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CN115300619B - 基于人乳头瘤病毒l2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法 - Google Patents

基于人乳头瘤病毒l2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN115300619B
CN115300619B CN202210777251.5A CN202210777251A CN115300619B CN 115300619 B CN115300619 B CN 115300619B CN 202210777251 A CN202210777251 A CN 202210777251A CN 115300619 B CN115300619 B CN 115300619B
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Abstract

本申请涉及生物制药技术领域，尤其涉及基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法；所述广谱疫苗包括纳米材料包裹L2蛋白多肽所形成的纳米疫苗，纳米疫苗为核壳结构，其中，内核为L2蛋白多肽，外壳为纳米材料；所述方法包括：对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到L2蛋白多肽；对所述L2蛋白多肽和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米疫苗；对所述佐剂和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米佐剂；收集所述纳米疫苗和纳米佐剂，得到广谱疫苗；通过采用纳米材料包裹L2蛋白多肽形成纳米疫苗，能避免L2蛋白多肽被破坏，同时能使得L2蛋白多肽在生物体内缓慢释放，综合提高L2蛋白多肽类疫苗的稳定性。

Description

基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物制药技术领域，尤其涉及基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法。
背景技术
高危人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是导致宫颈癌的主要病因，HPV亚型众多，迄今已发现达220余种，根据其对人类致病危害程度可大致分为高危型和低危型两大类，其中，高危型主要包括HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV35，HPV39，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58和HPV59等，与人类宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关；低危型主要以HPV6、HPV11为代表，主要引起生殖器疣等良性增生性病变。
病毒预防性疫苗是以病毒抗原作为起始材料，采用生物技术制备而成，通过刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防相应病毒感染的生物制品，其中代表性的病毒预防性疫苗为HPV疫苗，HPV疫苗一般以病毒主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原，诱发机体产生高滴度的中和抗体和有效的局部免疫反应，以阻止HPV的长期感染和重复感染。
