中相似尺寸的分布的纳米颗粒跟踪分析(NTA)代表性图。

图14(S2).Exo-srIκB在脓毒症小鼠模型中的抑制作用

(A)在野生型和LPS-处理的C57BL/6小鼠注射了指示的外泌体后，监测体温的变化。**<0.01，与PBS-处理的LPS组相比。(B)使用来自LPS和PBS(左)、Exo-天然(中)和Exo-srIκB(右)处理的C57BL/6(上小图)和BALB/c(下小图)小鼠的切片的肾皮质区的代表性图像。近侧管状的常规刷毛缘(*)或刷毛缘缺失(○)；染色质凝集(红色箭标)；裸露的基底膜(红色箭头)；空泡化(蓝色箭标)；比例尺，100μM。(C)LPS-诱导脓毒症小鼠的Exo-天然和Exo-srIκB-处理组之间每种器官中的浸润的Ly6G+细胞数量比较。(D)在PBS-、Exo-天然-和Exo-srIκB-处理脓毒症小鼠的血浆中测量IL-10水平。NS，不显著。

图15(S3).接受和未接受LPS攻击的小鼠的外泌体的生物分布

(A)在静脉内给药LPS后使用活体内成像系统检测的肾脏中mCLING-标记的外泌体的分析。

图16(S4).在HUVE中Exo-srIκB对LPS诱导的炎症反应的抑制作用(A)使用Exo-srIκBs 1x10⁷颗粒培养HUVEC(7x10⁴细胞)24h并且然后用36ng/ml的LPS刺激。24h后收集上清液并且分别测定IL-8(左)和MCP-1(右)的产生。使用JSH-23

作为阳性对照。***p<0.001，与二甲基亚砜(DMSO)相比较。#p<0.05，与仅用LPS处理的细胞相比较。(B)使用Exo-srIκBs预处理HUVEC 24h,然后经36ng/ml的LPS刺激1h。使用蛋白质印迹法评估p65和IκBα的蛋白质水平。使用GAPDH和组蛋白H3(HH3)作为用于胞质溶胶细胞裂解物和细胞核组分(左)的内源性对照。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)核NF-κB与其靶DNA序列5′-GGGACTTTCC-3′的结合(右)。

图17-20.Exo-srIκBs对LPS诱导脓毒症中的肺损伤的保护作用。

图17描述H&E染色，示出(1)肺泡；(2)毛细血管；(3)中性粒细胞；(4)肺泡巨噬细胞；(5)充血；(6)出血；(7)坏死。

图18描述假处理、天然外泌素和Exo-srIκB处理的脓毒症小鼠的存活曲线。

图19描述Exo-srIκB处理的脓毒症小鼠的血浆中TNF-α的水平。

图20描述H&E染色，显示(1)中央静脉；和(2)免疫细胞浸润。

具体实施方式

本公开提供EXPLOR技术(Yim et al.,Nature Communications 7,12277(2016),其用于将srIκB负载至外泌体内部并且全身递送Exo-srIκB,以评估他们对缺血性AKI进程的影响。通过使用蓝光照明诱导CRY2和CIBN的瞬时对接，使用生产两种重组蛋白CIBN-EGFP-CD9和srIκB-mCherry-CRY2的人胚肾(HEK)293T细胞系生产包含srIκB的外泌体(Exo-srIκB)(图1A)。从完整的HEK293T细胞生成对照外泌体(Exo-天然)。结果确定光遗传工程化的外泌体可以用作治疗剂,并且Exo-srIκB可以通过免疫应答调控和细胞凋亡缓解IR诱导的肾脏损伤。

除非本文另有指示或与上下文明确冲突，否则用于描述本公开(特别是在下面的权利要求的上下文中)的上下文中的术语“一个/种”(“a,”“an,”“the”)和类似指示词应被解释为包括单数和复数两者。本文引用的范围和数值仅仅意在作为一种单独地指向落入该范围的每一独立数值的简称方式。除非本文另外指示，否则每一独立数值都应当纳入本说明书之中，就如同该数值在本文中被单独应用。除非本文另外指示或另外与上下文明显冲突，否则本文描述的所有方法能够以任何合适的顺序实施。本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“诸如”(such as))的应用仅仅旨在更好地解释本公开并且不对本公开另外请求的范围产生限制。说明书中的语言都不应当被解释为暗示任何对本公开的实现的所必要的非请求元素。

如本文所使用，术语“约”意指修饰，例如核苷酸序列的长度、误差的程度、规模、成分在组合物中的数量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产量、流速、压力等数值，以及其范围，指可能发生的数量中的变化，例如，在用于制造化合物、组合物、浓缩物或使用配方的典型测量和处理程序之中；在这些程序之中的意外错误；在用于执行所述方法的原始材料或配料的生产、取料或纯度方面的差异之中；以及类似的考虑因素。术语“约”也包含由于例如，或组合物、制剂或在特定初始浓度的细胞培养物或混合物的老化而变动的量，以及由于组合物或具有特定初始浓度的制剂或混合物的混合或处理而变动的量。无论是否被术语“约”修饰，本文所附权利要求包括这些数量的等效物。术语“约”进一步可以指与所陈述的参考数值相似的数值的范围。在某些实施方式中，术语“约”指落入百分之50、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或小于所陈述的参考值的数值范围。

如本文使用的，术语“受试者”指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。

AKI

根据NF-κB信号转导的免疫应答可能涉及AKI,并且Exo-srIκB可能产生改善由脓毒症引发的肾脏损伤中的肾脏损伤的作用。在本文的一些实施例中，评估给药抑制剂是否能够缓解缺血性AKI的进程。在本文的一些实施例中，在IRI之前和之后使用EXPLOR技术将srIκB递送至小鼠，并且其结果与对照组相比较。因此，已被确认的是，与对照组相比较，Exo-srIκB-处理的小鼠展示出血清和肌酐的较低水平，因此产生了对IR诱导的AKI的预防和治疗作用。另一方面，对局部给药Exo-srIκB是否影响肾脏的NF-κB信号的检查结果为，发现与对照组相比较，Exo-srIκB显著地降低NF-κB的核易位和核结合活性。NF-κB通路可能在免疫应答中起着重要的作用。比较在Exo-srIκB处理组和对照组中泛-炎症细胞因子/趋化因子的基因表达的结果为，确定了IL-1β、IL-6，包括CCL2、CCL5、CXCL2和TNF-α的炎症介质的显著下降。最终，在本文的实施例中，进行流式细胞术分析，以对比是否NF-κB抑制剂处理影响肾免疫细胞的群体，并且观测到包括中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和T细胞的多种免疫细胞群体的频率的显著下降。

IRI可以诱导炎症级联反应和氧化应激，引起细胞因子风暴，导致细胞凋亡和对临近组织的结构伤害。NF-κB信号通路可以调节在快速响应IRI刺激中的细胞存活和炎症，特别是来自缺氧/再灌注的早期阶段期间的受损细胞的高水平。例如，释放一些内源性因子诸如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、热激蛋白(HSP)和病原-/损伤相关分子模式(PAMPs/DAMPs)。这些内源性分子可以刺激Toll样受体(TLR)和模式识别受体(PRP)，诸如IL-1R。TLR和IL-1R分享相同的细胞内结构域并且磷酸化抑制蛋白IκB残基以及激活IκB激酶(IKK),其最终导致IκB被蛋白酶体降解。该过程允许异二聚体(例如,p50/p65)从细胞质移向细胞核，其结合DNA并且促进包括TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的炎症介质转录，其进一步加速NF-κB信号转导。该促-炎症级联反应可以通过诱导暴露于IRI的肾导管细胞的细胞凋亡和促进白细胞迁移/激活来调节周围的微环境。本公开的缺血性AKI模型也能够诱导NF-κB信号转导的激活，其诱导一些炎症细胞因子/趋化因子基因的表达，与假手术组相比较显著地影响肾免疫细胞群体。近期研究包括TLR拮抗剂、细胞因子拮抗剂,IKK复合物拮抗剂,蛋白酶体抑制剂,对特定NF-κB复合物特异的诱捕寡核苷酸(ODN),以及在各种器官中抑制Rel蛋白翻译的ODN。它显示通过使用包括以下的多种药理学抑制剂抑制NF-κB信号转导来阻断在IRI中的NF-κB的作用。在丝氨酸残基32和36处具有突变的IκBα蛋白没有磷酸化并且因此在细胞质中与NF-κB作为多聚体存在并且没有降解，其维持NF-κB核易位。该非可降解的IκBα,或称为超阻遏物IκBα(srIκB),已知具有通过诱导细胞凋亡而抗肿瘤的作用。

在本公开中，Exo-srIκB的治疗作用显示在表示急性肾炎的肾脏IRI模型中。Exo-srIκB通过下调能够限制白细胞迁移/激活的促炎症介质的生产以及诱导炎症细胞的早期凋亡调节AKI进程，导致炎症阶段的早期结束。在本公开中，确定的是，给药Exo-srIκB仅影响肾脏中的免疫细胞群体频率并且并不影响脾脏中的免疫细胞群体频率。这些结果显示对于肾脏常驻免疫细胞，Exo-srIκB选择性地抑制细胞增殖或促进细胞凋亡。另一方面，可以解释为体内递送ExosrIκB阻断脾脏免疫细胞外流到受损肾脏。在本公开中，显示Exo-srIκB通过抑制NF-κB信号传递的激活而缓解小鼠中IR诱导的AKI。此外，Exo-srIκB的体内递送能够通过降低促炎症基因的表达和减少包括中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和T细胞的肾免疫细胞群体而改善肾脏的总体炎症状态。相应地，在一方面，本公开涉及其上装有srIκB的外泌体，并且更具体地涉及其上装有由氨基酸序列SEQ ID NO:1表示的srIκB的外泌体。下文中，srIκB可以表达为货物蛋白。

在一些实施方式中，本文所描述的AKI是缺血-再灌注(IR)诱导的AKI、脂多糖(LPS)诱导的AKI或脓毒症诱导的AKI，但不限于此。缺血-再灌注(IR)损伤(IRI)是急性肾损伤(AKI)的主要诱因。缺血-再灌注(IR)诱导的急性肾损伤(AKI)相对普遍，但是当受试者遭受全身血流灌注不足然后血流恢复和复氧时，可能发生严重的医疗病症。最常见的临床实例包括经历肾移植或心脏手术的患者以及具有脓毒症、创伤或心肌梗死的患者。肾IR损伤(IRI)与高发病率/死亡率相关联并且已知在包括心脏、肺和肝脏的其他器官中诱导功能障碍。在IR诱导的AKI中、缺氧和再灌注生成活性氧(ROS)，然后是包括细胞死亡和炎症的级联反应，以及随后的肾衰竭。免疫应答可能显著地影响肾IRI和修复。核因子(NF)-κB信号转导，其控制细胞因子生产和细胞存活，重要地涉及IR诱导的AKI；对它的抑制能够缓解缺血性AKI。

