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CN115212813A - 一种全水相双层多孔凝胶微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种全水相双层多孔凝胶微球及其制备方法和应用 Download PDF

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CN115212813A CN202210846105.3A CN202210846105A CN115212813A CN 115212813 A CN115212813 A CN 115212813A CN 202210846105 A CN202210846105 A CN 202210846105A CN 115212813 A CN115212813 A CN 115212813A
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Abstract

本发明提供了一种全水相双层多孔凝胶微球及其制备方法和应用，该微球的制备方法为：将聚乙二醇和葡聚糖制成双层全水相溶液；分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相混合，聚乙二醇相体积大于葡聚糖相体积，乳化，再向其中加入交联剂混匀，得乳液1；分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相混合，聚乙二醇相体积小于葡聚糖相体积，乳化，再向其中加入交联剂混匀，得乳液2；将乳液2注射至乳液1的液滴内，然后将液滴置于钙离子接收液中进行交联反应，取出，制得。该全水相双层多孔凝胶微球可有效解决现有的单层多孔凝胶微球存在的无法研究多个组织间相互作用关系，以及无法做到药物多阶段缓释等问题。

Description

一种全水相双层多孔凝胶微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于多孔凝胶技术领域，具体涉及一种全水相双层多孔凝胶微球及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，多孔凝胶微球由于能够加快物质交换速率、高度模拟体内环境、操作方便等优点被广泛应用细胞培养载体、类器官构建、组织损伤修复、药物缓释等领域。因此已有许多学者利用不同的方法制作出尺寸可控，球形度好，孔径大小可调控的多孔凝胶微球。
在众多方法中，乳液模板法由于可以简便地调控多孔微球孔径大小，被研究者广泛关注。乳液模板法一般操作是向油包水包油乳液的连续相中加入乳液稳定剂、交联剂、引发剂，紫外交联制得凝胶微球，凝胶微球再将乳液模板排出制得多孔凝胶微球。然而上述方法制备多孔微球的过程中均采用了油相或其他有机物质，其很难直接包封生物活性物质，操作步骤繁琐。近年来出现的全水相乳液模板法具有极大优势。此方法不仅具有生物相容性高，可以直接包封细胞，制作步骤简单等优点，并且制作材料来源广泛价格低廉，降低了制作成本利于大规模生产使用。然而目前利用全水相乳液模板法制做出的多孔凝胶微球仅有单层结构，使得微球的应用前景受到了限制。
在类器官构建、组织修复方面，单层多孔凝胶微球至多只能构建一种组织不能构建多个组织，研究人员无法用其研究组织间的相互作用；在药物缓释方面，单层微球能够包裹的药物种类有限，且无法做到药物的多阶段释放。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种全水相双层多孔凝胶微球及其制备方法和应用，该全水相双层多孔凝胶微球可有效解决现有的单层多孔凝胶微球存在的无法研究多个组织间相互作用关系，无法做到药物多阶段缓释的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇和葡聚糖混合后向其中加水，制成双层全水相溶液；
(2)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照65％-75％：35％-25％的体积比混合，然后乳化，再向其中加入交联剂混匀，得乳液1；
(3)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照20％-40％：80％-60％的体积比混合，然后乳化，再向其中加入交联剂混匀，得乳液2；
(4)将乳液2注射至乳液1的液滴内，然后将液滴置于钙离子接收液中进行交联反应，取出，制得。
上述方案中，将聚乙二醇和葡聚糖混合后加水，由于水分子对两个物质的亲和力不同，因此水分会以不同的比例分配到两个物质中去，形成互不相容的两相，进而形成全水相；乳液1中聚乙二醇相的体积占比大于葡聚糖相的体积占比，因此，形成的乳液中葡聚糖相作为分散相，聚乙二醇相作为连续相，葡聚糖颗粒均匀分散于聚乙二醇相中；乳液2中刚好与乳液1相反，其中聚乙二醇相的体积占比小于葡聚糖相的体积占比，因此，形成的乳液中葡聚糖相作为连续相，聚乙二醇相作为分散相，聚乙二醇颗粒均匀分散于葡聚糖相中，由于两种乳液的连续相不同，当乳液2注射进入乳液1中时，两液滴互不相容，形成层次分明的双层液滴结构；
乳液1和乳液2中交联剂均存在连续相中，当双层液滴滴落至钙离子接收液中时，连续相中的交联剂与钙离子交联反应形成凝胶，反应过程中，凝胶吸水膨胀将分散相挤出，使得连续相内形成多孔结构。所形成的孔隙结构的大小与分散性的液滴大小近乎相等，且分散相大小可以通过乳化频率不同而进行调整，乳化频率大，分散相液滴直径小，乳化频率小，分散相液滴直径大，因此，双层多孔凝胶微球的孔隙大小是可以根据需要进行调控的。
进一步地，制备过程中，分别将乳液1和乳液2装入注射器1和注射器2 内，注射器1的注射针头竖直设置，注射器2的注射针头水平设置，推动注射器1，使得乳液1在注射器1注射针头前端成液滴状，该液滴将注射器2注射针头覆盖，然后以8μl/min-25μl/min的速度推动注射器2，使得乳液2进入乳液1 形成的液滴内，由于乳液1和乳液2的连续相互不相容，所以可以形成双层结构液滴。最后，形成的双层结构液滴在重力作用下滴落至钙离子接受液中进行交联反应。
进一步地，聚乙二醇的分子量为8-10kDa，葡聚糖的分子量为500-600kDa。
上述方案中，聚乙二醇的分子量明显低于葡聚糖的分子量，使得两者混合后会形成双层结构的全水相溶液。
进一步地，步骤(1)中双层全水相溶液中聚乙二醇和葡聚糖的质量百分占比比为3％-15％:3％-15％。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中乳化后，分散相颗粒的直径为10-100μm。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的就交联剂为海藻酸、羧甲基纤维素钠、基质胶或葡聚糖。
进一步地，步骤(2)中交联剂的加入量为聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的 0.8-1.5倍。
进一步地，步骤(3)中交联剂的加入量为聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的 0.8-1.5倍。
进一步地，乳液1和乳液2的密度相同。
一种全水相双层多孔凝胶微球，采用上述方法制成。
上述全水相双层多孔凝胶微球在3D细胞培养、类器官构建、药物递送以及组织修复中的应用。
本申请所产生的有益效果为：
1、采用本申请中以全水相乳液为模板制作出尺寸稳定，球形度好，孔径大小可控，内层微球占比可调控的双层多孔凝胶微球，该制备方法制备工序简单，易于操作，制备过程中未使用油相或其他有机物质。
2、本申请中制得的微球为双层结构，可以在制作微球的过程中直接向连续相和分散相中加入不同的细胞，因此可以在内层微球中构建一种组织，在外层微球中构建一种组织，以达到用双层微球构建多种精细组织的效果。与单层结构的多孔微球只能构建一种组织不同，此双层多孔微球可以研究多种组织间的相互作用；同时，用同样的直接包封的办法，此双层多孔微球还可以包裹多种药物，实现药物的缓释，大大提高了微球的应用范围。
3、本申请中微球内层结构大小可调，可根据使用要求进行调整，进一步地的提高了微球的应用范围。
4、全水相乳液为模板制作多孔微球生物相容性高、可直接包封细胞、成本低等优点。又在此基础上利用简单的双针管注射法赋予了多孔微球双层结构，使其能够模拟更加复杂的组织，以解决目前病理模型构建，组织工程领域的难点问题。且经过数据统计，微球的尺寸，孔径的尺寸，内层微球的占比都稳定且可控，因此在生产或研究领域中具有巨大潜力。
附图说明
图1为本申请制备过程演示图；
图2为本申请制备过程实物图；
