CN115236049A - 心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物传感技术，旨在提供一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统与方法。该系统包括电穿孔与信号记录集成系统和图像采集与分析模块，以及通过排线与电穿孔与信号记录集成系统电连接的纳米微电极阵列器件；所述图像采集与分析模块包括设于纳米微电极阵列器件上方用于采集图像信号的荧光显微镜，以及内置于计算机中的用于实现图像分析功能的图像分析模块；荧光显微镜通过电缆连接至计算机，以实现图像信号的传送。本发明可以准确、高效地实现微电极阵列上的原位细胞电穿孔，能够实现递送效率及电信号分析。本发明提供的纳米微电极阵列器件制造工艺简单，有利于大规模加工，实现低成本的商业制造。

Description

心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统与方法

技术领域

本发明涉及生物传感技术，特别涉及一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化器件系统与方法。

背景技术

转染是通过将外源物质引入细胞内环境来修饰靶细胞的一种通用策略，在生物医学研究中发挥着重要作用。为了实现细胞转染，电穿孔、脂质体或病毒的技术被广泛应用于实际应用中。其中，电穿孔术因操作方便、转染效率高而日益受到重视。当细胞被电穿孔时，细胞膜上会产生短暂的孔洞，使外源物质进入细胞。然而，数百伏特的电穿孔电压容易杀死细胞或引起不良反应，成功转染的细胞也有可能被高压电穿孔破坏。为了减少细胞损伤，研究人员开发了基于纳米器件的低压电穿孔技术。与高压相反电穿孔，这些纳米器件只需要几十伏特或几伏特的电压，已被证明可以实现类似的传输效率，并具有更高的细胞活力。为了保持细胞的高活力，生物分子(如DNA质粒、染料分子)通常在这些温和的电穿孔条件下被送入细胞和电信号同时记录。

电穿孔后细胞活性的变化，如基因重组或蛋白表达的改变，为进一步研究提供了基础。因此，评估细胞活力和传递效率对于在细胞水平上准确解释电穿孔策略至关重要。为了直观地检查细胞活力和传递效率，荧光染料或报道的荧光蛋白被用作常规的工具来表征。据报道，光学生物传感器具有检测色度或荧光信号的潜力。这些强大的光学生物传感器可以为检测来自细胞和分析物的荧光信号提供新的策略。对于定性和定量荧光分析，流式细胞术和荧光显微镜是检查细胞标记的有力方法，具有高灵敏度和高分辨率，可以对单个标记的细胞进行分类。因此，这些平台可以用于电穿孔的评估。然而，由于细胞采集过程耗时、复杂，影响了电穿孔结果的分析效率，流式细胞术难以满足纳米器件电穿孔原位评价的要求。为了实现准确和高效的电穿孔评估，荧光显微镜是原位分析细胞活力和传递效率的首选。电穿孔细胞根据其目标特征用不同的荧光探针进行标记。为了同时评估细胞活力和传递效率，LIVE/DEAD染料是电穿孔试验的首选。在这一对染料中，钙黄素AM渗透到细胞膜上，用酯酶裂解，在活细胞中显示绿色荧光。碘化丙啶(PI)不能作用于活细胞膜，但当细胞死亡或电穿孔时，它可以穿过破损的细胞膜，并与DNA或RNA结合时，表现出增强的红色荧光。基于这对染料的独特功能，转染质量可由绿色和/或红色荧光标记的细胞在总细胞中的比例来决定。因此，通过人工计数绿标记细胞、红标记细胞、绿-红标记细胞的数量，可以准确计算细胞活力和传递效率。然而，在处理大量荧光图像时，人工计数是一种繁琐而耗时的方法，具有很好的实用性。

为了提高分析效率，研究人员开发了智能分析软件ImageJ，取代了劳动密集型的手工工作，成为半自动高效的细胞转染分析平台。利用ImageJ可以获得目标区域内细胞的一系列几何特征，包括数量、周长和面积。然而，ImageJ在分析细胞活力和电穿孔传递效率方面仍然存在明显缺陷。例如ImageJ不能同时处理大量的图像，需要通过主观判断对每张图像手动设置阈值。此外，由于细胞识别、阈值选择和图像分割不准确，统计结果缺乏准确性。这些局限性极大地阻碍了电穿孔质量的分析评估。