使用EXPLOR,一种光遗传工程化外泌体技术，将NF-κB(Exo-srIκB)的外泌体超阻遏物抑制剂装载到外泌体之内，并且肾脏IR手术之前和之后给药至B6 WT小鼠，如在本文中的实施例所示出的。结果与对照外泌体(Exo-天然)注射组的结果相比较。Exo-srIκB处理导致在缺血后小鼠中的血尿素氮、肌酐和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的水平低于Exo-天然处理组中的水平。Exo-srIκB的全身给药降低了缺血后肾脏中NF-κB的活性，导致降低的细胞凋亡水平。缺血后肾脏显示与对照相比，Exo-srIκB处理的促炎症细胞因子和黏附分子的基因表达下降。Exo-srIκB处理也显著地影响缺血后肾免疫细胞群体，与对照组的那些相比较，降低了中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和T细胞频率。因此，通过外泌体传递的NF-κB信号转导的调节可以用作针对AKI(包括IR-诱导的AKI)的新治疗方法。

在本公开的另一种实施方式中，外泌体被工程化以包含NF-κB的生物抑制剂的突变形式，称为超阻遏物(SR)IκB(srIκB，SEQ ID NO:1)(N.Yim et al.,NatureCommunications 7,12277(2016)。

如以下实施例所显示，光遗传工程化的外泌体系统(EXPLOR)用于将大量的srIκB负载至稳定转染细胞内的外泌体内。以下实施例确认纯化的负载srIκB的外泌体(Exo-srIκBs)的腹腔内注射减轻了脓毒症小鼠模型的死亡率和全身性炎症。在使用荧光染料标记的外泌体进行的生物分布研究中，在小鼠的脾脏和肝脏中，主要在中性粒细胞中观察到Exo-srIκB，并且在单核细胞中相对较少。而且，这些实施例确认Exo-srIκB缓解响应脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子(TNF)-α的在单核细胞THP-1细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的炎症反应。这些结果确认Exo-srIκB能够通过抑制NF-κB的激活来发挥保护作用以对抗全身性炎症和脓毒症诱导的死亡。

本公开提供治疗有需要的受试者的急性肾损伤(AKI)的方法，包括向受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。在一些实施方式中，所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：NF-κB抑制蛋白、其片段及其混合物。

所述组合物是生理学上可接受外泌体的水基溶液或悬浮液。

所述NF-κB抑制剂选自于NF-κB抑制药物、NF-κB抑制蛋白或其片段、或其混合物。

特别地，所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：超阻遏物-IκB、IκB-α、IκB-β、IκB-ε、BCL-3、其突变体、或其混合物。

在本公开的另一个实施方式中，本公开的外泌体包含NF-κB的生物抑制剂的突变形式，称为超阻遏物(SR)IκB(srIκB，SEQ ID NO:1)。

在本公开的另一个实施方式中，srIκB将IκB(SEQ ID NO:2)的Ser32和Ser36替换为Ala。

SEQ ID NO:1智人(Homo sapiens)，超阻遏物-IκB(srIκB)

MFQAAERPQEWAMEGPRDGLKKERLLDDRHDAGLDAMKDEEYEQMVKELQEIRLEPQEVPRGSEPWKQQLTEDGDSFLHLAIIHEEKALTMEVIRQVKGDLAFLNFQNNLQQTPLHLAVITNQPEIAEALLGAGCDPELRDFRGNTPLHLACEQGCLASVGVLTQSCTTPHLHSILKATNYNGHTCLHLASIHGYLGIVELLVSLGADVNAQEPCNGRTALHLAVDLQNPDLVSLLLKCGADVNRVTYQGYSPYQLTWGRPSTRIQQQLGQLTLENLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDCVFGGQRLTL

SEQ ID NO:2智人，IκB-α

MFQAAERPQEWAMEGPRDGLKKERLLDDRHDSGLDSMKDEEYEQMVKELQEIRLEPQEVPRGSEPWKQQLTEDGDSFLHLAIIHEEKALTMEVIRQVKGDLAFLNFQNNLQQTPLHLAVITNQPEIAEALLGAGCDPELRDFRGNTPLHLACEQGCLASVGVLTQSCTTPHLHSILKATNYNGHTCLHLASIHGYLGIVELLVSLGADVNAQEPCNGRTALHLAVDLQNPDLVSLLLKCGADVNRVTYQGYSPYQLTWGRPSTRIQQQLGQLTLENLQMLPESEDEESYDTESEFTEFTEDELPYDDCVFGGQRLTL

SEQ ID NO:3重组srIκBα肽

DRHDAGLDAMKDE

在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ IDNO:1至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQID NO:1至少87％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少88％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少89％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少91％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少93％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少94％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:1表示。

在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少87％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少88％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少89％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ IDNO:2至少91％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQID NO:2至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少93％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少94％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:1表示。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:2表示。

在本公开的另一个实施方式中，外泌体还包括光特异性结合蛋白。在一些实施方式中，所述光特异性结合蛋白包括第一光特异性结合蛋白和/或第二光特异性结合蛋白，其在照射时相互可逆地相互作用。在一些实施方式中，第一光特异性结合蛋白与外泌体特异性标志物缀合以形成第一融合蛋白(融合蛋白I)。在一些实施方式中，第二光特异性结合蛋白与NF-κB抑制蛋白缀合以形成第二融合蛋白(融合蛋白II)。在一些实施方式中，所述融合蛋白I和所述融合蛋白II通过所述第一光特异性结合蛋白和所述第二光特异性结合蛋白可逆地连接。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白与所述外泌体特异性标志物缀合以在朝向所述外泌体内部的方向上定位。

在其他实施方式中,第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白选自包括以下的组：CIB、CIBN、PhyB、PIF、FKF1、GIGANTEA、CRY或PHR，但不限于此。

在另外的实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CIB或CIBN并且所述第二光特异性结合蛋白是CRY或PHR，或者所述第一光特异性结合蛋白是CRY或PHR并且所述第二光特异性结合蛋白是CIB或CIBN。

在其他实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是PhyB并且所述第二光特异性结合蛋白是PIF，或者所述第一光特异性结合蛋白是PIF并且所述第二光特异性结合蛋白是PhyB。

在其他实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是GIGANTEA并且所述第二光特异性结合蛋白是FKF1，或者所述第一光特异性结合蛋白是FKF1并且所述第二光特异性结合蛋白是GIGANTEA。

在一些实施方式中，所述外泌体特异性标志物选自由CD9、CD63、CD81或CD82组成的组，但不限于此。在另一个实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD9。在另一个实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD63。在另一个实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD81。在另一个实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD82。

在一些实施方式中，所述外泌体具有在约50nm和约200nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约50nm和约75nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约75nm和约100nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约100nm和约125nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约125nm和约150nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约150nm和约175nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约175nm和约200nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有在约50nm和约150nm之间的直径。在一些实施方式中，所述外泌体具有以下的直径：约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150或更大以及和/或约75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或更小。

在没有列出所有细节的情况下，将在美国专利No.10-2100420和韩国专利No.10-2100420的内容通过援引并入本文以提供制备包含本公开的NF-kB抑制剂的外泌体的组合物和方法。

本公开还提供了治疗有效药物的持续释放，而常规的持续作用需要治疗剂的重复给药。

本公开还进一步提供包括有运载有NF-κB抑制剂的细胞外囊泡(外泌体)的药物组合物以及药学上可接受的载体或多种载体。

尽管近期对IR诱导的AKI的病理生理学的认知具有值得注意的进步，但是尚没有开发出用于治疗缺血性AKI的且具有已证实临床疗效和安全性的药物；因此，相关的死亡率和发病率水平至关重要。由于NF-κB信号转导深入参与IR诱导的AKI的病程，因此评估使用外泌体进行NF-κB抑制剂的全身递送是否能够缓解缺血性AKI的病程。使用EXPLOR技术通过光遗传控制外泌体的生物合成，在IRI手术前/后将Exo-srIκB递送至小鼠，并且将结果与对照组的那些的结果相比较。结果显示接受Exo-srIκB处理的小鼠组被保护免于IR诱导的AKI；显示出比对照组更好的生物化学和组织学结果。Exo-srIκB的全身递送抑制在缺血后肾脏中的NF-κB信号转导，其导致促炎症细胞因子/趋化因子和黏附分子的表达降低以及细胞凋亡的缓解。最终，NF-κB处理影响了肾免疫细胞群体，并且通过流式细胞仪和免疫荧光分析观测到，包括中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和T细胞的多种免疫细胞群体的频率显著降低。

在IRI的早期病程期间，促炎症级联反应和氧化应激导致NF-κB通路激活，随后导致细胞存活和炎症的调节。在缺氧/再灌注的早期阶段期间，释放多种内源性因子，包括高迁移率族蛋白B1、热激蛋白、和病原/损伤相关分子模式，并且这些分子刺激模式识别受体，诸如Toll样受体(TLR)和白介素-1受体(IL-1R)。这一过程随后激活IκB激酶(IKK)，其导致蛋白酶体降解IκB。接下来，异二聚体(例如,p50/p65)从胞质溶胶迁移向细胞核，在细胞核他们促进包括TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8的炎症介质转录，其进而进一步促进NF-κB信号转导。该促炎症级联反应通过诱导受IRI作用的肾管状细胞中的细胞凋亡，以及促进白细胞迁移/激活来调节周围微环境。本实验的缺血性AKI模型能够复制在肾IRI之后NF-κB信号转导的激活，导致多种免疫细胞因子/趋化因子和组织细胞凋亡的表达增加，其极大地影响肾免疫细胞群体。

最近实验研究显示关于NF-κB的阻断对于IRI影响的更多详细证据，在各种器官中使用包括TLR拮抗剂、细胞因子拮抗剂(33)、IKK复合物拮抗剂、蛋白酶体抑制剂和对特定NF-κB复合物特异的诱捕寡核苷酸的NF-κB信号转导的选择性药理学抑制剂。srIκB是在丝氨酸残基32和36处具有突变的非可降解IκBα蛋白。该蛋白阻止NF-κB核易位和随后的NF-κB信号转导。srIκB已经证明在肺IRI模型中的保护作用，因为它降低中性粒细胞浸润和肺水肿，并且已知具有抗肿瘤作用，因为它减少化学耐药性。然而，在肾脏损伤的病程中的srIκB处理作用尚没有被全面评估。通过使用生物工程化外泌体作为载体，Choi等最近展示srIκB处理在脓毒性AKI模型中的治疗益处。以下实施例演示了Exo-srIκB处理在肾IRI模型中的保护作用，扩大了通过外泌体递送srIκB在多种类型的AKI中的治疗潜力。

