CN115219705A - 生物标志物在库欣综合征诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物标志物在库欣综合征诊断中的应用，本发明通过对样本进行非靶向组学检测，鉴定健康人群和库欣综合征患者中的差异代谢物，发现所述代谢物LysoPE 22:5在库欣综合征中的水平显著上升，并进行验证和诊断效能分析，证明了LysoPE 22:5是库欣综合征诊断的候选标志物。

Description

生物标志物在库欣综合征诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物在库欣综合征诊断中的应用。

背景技术

库欣综合征(Cushing syndrome，CS)是由慢性糖皮质激素过度分泌而引起的一系列临床症群，库欣病(Cushing Disease)及肾上腺皮质腺瘤是其中最常见的两种类型。其中库欣病占库欣综合征的70％左右，是由垂体分泌过量的ACTH所引起。库欣综合征临床表现主要有肥胖、高血压、继发性糖尿病、向心性肥胖、肌肉萎缩、多毛、月经失调、性功能障碍、紫纹、满月脸、骨质疏松、痤疮和色素沉着、水肿、头痛、伤口不愈等。有研究发现库欣综合征首次出现症状后的平均诊断时间为6.0年，库欣综合征的典型症状往往进展缓慢，非特异性强，极可能被忽略或因其临床表现而归因于其他常见的疾病。此外经调查显示未经治疗的库欣综合征人群在5年内有50％的死亡率，主要由于心血管事件(充血性心力衰竭或心肌梗死)或感染。库欣综合征的发病率很高，可以影响肌肉系统，导致肌病和充血性心力衰竭；影响骨骼完整性，导致早期骨质疏松；影响生殖功能，导致月经不调和不孕；引起情绪障碍(Prague,Julia Kate,Stephanie May,and Benjamin Cameron Whitelaw."Cushing’ssyndrome."Bmj 346(2013))。而库欣综合征的延迟诊断可导致不可逆的器官损伤。

目前除了传统的诊断方法外，已有研究尝试将基因技术用于CS的定性诊断，但仍缺乏大样本的研究，因此寻找可靠、稳定的生物标志物对库欣综合征的定性诊断至关重要。血清标志物检测方便，操作简单，成本花费不高，在一些疾病诊断及治疗等方面的应用已被认可。代谢组学是一门新兴组学技术，是“系统生物学”的组成的重要部分。代谢组学主要研究对象为生物有机体内体液、细胞、组织中质量小于1000的小分子化合物，主要分析平台有色谱-质谱联用技术、核磁共振技术等高分辨率、高灵敏度、高通量的现代仪器分析。其通过定性或定量研究生物体内被扰动的代谢产物(内源性代谢物质)种类、数量、含量等变化，来揭示体内代谢通路的改变。代谢组学处于转录、基因和蛋白质表达的终端，能够直接、准确地反映生物体目前处于的病理生理状态，广泛应用于疾病诊断、药物研发、营养学、毒理学、运动医学等领域，尤其是为临床疾病诊断提供可靠的理论依据及手段。研究血液中呈现显著性差异的代谢物，寻找血清标志物，对于实现库欣综合征的早期诊断具有重要的意义。

发明内容

本发明为了评估代谢物与库欣综合征之间的相关性，通过收集健康对照与库欣综合征的样本，综合分析样本的代谢组学，筛选在两个群组中含量呈现显著性差异的代谢物，并进一步分析差异代谢物的诊断效能，从而发现适于库欣综合征诊断的生物标志物。

具体地，本发明提供了如下技术方案：

本发明第一方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断库欣综合征的产品中的应用，所述生物标志物为LysoPE 22:5。

术语“生物标志物”是指生物系统内的物质，其用作所述系统的生物学状态的指标。在本领域中，术语“生物标志物”有时也适用于检测所述内源性物质(例如抗体、核酸探针等、成像系统)的手段。生物标志物可以是活生物体中存在的任何种类的分子，例如核酸(DNA、mRNA、miRNA、rRNA等)、蛋白质(细胞表面受体、胞质蛋白等)、代谢物或激素(血糖、胰岛素、雌激素等)、具有另一种分子(例如蛋白质上的糖部分或磷酰基残基、基因组DNA上的甲基残基)或已被生物体内化的物质或这种物质的代谢产物的某种修饰特征的分子。