对于自动化单元分析，大量的工作被用于开发自动化策略，而不是人工或主观的策略(例如，批量图像导入、阈值设置和计算)。直方图均衡化(HE)是增强图像对比度的关键过程，但它很难处理局部对比度高的情况。为了克服这一缺点，Ketcham提出了一种自适应直方图均衡化(AHE)算法，对图像的各个部分进行HE。然而，时间成本和图像噪声都增加了。为了进一步解决AHE的这些问题，引入了对比度有限自适应直方图均衡化(CLAHE)算法来处理荧光强度的不均匀性。尽管CLAHE算法清除了细胞边界，并将黑暗的细胞变亮，但传统分水岭算法仍难以准确识别重叠的细胞和极端黑暗的细胞。

因此，迫切需要建立一个自动化、准确、高效的电池电穿孔分析的强大平台，以实现细胞胞内递送与电传感检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统与方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统，包括电穿孔与信号记录集成系统和图像采集与分析模块；该系统还包括通过排线与电穿孔与信号记录集成系统电连接的纳米微电极阵列器件；

所述纳米微电极阵列器件包括由上至下依次布置的中空玻璃培养腔、纳米微电极阵列芯片和PCB适配器，纳米微电极阵列芯片固定在PCB适配器表面的中心位置；

所述玻璃培养腔呈中空圆环状，其径向尺寸与纳米微电极阵列芯片适配；当其被固定在纳米微电极阵列芯片上之后能够覆盖后者从而形成顶端开口的中空腔体，且以后者的表面作为中空腔体的底面；

所述纳米微电极阵列芯片是以玻璃板为基底，在基底上以点阵方式均匀设有若干个电极位点，通过光刻、磁控溅射和剥离工艺在基底上沿周向均匀地形成若干根由四周向中心延伸的电极引线，各电极引线彼此之间绝缘且末端分别延伸至所述电极位点处；在PCB适配器的表面由四周向中心延伸布置了若干根微带线，其数量与电极引线的数量相同，各微带线的一端与电极引线一一对应地相连，另一端与焊接在PCB适配器边缘的排针一一对应地电连接；

所述图像采集与分析模块包括设于纳米微电极阵列器件上方用于采集图像信号的荧光显微镜，以及内置于计算机中的用于实现图像分析功能的图像分析模块；荧光显微镜通过电缆连接至计算机，以实现图像信号的传送。

作为本发明的优选方案，所述纳米微电极阵列器件置于37℃、5.0％二氧化碳气氛的培养箱中；在器件的玻璃培养腔中设有参比电极；通过排线将PCB适配器的排针一一对应地连接至电穿孔与信号记录集成系统中前端的初级放大器和脉冲发生器模块，然后通过电缆与该集成系统中后端的集成滤波器和二次放大器模块进行通信；电穿孔与信号记录集成系统的后端设于培养箱外部，并通过电缆连接计算机和电源。

作为本发明的优选方案，所述纳米微电极阵列芯片中电极引线是由ITO材料或Au制得；微电极阵列芯片的面积在400～576mm²之间，电极引线的直径为50～200μm，数量为16～32根，相邻电极引线的间距为300～500μm。

作为本发明的优选方案，所述纳米微电极阵列芯片与PCB适配器表面之间、玻璃培养腔与纳米微电极阵列芯片之间，分别通过聚二甲基硅氧烷实现固定连接。

作为本发明的优选方案，所述纳米微电极阵列芯片通过下述方式制备获得：

(1)根据需要的尺寸和形状，将玻璃板分割成小片；

(2)通过磁控溅射在片状玻璃板表面沉积ITO材料或Au，然后使用丙酮进行剥离；

(3)在片状玻璃板上旋涂光刻胶层，烘烤后按设计布局进行曝光、显影，然后使用氧等离子体清洗样品；

(4)在样品表面旋涂负光刻胶，对玻璃板和电极引线的表面进行绝缘处理；烘烤后曝光，然后烘烤后显影；以异丙醇漂洗，最后再经烘烤，得到纳米微电极阵列芯片；其中，玻璃板和电极引线的绝大部分被绝缘层覆盖，只暴露出位于芯片边缘的连接垫和位于芯片中间的电极位点。

本发明进一步提供了一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测方法，包括以下步骤：

(1)将纳米微电极阵列器件用75％乙醇灭菌，并置于生物安全柜中紫外照射至少2小时，然后将10ng/mL纤维蛋白溶液覆盖在微电极阵列器件上过夜放置，以促进细胞粘附；