炎症进程调控在缺血性AKI领域是治疗的主要考虑。脾切除术以及抗TNF-α试剂，英利昔单抗的使用，通过降低炎症细胞因子表达和巨噬细胞/单核细胞累积，显示出在实验性缺血性AKI模型中的保护作用。抑制白细胞和巨噬细胞的迁移还保护肾功能和缓解细胞死亡。提供的实施例已经显示Exo-srIκB处理下调在IR损伤肾脏中的促炎症细胞因子/趋化因子和黏附分子的表达，降低细胞凋亡，并且缓解多系免疫细胞积累。这些结果表示Exo-srIκB通过促炎症级联反应的下调改变缺血性AKI的病程，限制随后的白细胞迁移/激活并且阻止细胞凋亡。

相较于其他种类的载体作为递送工具的应用，外泌体可以具有多种益处。首先，EV在循环期间固有地防御降解并且当自体使用时没有免疫原性。外泌体还能通过他们的内在的细胞靶向特性克服天然屏障诸如血脑屏障。此外，外泌体在摄取、细胞内运输和最终将货物运送到靶细胞的过程中使用受体细胞的内在机制。当维持这些特性时，EXPLOR技术使其能够通过与外泌体可控的、可逆的脱离极大地增加货物蛋白的细胞内水平。在治疗蛋白的细胞内递送期间存在几种技术障碍，包括低纯化效率、诱导对宿主的免疫应答、以及受限的胞浆递送，并且该使用EXPLOR的新外泌体递送方法相较于先前技术具有显著地改善的外泌体负载能力、递送效率和纯度。以下实施例显示使用EXPLOR技术的Exo-srIκB的高效递送可以对实验性的IRI后的肾结果产生显著的改善。

全身Exo-srIκB处理可以仅影响肾脏中免疫细胞群体的频率，但是不影响脾脏中的免疫细胞群体。这要归功于Exo-srIκB或选择性地作用于减缓增殖或促进细胞凋亡的肾常驻免疫细胞，或全身递送Exo-srIκB阻断脾免疫细胞外流进入受损肾脏。已知肾脏常驻免疫细胞和来自淋巴器官的免疫细胞具有截然不同的起源、表型和功能特征。使用了嵌合小鼠或体内成像的进一步研究将能够辨别常驻肾免疫细胞与循环免疫细胞，并且提供受全身Exo-srIκB处理影响的免疫细胞群体的更多信息。

使用外泌体作为载体递送活性治疗剂货物是一种递送srIκB进入IR诱导的AKI模型内部的安全和有效的方法。Exo-srIκB处理通过下调在缺血性损伤肾脏中的NF-κB信号转导和减轻炎症和细胞凋亡而缓解在小鼠中IR诱导的AKI。使用外泌体将免疫抑制剂蛋白直接细胞内递送进入靶细胞内是有前景的IR诱导的AKI中治疗工具并且应当进一步探索Exo-srIκB在人类肾IRI中的治疗潜力。

脓毒症引起的疾病

脓毒症，其伴随有大量的器官衰竭和过度炎症反应，具有复杂的病理生理学特征，并且不容易开发出能有效治疗全部症状的治疗剂。脓毒症在先天性免疫系统的强激活过程中被诱导，并且被由病原体激活的模式识别受体(PRR)调控，导致补体系统、凝血系统和血管内皮的激活并且因此很难到稳态。

如本文实施例所示，在脓毒症小鼠模型中Exo-srIκB的作用是能够通过抑制NF-κB活性解决炎症反应和降低器官损伤。srIκB是IκBα的非可降解形态，IκBα保护NF-κB免于进入细胞核并且作为转录因子起作用。例如，为了生成负载srIκB的免疫抑制剂外泌体，利用了能够将功能蛋白装至外泌体上的近期技术。通过将Exo-srIκB递送到脓毒症小鼠模型中全身(例如，全身递送)，本文的实施例确认将外泌体递送到在脓毒症炎症反应中起关键用作的中性粒细胞和巨噬细胞。此外，在本实施例的两个小鼠脓毒症模型中，Exo-srIκB处理显著地降低促炎症标志物诸如TNF-α、IL-1β和IL-6，但是并不降低抗炎细胞因子IL-10。即使当在LPS注射后1小时注射外泌体，也观测到Exo-srIκB的显著的治疗作用。因此，使用Exo-srIκB处理也可以应用于在转变到免疫抑制状态之前的脓毒症的早期阶段。

促炎症细胞因子可以在由脓毒症诱导的急性肾损伤(AKI)中起重要作用。在本文实施例中的由CLP手术或LPS注射引起的具有AKI的小鼠模型中，作为组织病理学检查的结果，确认肾小球结构被破坏，肾小管上皮细胞退化并且在脓毒症-诱导组中的肾小管发生严重的细胞内水肿和充血。然而，给药Exo-srIκB减轻了病变、肾损伤和炎症细胞入侵的严重程度。

中性粒细胞的组织浸润可能是脓毒症的主要进程。例如，在一些研究中，靶向特定黏附分子以耗尽中性粒细胞和抑制中性粒细胞的募集能够降低在脓毒症中的组织损伤，已经报道其能够被保护。TNF-α和IL-1β是关于趋化因子诸如MCP-1和IL-8的表达的主要介质，其在炎症反应期间对于中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞是重要的化学趋化因子。这些趋化因子在激活后引发单核细胞/巨噬细胞的局部入侵。然而，在HUVEC中，显示Exo-srIκB减轻LPS诱导的MCP-1和IL-8的释放，因此抑制单核细胞/巨噬细胞入侵。这些数据与本文活体研究获得的结果相一致。在多个本实施中，Exo-srIκB处理显著地降低脓毒症动物模型的脾脏、肾脏、肺和肝脏中的中性粒细胞浸润。考虑到中性粒细胞在脓毒症的病理生理学中的重要作用，Exo-srIκB的组织保护作用可能至少与在肾脏中的中性粒细胞细胞的入侵减少有关。

在一些实施方式中，脾相较于其他器官诸如肾脏和肝显示更高水平的中性粒细胞。促炎症细胞因子可以在脾中发生并且影响其他器官。编码促炎症细胞因子的基因的大部分可被NF-κB控制，NF-κB是由LPS诱导的脓毒症炎症反应中重要的转录因子之一。对本文实施例中的根据Exo-srIκB的存在或缺失的NF-κB响应报告蛋白的表达进行调查，并且确认p65的易位。Exo-srIκB通过阻断NF-κB亚基p65的核易位来抑制NF-κB信号激活。

在一些实施方式中，外泌体可以用作在脓毒症小鼠模型中免疫抑制剂蛋白的治疗剂递送机制。外泌体可以是能够递送srIκB至细胞内部的出色载体，提供治疗脓毒症的新选择。之前已经建立体内直接将免疫抑制剂蛋白递送至靶细胞内的方法，但是根据本公开的Exo-srIκB用作NF-κB的抑制剂，因此抑制炎症相关基因的表达和直接炎症反应。本文的实施例显示其可以被抑制，因此缓解脓毒症的促炎症细胞因子风暴以及导致的器官损伤。

在由脂多糖(LPS；内毒素模型)或盲肠结扎穿孔(CLP,多微生物模型)诱导的脓毒症动物模型中的最近研究已经展示具有多种化学性质和作用机制的NF-κB抑制剂保护动物免遭脓毒症致死。尽管已经报告有超过700种NF-κB抑制剂，目前尚无NF-κB抑制剂被批准用于人类使用。已经发现各种甾体和非甾体抗炎药阻断NF-κB，但是它们的作用高度多向性并且缺乏特异性。近些年以在NF-κB激活通路中关键元素的特定抑制为目标的新治疗剂策略已经在开发之中，并且有关它们作为治疗脓毒症或治疗由脓毒症引起的一种或多种疾病的潜在效力方面的期望很高。表达没有磷酸化和阻遏物IκB(srIκB)位点的工程化的IκBα蛋白的遗传构建体也已经使用。在特定磷酸化位点(将Ser32和Ser36替换为Ala)的IκBα突变导致具有延长半衰期的优势活性形式IκBα。这些srIκB导致稳定的IκBα细胞质库，因此阻止胞核NF-κB激活。

这里，利用外泌体作为治疗剂递送工具来递送srIκB至治疗靶标。已经将外泌体视为转运各种蛋白和调控基因至靶细胞的强效治疗剂负载体。它们作为非免疫原性纳米囊泡起作用，并且能够保护它们的货物防御血清蛋白酶和免疫应答。已经可以使用称为EXPLOR的技术将可溶蛋白负载至外泌体，EXPLOR探索通过光遗传控制的天然外泌体生物合成工艺和可逆蛋白-蛋白相互作用。为了将特定靶蛋白装载入外泌体之内，生成了稳定表达两种重组蛋白CIBN-EGFP-CD9和srIκB-mCherry-CRY2的HEK293T细胞系(图1A)。与之前研究相一致，使用EXPLOR技术生产负载srIκB的外泌体。指定负载srIκB的外泌体为Exo-srIκB，并且从完整HEK293T细胞生成的外泌体称为Exo-天然。将Exo-srIκB应用到用于治疗目的的脓毒症模型，改善了脓毒症-诱导的器官损伤并且抑制促炎症细胞因子的分泌，因此改善脓毒症患者的总体存活。

本公开提供治疗有需要的受试者脓毒症引发疾病的方法，包括：向受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

在多个实施方式中，所述疾病选择于有以下组成的组：肺炎、细胞因子风暴综合征、呼吸窘迫综合征和器官衰竭，但不限于此。在一些实施方式中，所述疾病是肺炎。在一些实施方式中，所述疾病是细胞因子风暴综合征。在一些实施方式中，所述疾病是呼吸窘迫综合征。在一些实施方式中，所述疾病是器官衰竭。

在多个实施方式中，所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：NF-κB抑制蛋白、其片段及其混合物。在多个实施方式中，所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)、IκB-α、IκB-β、IκB-ε、BCL-3、其突变体和其混合物。在一些实施例中，所述NF-κB抑制剂是超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)。