如本发明所用，术语“生物标志物”、“分子标志物”是可互换的，并且是指与取自对照受试者，例如与患有库欣综合征的受试者的可比较样本相比，在取自未患库欣综合征的健康受试者的样本中差异存在的分子。因此，本发明的生物标志物提供有关库欣综合征患病的可能性。

本发明所用术语“受试者”，指需对一种状态敏感，尤其库欣综合征下的活的动物或人。优选，受试者为哺乳动物，包括人类及非人类哺乳动物如狗，猫，猪，牛，绵羊，山羊，马，大鼠，和小鼠。更优选的方案中，受试者为人类。术语“受试者”不排除未患有库欣综合征疾病的正常人。

如本发明所用，术语“诊断”是指鉴定患有库欣综合征症状的受试者中的疾病。

进一步，所述试剂包括色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法或其组合检测用试剂。

如本领域技术人员所知，质谱仪通常由三个部件组成：离子源、质量分析器和检测器。离子发生器将一部分样品转化为离子。如下所述，根据样品的相(固体、液体、气体)和未知物种的各种电离机制的效率，存在各种各样的电离技术。质谱仪通常还包括提取系统，该提取系统从样品中去除离子，然后将离子通过质量分析器并且到达检测器上。片段的质荷比(m/z)的差异允许质量分析器通过它们的质荷比对离子进行分类。最后，检测器测量指示物的量的值，从而提供用于计算存在的每种离子的丰度的数据。

在典型的质谱分析程序中，第一步包括样品的电离。在一个实施方案中，电离包括电子电离(EI)，其包括用电子轰击样品。在另一个实施方案中，电离包括化学电离(CI)，根据该化学电离，离子通过分析物与存在于离子源中的反应气体的离子的碰撞产生(合适的反应气体的实例包括甲烷、氨和异丁烷)。在另一个实施方案中，电离包括大气压化学电离(APCI)。在另一个实施方案中，电离包括大气压光子电离(APPI)。

当电离是电子电离时，这通常导致质量离子具有与母体分子相同的质量(M)，但是带电荷(M+或M-)。当电离是化学电离时，这通常导致具有母体分子质量的质量离子和用于电离分子的化学物质，众所周知的实例包括[M+H]+、[M-H]-、[M+NH4]+和[M+Na]+。这种分子离子在本说明书中也称为“假分子离子”。

在另一个实施方案中，电离包括电喷雾电离(ESI)，其中含有目标分析物的液体通过电喷雾分散成细气溶胶。在另一个实施方案中，电离包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI)，其通常包括三步法，如下：(1)将样品混合在合适的基质材料中并将其施加到表面，通常是金属板；(2)通常用脉冲激光照射样品，从而触发样品和基质材料的烧蚀和解吸；(3)通过在烧蚀气体的热羽流中质子化或去质子化使分析物分子电离，使离子加速进入用于分析它们的质谱仪。这些电离技术是本领域技术人员公知的。电离，特别是电子电离，可能导致一些样品的分子碎裂成带电碎片。

在电离之后，根据质量分析器中的质荷比(m/z)分离第一步中产生的离子。这通常通过以下一种或多种质荷比分离技术进行：通过四极质谱仪中使用的四极电场，通过离子阱质谱仪使用的离子阱四极电场，通过飞行时间质谱仪使用的纵向离子传播时间，以及通过电和磁扇区质谱仪传统上使用的电场和/或磁场偏转。最后一种技术涉及加速离子并使它们经受电场或磁场，使得电场或磁场使离子偏转。具有相同质荷比的离子将经历相同的偏转量。