图3A为乳液1的显微图；图3B为乳液1中分散相颗粒直径统计图；
图4A为乳液2的显微图；图4B为乳液2中分散相颗粒直径统计图；
图5A为双层多孔微球的外层直径统计图；图5B为双层多孔微球的内层直径统计图；
图6为内层微球结构在整个微球中的占比统计图；
图7为最终双层多孔微球的扫描电镜图；
图8A为双层多孔微球的外层直径统计图；图8B为双层多孔微球的内层直径统计图；
图9为内层微球结构在整个微球中的占比统计图；
图10为注射时间与内层微球结构占比的关系图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种全水相双层多孔凝胶微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇和葡聚糖按照混合后向其中加水，制成聚乙二醇质量占比为8％，葡聚糖质量占比为8％的双层全水相溶液，聚乙二醇的分子量为8kDa，葡聚糖的分子量为500kDa；
(2)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照75％：25％的体积比混合，然后于500rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为40μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液1；
(3)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照20％：80％的体积比混合，然后于600rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为25μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液2；
(4)分别将乳液1和乳液2分别装入注射器1和注射器2内，注射器1的注射针头竖直设置，注射器2的注射针头水平设置，推动注射器1，使得乳液1 在注射器1注射针头前端成液滴状，该液滴将注射器2注射针头覆盖，然后以13μl/min的速度推动注射器2，使得乳液2进入乳液1形成的液滴内，注射27s，最后，形成的双层结构液滴在重力作用下滴落至含有15wt％钙离子的钙离子接受液中进行交联反应80min，取出，制得。
实施例2
一种全水相双层多孔凝胶微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇和葡聚糖按照混合后向其中加水，制成聚乙二醇质量占比为8％，葡聚糖质量占比为8％的双层全水相溶液，聚乙二醇的分子量为8kDa，葡聚糖的分子量为500kDa；
(2)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照75％：25％的体积比混合，然后于500rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为30μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液1；
(3)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照20％：80％的体积比混合，然后于600rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为25μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液2；
(4)分别将乳液1和乳液2分别装入注射器1和注射器2内，注射器1的注射针头竖直设置，注射器2的注射针头水平设置，推动注射器1，使得乳液1 在注射器1注射针头前端成液滴状，该液滴将注射器2注射针头覆盖，然后以 13μl/min的速度推动注射器2，使得乳液2进入乳液1形成的液滴内，注射58s，最后，形成的双层结构液滴在重力作用下滴落至含有15wt％钙离子的钙离子接受液中进行交联反应80min，取出，制得。
实施例3
一种全水相双层多孔凝胶微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇和葡聚糖按照混合后向其中加水，制成聚乙二醇质量占比为15％，葡聚糖质量占比为7％的双层全水相溶液，聚乙二醇的分子量为8kDa，葡聚糖的分子量为500kDa；
(2)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照70％：30％的体积比混合，然后于400rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为30μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液1；
(3)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照300％：70％的体积比混合，然后于700rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为25μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液2；
(4)分别将乳液1和乳液2分别装入注射器1和注射器2内，注射器1的注射针头竖直设置，注射器2的注射针头水平设置，推动注射器1，使得乳液1 在注射器1注射针头前端成液滴状，该液滴将注射器2注射针头覆盖，然后以13μl/min的速度推动注射器2，使得乳液2进入乳液1形成的液滴内，注射105s，最后，形成的双层结构液滴在重力作用下滴落至含有15wt％钙离子的钙离子接受液中进行交联反应80min，取出，制得。
实施例4
一种全水相双层多孔凝胶微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇和葡聚糖按照混合后向其中加水，制成聚乙二醇质量占比为3％，葡聚糖质量占比为10％的双层全水相溶液，聚乙二醇的分子量为8kDa，葡聚糖的分子量为500kDa；
(2)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照65％：35％的体积比混合，然后于400rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为30μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液1；
(3)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照40％：60％的体积比混合，然后于800rpm的震荡频率将其乳化，使分散相颗粒直径为25μm，再向其中加入海藻酸混匀，海藻酸占聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的1倍，得乳液2；
(4)分别将乳液1和乳液2分别装入注射器1和注射器2内，注射器1的注射针头竖直设置，注射器2的注射针头水平设置，推动注射器1，使得乳液1 在注射器1注射针头前端成液滴状，该液滴将注射器2注射针头覆盖，然后以 13μl/min的速度推动注射器2，使得乳液2进入乳液1形成的液滴内，注射60s，最后，形成的双层结构液滴在重力作用下滴落至含有15wt％钙离子的钙离子接受液中进行交联反应80min，取出，制得。
试验例
以实施例1中的制备过程以及制得的双层凝胶微球为例，对实施例1制备过程中的分散性粒径、微球粒径等进行检测，具体结果见图3-6，将最终制得的双层多孔微球进行洗涤后干燥，然后进行电镜扫描，具体结果见图7。
通过图3得知，乳液1中分散相液滴大小均匀，液滴直径集中在20-40μm。
通过图4得知，乳液2中液滴大小均匀，液滴直径集中在20-30μm。
通过图5得知，双层多孔微球结构中微球整体直径集中在34-36mm，内层微球直径集中在28-32mm。
通过图6得知，双层多孔微球结构中内层微球在整体微球结构中的体积占比集中在60-75％。
通过图7得知，双层多孔微球内部呈现明显的双层结构，且内层和外层结构中均存在大量的孔隙结构。
以实施例2中的制备过程为例，对实施例2制备过程中分散相粒径、微球粒径等进行检测，具体结果见图8-10。
通过图8得知，双层多孔微球结构中微球整体直径集中在33-34mm，内层微球直径集中在18-21mm。
通过图9得知，双层多孔微球结构中内层微球在整体微球结构中的体积占比集中在60-70％。
通过图10得知，内层微球随着注射时间不同，在整个微球中的占比也不同，内层微球占比与注射时间几乎成正比例关系，证明微球的制作可控性强。