在多个实施方式中，所述组合物是通过口服、经皮、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下或混合途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过口服途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过经皮途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过腹腔内途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过肌肉内途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过皮下途径给药。在一些实施方式中，所述组合物通过混合途径给药。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括向受试者给药抗炎剂。

在一些实施方式中，所述包含NF-κB抑制剂的外泌体进一步包括光特异性结合蛋白。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少87％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ IDNO:1至少88％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQID NO:1至少89％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少91％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少93％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少94％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:1表示。

在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少86％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少87％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少88％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少89％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ IDNO:2至少91％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQID NO:2至少92％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少93％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少94％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:2至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:1表示。在一些实施方式中，NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:2表示。

在一些实施方式中，所述光特异性结合蛋白是第一光特异性结合蛋白和/或第二光特异性结合蛋白；在多个实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白与外泌体特异性标志物缀合以形成融合蛋白I；并且所述第二光特异性结合蛋白与NF-κB抑制剂缀合以形成融合蛋白II。在多个实施方式中，所述融合蛋白I和所述融合蛋白II通过所述第一光特异性结合蛋白和所述第二光特异性结合蛋白可逆地连接。在多个实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白与所述外泌体特异性标志物缀合以在朝向所述外泌体内部的方向上定位。

在一些实施方式中,第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白选自于由以下组成的组：CIB、CIBN、PhyB、PIF、FKF1、GIGANTEA、CRY和PHR。在多个实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CIB并且所述第二光特异性结合蛋白是CRY。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CIBN并且所述第二光特异性结合蛋白是CRY。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CIB并且所述第二光特异性结合蛋白是PHR。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CIBN并且所述第二光特异性结合蛋白是PHR。

在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CRY或者PHR并且所述第二光特异性结合蛋白是CIB或者CIBN。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CRY并且所述第二光特异性结合蛋白是CIB。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是CRY并且所述第二光特异性结合蛋白是CIBN。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是PHR并且所述第二光特异性结合蛋白是CIB。在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是PHR并且所述第二光特异性结合蛋白是CIBN。

在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是PhyB并且所述第二光特异性结合蛋白是PIF。在多个实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是PIF并且所述第二光特异性结合蛋白是PhyB。

在一些实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是GIGANTEA并且所述第二光特异性结合蛋白是FKF1。在多个实施方式中，所述第一光特异性结合蛋白是FKF1并且所述第二光特异性结合蛋白是GIGANTEA。

在一些实施方式中，所述外泌体特异性标志物选自由CD9、CD63、CD81和CD82组成的组。在一些实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD9。在一些实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD63。在一些实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD81。在一些实施方式中，所述外泌体特异性标志物是CD82。

在一些实施方式中，所述组合物是进一步包括生理学上可接受的载体或多个载体的药物组合物。

技术

近来，外泌体作为用于基因/药物递送的新生物载体已经引起极大关注。外泌体是在细胞-细胞交流中起重要作用的细胞外囊泡(EV)，其细胞交流通过传递生物活性物质到受体细胞或者影响靶细胞的信号通路。外泌体更易于存储并且展示出更大稳定性。外泌体具有克服生物屏障的高能力，并且能够载有靶向特定细胞类型的表面分子，因此，更少地引起脱靶效应。然而，在外泌体的临床应用中，获取大量的纯外泌体和将可溶蛋白负载到外泌体中是一个重大的挑战。使用“经由光可逆蛋白-蛋白相互作用蛋白负载的外泌体”(EXPLOR)，一种由Yim等开发的新的、光遗传工程化的外泌体技术，实现了外泌体的生产效率和生物相容性方面的重要进展。Choi等最近已经将该EXPLOR技术用在实验性的脓毒症模型中；他们将包含超阻遏物IκB(srIκB)的外泌体递送到小鼠。这是阻止NF-κB核易位的κB抑制剂的非可降解形式。他们的研究显示在小鼠脓毒症模型中，用Exo-srIκB处理减轻了全身促炎症反应和随后的器官功能障碍。

实施例

动物：在Yonsei Medical Center的中心动物实验室的无特定病菌的条件下培育雄性C57BL/6J小鼠。使用6-7周龄的雄性小鼠用于所有实验。此外，从Orientbio(Seong-Nam,韩国)购买C56BL/6,C57BL/6N,BALB/c小鼠。一般由Dr.M.Kim(University ofRochester,Rochester,NY,USA)提供在中性粒细胞和巨噬细胞中固有表达GFP的LysM^GFP/+小鼠。

外泌体分离：使用表达两种重组蛋白CIBN-EGFP-CD9和srIκB-mCherry-CRY2的HEK293T细胞系生产负载srIκB的外泌体。使用完整的HEK293T细胞生产Exo-天然。接种稳定细胞至T175培养瓶之内并在37℃下进行24h。移除培养基后，冲洗细胞并使用消除外泌素的培养基再次悬浮细胞。然后在CO₂培养箱中，将细胞暴露于来自460-nm发光二极管的持续蓝光照明。72h后，收获细胞培养上清液并离心，以去除细胞和碎片，并且经0.22-μm聚醚砜过滤器过滤；使用切向流过滤和尺寸排阻色谱法的组合分离外泌体。在一些实施例中，为产生Exo-srIκB，将稳定细胞接种入T175培养瓶中。1天后，仔细移除培养基，用PBS冲洗细胞，加入消除外泌体的培养基。然后，在CO₂培养箱中，将细胞暴露于来自460-nm发光二极管的持续蓝光照明。72h后，收获细胞培养上清液并且以1,000g离心15min以移除细胞和细胞碎片，并且然后经0.22-μm聚醚砜(PES)过滤器过滤以去除大颗粒。使用基于截留分子量(MWCO)的膜过滤分离外泌体。经SEC纯化分离的外泌体。

透射电子显微镜：借助TEM观察EV的形态，碳涂层铜栅(Electron MicroscopySciences,Hatfield,PA)吸收5μl的EV 15s。移除过量液体后，使用2％乙酸铀酰(ElectronMicroscopy Sciences)负染色样品。使用在200kV下操作的Tecnai G2 Retrofit电子显微镜(FEI company,Hillsboro,OR)获得TEM图像。经负染色从形态学方面评估细胞外囊泡(EV)。首先，将悬浮在PBS中的5μL的EV加载到辉光放电碳涂层铜网格(ElectronMicroscopy Sciences,Hatfield,PA，USA)上。在样品吸收3-5s后，用滤纸吸干网格并且用2％乙酸铀酰(UA)染色。下一步，使用干燥器干燥样品20s。在200kV下用Tecnai G2Retrofit(FEI Company,Hillsboro,OR,USA)观察EV。

纳米颗粒跟踪分析：使用具有嵌入式488nm激光的Zetaview工具(PMX120,Particle Metrix,Germany)通过NTA测量EV的颗粒数量和尺寸分布。根据厂商说明书在无颗粒的PBS中稀释(血清1:100-1:10000)样品。用相机级别78和快门80在25℃恒定流动条件下分析样品。经NTA确定的尺寸分布对应于在悬浮液中EV的流体动力学直径。由布朗运动速率计算颗粒数量，使用二维斯托克斯-爱因斯坦方程基于颗粒运动的速率确定尺寸。特定样品在0.2-μm过滤的PBS中在1:100和1:10,000之间稀释。基于每帧50–200颗粒的计数测量EV浓度。对于每次测量，通过使用以下设置扫描11个细胞位置来执行两个循环：焦点，自动对焦；所有样品的相机灵敏度，78.0；快门，70；以及细胞温度：25℃。以每ml颗粒数表达EV浓度(pn/ml)。

免疫印迹在包含Halt^TM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(100X)(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)的RIPA缓冲液中裂解细胞并且在Triton X-100裂解缓冲液中裂解肾脏。在4℃下以9,000–16,000×g离心裂解物10–20min并且在-70℃下保存上清液用于随后的免疫印迹。使用BCA测定(Pierce^TM BCA Protein Assay,Thermo Scientific^TM)来测量蛋白质浓度。在Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)中裂解蛋白质提取物，并且在100℃下加热5min。在丙烯酰胺变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳蛋白质并且转移到硝酸纤维素(NC)膜上。在22℃下封闭缓冲液A(PBS,0.1％吐温20,和5％脱脂奶)中孵育转移膜1h,并且然后用抗以下的一抗在4℃下过夜孵育：srIκB(定制抗体,Abclon,Seoul,Korea)、mCherry、Alix、TSG101、GM130、钙联蛋白(Abcam,Cambridge,UK)、CD9、CD63(SBI,Tokyo,Japan)、GAPDH(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)、抗增殖蛋白(NOVUSBIO,Centennial,CO)、核孔蛋白p62(BD bioscience,San Jose,CA)、NF-κB(Clone 8242S,Cellsignaling technology,Danvers,MA)、核纤层蛋白B1(Clone ab133741)、ICAM-1(CloneAF796,R&D Systems)、切割的caspase-3(Clone 9661L,Cell signaling technology)、切割的PARP(Clone 9544S,Cell signaling technology),和β-肌动蛋白(A5441,Sigma-Aldrich)。在冲洗并用特异性二抗孵育膜后，使用化学放光剂[Clarity and Clarity MaxECL蛋白质印记底物(Bio-Rad)或West-Q Pico Dura ECL溶液(GenDEPOT,Katy,Tx)]对其进行显影。使用Image J软件(NIH)测量各组谱带的相对光密度。

小鼠肾缺血-再灌注模型：经腹腔给药替来他明/唑拉西泮

-甲苯噻嗪

混合物(1mg/kg)麻醉小鼠，并且放置在加热手术垫上(37℃)。使用背侧切口进行双侧IRI。切剖肾蒂，在每一肾蒂上放置微夹(Jeungdo Bio&Plant,Seoul,South Korea)30min。假处理动物接受麻醉并且仅双背侧切口。在术中期间，使用1ml温的生理盐水补水小鼠，以防止脱水。缺血30min后，移除双夹并且确认血流恢复，然后使用

WoundClosure System(Harvard apparatus,Holliston,MA)闭合伤口。允许动物在自由取食食物和水的情况下恢复。在IRI手术24或48h后杀死小鼠。收集每一小鼠的血清、脾和肾脏用于进一步分析。使用Cobas C502自动分析仪(Roche diagnostics,Basel,Switzerland)分析血清BUN和肌酐水平。

酶联免疫吸附测定(ELISA):稀释样品1:100–1000倍后，使用小鼠ELISA试剂盒,根据厂家规程(Mouse Lipocalin-2/NGAL Quantitative ELISA kit)(R&D Systems,Minneapolis,MN)测量血清NGAL水平。