在分离后，检测离子。通常，检测器记录感应的电荷或当离子通过或撞击表面时产生的电流。在扫描仪器中，在扫描过程中在检测器中产生的信号与仪器在扫描中的位置将产生质谱，作为m/z的函数的离子的记录。

进一步，所述试剂选自色谱-质谱法组合检测用试剂。

作为一种可选择的实施方式，色谱技术是气相色谱，组合方法称为气相色谱-质谱法(GC/MS，GCMS或GC-MS)。如本领域技术人员所知，在该技术中，使用气相色谱仪分离不同的化合物。将该分离的化合物流送入质谱仪，如上所述进行电离、质量分析和检测。

作为另外一种优选的实施方式，色谱方法是液相色谱，组合方法称为液相色谱-质谱法(LC/MS，LCMS或LC-MS)。如本领域技术人员所知，该技术使用液体流动相色谱分离化合物。通常，液相是水和有机溶剂的混合物。然后将分离的化合物流进料到质谱仪中，用于如上所述的电离、质量分析和检测。

作为一种优选的实施方式，所述质谱法为串联质谱法。所述串联质谱法选自离子阱质谱法、四极杆飞行时间质谱法、三重四极杆质谱法、四极杆离子阱质谱法、离子迁移率-四极杆离子阱-飞行时间质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、离子迁移率谱仪-四极杆离子阱质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、三重四级杆-轨道阱质谱法、四极杆离子阱-轨道阱质谱法、飞行时间或离子阱-傅立叶变换质谱法。

“样本”与“样品”在本发明中可以互换使用，用于本发明时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于组织样本，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液(follicular fluid)，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，尿，和组织培养液(tissue culture medium)，组织提取物如匀浆化的组织，细胞提取物，及其组合。

进一步，所述样本选自血液、血清、血浆。

在通过适当的质谱法分离和分析之后，在受试者的样本中鉴定的代谢物可用于检测受试者中的库欣综合征。通常，该步骤包括使受试者样本中生物标志物的水平与参考值进行比较，其中与所述参考值比较的所述生物标志物在所述样本中的水平指示在所述受试者中的库欣综合征。

作为可选择的实施方案，与所述参考值相比生物标志物在所述样本中的水平的减少指示在所述受试者中的库欣综合征。在一个实施方案中，与所述参考值相比，代谢物在所述样本中的水平的增加指示在所述受试者中的库欣综合征。与参考值相比的差异可以是如下面定义和例示的增加，或者如下面定义和例示的减少。

通常，样本中生物标志物的水平与参考值相比的增加或减少被测量为％平均差异。在本说明书中，术语“％平均差异”是指与参照受试者(即对照)中的总离子计数相比，患有库欣综合征的受试者中每种质量离子的总离子计数的％差异。

在测量值包括患有库欣综合征的受试者中适当质量离子的总离子计数增加的情况下，与参考值相比，％平均差异测量为(平均疾病/平均对照)×100％。在测量值包括患有疾病的受试者中适当质量离子的总离子计数减少的情况下，与参考值相比，％平均差异测量为(平均对照/平均疾病)×100％。因此，％平均差异总是超过100％，除了在患有库欣综合征的受试者中适当质量离子的总离子计数与参考值完全相同的情况。