目前，大部分的HPV疫苗均由所包含病毒型别的主要衣壳蛋白L1基因重组后形成的病毒样颗粒构成，具有型特异性，只能够预防针对所包含型别的感染，不能完全保护机体免受其他HPV型别的感染；而L2蛋白在HPV各型别中高度保守，有许多多肽表位可与其他型别的HPV发生交叉中和反应，且其多为线性表位，其多肽分子量小，可在原核系统内生产，具有工艺简单，造价低廉，副作用少等优势，但是与L1蛋白相比，其诱导产生的抗体滴度较低，这是由于传统的蛋白多肽类疫苗会被体内酶和其他多种因素破坏，使得L2蛋白多肽在体内的稳定性差，导致L2蛋白多肽在体内的半衰期较短，因此如何提高L2蛋白多肽类疫苗在体内的稳定性，以提高L2蛋白多肽在体内的半衰期，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法，以解决现有技术中L2蛋白多肽类疫苗在体内的稳定性较差的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗，所述广谱疫苗包括纳米材料包裹L2蛋白多肽所形成的纳米疫苗，所述纳米疫苗为核壳结构，其中，内核为L2蛋白多肽，外壳为纳米材料。
可选的，所述L2蛋白多肽的序列如SEQ ID NO.1。
可选的，所述广谱疫苗还包括纳米材料包裹佐剂所形成的纳米佐剂，所述纳米佐剂为核壳结构，其中，内核为佐剂，外壳为纳米材料。
可选的，所述佐剂包括咪喹莫特(即R837)。
可选的，所述纳米材料包括：TPGS-b-(PCL-ran-PGA)共聚物纳米材料。
第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的广谱疫苗的方法，所述方法包括：
对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽；
对所述L2蛋白多肽和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米疫苗；
对所述佐剂和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米佐剂；
收集所述纳米疫苗和所述纳米佐剂，得到广谱疫苗。
可选的，所述对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽，具体包括：
对HPV L2蛋白抗原的基因片段以DNA序列数据库中的基因序列进行比对，后进行分析，得到L2蛋白的氨基酸序列；
预测所述氨基酸序列的二级结构、亲水性、可塑性、抗原指数和表面可及性，后以目标条件进行考察和筛分，得到多条L2蛋白多肽序列；
对多条所述L2蛋白多肽序列进行筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽。
可选的，所述目标条件包括多肽的亲水性、多肽的空间结构、多肽的序列保守性和多条的免疫原性。
可选的，所述筛选包括以氨基酸的预设序列长度和是否有二级结构进行筛选，所述预设序列长度为8～20个。
可选的，所述纳米疫苗和所述纳米佐剂的粒径都为100m～600nm。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗，通过采用纳米材料包裹L2蛋白多肽形成纳米疫苗，由于L2蛋白多肽分子量小，通过纳米材料的包裹，能一定程度上避免生物体内酶和其他多种因素对L2蛋白多肽造成破坏，同时通过纳米材料的承载，使得L2蛋白多肽在生物体内缓慢释放，发挥缓控释、长循环等效果，从而综合提高L2蛋白多肽类疫苗的稳定性。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的方法的详细流程示意图；
图3为本申请实施例提供的L2蛋白多肽的氨基酸序列免疫原性分析的示意图；
图4为本申请实施例提供的L2蛋白多肽序列结构分析的示意图；
图5为本申请实施例提供的复乳溶剂挥发法的流程示意图；
图6为本申请实施例提供的纳米疫苗TPP-L2pep纳米粒的扫描电镜图；
图7为本申请实施例提供的纳米疫苗TPP-L2pep纳米粒的粒径分布图；
图8为本申请实施例提供的纳米佐剂TPP-R837纳米粒的粒径分布图；
图9为本申请实施例提供的纳米佐剂和纳米疫苗的体外释放曲线示意图；
图10为本申请实施例提供的细胞对空白纳米粒的摄取情况示意图；
图11为本申请实施例提供的细胞对带有荧光标记的纳米粒TPP-FITC-BSA的摄取情况示意图；
图12为本申请实施例提供的在1∶200稀释度条件下TPP-L2pep组、TPP-L2pep和TPP-R837混合组的血清抗体水平对比情况图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