使用市售ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)测量收集自THP-1和HUVEC培养液的上清液中的TNF-α、IL-8和MCP-1水平，并且使用Trans AM NF-κB p65试剂盒(Active Motif,Carlsbad,CA,USA)测量HUVEC中的NF-κB活性。在高级CLP术后使用MouseMagnetic Luminex eScreening Assay试剂盒(R&D Systems)测量在指示时间点通过心脏穿孔收集的小鼠血浆中的TNF-α、CCL-4/巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、IL-6和IL-1β水平。根据厂商说明书进行测定。使用Luminex 200TM System(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)以双份法测定所有样品和标准。为了测量在指示时间点的血清TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL4，在LPS内毒素血症程序后通过心脏穿孔收集血液样品，允许在室温下凝块2h,并且然后在4℃下以2,000g离心20min。

NE-PER核和胞质提取：收集肾脏，切成小片，用PBS冲洗，并且使用根据肾脏重量在从NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent试剂盒(ThermoFisher,Waltham,MA)获得的一定体积的细胞质提取剂(CER)I中的珠进行均质化。在15s剧烈涡流和10min冰上孵育后，在每一肾脏样品加入CER II，然后冰上孵育1min并且以16,000×g离心5min。收集上清液作为胞质提取物，并且在细胞核抽取试剂中悬浮不溶性组分。在以16,000×g离心10min后，收集全部上清液并且用作细胞核提取物。

肾脏损伤得分和免疫组织化学法的组织病理学评估：通过苏木精伊红(HE)和IHC染色来处理福尔马林固定和石蜡包埋肾脏组织样品的五片微米厚切片。为组织学上评估肾脏损伤，每一载玻片用HE染色。肾脏病理家(JIY)以盲法计分皮质区域中坏死小管占总小管的百分比。根据损坏小管占总小管的百分比计分肾脏损伤。0,正常；1,<25％损伤；2,25–50％损伤；3,50–75％损伤,4,75–90％损伤；和5,>90％损伤。损伤小管的组织学标准包括小管刷毛缘的损失、空泡化、染色质凝集和裸露的小管基底膜。评估和计分五个随机选择的高倍视野中典型地包括50-100小管的肾脏小管。

对于IHC，将组织切片去石蜡化、在乙醇中再水合和在自来水下冲洗。使用Black&Decker蔬菜蒸发器在10mM柠檬酸钠缓冲液中修复抗原20min。使用10％驴血清在22℃封闭载玻片30min，并且使用PBS冲洗。使用在牛血清白蛋白中的2％酪蛋白将NF-κB(Clone8242S,Cell signaling technology,Danvers,MA)和ICAM-1(Clone AF796,R&D Systems)的一抗稀释至适当浓度，加到载玻片，并且在4℃下隔夜孵育。冲洗后，在22℃下施加二抗(Dako,Carpinteria,CA)1h。将二氨基联苯胺加入2min，并且使用苏木精复染载玻片。以400×放大和通过数字图像分析(MetaMorph version 4.6r5,Universal Imaging Corp.,Downingtown,PA)检测每一切片中的至少五个视野以获得染色强度的半定量得分。

NF-κB的DNA结合活力分析：使用TransAM NF-κB测试试剂盒(ActiveMotif,Carlsbad,CA)根据厂商规程，使用二十微克肾脏细胞核提取物测量p65/c-Rel(NF-κB)与DNA的结合活性。

定量实时聚合酶链式反应：使用已建立的全肾脏RNA提取方法。简言之，使用700μl的RNAiso试剂(Takara Bio Inc.,Otsu,Shiga,Japan)均质化全肾脏样品。接下来，将160μl的氯仿加入肾细胞的均质化样品中。接下来，剧烈摇晃混合物30s,在22℃保持3min,并且在4℃下以16,000×g离心15min。小心地将位于三相的顶部的水相转移到新的管，以防止被其它相污染。加入400μl的异丙基并且在4℃下以16,000×g离心30min沉淀抽取的RNA。使用70％乙醇冲洗RNA沉淀，空气干燥2分钟，并且在无菌的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水中溶解。以260和280nm的波长用分光光度测量法评估提取的RNA的数量和质量。使用cDNA合成试剂盒(Takara Bio Inc,Shiga Prefecture,Japan)逆转录分离的RNA为cDNA。五微升的每种cDNA与10μl的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)和5pmol的有义/反义引物混合。在确定每种引物最优浓度的初步试验之后确定引物浓度。使用ABI PRISM 7700Sequence Detection System(Applied Biosystems)测量Il-1α、Il-1β、Il-2、Il-4、Il-6、Il-10、Il-17α、Ccl2、Ccl3、Ccl5、Cxcl2、Ifn-γ、Tnf-α和Icam-1的表达水平。PCR条件如下：起始加热步骤在95℃下进行9min，然后进行在94.5℃下变性30分钟，在60℃下退火30s以及在72℃下延伸1min的35个循环，以及在72℃下最终延伸7min。表1示出每一引物的序列数据。

表1引物序列

每一样品在不同试管中以一式三份运行，与每个测定平行地运行不含cDNA的阴性对照。实时PCR后，以2℃/min的速率将温度从60℃增加至95℃，以构建熔解曲线。相对于18SrRNA，归一化每一基因的表达值，使用2^-△△CT比较C_T方法计算相对倍数表达值。

血清中的多重细胞因子测定：使用Milliplex Mouse Cytokine/ChemokineMagnetic bead Panel–Multiplex Assay试剂盒，根据厂商规程(EMD Millipore,Billerica,MA),使用1:2稀释血清分析十三种炎症细胞因子和趋化因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、CCL2、CCL3、CCL5、CXCL2、IFN-γ和TNF-α。使用Luminex200酶标仪(EMD Millipore)进行定量。

末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记测定：使用市售可购的试剂盒(S7110,Merck Millipore,Billerica,MA)并用经FITC-标记的TUNEL试剂评估细胞死亡。通过以400×放大检查每一切片中的至少五个视野并通过数字图像分析(MetaMorph version 4.6r5,Universal Imaging Corp.)来鉴定在福尔马林固定的肾组织中的TUNEL-阳性细胞。

小鼠脾细胞和肾脏单核细胞的分离:根据已建立规程分离KMNC。放血后移出双肾，去膜，精细切碎并在37℃下在胶原酶类I中(1mg/ml)(Worthington Biochemical,Lakewood,NJ)孵育30min。酶消化后，经70μm筛网(BD bioscience,San Jose,CA)机械破碎组织达到单细胞悬浮液。依据厂商说明书，在RT下使用等渗Percoll密度梯度分离技术(GEHealthcare,Chicago,IL)(在制动模式下以1,500×g进行30min)离心，然后收集KMNC。冲洗收集的细胞并且重悬浮在包含5％FBS的RPMI培养液，以及使用

II FLAutomated Cell Counter(Life Technologies,Waltham,MA)自动计数。

使用70μm的筛网(BD bioscience)经机械破碎脾脏收集脾细胞用RBC裂解溶液(Qiagen,Hilden,Germany)孵育3min,以移除红血细胞。

肾脏CD4⁺ T细胞的FACS分选:关于FACS分选，在冰上使用抗CD16/CD32 Fc阻断剂(Clone 93,Biolegend,San Diego,CA)预孵育KMNC 10min，使用单克隆Ab抗CD45(APC,Clone 30-F11,Biolegend),抗Ly6G(APC-Fire750,Clone 1A8,Biolegend),抗Ly6C(FITC,Clone HK1.4,Biolegend),抗F4/80(PerCP-Cy5.5,Clone BM8,Biolegend)和抗CD3(PE,Clone 17A2,Biolegend)在4℃下染色30min。在冲洗和重悬浮在FACS缓冲液(PBS with 5％FBS)中后,使用LSRII并用FACS Diva软件(BD Biosciences)和FlowJo软件(10.2版本)分析染色细胞。除去碎片/死亡细胞和双细胞(doublets)后，基于CD45、Ly6G、Ly6C、F4/80和CD3表达分析每一样品。使用OneComp eBeads(ThermoFisher)用于补偿。

免疫荧光：在去石蜡化、再水合和抗原修复后，使用10％山羊血清在22℃下封闭载玻片30min，使用具有吐温-20的磷酸盐缓冲盐水冲洗。使用在牛血清白蛋白中2％酪蛋白将荧光素(FITC)-缀合的莲花四蕈兰凝集素(LTL)(Clone FL-1321,Vector laboratories,Burlingame,CA)、Ly-6G(Clone ab25377,Abcam,Cambridge,UK)、Ly-6C(Clone ab15627,Abcam)和F4/80(Clone ab6640,Abcam)的一抗稀释至合适浓度，并且在4℃下过夜孵育。冲洗后，在22℃下施加山羊抗-大鼠IgG Alexa Fluor 647(ab150167,Abcam)1h。接下来,使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(MBD0015,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)复染色载玻片。以400×放大和通过数字图像分析(MetaMorph version 4.6r5,Universal ImagingCorp.)检测每一切片中的至少五个视野获得染色强度的半定量得分。

统计：以均值±标准偏差(SD)值表达数据。使用Prism 8(GraphPad,San Diego,CA)单向ANOVA以及Bonferroni事后检验分析统计差异。如果P<0.05，结果具有统计显著性。

LPS内毒素血症模型：为了产生LPS内毒素血症小鼠模型，将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)(Sigma-Aldrich,Milwaukee,WI,USA)的LPS注射进入雄性小鼠。

高级别CLP脓毒症模型和处理方案：使用略经修改的先前描述的程序，使购自ORIENTBIO(Seongnam-si,Gyeonggi-do,Republic of Korea)的雄性C57BL/6小鼠在9-10周龄时接受高级别CLP。所有小鼠都被安置在经国际实验动物护理评估和认证协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal CareInternational)认证的Yonsei Biomedical Research Institute,Yonsei UniversityCollege of Medicine的无特定病菌区中，并且进行实验。在所有程序开始前，经注射80mg/kg克他命和10mg/kg甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠。麻醉后，以无菌的方式打开腹膜并且使用4-0黑丝线在距离远端1cm处结扎盲肠并且使用23号针刺穿。在刺穿后，移除针以及通过两个穿刺点挤出少量粪便以确保通畅。然后，将盲肠放回腹腔以及使用6-0尼龙缝合线合拢腹腔切口，在皮肤上使用可移除不锈钢伤口夹。在该程序之后，皮下施用每20g体重1ml预温盐水。假处理小鼠进行相同的程序，除了盲肠的结扎和穿刺。在该程序之后,在第0、6、12和18h时，经i.p.注射将Exo-天然或者Exo-srIκB的1.0×10⁹颗粒施用到小鼠。作为对照，以同样方式注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。在CLP之后最初的48h期间每2h评估动物，并且之后每4h，持续5天。在CLP之后18h内收集取样以评估该程序的结果。