在其中样本中生物标志物的水平与参考值相比增加指示受试者中的库欣综合征的实施方案中，样本中一种或多种生物标志物的水平与参考值相比的％平均差异没有特别限制。在一个实施方案中，所述％平均差异为至少100％，例如至少101％，例如至少102％，例如至少103％，例如至少104％，例如至少105％，例如至少106％，例如至少107％，例如至少108％，例如至少109％，例如至少110％，例如至少112％，例如至少114％，例如至少116％，例如至少118％，例如至少120％，例如至少130％，例如至少140％，例如至少150％，例如至少160％，例如至少170％，例如至少180％，例如至少190％，例如至少200％，例如至少250％，例如至少300％，例如至少350％，例如至少400％，例如至少450％，例如至少500％，例如至少550％，例如至少600％，例如至少650％，例如至少700％，例如至少750％，例如至少800％，例如至少850％，例如至少900％，例如至少950％，例如至少1000％，例如至少1100％，例如至少1200％，例如至少1300％，例如至少1400％，例如至少1500％，例如至少1600％，例如至少1700％，例如至少1800％，例如至少1900％，例如至少2000％，例如至少2500％，例如至少3000％，例如至少3500％，例如至少4000％，例如至少4500％，例如至少5000％，例如至少5500％，例如至少6000％，例如至少6500％，例如至少7000％，例如至少7500％，例如至少8000％，例如至少8500％，例如至少9000％，例如至少9500％，例如至少10,000％，例如至少11,000％，例如至少12,000％，例如至少13,000％，例如至少14,000％，例如至少15,000％，例如至少16,000％，例如至少17,000％，例如至少18,000％，例如至少19,000％，例如至少20,000％，例如至少25,000％，例如至少30,000％，例如至少35,000％，例如至少40,000％，例如至少45,000％，例如至少50,000％，例如至少55,000％，例如至少60,000％，例如至少65,000％，例如至少70,000％，例如至少75,000％，例如至少80,000％，例如至少85,000％，例如至少90,000％，例如至少95,000％，例如至少100,000％。

在其中样本中生物标志物的水平与参考值相比增加指示受试者中的库欣综合征的实施方案中，％平均差异通常为101％至15,000％，例如105％至12,000％，例如110％至10,000％，例如110％至9000％，例如120％至8000％，例如130％至7000％，例如140％至6000％，例如150％至5000％，例如160％至4000％，例如170％至3000％，例如180％至2500％，例如190％至2250％，例如200％至2000％，例如250％至1900％，例如300％至1800％，例如350％至1700％，例如400％至1600％，例如450％至1550％，例如500％至1500％。

在其中样本中生物标志物水平与参考值相比降低指示受试者中的库欣综合征的实施方案中，样本中生物标志物水平与参考值相比的％平均差异没有特别限制。在一个实施方案中，所述％平均差异为至少100％，例如至少101％，例如至少102％，例如至少103％，例如至少104％，例如至少105％，例如至少106％，例如至少107％，例如至少108％，例如至少109％，例如至少110％，例如至少112％，例如至少114％，例如至少116％，例如至少118％，例如至少120％，例如至少130％，例如至少140％，例如至少150％，例如至少160％，例如至少170％，例如至少180％，例如至少190％，例如至少200％，例如至少250％，例如至少300％，例如至少350％，例如至少400％，例如至少450％，例如至少500％，例如至少550％，例如至少600％，例如至少650％，例如至少700％，例如至少750％，例如至少800％，例如至少850％，例如至少900％，例如至少950％，例如至少1000％，例如至少1100％，例如至少1200％，例如至少1300％，例如至少1400％，例如至少1500％，例如至少1600％，例如至少1700％，例如至少1800％，例如至少1900％，例如至少2000％，例如至少2500％，例如至少3000％，例如至少3500％，例如至少4000％，例如至少4500％，例如至少5000％，例如至少5500％，例如至少6000％，例如至少6500％，例如至少7000％，例如至少7500％，例如至少8000％，例如至少8500％，例如至少9000％，例如至少9500％，例如至少10,000％，例如至少11,000％，例如至少12,000％，例如至少13,000％，例如至少14,000％，例如至少15,000％，例如至少16,000％，例如至少17,000％，例如至少18,000％，例如至少19,000％，例如至少20,000％，例如至少25,000％，例如至少30,000％，例如至少35,000％，例如至少40,000％，例如至少45,000％，例如至少50,000％，例如至少55,000％，例如至少60,000％，例如至少65,000％，例如至少70,000％，例如至少75,000％，例如至少80,000％，例如至少85,000％，例如至少90,000％，例如至少95,000％，例如至少100,000％。