在本申请的一个实施例中，提供一种基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗，所述广谱疫苗包括纳米材料包裹L2蛋白多肽所形成的纳米疫苗，所述纳米疫苗为核壳结构，其中，内核为L2蛋白多肽，外壳为纳米材料。
在一些可选的实施方式中，所述L2蛋白多肽的序列如SEQ ID NO.1。
本申请实施例中，控制L2蛋白多肽序列为CTSSTPIPGSRPT(Cys-Thr-Ser-Ser-Thr-Pro-Ile-Pro-Gly-Ser-Arg-Pro-Thr)的积极效果是由于该段序列是HPV52 L2蛋白中氨基酸位置在211-222的多肽序列，同时该序列和HPV16/33/35/58型别有同源序列，因此具有较好的广谱性，并且整体多肽序列的免疫原性和亲水性较好，无二级结构，因此能作为免疫原进行纳米疫苗的制备。
在一些可选的实施方式中，所述广谱疫苗还包括纳米材料包裹佐剂所形成的纳米佐剂，所述纳米佐剂为核壳结构，其中，内核为佐剂，外壳为纳米材料。
本申请实施例中，控制广谱疫苗还包括佐剂，可以通过佐剂辅助纳米疫苗的免疫反应，提高纳米疫苗的预防效果。
在一些可选的实施方式中，所述佐剂包括咪喹莫特(R837)。
本申请实施例中，控制佐剂包括咪喹莫特，由于Toll样受体(TLR)是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，其配体或激动剂可作为重要的免疫佐剂，上调预防性疫苗诱导的特异性免疫应答，其中TLR7是I型跨膜蛋白，能诱导产生炎症因子、趋化因子和IFN-I来发挥生物学效应，而人工合成的咪喹莫特(R837)可活化TLR7，能通过诱导炎症细胞因子IFN-α和IL-12等的生成来发挥免疫调节作用，进而激活天然和获得性免疫，因此可以通过TLR7激动剂R837辅助纳米疫苗，提高纳米疫苗的预防效果。
在一些可选的实施方式中，所述纳米材料包括：TPGS-b-(PCL-ran-PGA)共聚物纳米材料。
本申请实施例中，控制纳米材料包括TPGS-b-(PCL-ran-PGA)共聚物纳米材料的积极效果是由于纳米材料TPGS-b-(PCL-ran-PGA)结合了PCL优良的药物透过性，PGA的快速降解性及TPGS优良的乳化助溶性，其作为药物载体能提高所包载药物的稳定性和作用效果，且具有良好的生物相容性，已在乳腺癌、宫颈癌的治疗及肺癌、膀胱癌口服化疗药物的应用等方面得以研究，而目前尚未在预防性疫苗的领域中利用，因此利用共聚物纳米材料包裹L2蛋白多肽，形成预防性纳米疫苗，可以很好的提高纳米疫苗的稳定性。
在本申请的一个实施例中，如图1所示，提供一种基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗的制备方法，所述方法包括：
S1.对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽；
S2.对所述L2蛋白多肽和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米疫苗；
S3.对所述佐剂和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米佐剂；
S4.收集所述纳米疫苗和所述纳米佐剂，得到广谱疫苗；
其中，所述包载制备包括复乳溶剂挥发法制备和溶剂挥发制备中的任一种。
在一些可选的实施方式中，如图2所示，所述对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽，具体包括：
S101.对HPVL2蛋白抗原的基因片段以DNA序列数据库中的基因序列进行比对，后进行分析，得到L2蛋白的氨基酸序列；
S102.预测所述氨基酸序列的二级结构、亲水性、可塑性、抗原指数和表面可及性，后以目标条件进行考察和筛分，得到多条L2蛋白多肽序列；
S103.对多条所述L2蛋白多肽序列进行筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽，其中，DNA序列数据库可以是Genbank。
本申请实施例中，先通过对HPVL2蛋白抗原的基因片段进行比对，再分析其翻译出的L2蛋白的氨基酸序列，再通过氨基酸序列的结构特征和性能特征，筛分出多条L2蛋白多肽序列，最后根据实际需求的特性进一步对L2蛋白多肽序列进行筛选，得到和HPV16/33/35/58型别有同源序列的L2多肽蛋白序列，使其具有广谱性。