活体成像：使用激光扫描活体共聚焦显微镜(IVM-C；IVIM Technology,Daejeon,South Korea)来可视化Exo-srIκB的生物分布和抗-脓毒症作用。在活体成像期间，使用恒温控制器维持小鼠体温在37℃。使用肌内注射舒泰(Zoletil)(30mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉小鼠。为了评估包括肝脏、脾脏和肾脏的内部器官，在皮肤和腹膜均做10mm的小切口。在成像期间通过重复施加盐水保持暴露器官含水。在注射Exo-天然或Exo-srIκB之前和之后通过广域z-stack成像可视化外泌体的生物分布。为在C57BL/6N小鼠体内荧光标记中性粒细胞，将缀合Alexa Fluor 555(A20009；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)的抗-Ly6G抗体(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)静脉内注射。经尾静脉导管或31-G胰岛素注射器静脉内注射标记有mCLING ATTO 647N(Synaptic System,

Germany)的天然或srIκB外泌体。为生成脓毒症模型，在成像前1-16h静脉内注射高剂量LPS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)。

共聚焦显微术：对于外泌体摄取分析，在0.5ml of Dulbecco’s PBS(DPBS)中稀释外泌体。然后，根据厂商说明书用647N-标记的mCLING-ATTO(Synaptic System)孵育悬浮液。然后，通过离心获得混合物沉淀以及使用HUVEC孵育300μl的重悬浮沉淀。在24h后，使用DPBS冲洗细胞并且在4％多聚甲醛溶液中固定。使用Hoechst进行胞核染色。使用Zeiss 710共聚焦显微镜(Zeiss,Oberkochen,Germany)记录图像。

荧光素酶测定:依据厂商说明书使用受NF-κB响应元件调节的荧光素酶报告构建体(SL-0012；Signosis,Santa Clara,CA,USA)稳定转染HEK293细胞并且使其生长。在37℃下使用外泌体处理细胞24h，使用SpectraMax ID3酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)测量荧光素酶活性(E1501；Promega,Madison,WI,USA)。

流式细胞仪:使用流式细胞仪评估HUVEC上表达的表面标志物水平。通过离心分离和收获细胞，用与藻红蛋白(PE)缀合的对人ICAM-1特异的抗体(BD Biosciences)在冰上避光标记30min，并且然后充分洗涤。使用BD Celesta流式细胞仪(BD Biosciences)分析所有样品。使用BD FACSDiva软件分析数据。使用PE缀合的对IgG1κ(BD Biosciences)特异的抗体作为同种型对照。

实施例1.工程化外泌体的表征和分析

如图13中所示先前的研究已经充分描述外泌体的生产、收集和纯化。颗粒的尺寸大部分范围在30至120nm，平均尺寸101nm。透射电子显微镜(TEM)显示具有依据纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果的尺寸的完整杯形膜囊泡(图1，B和C)。Exo-srIκB的免疫印迹分析结果显示稳健表达了靶蛋白，包括具有阳性外泌体标志物诸如CD63、TSG101、Alix和GAPDH的srIκB、mCherry、CD9和GFP。Exo-srIκB缺少包括抗增殖蛋白、钙联蛋白、GM130和核孔蛋白p62的细胞器标志物的表达。Exo-天然不表达除外泌体标志物之外的任何标志物(图1D)。

实施例2.Exo-srIκB的注射减轻肾缺血-再灌注损伤

首先研究Exo-srIκB在肾IRI的病程中的作用。在肾IRI之前或之后以1-h为间隔每个实验组腹腔内注射三次3×10⁹pn Exo-srIκB或Exo-天然(总计9×10⁹pn)。(预处理：在IRI手术前3、2和1h；后处理：在IRI手术后1、2和3h)在手术后24或48h杀死小鼠(图2A)。

有趣的是，接受Exo-srIκB的小鼠组相较于Exo-天然-注射组在预处理和后处理模型中均显示在IRI手术后明显更低的血清尿素氮(BUN)和肌酐水平(两个模型中24-h/48-hBUN和肌酐,P<0.001)(图2B和2C)。与Exo-天然组的那些相比较，Exo-srIκB注射组在预处理和后处理模型中的血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平显著下降(P<0.001)(图2D)。组织学评价结果揭示，与Exo-天然组的那些相比较，接受Exo-srIκB处理小鼠组在预处理/后处理模型中小管损伤得分更低(P<0.05，对比Exo-天然-注射组)(图2E)。总体上，这些数据显示Exo-srIκB全身递送阻止了缺血性AKI的进程。

实施例3.全身Exo-srIκB处理抑制在IR-损伤肾脏中的肾NF-κB信号转导

为了理解全身Exo-srIκB处理影响IR诱导的AKI的进程的内在机制，首先研究Exo-srIκB的全身递送以确定它是否抑制在肾脏中的局部NF-κB信号转导。经蛋白质印迹法测量来自每一不同实验组的肾细胞核提取物中的NF-κB p65蛋白表达。使用9×10⁹pn的Exo-srIκB全身处理与Exo-天然-处理组相比较，在预IRI处理模式中，显著降低IR诱导的NF-κB核易位(IRI后24-h,P<0.05；48-h,P<0.001)和IRI后(IRI后24-/48-h,P<0.01)(图3A)。使用来每一实验组的肾细胞核提取物通过测量p65的DNA结合活性再次确认该发现。与Exo-天然组相比，无论怎样的处理时机，在肾IRI后，Exo-srIκB处理，均显著下调NF-κB的DNA结合活性(预处理:IRI后24-/48-h,P<0.05；后处理:IRI后24-/48-h,P<0.01)(图3B)。经NF-κB免疫组织化学(IHC)染色的进一步验证显示相较于对照处理组的NK-κB表达，Exo-srIκB处理组中NK-κB表达显著下降(预处理:IRI后24-h,P<0.05；48-h,P<0.001以及后处理:IRI后24-/48-h,P<0.05)(图3C)。因此，全身Exo-srIκB处理能够降低在IR后损伤肾脏中的肾NF-κB信号转导。

实施例4.Exo-srIκB改善缺血后肾脏中的炎症

为进一步研究是否全身外泌体srIκB处理局部地缓解肾IRI诱导的炎症，通过定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)确定了关键炎症介质的表达水平，包括Il-1α、Il-1β、Il-2、Il-4、Il-6、Il-10、Il-17α、Ccl2、Ccl3、Ccl5、Cxcl2、Ifn-γ、和Tnf-α。与Exo-天然-处理组的那些相比，在IRI前9×10⁹pn的Exo-srIκB处理在IR损伤肾脏中显著抑制Il-1β、Il-6、Tnf-α、Ccl2、Ccl5、和Cxcl2的表达水平。(图4A)。使用来自不同实验组的血清进行多重细胞因子分析。结果不如肾脏转录数据显著，但是与对照组的相比，在Exo-srIκB处理组中炎症细胞因子的下降表达的趋势明显，包括IL-6、TNF-α、CCL2、CCL5和CXCL2(图4B)。

此外,通过比较不同处理组之间转录物组/翻译的细胞内黏附分子1(ICAM-1)水平，评估了外泌体srIκB处理对黏附分子的表达的作用。qRT-PCR结果揭示，在预处理/后处理两种模型中，相较于Exo-天然处理的Icam-1表达水平,Exo-srIκB处理组中的Icam-1表达水平显著更低(图4C)。经蛋白质印迹和IHC染色在翻译水平上重现该结果。因此，在IR诱导的AKI中，全身Exo-srIκB递送能够下调促炎症细胞因子/趋化因子和黏附分子的表达。

实施例5.Exo-srIκB改善缺血后肾脏的细胞凋亡

基于NF-κB在调控程序性细胞死亡中的已知作用，研究Exo-srIκB如何影响缺血后肾脏的细胞凋亡。肾脏IRI手术诱导肾细胞的显著细胞凋亡，其在蛋白质印迹分析中显示切割的caspase-3和切割的Poly(ADP-ribose)聚合酶(PARP)水平的突然增加。损伤前/后全身递送Exo-srIκB可以极大地下调切割的caspase-3和切割的PARP的表达水平,表明Exo-srIκB具有抗缺血后肾脏的细胞凋亡的保护作用(图5A)。使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色确定肾细胞损伤的程度。与对照组相比较，Exo-srIκB-处理的肾脏显示在预处理/后处理模型中，TUNEL阳性细胞的数量显著的降低(图5B)。

实施例6.肾缺血-再灌注损伤后外泌体的生物分布

研究Exo-srIκB在肾IRI模型中的生物分布以更好理解哪种细胞类型协调Exo-srIκB在缺血后肾脏中的保护作用。在IRI手术前1h给小鼠静脉内注射荧光标记的Ly6G和F4/80抗体以及再灌注后1hr静脉内注射9×10⁹pn的Exo-srIκB。在再灌注之后的10min、5h和24h时进行活体成像。注射DiD标记的外泌体以及抗-Ly6G抗体以可视化中性粒细胞(Fluor555)，和抗F4/80抗体以可视化巨噬细胞(Fluor 488)之后活的体成像确认在缺血后肾脏中的中性粒细胞(Ly6G⁺)和巨噬细胞(F4/80⁺)摄取Exo-srIκB和Exo-天然二者(图6B)。我们观察IRI后肾小管中的DiD(绿色)信号温和增加，提高肾小管细胞摄取外泌体的可能性，但是与DiD标记的外泌体注射前相比较信号强度并没有显著差异(数据未显示)。同时观测脾脏，显示在外部实质中的中性粒细胞和巨噬细胞内摄取的外泌体(图6C)。内实质区并没有显示任何显著的摄取(数据未示出)。