(2)取已分离的动物心室组织，清洗、切碎后在胰蛋白酶和胶原酶II型中消化成细胞悬浊液；将消化组织进行离心、重悬、过滤以及两次差异贴壁，得到纯化的心肌细胞；

(3)将分离的原代心肌细胞种植于纳米微电极阵列器件的玻璃培养腔内，然后置培养箱中，在37℃和5％CO₂的条件下进行培养；隔天换液，直至心肌细胞出现自发搏动；

(4)在心肌细胞出现自发搏动后，向心肌细胞中添加钙黄绿素荧光物质，并利用计算机设置电穿孔与信号记录集成系统中的电压、脉宽、频率、时长的参数值；对心肌细胞执行电穿孔操作使药物能从胞外递送到胞内，记录全过程中心肌细胞的胞内外的动作电位；

(5)利用荧光显微镜采集纳米微电极阵列器件中心肌细胞电穿孔前后的图像，传送至计算机后由图像分析模块提取图像特征值，计算心肌细胞电穿孔后的药物递送效率、细胞的存活率和死亡率；

(6)利用电穿孔与信号记录集成系统对心肌细胞的电生理信号进行信号二次放大和滤波处理，并将信号采样结果传输到计算机，由内置的信号处理模块进行去基线和滤波处理，在提取特征点后分别计算电信号的频率与幅值。

作为本发明的优选方案，在步骤(2)中，离心时的转速为1000rpm，离心时间为5分钟；过滤时使用70μm细胞滤网；差速贴壁处理两次，每次45分钟。

作为本发明的优选方案，在步骤(3)中，原代心肌细胞的种植密度为3.0×10⁵细胞/cm²。

作为本发明的优选方案，在步骤(5)中，图像分析模块对获得的图像信号依次进行图像预处理、距离变换、分水岭分割和二次分割处理；

其中，在图像预处理时，对荧光图像先进行毫米级的卷积核高斯滤波，然后采用CLAHE算法进行图像增强；再利用OTSU算法对灰度图像进行粗阈值分割，在阈值分割后对二值进行距离变换；

在二次分割处理时，将第一次分割时所得图像的像素值设为零，然后使用OTSU分割剩余区域。

作为本发明的优选方案，在步骤(6)中，电生理信号的采样率为15kHz，带通率为1～7.5kHz。

发明原理描述：

1、与人工计数或ImageJ图像辅助分析相比，本发明所提供的检测系统可以同时保证电穿孔分析的准确性和效率。在实际操作中，由于进行ImageJ图像处理时会在调整阈值等方面引入人为主观判断的原因，使得与实际数据产生较大偏差。而本发明可实现在荧光显微镜获取图像后立即输出细胞活性、递送效率和细胞死亡率，检测所得分析数值更加接近真实值。与传统ImageJ图像辅助分析相比的处理效率(10分钟/10张图像)相比，本发明能够实现更高的效率处理(～8s/10张图像)。

2、现有技术虽可以分别实现对心肌细胞内外电信号检测，但加工复杂、耗时费力阻碍了其大规模、平行的制备，限制了其在临床和基础研究中的广泛应用。微米精度以上的光刻和磁控溅射对于一般的微加工实验室均可完成，且这些都可以进行平行大规模的操作，实现高效经济地制备器件。因此，本发明基于简单的光刻和磁控溅射微加工技术实现微电极阵列器件制备，允许高效和经济的平台构建，同时实现了细胞内外电生理记录及药物递送用于广泛的生物医学领域。

3、现有技术虽可以分别实现对心肌细胞电信号检测或药物递送，但不具备多功能性，无法提供心肌细胞在药物递送后的状态等相关性研究。本发明利用微电极阵列通过递送与电传感一体化的检测，可以原位、准确、高效的记录电信号的同时，能够实现心肌细胞的药物递送效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、现有技术虽可以分别实现对心肌细胞递送后的效率进行计算，但分析的准确性有所偏差，且分析效率较低。本发明利用心肌细胞胞内递送的传感检测系统，可以准确、高效地实现微电极阵列上的原位细胞电穿孔，能够实现递送效率及电信号分析。

2、本发明所用微电极阵列器件制造工艺简单，有利于大规模加工；由于能采用兼容大规模工艺的光刻、磁控溅射、剥离技术，避免电子束曝光、离子束刻蚀等复杂、耗时的工艺，有利于实现低成本的商业制造。