在一些可选的实施方式中，所述目标条件包括多肽的亲水性、多肽的空间结构、多肽的序列保守性和多肽的免疫原性。
本申请实施例中，控制目标条件的类型，能有效的将符合条件的多条L2蛋白多肽序列筛分出，为后续得到最终的单一序列的L2蛋白多肽作铺垫。
在一些可选的实施方式中，所述筛选包括以氨基酸的预设序列长度、亲水性及是否有二级结构进行筛选，所述预设序列长度为8～20个。
本申请实施例中，预设序列长度为8～20个的积极效果是在该预设序列长度范围内，既保证产生的抗体具有亲和性和特异性，无二级结构，又易于获取高纯度的多肽产品，方便其制备，降低预防性疫苗的制备成本。
在一些可选的实施方式中，所述纳米疫苗和所述纳米佐剂的粒径都为100mm～600nm。
本申请实施例中，控制纳米疫苗和纳米佐剂的粒径，对保证纳米疫苗的质量稳定性和作用效果是重要的。
实施例1
S1.对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽，具体包括：
一、HPV L2蛋白抗原表位分析，筛选抗原肽：
1.对HPV L2蛋白抗原的基因片段进行PCR扩增，结合Genbank中提交的基因序列进行比对，如图3所示，分析L2蛋白的氨基酸序列；
2.如图4所示，分别运用Gamier-Robson和Chou-Fasman的方法预测氨基酸序列的二级结构，包括氨基酸序列所形成蛋白的α、β区域，转角、卷曲等区域，运用Kyte-Doolittle和Eisenberg方法预测蛋白的亲水性，运用Karplus-Schulz方法预测其可塑性，运用Jameson-Wolf方法预测抗原指数，运用Emini方法预测表面可及性，在以多肽的亲水性，空间结构，序列保守性和免疫原性作为考察指标的前提下，得到多条L2蛋白多肽序列；
3.选择序列长度在8-20个氨基酸残基、无二级结构、亲水和尽量位于蛋白表面的多肽序列，经过比较分析，选择了HPV52 L2蛋白中氨基酸位置在211-222的L2蛋白多肽序列CTSSTPIPGSRP。
L2蛋白抗原表位预测结果
实施例2
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
S2.对L2蛋白多肽和所述纳米材料进行复乳溶剂挥发法制备，得到纳米疫苗，具体包括：
二、纳米疫苗的制备：
1.合成纯度在95％以上的L2蛋白多肽100mg，作为免疫原进行纳米疫苗制备，采用纳米材料TPGS-b-(PCL-ran-PGA)分别包载L2多肽片段和佐剂R837，制备纳米疫苗TPP-L2pep和纳米佐剂TPP-R837。
2.按照复乳溶剂挥发法制备含有纳米疫苗的纳米粒TPP-L2pep，如图5所示，使用该方法，可以将不相溶的水相和油相通过超声和机械搅拌乳化制得乳剂，挥发以除去内相溶剂，析出成球材料，固化成微球，适合小批量制备纳米粒，具体方法包括：
(1)称取100mg的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)溶解于2mL的二氯甲烷(DCM)中，将10mg多肽溶于200μL的PBS后加入DCM溶液中，于冰上以40％功率，超声30s，得到乳化液。
(2)往乳化液中缓缓加入6mL的7％(W/V)的PVA水溶液，于冰上以40％功率，超声25s。
(3)使用1mL注射器，将所得乳液逐滴加入到磁力搅拌器上的50mL的含2％异丙醇的1％(W/V)PVA水溶液中，边加边磁力搅拌，加完后以600rpm磁力搅拌过夜，得到纳米溶液。
(4)将纳米溶液倒入离心管中，以4℃在20000rpm条件下离心20min，收集上清液，并往纳米粒沉淀中加入适量无菌水，以4℃在20000rpm条件下离心20min，再移除上清液。
(5)重复加水离心清洗三次，之后加入无菌水重悬，放入-80℃的冰箱冷冻结冰。
(6)从冰箱中取出纳米粒冷冻结块后的离心管，拿开管盖，用封口膜封住管口，并在薄膜上戳数个小孔，立即放入冷冻干燥机内冷冻干燥2天，待纳米微粒变成干粉或棉絮状时拿出，于4℃保存备用，得到纳米疫苗。
S3.对佐剂和所述纳米材料进行溶剂挥发法制备，得到纳米佐剂，具体包括：