在其中样本中生物标志物的水平与参考值相比降低指示受试者中的库欣综合征的实施方案中，％平均差异通常为101％至15,000％，例如105％至12,000％，例如110％至10,000％，例如110％至9000％，例如120％至8000％，例如130％至7000％，例如140％至6000％，例如150％至5000％，例如160％至4000％，例如170％至3000％，例如180％至2500％，例如190％至2250％，例如200％至2000％，例如250％至1900％，例如300％至1800％，例如350％至1700％，例如400％至1600％，例如450％至1550％，例如500％至1500％。

优选地生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。

本发明第二方面提供了一种诊断库欣综合征的试剂盒，所述试剂盒包含检测样本中LysoPE 22:5的试剂；以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患库欣综合征的说明书。

进一步，所述试剂检测LysoPE 22:5的含量和/或浓度。

进一步，所述试剂盒还包括处理样本的试剂。

当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以试剂盒形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的代谢物，以降低测定的复杂性和成本。

可使用本发明所述的能够检测样本代谢物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中代谢物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本代谢物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。高于或低于预定阈值的代谢物的存在或不存在可以例如通过发色、发荧光、电化学发光或其他输出(例如在酶免疫测定(EIA)，诸如酶联免疫测定(ELISA)中)来显示。

在一个实施方案中，试剂盒可包含固体基片诸如芯片、载玻片、阵列等，其具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种样本代谢物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样本中生物标志物的存在和/或浓度和/或量。如上所述，在患有库欣综合征的受试者的样本中发现所述生物标志物的水平升高。芯片可被配置成使得仅当这些代谢物中的一种或多种的浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色变化)，所述阈值被选择或区分指示对照受试者的生物标志物的浓度和/或量与指示患有或易患库欣综合征的患者的生物标志物的浓度和/或量。因此，可检测到的输出(诸如颜色变化)的存在立即表明样本中包含显著升高水平的生物标志物，表明受试者患有或易患库欣综合征。

本发明第三方面提供了生物标志物在构建预测库欣综合征的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统或装置中的应用，所述生物标志物为LysoPE 22:5。

所述计算模型采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估库欣综合征中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

接受者操作曲线下面积(＝AUC)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的接受者操作特征(ROC)描述得最好。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。

实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或者疾病进展对无疾病进展。在每种情况中，ROC线图通过对于决策阈的整个范围将灵敏度对1-特异性绘图来描绘两种分布之间的交叠。y轴上是灵敏度，或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数目)/(真阳性的数目+假阴性测试结果的数目)]。这也称作疾病或状况的存在的阳性。它仅仅自受影响亚组来计算。x轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数目)/(真阴性的数目+假阳性结果的数目)]。它是特异性的一项指标，而且完全自不受影响的亚组来计算。因为真阳性和假阳性分数通过使用来自两个不同亚组的测试结果完全分开计算，所以ROC线图不依赖于样品中疾病的流行程度。ROC线图上的每个点代表一个对应于特定决策阈的灵敏度/1-特异性对。一项具有完美区分(两种结果分布没有交叠)的测试具有通过左上角的ROC线图，那里真阳性分数为1.0，或100％(完美灵敏度)，且假阳性分数为0(完美特异性)。一项不区分(两个组的结果分布相同)的测试的理论线图是从左下角到右上角的45°对角线。大多数线图落在这两种极端之间。(如果ROC线图完全落在45°对角线以下，那么这容易通过将“阳性”的标准从“大于”颠倒成“小于”或反之来矫正。)定性地，线图越接近左上角，测试的整体精确性越高。

量化实验室测试的诊断精确性的一项便利目标是通过单一数值来表述它的性能。最常见的全局度量是ROC曲线下面积(AUC)。常规地，此面积总是≥0.5(如果不是这样，那么可以颠倒决策规则来使之这样)。数值范围介于1.0(完美分开两个组的测试值)和0.5(两个组的测试值之间没有明显分布差异)之间。面积不仅取决于线图的特定部分诸如最接近对角线的点或90％特异性处的灵敏度，而且还取决于整个线图。这是ROC线图如何接近完美者(面积＝1.0)的一种定量、描述性表述。