附图说明

图1为纳米微电极阵列芯片的光学显微镜图；

图2为纳米微电极阵列器件的结构示意图；

图3为本发明的图像采集与分析的流程框图；

图4为本发明的递送效果及电信号展示图。

图2中附图标记为：玻璃培养腔1；纳米微电极阵列芯片2；PCB适配器3。

具体实施方式

首先需要说明的是，本发明涉及数据库技术，是计算机技术在信息安全技术领域的一种应用。在本发明的实现过程中，会涉及到多个软件功能模块的应用。申请人认为，如在仔细阅读申请文件、准确理解本发明的实现原理和发明目的以后，在结合现有公知技术的情况下，本领域技术人员完全可以运用其掌握的软件编程技能实现本发明。前述软件功能模块包括但不限于：图像分析模块、信号处理模块等，凡本发明申请文件提及的均属此范畴，申请人不再一一列举。

本领域技术人员知道，除了以纯计算机可读程序代码方式实现本发明提供的系统的一部分及其各个装置、模块、单元以外，完全可以通过将方法步骤进行逻辑编程来使得本发明提供的系统及其各个装置、模块、单元以逻辑门、开关、专用集成电路、可编程逻辑控制器以及嵌入式微控制器等的形式来实现相同功能。所以，本发明提供的系统及其各项装置、模块、单元可以被认为是一种硬件部件，而对其内包括的用于实现各种功能的装置、模块、单元也可以视为硬件部件内的结构；也可以将用于实现各种功能的装置、模块、单元视为既可以是实现方法的软件模块又可以是硬件部件内的结构。

还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

下面结合附图，对本发明的实现方式进行详细描述。

本发明的心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统，包括纳米微电极阵列器件、电穿孔与信号记录集成系统、图像采集与分析模块。其中，

如图2所示，纳米微电极阵列器件包括由上至下依次布置的中空玻璃培养腔、纳米微电极阵列芯片和PCB适配器，纳米微电极阵列芯片固定在PCB适配器表面的中心位置，三者之间分别通过聚二甲基硅氧烷实现固定连接。玻璃培养腔呈中空圆环状，其径向尺寸与纳米微电极阵列芯片适配；当其被固定在纳米微电极阵列芯片上之后能够覆盖后者从而形成顶端开口的中空腔体，且以后者的表面作为中空腔体的底面；所述纳米微电极阵列芯片是以玻璃板为基底，在基底上以点阵方式均匀设有若干个电极位点，通过光刻、磁控溅射和剥离工艺在基底上沿周向均匀地形成若干根由四周向中心延伸的电极引线，各电极引线彼此之间绝缘且末端分别延伸至所述电极位点处；在PCB适配器的表面由四周向中心延伸布置了若干根微带线，其数量与电极引线的数量相同，各微带线的一端与电极引线一一对应地相连，另一端与焊接在PCB适配器边缘的排针一一对应地电连接。

作为示例，纳米微电极阵列芯片可选通过下述方式制备获得：

(1)根据需要的尺寸和形状，将玻璃板分割成小片；

(2)通过磁控溅射在片状玻璃板表面沉积ITO材料或Au，然后使用丙酮进行剥离；

(3)在片状玻璃板上旋涂光刻胶层，烘烤后按设计布局进行曝光、显影，然后使用氧等离子体清洗样品；

(4)在样品表面旋涂负光刻胶，对玻璃板和电极引线的表面进行绝缘处理；烘烤后曝光，然后烘烤后显影；以异丙醇漂洗，最后再经烘烤，得到纳米微电极阵列芯片；其中，玻璃板和电极引线的绝大部分被绝缘层覆盖，只暴露出位于芯片边缘的连接垫和位于芯片中间的电极位点。

在该系统中，纳米微电极阵列器件置于37℃、5.0％二氧化碳气氛的培养箱中；在器件的玻璃培养腔中设有参比电极；通过排线将PCB适配器的排针一一对应地连接至电穿孔与信号记录集成系统中前端的初级放大器和脉冲发生器模块，然后通过电缆与该集成系统中后端的集成滤波器和二次放大器模块进行通信；电穿孔与信号记录集成系统的后端设于培养箱外部，并通过电缆连接计算机和电源。