(1)称取5mg的R837溶于DMSO中，加热溶解，再称取100mg的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)溶解于2mL的DCM中，将R837加入DCM溶液中混匀，得到混合液。
(2)往混合液中缓缓加入6mL的5％(W/V)的PVA水溶液，于40％功率和冰浴条件下，超声30s，得到乳液。
(3)使用1mL注射器，将所得乳液逐滴加入到磁力搅拌器上的50mL的含2％异丙醇的1％(W/V)PVA水溶液中，边加边磁力搅拌，加完后以600rpm磁力搅拌过夜，得到纳米溶液。
(4)将纳米溶液倒入离心管中，以4℃在20000rpm条件下离心20min，收集上清液，并往纳米粒沉淀中加入适量无菌水，以4℃在20000rpm条件下离心20min，再移除上清液。
(5)重复加水离心清洗三次，之后加入无菌水重悬，放入-80℃冰箱冷冻结冰。
(6)从冰箱中取出纳米粒冷冻结块后的离心管，拿开管盖，用封口膜封住管口，并在薄膜上戳数个小孔，立即放入冷冻干燥机内冷冻干燥2天。待纳米微粒变成干粉或棉絮状时拿出，于4℃保存备用，得到纳米佐剂。
S4.收集纳米疫苗和纳米佐剂，得到广谱疫苗。
实施例3
将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：
对得到的纳米疫苗和纳米佐剂进行检测：
三、广谱疫苗特性检测：
广谱疫苗特性检测包括纳米粒表征，纳米粒的包封率和载药量检测，纳米粒的体外缓释性，细胞对纳米粒摄取的鉴定，流程如下：
1.纳米粒的理化性质表征：
使用扫描电镜法观察纳米粒表面形态，取冻干的包括纳米疫苗和纳米佐剂的纳米粒的粉末少许，用导电胶将倒出的粉末粘贴到样品铜座上，在扫描电镜下观察纳米粒的表面形态并照相，再通过动态光散射仪和激光粒度仪测量纳米粒的粒径大小、zeta电位及多分散指数，每种样品分别测量三次，计算其平均值。
如图6所示，本申请制备的纳米疫苗TPP-L2pep纳米粒表面都光滑圆整，呈圆球形，并且如图7所示，其平均粒径均在100-600nm之间，粒径分布图显示纳米粒粒径分布峰较集中，大小均一。
同时，如图8所示，所制备得到的纳米佐剂TPP-R837纳米粒的平均粒径在100-600nm之间，粒径分布图显示纳米粒粒径分布峰较集中，大小均一。
2.纳米粒的包封率和载药量检测：
使用标准曲线法检测纳米粒的包封率和载药量，该方法先将标准品成分配制成不同的已知浓度溶液，测定吸光度值，绘制出标准曲线，在纳米粒的制备过程中，收集纳米粒离心后的上清液，通过测量纳米粒离心上清液吸光度值，得到未包封该成分的含量，从而计算出纳米粒的包载效率，并按照以下公式计算纳米粒的包封率和载药量：
包封率(％)＝(纳米粒制备中加入的L2pep或R837总量-上清液中游离的L2pep或R837的含量)/(纳米粒制备中加入的L2pep或R837总量)×100％；
载药量＝(纳米粒制备中加入的L2pep或R837总量-上清液中游离的L2pep或R837的含量)/纳米粒的总重量。
具体实施方法如下：
将标准品的L2蛋白多肽配制成不同浓度的已知溶液，并测定不同浓度在214nm处的吸光度值，再绘制出标准曲线。
测量纳米离心上清液中在214nm处的吸光度值，记为A214值，再根据标准曲线，计算得到未包封L2蛋白多肽的含量，从而计算得到包裹有L2蛋白多肽的纳米疫苗的包封率和载药量，重复制备纳米疫苗三次，并测量计算其平均值。
将佐剂R837溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并呈倍比稀释成不同浓度溶液(0，0.05，0.1，0.2，0.4mg/mL)，测量在325nm处的吸光度值，并绘制标准曲线，计算得到纳米佐剂离心后的上清液中未包封佐剂R837的含量，得出包括纳米佐剂的纳米粒的包封率和载药量，多次测量取平均值。
根据标准曲线计算，纳米疫苗TPP-L2pep的包封率约为51.24％，载药量约为73.20μ/mg；纳米佐剂TPP(R837)的包封率约为27.25％，载药量约为20.96μg/mg。
3.纳米粒的体外缓释性：