整体测定法灵敏度会取决于实施本发明公开的方法要求的特异性。在某些优选设置中，特异性75％可能是充分的，而且统计方法和所得算法可以基于此特异性要求。在一个优选实施方案中，用于评估有库欣综合征风险的个体的方法基于特异性80％、85％、或还优选90％或95％。

本发明第四方面提供了一种预测库欣综合征的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统或装置，所述计算模型以LysoPE 22:5的水平作为输入变量，输出判别值。

所述判别值是基于所述样本中所述生物标志物的浓度和/或量值以及具有存储在计算模型的作为解释变量的所述生物标志物的浓度和/或量的判别来计算。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与库欣综合征相关的生物标志物LysoPE 22:5，通过检测生物标志物的水平，与健康对照相比，可以判断受试者是否患有或易患库欣综合征，以期实现库欣综合征早期的诊断，从而在库欣综合征早期进行干预治疗，提高患者的生活和生存质量。

附图说明

图1是库欣综合征患者和健康人群中LysoPE 22:5的差异分析条形图；其中，1A是发现队列库欣综合征患者和健康人群中LysoPE 22:5的差异分析条形图；1B是验证队列库欣综合征患者和健康人群中LysoPE 22:5的差异分析条形图。

图2是库欣综合征患者和健康人群中LysoPE 20:5的差异分析条形图；其中，2A是发现队列库欣综合征患者和健康人群中LysoPE 20:5的差异分析条形图；2B是验证队列库欣综合征患者和健康人群中LysoPE 20:5的差异分析条形图。

图3是LysoPE 22:5接受者操作特征曲线图；其中3A是发现队列接受者操作特征曲线图；3B是验证队列接受者操作特征曲线图。

图4是LysoPE 20:5接受者操作特征曲线图；其中4A是发现队列接受者操作特征曲线图；4B是验证队列接受者操作特征曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例库欣综合征相关代谢物的筛选及效能判断

1.队列招募人群

此次研究共招募了30名健康志愿者和34名在北京协和医院确诊为库欣综合征的患者作为发现队列。招募了25名健康志愿者和23名在北京协和医院确诊为库欣综合征的患者作为验证队列。诊断是通过临床症状、家族史、影像、血皮质醇测定来验证的。

排除标准包括：

1)入组前3个月内接受抗生素治疗≥3天；

2)现患器质性消化系统疾病，或1年内接受过消化道手术；

3)合并甲亢、糖尿病酮症酸中毒、肾上腺皮质功能不全、妊娠、严重贫血、严重肾功能不全(eGFR≤15mL/min/1.73㎡)、中毒或药物副反应；

4)确诊全身性自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)或恶性肿瘤。

健康对照组入组标准为：医师问诊、查体及血化验确认为健康人群。

2.样本的采集与保存

在参与者入院后的第二天早上抽取外周静脉血，并收集新鲜的血清样本，并立即在-80℃下冷冻。所有的临床信息都按照标准程序收集(注：本研究得到了北京协和医院伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》的原则执行。所有受试者都提供了参与该研究的书面知情同意书)。

抽取受试者于清晨空腹状态下的外周静脉血，使用EDTA-K2抗凝采血管(血浆管)与分离胶促凝管(血清管)各采集1管约5mL样本，获取样本后于1小时内离心(血浆管500g×10分钟，血清管3500rpm×5分钟)，取上清液分装至1.5mL eppendorf管，并置于-80℃冰箱中保存。

3.血清非靶向代谢组学检测及差异代谢物筛选

3.1血清非靶向代谢组学检测

血清代谢组学采用超高效液质联用(UHPLC-MS)分析，期间使用Vanquish超高效液相色谱系统(ThermoFisher，德国)和Orbitrap Q ExactiveTM HF质谱仪(Thermo Fisher，德国)，在Novogene Co.,Ltd.(北京，中国)仪器。