Claims (10)

1.一种全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇和葡聚糖混合后向其中加水，制成双层全水相溶液；
(2)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照65％-75％：35％-25％的体积比混合，然后乳化，再向其中加入交联剂混匀，得乳液1；
(3)分别取上层聚乙二醇相和下层葡聚糖相，将聚乙二醇相和葡聚糖相按照20％-40％：80％-60％的体积比混合，然后乳化，再向其中加入交联剂混匀，得乳液2；
(4)将乳液2注射至乳液1的液滴内，然后将液滴置于钙离子接收液中进行交联反应，取出，制得。
2.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，聚乙二醇的分子量为8-10kDa，葡聚糖的分子量为500-600kDa。
3.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中双层全水相溶液中聚乙二醇和葡聚糖的质量百分占比比为3％-15％:3％-15％。
4.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中乳化后，分散相颗粒的直径为10-100μm。
5.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中的就交联剂为海藻酸、羧甲基纤维素钠、基质胶或葡聚糖。
6.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中交联剂的加入量为聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的0.8-1.5倍。
7.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中交联剂的加入量为聚乙二醇相和葡聚糖相总体积的0.8-1.5倍。
8.如权利要求1所述的全水相双层多孔凝胶微球的制备方法，其特征在于，乳液1和乳液2的密度相同。
9.一种全水相双层多孔凝胶微球，其特征在于，采用权利要求1-8中任一项所述方法制成。
10.权利要求9中所述全水相双层多孔凝胶微球在3D细胞培养、类器官构建、药物递送以及组织修复中的应用。
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