称取包括纳米疫苗或纳米佐剂的纳米粒，分装成数管，每管5mg，向5mg的纳米粒中加入1mL的PBS，混匀，于恒温水浴振荡器中以37℃和150rpm条件下振荡孵育，并在不同的时间点(4h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，7d，14d，21d，28d)取出样品，以15000rpm离心15min收集上清液，检测吸光度值，后参照标准曲线计算上清液中L2蛋白多肽和佐剂R837的释放量。
如图9所示，纳米疫苗和纳米佐剂的体外释放曲线显示，开始阶段两者的纳米粒都快速释放，而24h后释放出的L2蛋白多肽和佐剂R837分别为8.4％和6.5％，并持续释放达到高峰，之后速度渐渐放缓，至实验结束28天L2多肽和R837的含量分别为44.2％和34.8％。
4.细胞对纳米粒摄取鉴定：
按照所述复乳溶剂挥发法，使用纳米材料包载异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)，制备荧光标记纳米粒TPP-FITC-BSA和空白对照纳米粒TPP-blank，检测包封率。
准备Hela细胞，接种到12孔板，于37℃培养过夜，次日以PBS清洗两次，每孔加入1mL无血清培养基，于37℃孵育1h，再分别加入纳米粒TPP-FITC-BSA和对照TPP-blank(纳米粒终浓度都为0.2mg/m1)，分别与Hela细胞在37℃条件下孵育4h。
用1mL预冷的PBS清洗孵育后的细胞三次，移除游离的纳米粒，再加入完全培养基继续培养，24h后荧光显微镜下观察细胞的荧光强度，研究该纳米粒的摄取情况。
为了观察细胞对纳米粒的摄取情况，制备了带有荧光标记的纳米粒TPP-FITC-BSA，同时以空白纳米粒TPP-blank作为对照，如图10和图11所示，与HeLa细胞孵育后发现TPP-FITC-BSA与细胞作用后显微镜下可见明显绿色荧光，说明蛋白FITC-BSA成功包载入纳米粒内，并能够被细胞所摄取。据此推测L2多肽被包载进TPP后，亦能被细胞摄取，并释放L2多肽抗原，诱导免疫反应的发生。
实施例4
将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：
四.纳米疫苗效果评价：
为了检测制备的纳米疫苗TPP-L2pep及纳米佐剂TPP-R837能否在体内有效诱导体液免疫反应，使用了ELISA方法对免疫小鼠血清进行检测：
选用6～8周龄的雌性BALB/C小鼠，随机分成不同实验组，包括PBS组，TPP-blank组，L2pep组，TPP-L2pep组，R837组，TPP-R837组，TPP-L2pep和TPP-R837混合组，L2pep和R837混合组，将各个纳米粒干粉用无菌PBS溶解后，各组于腹腔皮下注射免疫小鼠，一周后加强免疫一次，14天后小鼠摘眼球取血，收集血液后室温放置15min，然后于4℃静置3h，待血液凝固后，于3000rpm离心10min，分离获得血清，检测血清中HPV的抗体水平。
其中，ELISA具体操作步骤如下：
(1)包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释，包被浓度为2μg/mL，每孔加100μL，于37℃温育2h后，在4℃的冰箱放置16h～18h，完成包被。
(2)洗涤：包被结束后倒尽板孔中液体，加满PBST缓冲液进行洗涤，后静放5min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3～5次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
(3)封闭：在ELISA板的每孔加封闭液200μL，于37℃放置2h。
(4)洗涤：对封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同(2)。
(5)加被检血清：用稀释液将血清从1∶40的比例进行5倍系列稀释，稀释度分别为1∶40，1∶200、1∶1000、1∶5000，1∶25000，1∶125000，1∶625000，每孔加入100μL的血清稀释液，同时设空白对照和阴性对照，于37℃孵育2h。
(6)洗涤：方法同(2)。
(7)加二抗：加HRP标记的二抗，用稀释液稀释，稀释倍数参考说明书，二抗1∶5000稀释，取2μL抗体加到10mL稀释液里面。将稀释好的二抗加入各孔，每孔100μL，于37℃反应1h。
(8)洗涤：方法同(2)。
(9)显色：显色液需现配，每孔100μL，具体方法为：