电穿孔与信号记录集成系统为现有技术，其实现方案具体可参考“Xu D,Fang J,Zhang M,et al.Porous Polyethylene Terephthalate Nanotemplate Electrodes forSensitive Intracellular Recording of Action Potentials[J].Nano Letters,2022,22(6):2479-2489.”文献的记载。

图像采集与分析模块包括设于纳米微电极阵列器件上方用于采集图像信号的荧光显微镜，以及内置于计算机中的用于实现图像分析功能的图像分析模块；荧光显微镜通过电缆连接至计算机，以实现图像信号的传送。

作为示例，纳米微电极阵列芯片中电极引线可选由ITO材料(Indium Tin Oxide，In₂O₃+SnO₂)或Au制得；微电极阵列芯片的面积在400～576mm²之间，电极引线的直径为50～200μm，数量为16～32根，相邻电极引线的间距为300～500μm。

利用前述系统，本发明可实现心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测方法，具体包括以下步骤：

(1)将纳米微电极阵列器件用75％乙醇灭菌，并置于生物安全柜中紫外照射至少2小时，然后将10ng/mL纤维蛋白溶液覆盖在微电极阵列器件上过夜放置，以促进细胞粘附；

(2)取已分离的动物心室组织，清洗、切碎后在胰蛋白酶和胶原酶II型中消化成细胞悬浊液；将消化组织进行离心、重悬、过滤以及两次差异贴壁，得到纯化的心肌细胞；离心时的转速为1000rpm，离心时间为5分钟；过滤时使用70μm细胞滤网；差速贴壁处理两次，每次45分钟。

(3)将分离的原代心肌细胞种植于纳米微电极阵列器件的玻璃培养腔内，种植密度为3.0×10⁵细胞/cm²。然后置培养箱中，在37℃和5％CO₂的条件下进行培养；隔天换液，直至心肌细胞出现自发搏动；

(4)在心肌细胞出现自发搏动后，向心肌细胞中添加钙黄绿素荧光物质，并利用计算机设置电穿孔与信号记录集成系统中的电压、脉宽、频率、时长的参数值；对心肌细胞执行电穿孔操作使药物能从胞外递送到胞内，记录全过程中心肌细胞的胞内外的动作电位；

(5)利用荧光显微镜采集纳米微电极阵列器件中心肌细胞电穿孔前后的图像，传送至计算机后由图像分析模块提取图像特征值，计算心肌细胞电穿孔后的药物递送效率、细胞的存活率和死亡率；

图像分析模块对获得的图像信号依次进行图像预处理、距离变换、分水岭分割和二次分割处理；其中，在图像预处理时，对荧光图像先进行毫米级的卷积核高斯滤波，然后采用CLAHE算法进行图像增强；再利用OTSU算法对灰度图像进行粗阈值分割，在阈值分割后对二值进行距离变换；在二次分割处理时，将第一次分割时所得图像的像素值设为零，然后使用OTSU分割剩余区域。

(6)利用电穿孔与信号记录集成系统对心肌细胞的电生理信号进行采样，采样率为15kHz，带通率为1～7.5kHz；再进行信号二次放大和滤波处理，并将信号采样结果传输到计算机，由内置的信号处理模块进行去基线和滤波处理，在提取特征点后分别计算电信号的频率与幅值。

更为细化的具体实施例子：

步骤1：采样通用的光刻、磁控溅射、剥离技术制备纳米微电极阵列芯片。

以18mm×18mm×1mm的玻璃板为基底，制备32个200μm×40μm电极的阵列图案。通过磁控溅射在玻璃板表面沉积ITO，然后使用丙酮进行剥离；在玻璃板上以3000rpm/min旋涂光刻胶层，烘烤后按设计布局进行i线曝光、显影，然后使用氧等离子体清洗样品；在样品表面旋涂负光刻胶，对玻璃板和电极引线的表面进行绝缘处理；烘烤后曝光、显影，以异丙醇漂洗，最后在N₂和150°条件下硬烘烤30min，完成纳米微电极阵列芯片的制备。作为示例，单个微电极阵列芯片的尺寸为18mm×18mm，具备32个电极，电极有效区域200μm×40μm。