实施例7.Exo-srIκB全身递送影响肾脏IRI后肾免疫细胞群体

已知免疫细胞在缺血后AKI的进程中具有重要作用；因此，评估了在IRI手术前提供外泌体srIκB处理是否影响每种免疫细胞类型的群体。在缺血性AKI 24h后，实验组之间经机械粉碎、酶消化和Percoll密度梯度分离方法的多步骤后分离的肾细胞总数量没有差别，但是相较于Exo-天然-处理组的那些，Exo-srIκB-处理组具有显著低的肾单核细胞(KMNC)的频率(P<0.05)(图7,A和B)。进一步分析显示，在总KMNC中，相较于Exo-天然-注射组中的那些，Exo-srIκB-注射组具有显著低频率的中性粒细胞(CD45⁺Ly6G⁺)(P<0.01)、促/抗炎症单核吞噬细胞(CD45⁺Ly6C⁺/CD45⁺F4/80⁺)(分别P<0.01/P<0.05)和T细胞(CD45⁺CD3⁺)(P<0.05)(图7C)。IR损伤肾脏的免疫荧光结果也显示在Exo-srIκB注射肾脏中的中性粒细胞和单核吞噬细胞的频率降低(图7D)。然而，Exo-srIκB处理对缺血性AKI之后脾脏中的总免疫细胞数量或频率并没有显著作用。Exo-srIκB和Exo-天然处理组之间，除T细胞(CD45⁺CD3⁺)，总细胞数量和总免疫细胞(CD45⁺)、中性粒细胞(CD45⁺Ly6G⁺)和促/抗炎症单核吞噬细胞(CD45⁺Ly6C⁺/CD45⁺F4/80⁺)的频率没有差异。这确认了在缺血性AKI之前全身Exo-srIκB处理对肾免疫细胞增值/转移具有显著的局部作用，但是对脾免疫细胞没有。

实施例8.Exo-srIκB的静脉内递送

为验证腹腔内外泌体递送是否发现与静脉内递送具有相似的保护效果，使用静脉内注射方法重复一些实验。静脉内递送Exo-srIκB的情况下，重现了改善的生物化学结果以及NF-κB信号转导和ICAM-1表达水平的降低，如图8所示。因此，在缺血性AKI模型中Exo-srIκB的静脉内递送与腹腔内递送相比较产生相似的生物效应。

实施例9.负载srIκB的外泌体的更多表征和分析

为产生足够的外泌体，从每种细胞类型收集培养液。

HUVECs购自American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA,USA)并且在包含10％胎牛血清(FBS；Atlas Biologicals,Fort Worth,CO,USA)、肝素(Sigma-Aldrich)、内皮细胞生长补充剂(BD Biosciences)和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher)的F-12K培养基(ATCC)中培养。在全部实验中使用第三代和第六代之间的HUVEC。人单核细胞(THP-1)购自ATCC并且在具有10％FBS、1％青霉素/链霉素和0.05mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的RPMI 1640培养基(Welgene,Daegu,Korea)中培养。

使用切向流过滤(TFF)和尺寸排阻色谱(SEC)的组合分离外泌体(图13A)。为了降低SEC柱负载了可能超过其结合能力的杂质的风险，样品经TFF进行透析过滤和浓缩。TFF后，浓缩的培养基装载在SEC柱上用于进一步纯化。然后进行第二次TFF以浓缩外泌体。每种类型的外泌体经由纳米颗粒跟踪分析(NTA)来分析，其表征外泌体的尺寸和浓度(图13B)。直径在30至120nm的颗粒占所有颗粒的80％多，平均尺寸为101nm，其与外泌体的典型尺寸范围(30–120nm)相一致。此外,透射电子显微镜(TEM)显示具有对应于从Exo-天然和Exo-srIκB获得的NTA结果的尺寸的完整的杯状膜囊泡(图9B)。为了进一步表征我们制剂中的外泌体，研究两种常见外泌体标志物。它们是通过蛋白质印迹的四次穿膜蛋白CD63和TSG101。

如前述研究中描述进行蛋白质印迹。使用靶向以下蛋白质的抗体：IκBα(CST4812；Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)、p65(CST6956S；Cell SignalingTechnology)、CD9(NBP2-22187；NOVUSBIO,Centennial,CO,USA)、CD63(EXOAB-CD63A-1；SBI,Tokyo,Japan)、TSG101(ab228013；Abcam,Cambridge,UK)、GM130(ab52649；Abcam)、GAPDH(sc-47724；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、组蛋白H3(ab1791；Abcam)、mCherry(ab125096；Abcam)和GFP(CST2555；Cell Signaling Technology)。

在样品中清晰地观测到CD63和TSG101的存在，然而在细胞裂解物中仅检测到高尔基体衍生的污染物GM130(图9C)。该外泌体制剂的分析显示它们展示出外泌体的特征。而且，观测到srIκB-mCherry-CRY2(130kDa)稳健负载至从srIκB稳定细胞系分离出的外泌体内。

实施例10.Exo-srIκB在脓毒症小鼠中提高存活并且缓解急性器官损伤

研究以确定腹腔内(i.p.)注射Exo-srIκB是否保护抵抗内毒素休克。动物接受单次具有致死剂量LPS(针对C57BL/6，40mg/kg体重，针对BALB/c，20mg/kg体重)的i.p.注射，然后单次i.p.注射Exo-srIκB(相隔6h)。与显示由于LPS诱导的脓毒症的100％死亡率的对照C57BL/6小鼠相比，用Exo-srIκB处理的小鼠对LPS诱导的死亡率有显著的抵抗力；从脓毒症中拯救了小鼠中的大部分并且显示延长的生存(图10A，上)。Exo-srIκB调节的作用与抗LPS诱导的温度下降的适度保护有关(图14A)。使用BALB/c小鼠开发LPS诱导的脓毒症的小鼠小鼠模型。Exo-srIκB处理显著提高在BALB/c小鼠中LPS诱导的脓毒症的存活率(图10A，中)。接下来使用CLP诱导的脓毒症模型作为标准化的腹腔内脓毒症的鼠模型来检查Exo-srIκB在存活方面的作用。动物存活过7-天监控期，表明Exo-srIκB提供抗脓毒症死亡的持续保护(图10A，下)。为进一步研究Exo-srIκB处理是否缓解由脓毒症诱导的炎症，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)确定血清中关键炎症因子的浓度。在用LPS-诱导的脓毒症的Exo-srIκB处理组中观测到促炎症细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6,以及趋化因子四氯化碳(CCL4)的表达水平的显著下降显著下降(图10B，上)。还观察到CLP组中的TNF-α和CCL4的血清水平显著地高于假手术对照小鼠中的水平，但是在用CLP和Exo-srIκB两者处理的小鼠中并没有提升(图10B,下)。这些结果提示Exo-srIκB减轻由LPS或CLP诱导的炎症，保护脓毒症小鼠对抗急性炎症过程。

多个研究显示急性肾损伤(AKI)是频繁和严重的脓毒症并发症，在50％或更多病例中发生，并且涉及很高的死亡率。为了判定Exo-srIκB在脓毒症小鼠模型中CLP诱导的AKI中作用，进行肾脏组织学检查。与进行假手术的那些相比，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠和Exo-天然小鼠的肾小管细胞在空泡化、刷毛缘的损失和小管上皮细胞的核凝集方面显示显著的损伤(图10C)。需注意，Exo-srIκB处理显著降低对小管区域的损伤，保护近侧小管以及证明了Exo-srIκB针对脓毒症诱导的肾损伤的治疗潜力。这些结果与LPS诱导的AKI的结果相一致(图14B)。进一步评估组织学肾脏损伤的严重程度，发现Exo-srIκB处理在两种脓毒症模型中的损伤得分均显著降低了50％(图10D)。尽管出现一些损伤区域，但是Exo-srIκB减轻了肾小管中的退行性变化。这些数据表明，Exo-srIκB在改善脓毒症小鼠肾脏生理结构和功能方面至关重要。

实施例11.LPS注射后外泌体的生物分布

研究了注射LPS的脓毒症小鼠模型中外泌体生物分布的变化。使用定制的活体视频速率激光扫描共聚焦显微术系统分析体内生物分布。将mCLING荧光染料标记的外泌体静脉内注射到LysM^gfp/+转基因C57BL/6小鼠内，该小鼠也已经注射了抗-Ly6G抗体，以可视化中性粒细胞(绿色荧光蛋白[GFP]和Alexa 555)和巨噬细胞(GFP)。观察到大多数外泌体被中性粒细胞和巨噬细胞迅速摄取，即，在静脉内注射外泌体的几分钟之内(图11A)。

外泌体主要递送到肝脏的中性粒细胞(图11B)，并且在LPS诱导的小鼠的脾脏中观察到中性粒细胞和巨噬细胞的募集增加，以及增加的外泌体的摄取(图11C)。将mCLING标记的外泌体递送到注射LPS的小鼠肾脏中的中性粒细胞(图15A)。这些观察结果表明，在脓毒症小鼠模型中，在30分钟内治疗性外泌体被成功递送到目标中性粒细胞和巨噬细胞。

实施例12.Exo-srIκB减轻与脓毒症关联的炎症

体外鉴定了Exo-srIκB的靶特异性和效率。Exo-srIκB，而不是Exo-天然，在稳定表达NF-κB荧光素酶报道基因的HEK293细胞中显著阻断TNF-α诱导的NF-κB的激活(图12A)。Exo-srIκB的增加剂量以剂量依赖的方式降低NF-κB报告活性，表明从外泌体释放的srIκB阻止NF-κB转录活性(图12B)。

在所有脓毒症-响应细胞中，单核细胞/巨噬细胞在促进免疫应答中具有最重要的作用，并且脓毒症小鼠中这些细胞的消耗会增加死亡率。在细胞培养模型中广泛地使用THP-1细胞代表单核细胞。当使用LPS刺激THP-1细胞，与Exo-天然相比较，使用Exo-srIκB处理导致受NF-κB转录控制的炎症细胞因子TNF-α和单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的分泌降低(图12C)。还将Exo-srIκB的作用与通常使用的NF-κB抑制剂JSH-23的作用相比较，JSH-23干扰NF-κB与其靶DNA的结合。实例数据显示在抑制LPS诱导的NF-κB激活和THP-1细胞中的细胞因子产生方面，Exo-srIκB和JSH-23具有相当的效果(图12C,柱4对比柱6)。

脓毒症的特征是单核细胞粘附于内皮细胞。在正常情况下，内皮细胞是静止的，不与单核细胞相互作用。然而，在炎症环境中，活化的内皮细胞表达黏附分子，例如细胞间细胞黏附分子(ICAM)-1，其与单核细胞结合。广泛认为黏附分子的表达在脓毒症的发展过程中被激活。