在(8)进行到一半时配置显色液，先配制2mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)使用液(称取10mg的TMB粉末溶于5mL无水乙醇，待其完全溶解)，取0.5mL的TMB使用液加入9.5mL的底物缓冲液，待(8)完成后取10uL的30％的过氧化氢溶液加入之前配置的10mL溶液中混匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中，然后将ELISA板于37℃反应约10min～20min。
(10)终止：将ELISA板取出，每孔加终止液(2mol/L的硫酸溶液)50μL。
(11)观察结果：终止后立即到酶标仪上于450nm处上读数，以空白对照孔调零后测各孔的OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
如图12所示，本申请的数据显示在1∶200稀释度下，TPP-L2pep组、TPP-L2pep和TPP-R837混合组都表现出较高的血清抗体水平，且相比较游离的L2pep组，用纳米材料包载后提高了小鼠血清中抗体水平，这说明用纳米材料包载L2多肽后能对抗原起保护作用，延长抗原在机体内滞留时间，从而能更加有效地刺激抗体的产生。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
(1)本申请实施例提供的广谱疫苗，通过采用纳米材料包裹L2蛋白多肽形成纳米疫苗，由于L2蛋白多肽分子量小，通过纳米材料的包裹，能避免生物体内酶和其他多种因素对L2蛋白多肽造成破坏，同时能使得L2蛋白多肽在生物体内缓慢释放，发挥缓控释、长循环等效果，综合提高L2蛋白多肽类疫苗的稳定性和作用时间。
(2)本申请实施例提供的广谱疫苗，由于L2蛋白多肽分子量小，可在体外合成或在原核系统内进行生产，工艺简单并且造价低廉，能有效的降低HPV疫苗的制备成本。
(3)本申请实施例提供的广谱疫苗，将纳米材料TPGS-b-(PCL-ran-PGA)用于预防性疫苗中，利用其包裹L2蛋白多肽，能有效的提高L2蛋白多肽类疫苗的稳定性。
(4)本申请实施例提供的广谱疫苗，通过以纳米材料包裹TLR7激动剂R837，能有效的辅佐纳米疫苗的功能，提高预防性疫苗的预防效果。
(5)本申请实施例提供的方法，整体流程简单，适合小规模的制备纳米疫苗和纳米佐剂。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Thr Ser Ser Thr Pro Ile Pro Gly Ser Arg Pro Thr
1 5 10

Claims (5)

1.一种基于人乳头瘤病毒L2蛋白的宫颈癌广谱疫苗，其特征在于，所述广谱疫苗包括纳米材料包裹L2蛋白多肽所形成的纳米疫苗，所述纳米疫苗为核壳结构，其中，内核为L2蛋白多肽，外壳为纳米材料；
所述L2蛋白多肽的序列如SEQ ID NO.1；
所述纳米材料为TPGS-b-(PCL-ran-PGA)共聚物纳米材料。
2.根据权利要求1所述的广谱疫苗，其特征在于，所述广谱疫苗还包括纳米材料包裹佐剂所形成的纳米佐剂，所述纳米佐剂为核壳结构，其中，内核为佐剂，外壳为纳米材料。
3.根据权利要求2所述的广谱疫苗，其特征在于，所述佐剂包括咪喹莫特。
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的广谱疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：
对HPV L2蛋白抗原进行表位分析和筛选，得到如SEQ ID NO.1所示的L2蛋白多肽；
对所述L2蛋白多肽和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米疫苗；
对所述佐剂和所述纳米材料进行包载制备，得到纳米佐剂；
收集所述纳米疫苗和所述纳米佐剂，得到广谱疫苗。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纳米疫苗和所述纳米佐剂的粒径分别为100nm～600nm。
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