纳米微电极阵列芯片的制备工艺均采用现有技术，上述示例内容只是简单概述，具体操作方案可参考公开文献记载。

步骤2：将制备的微电极阵列组装成器件。

微电极阵列用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)固定在定制的印刷电路板(Printed circuit board，PCB)适配器上，32个电极垫通过导电银浆粘接到PCB垫上。接着，将一个直径1.5厘米宽、高度1厘米的玻璃环固定在芯片的中心用于细胞培养，参考电极固定在塑料盖上，最后排针被焊接在PCB上。

步骤3：在微电极阵列器件上培养心肌细胞。

在细胞培养前，微电极阵器件用75％乙醇灭菌，并置于生物安全柜中紫外照射至少2小时，然后将10ng/mL纤维蛋白溶液覆盖在微电极阵列器件上过夜放置，以促进细胞粘附。选用新分离的1-3日龄新生SD大鼠的心室肌组织，并在冰冷的培养基中清洗去除血液。随后，将组织用剪刀在冰冷的平衡盐溶液中切碎成大约1mm³的碎片，用0.07％胰蛋白酶/0.05％II型胶原酶在37℃的消化2小时成细胞悬浊液。接着用含10％胎牛血清的培养基终止消化，采用1000rpm离心5分钟，70μm细胞滤网过滤，重新收集细胞。经过两次45分钟的差速贴壁后，得到纯化的细胞，并以2.0×105细胞/cm2的密度种植于多模态微电极阵列器件中，并在37℃，5％CO2培养箱中培养。隔天换液，直至心肌细胞出现自发搏动。

步骤4：进行电信号记录并进行电穿孔。

在心肌细胞出现自发搏动后(通常在培养后的2～3天)，利用心肌细胞细胞内递送生物传感系统进行电信号记录。

在心肌细胞出现自发搏动后，向心肌细胞中加入钙黄绿素荧光物质，添加浓度为10μg/mL，并通过计算机设置电穿孔与信号记录集成系统中的参数(电压、脉宽、频率、时长)来使心肌细胞电穿孔，从而使药物从胞外递送到胞内，并记录心肌细胞胞内外的动作电位。

作为示例，电压设置在5-20V，脉宽200μs-2ms,频率为1Hz，时长为1s-10s。

步骤5：对心肌细胞药物递送效果进行分析评价

在心肌细胞电穿孔后，放置在培养箱中孵育5min。随后通过图像采集分析模块对心肌细胞药物递送后的效果进行分析评价。通过荧光显微镜对心肌细胞采集图像，然后在计算机中对荧光图像进行图像预处理、距离变换、分水岭分割和二次分割处理等自动化操作，然后提取图像特征值后计算心肌细胞电穿孔后的药物的递送效率，细胞的存活率和死亡率。

步骤6：计算电信号的频率与幅值

利用电穿孔与信号记录集成系统对心肌细胞的电生理信号进行信号二次放大及滤波处理后采样，然后传输给微控制器进行后续信号处理后，通过TCP/IP协议将信号传输到计算机内置的信号处理模块进行去基线和滤波处理，在提取特征点后分别计算电信号的频率与幅值。

Claims (10)

1.一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测系统，包括电穿孔与信号记录集成系统和图像采集与分析模块；其特征在于，该系统还包括通过排线与电穿孔与信号记录集成系统电连接的纳米微电极阵列器件；

所述纳米微电极阵列器件包括由上至下依次布置的中空玻璃培养腔、纳米微电极阵列芯片和PCB适配器，纳米微电极阵列芯片固定在PCB适配器表面的中心位置；

所述玻璃培养腔呈中空圆环状，其径向尺寸与纳米微电极阵列芯片适配；当其被固定在纳米微电极阵列芯片上之后能够覆盖后者从而形成顶端开口的中空腔体，且以后者的表面作为中空腔体的底面；

所述纳米微电极阵列芯片是以玻璃板为基底，在基底上以点阵方式均匀设有若干个电极位点，通过光刻、磁控溅射和剥离工艺在基底上沿周向均匀地形成若干根由四周向中心延伸的电极引线，各电极引线彼此之间绝缘且末端分别延伸至所述电极位点处；在PCB适配器的表面由四周向中心延伸布置了若干根微带线，其数量与电极引线的数量相同，各微带线的一端与电极引线一一对应地相连，另一端与焊接在PCB适配器边缘的排针一一对应地电连接；