为了探讨Exo-srIκB对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中细胞黏附分子表达的影响，该实施例首先检查了Exo-srIκBs是否在细胞中内化。在HUVEC中可检测到mCLING标记的Exo-srIκB，在24h后观察到最大内化(图12D)。发现Exo-srIκB处理显著地抑制HUVEC中的ICAM-1表达(图12E)。IL-8和MCP-1还触发了单核细胞向血管内皮的迁移和粘附，并且导致这些细胞外渗到周围组织中。在之前的各种组织中在由细菌和病毒感染的急性炎症期间已经观察到IL-8和MCP-1的表达，并且其与严重的脓毒症有关联。发现Exo-srIκB通过抑制HUVEC中的NF-κB转录活性(图16B)来抑制LPS诱导的IL-8和MCP-1的产生(图16A)。这些结果确认Exo-srIκB降低在脓毒症期间NF-κB介导的炎症反应。

实施例13.Exo-srIκBs对LPS诱导脓毒症中的肺损伤的保护作用。

动物接受致死剂量(30mg/kg体重)的LPS的单次腹腔内注射30分钟，然后单次静脉内注射Exo-srIkB(1x10¹⁰)10hr。如图17所示通过H&E染色分析肺组织。LPS注射10hr组显示中性粒细胞浸润和肺泡巨噬细胞增殖，肺泡内和外充血，并且出血持续。观察到肺泡内皮细胞损伤以及肺泡坏死。尽管观察到轻微充血，但是外泌体给药缓解了肺泡壁扩张，中性粒细胞浸润和肺泡巨噬细胞增殖。

向LPS施用组(阴性对照)和3剂Exo-srIkB施用组施用30mg/kg LPS，每组由10只小鼠组成。给药30分钟后，i.v注射一次Exo-srIkB，并评估72小时的存活率，如图18所示。与对照C57BL/6小鼠相比，经高剂量Exo-srIκB处理的小鼠对LPS诱导的死亡率具有抵抗力，并显示出延长的存活。

向LPS施用组(阴性对照)和3剂Exo-srIkB施用组给药30mg/kg LPS，每组由5只小鼠组成。给药30分钟后，i.v注射一次Exo-srIkB，并在每个时间点通过尸检获得血浆。通过ELISA方法测量获得的TNF-α血浆水平(图19)。在LPS诱导的脓毒症的Exo-srIκB处理组中，促炎症细胞因子TNF-α的表达水平以时间依赖性方式降低。

动物接受致死剂量(30mg/kg体重)的LPS单次腹腔内注射30分钟，然后单次静脉注射Exo-srIkB(1x10¹⁰)。通过H&E染色分析肝脏组织(图20)。LPS给药1小时后，观察到中央静脉周围库普弗细胞和免疫细胞略有浸润，但在外泌体施用组中减轻了炎症细胞的浸润。LPS给药10小时后，中央静脉周围库普弗细胞和免疫细胞的浸润显着增加，并观察到肝细胞间结缔组织的损伤。在外泌体施用组中，减少了浸润，但是肝细胞坏死和肿胀过程有望逐渐缓解。因此，反复给药外泌体有望增强保护作用。

治疗AKI的实施方式

实施方式1.一种治疗有需要的受试者急性肾损伤(AKI)的方法，包括向受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

实施方式2.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：NF-κB抑制蛋白、其片段及其混合物。

实施方式3.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)、IκB-α、IκB-β、IκB-ε、BCL-3、其突变体和其混合物。

实施方式4.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂时超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)。

实施方式5.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述组合物是通过口服、经皮、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下或混合途径给药。

实施方式6.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

实施方式7.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向受试者给药抗炎剂。

实施方式8.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述包含NF-κB抑制剂的外泌体进一步包括光特异性结合蛋白。

实施方式9.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。

实施方式10.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:1表示。

实施方式11.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:2表示。

实施方式12.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述光特异性结合蛋白是第一光特异性结合蛋白和/或第二光特异性结合蛋白；所述第一光特异性结合蛋白与外泌体特异性标志物缀合以形成融合蛋白I；并且所述第二光特异性结合蛋白与NF-κB抑制剂结合以形成融合蛋白II。

实施方式13.根据实施方式12所述的方法，其中所述融合蛋白I和所述融合蛋白II通过所述第一光特异性结合蛋白和所述第二光特异性结合蛋白可逆地连接。

实施方式14.根据实施方式12或13所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白与所述外泌体特异性标志物缀合以在朝向所述外泌体内部的方向上定位。

实施方式15.根据实施方式12-14中任一项所述的方法，其中第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白选自于由以下组成的组：CIB、CIBN、PhyB、PIF、FKF1、GIGANTEA、CRY和PHR。

实施方式16.根据实施方式15所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是CIB或者CIBN并且所述第二光特异性结合蛋白是CRY或者PHR。

实施方式17.根据实施方式15所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是CRY或者PHR并且所述第二光特异性结合蛋白是CIB或者CIBN。

实施方式18.根据实施方式15所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是PhyB并且所述第二光特异性结合蛋白是PIF。

实施方式19.根据实施方式15所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是PIF并且所述第二光特异性结合蛋白是PhyB。

实施方式20.根据实施方式15所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是GIGANTEA并且所述第二光特异性结合蛋白是FKF1。

实施方式21.根据实施方式15所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是FKF1并且所述第二光特异性结合蛋白是GIGANTEA。

实施方式22.根据权利要求12-21中任一项所述的外泌体，其中所述外泌体特异性标志物选自由CD9、CD63、CD81和CD82组成的组。

实施方式23.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述外泌体具有在约50nm和约200nm之间的直径。

实施方式24.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述外泌体具有在约50nm和约150nm之间的直径。

实施方式25.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述组合物是进一步包括生理学上可接受的载体的药物组合物。

实施方式26.用于治疗AKI的包括包含实施方式1-16所描述的NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

实施方式27.组合物用于治疗AKI的用途，所述组合物包括包含实施方式1-16所描述的NF-κB抑制剂的外泌体。

治疗其他疾病的实施方式

实施方式1.一种治疗有需要的受试者由脓毒症引起的疾病的方法，包括：向所述受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

实施方式2.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述疾病选择由肺炎、细胞因子风暴综合征、呼吸窘迫综合征和器官衰竭组成的组。在一些实施方式中，所述疾病是肺炎。在一些实施方式中，所述疾病是细胞因子风暴综合征。在一些实施方式中，所述疾病是呼吸窘迫综合征。在一些实施方式中，所述疾病是器官衰竭。

实施方式3.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：NF-κB抑制蛋白、其片段及其混合物。

实施方式4.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)、IκB-α、IκB-β、IκB-ε、BCL-3、其突变体和其混合物。

实施方式5.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂时超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)。

实施方式6.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述组合物是通过口服、经皮、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下或混合途径给药。

实施方式7.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

实施方式8.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向受试者给药抗炎剂。

实施方式9.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述包含NF-κB抑制剂的外泌体进一步包括光特异性结合蛋白。

实施方式10.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。

实施方式11.根据实施方式10所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:1表示。

实施方式12.根据实施方式10所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂由SEQ ID NO:2表示。

实施方式13.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述光特异性结合蛋白是第一光特异性结合蛋白和/或第二光特异性结合蛋白；所述第一光特异性结合蛋白与外泌体特异性标志物缀合以形成融合蛋白I；并且所述第二光特异性结合蛋白与NF-κB抑制剂结合以形成融合蛋白II。

实施方式14.根据实施方式13所述的方法，其中所述融合蛋白I和所述融合蛋白II通过所述第一光特异性结合蛋白和所述第二光特异性结合蛋白可逆地连接。

实施方式15.根据实施方式13或14所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白与所述外泌体特异性标志物缀合以在朝向所述外泌体内部的方向上定位。

实施方式16.根据实施方式13-15中任一项所述的方法，其中第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白选自于由以下组成的组：CIB、CIBN、PhyB、PIF、FKF1、GIGANTEA、CRY和PHR。

实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是CIB或者CIBN并且所述第二光特异性结合蛋白是CRY或者PHR。

实施方式18.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是CRY或者PHR并且所述第二光特异性结合蛋白是CIB或者CIBN。

实施方式19.根据实施方式16所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是PhyB并且所述第二光特异性结合蛋白是PIF。

实施方式20.根据实施方式16所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是PIF并且所述第二光特异性结合蛋白是PhyB。

实施方式21.根据实施方式16所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是GIGANTEA并且所述第二光特异性结合蛋白是FKF1。

实施方式22.根据实施方式16所述的方法，其中所述第一光特异性结合蛋白是FKF1并且所述第二光特异性结合蛋白是GIGANTEA。

实施方式23.根据实施方式13-22中任一项所述的方法，其中所述外泌体特异性标志物选自由CD9、CD63、CD81和CD82组成的组。

实施方式24.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述外泌体具有在约50nm和约200nm之间的直径。

实施方式25.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述外泌体具有在约50nm和约150nm之间的直径。

实施方式26.根据上述实施方式中任一项所述的方法，其中所述组合物是进一步包括生理学上可接受的载体的药物组合物。

实施方式27.用于治疗由脓毒症引起的疾病的包括包含实施方式1-16所描述的NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

实施方式28.组合物用于治疗由脓毒症引起的疾病的用途，所述组合物包括包含实施方式1-16所描述的NF-κB抑制剂的外泌体。

尽管本文通过参考各种特定材料、程序和实施例已经示例和描述了本公开，但是应理解的是，本公开不被限制于为前述目的而选择的特定材料和程序的特定组合。本领域人员应当理解所暗示的所述细节的无数变化。说明书和实施例旨在视为仅用作示例性，本公开的真是范围和精神由以下权利要求所表示。本申请所指的所有参考、专利和专利申请，其全部内容通过援引并入本文。

Claims

1.一种治疗有需要的受试者急性肾损伤(AKI)的方法，包括：向所述受试者给药有效量的包括包含NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：NF-κB抑制蛋白、其片段及其混合物。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NF-κB抑制剂选自由以下组成的组：超阻遏物(SR)-IκB(srIκB)、IκB-α、IκB-β、IκB-ε、BCL-3、其突变体和其混合物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物是通过口服、经皮、腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下或混合途径给药。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者给药抗炎剂。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含NF-κB抑制剂的外泌体进一步包括光特异性结合蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述NF-κB抑制剂包括具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少85％序列同一性的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

所述包含NF-κB抑制剂的外泌体进一步包含第一光特异性结合蛋白和/或第二光特异性结合蛋白，

所述第一光特异性结合蛋白与外泌体特异性标志物缀合以形成融合蛋白I；以及

所述第二光特异性结合蛋白与所述NF-κB抑制剂缀合以形成融合蛋白II。

9.一种治疗有需要的受试者由脓毒症引起的疾病的方法，包括：向所述受试者给药有效量的包括包含有NF-κB抑制剂的外泌体的组合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病选自由肺炎、细胞因子风暴综合征、呼吸窘迫综合征和器官衰竭组成的组。