所述图像采集与分析模块包括设于纳米微电极阵列器件上方用于采集图像信号的荧光显微镜，以及内置于计算机中的用于实现图像分析功能的图像分析模块；荧光显微镜通过电缆连接至计算机，以实现图像信号的传送。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述纳米微电极阵列器件置于37℃、5.0％二氧化碳气氛的培养箱中；在器件的玻璃培养腔中设有参比电极；通过排线将PCB适配器的排针一一对应地连接至电穿孔与信号记录集成系统中前端的初级放大器和脉冲发生器模块，然后通过电缆与该集成系统中后端的集成滤波器和二次放大器模块进行通信；电穿孔与信号记录集成系统的后端设于培养箱外部，并通过电缆连接计算机和电源。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述纳米微电极阵列芯片中电极引线是由ITO材料或Au制得；微电极阵列芯片的面积在400～576mm²之间，电极引线的直径为50～200μm，数量为16～32根，相邻电极引线的间距为300～500μm。

4.根据权利要求1所述的纳米微电极阵列器件，其特征在于，所述纳米微电极阵列芯片与PCB适配器表面之间、玻璃培养腔与纳米微电极阵列芯片之间，分别通过聚二甲基硅氧烷实现固定连接。

5.根据权利要求1所述的纳米微电极阵列器件，其特征在于，所述纳米微电极阵列芯片通过下述方式制备获得：

(1)根据需要的尺寸和形状，将玻璃板分割成小片；

(2)通过磁控溅射在片状玻璃板表面沉积ITO材料或Au，然后使用丙酮进行剥离；

(3)在片状玻璃板上旋涂光刻胶层，烘烤后按设计布局进行曝光、显影，然后使用氧等离子体清洗样品；

(4)在样品表面旋涂负光刻胶，对玻璃板和电极引线的表面进行绝缘处理；烘烤后曝光，然后烘烤后显影；以异丙醇漂洗，最后再经烘烤，得到纳米微电极阵列芯片；其中，玻璃板和电极引线的绝大部分被绝缘层覆盖，只暴露出位于芯片边缘的连接垫和位于芯片中间的电极位点。

6.一种心肌细胞胞内递送与电传感一体化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将纳米微电极阵列器件用75％乙醇灭菌，并置于生物安全柜中紫外照射至少2小时，然后将10ng/mL纤维蛋白溶液覆盖在微电极阵列器件上过夜放置，以促进细胞粘附；

(2)取已分离的动物心室组织，清洗、切碎后在胰蛋白酶和胶原酶II型中消化成细胞悬浊液；将消化组织进行离心、重悬、过滤以及两次差异贴壁，得到纯化的心肌细胞；

(3)将分离的原代心肌细胞种植于纳米微电极阵列器件的玻璃培养腔内，然后置培养箱中，在37℃和5％CO₂的条件下进行培养；隔天换液，直至心肌细胞出现自发搏动；

(4)在心肌细胞出现自发搏动后，向心肌细胞中添加钙黄绿素荧光物质，并利用计算机设置电穿孔与信号记录集成系统中的电压、脉宽、频率、时长的参数值；对心肌细胞执行电穿孔操作使药物能从胞外递送到胞内，记录全过程中心肌细胞的胞内外的动作电位；

(5)利用荧光显微镜采集纳米微电极阵列器件中心肌细胞电穿孔前后的图像，传送至计算机后由图像分析模块提取图像特征值，计算心肌细胞电穿孔后的药物递送效率、细胞的存活率和死亡率；

(6)利用电穿孔与信号记录集成系统对心肌细胞的电生理信号进行信号二次放大和滤波处理，并将信号采样结果传输到计算机，由内置的信号处理模块进行去基线和滤波处理，在提取特征点后分别计算电信号的频率与幅值。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，离心时的转速为1000rpm，离心时间为5分钟；过滤时使用70μm细胞滤网；差速贴壁处理两次，每次45分钟。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，原代心肌细胞的种植密度为3.0×10⁵细胞/cm²。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，图像分析模块对获得的图像信号依次进行图像预处理、距离变换、分水岭分割和二次分割处理；

其中，在图像预处理时，对荧光图像先进行毫米级的卷积核高斯滤波，然后采用CLAHE算法进行图像增强；再利用OTSU算法对灰度图像进行粗阈值分割，在阈值分割后对二值进行距离变换；

在二次分割处理时，将第一次分割时所得图像的像素值设为零，然后使用OTSU分割剩余区域。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(6)中，电生理信号的采样率为15kHz，带通率为1～7.5kHz。

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