首先进行样本代谢物提取，然后LC-MS/MS上机检测分子特征峰，检测过程中使用实验样本等体积混合制成的QC样本进行数据质控。然后，使用Compound Discoverer 3.1(CD3.1)软件对下机原始结果进行数据预处理，首先通过保留时间、质荷比等参数简单筛选，对于不同样本根据保留时间偏差和质量偏差(Part per million，ppm)进行峰对齐，使鉴定更准确；随后根据设置的ppm、信噪比(Signal-to-noise ratio，S/N)、加合离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量。

3.2血清代谢物鉴定

比对高分辨二级谱图数据库mzCloud和mzVault以及MassList一级数据库检索，进行代谢物鉴定。具体原理为：根据一级质谱中母离子的质荷比(m/z)确定代谢物的分子量，通过ppm以及加合离子等信息进行分子式预测，然后与数据库进行匹配；含有二级谱图的数据库根据实际二级谱图与数据库中每个代谢物的碎片离子、碰撞能等信息进行匹配，实现代谢物的二级鉴定。只有质量控制(QC)样品中变异系数(CV)值小于30％的特征被过滤后用于下游分析。

3.3血清差异代谢物的筛选

代谢物使用KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/pathway.htmL)、HMDB数据库(https://hmdb.ca/metabolites)和LIPIDMaps数据库(http://www.lipidmaps.org/)进行注释。获得血清代谢物注释及定量表后，使用SIMCA软件(v14.1，Umetrics，瑞典)进行多变量统计分析OPLS-DA，计算各特征的VIP值，利用Wilcoxon秩和检验计算显著性，最终选取VIP＞1且P＜0.05的代谢物为差异代谢物。结果如图1和图2所示，在发现队列中，相比健康对照，LysoPE 22:5、LysoPE 20:5在库欣综合征患者中的水平显著升高。

为了验证LysoPE 22:5、LysoPE 20:5用于库欣综合征诊断的准确性，同时检测了LysoPE 22:5、LysoPE 20:5在验证队列中的水平，结果如图1和图2所示，相比健康对照，LysoPE 22:5、LysoPE 20:5在库欣综合征的患者中呈现显著升高。

4.评估差异代谢物的诊断效能

使用R包p ROC计算差异代谢物的获得受试者工作曲线(ROC)，计算曲线下面积(AUC)及最佳Cut-off值，从而获得多个诊断模型。从中筛选出AUC值最优的差异代谢物LysoPE 22:5、LysoPE 20:5，LysoPE 22:5、LysoPE 20:5的发现队列和验证队列的ROC曲线分别如图3、4所示，发现队列和验证队列中LysoPE 22:5的AUC值分别0.738、0.816；发现队列和验证队列中LysoPE 20:5的AUC值分别0.822、0.798。

LysoPE 22:5、LysoPE 20:5属于磷脂酰乙醇胺脂质(Phosphatidyl ethanolaminelipid，LPE)，磷脂酰乙醇胺脂质与人体内代谢过程密切相关。而库欣综合征患者因为内分泌的整体紊乱会出现代谢紊乱，而磷脂酰乙醇胺脂质的改变在一定程度上可以反映代谢紊乱，由此可以确定LysoPE 22:5、LysoPE 20:5可以作为库欣综合征的诊断标志物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断库欣综合征的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为LysoPE 22:5。

2.根据权利要1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法或其组合检测用试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自色谱-质谱法组合检测用试剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述质谱法为串联质谱法。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述串联质谱法选自离子阱质谱法、四极杆飞行时间质谱法、三重四极杆质谱法、四极杆离子阱质谱法、离子迁移率-四极杆离子阱-飞行时间质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、离子迁移率谱仪-四极杆离子阱质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、三重四级杆-轨道阱质谱法、四极杆离子阱-轨道阱质谱法、飞行时间或离子阱-傅立叶变换质谱法。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述样本选自血液、血清、血浆。

7.一种诊断库欣综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测样本中LysoPE22:5的试剂；以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患库欣综合征的说明书。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括处理样本的试剂。

9.生物标志物在构建预测库欣综合征的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统或装置中的应用，其特征在于，所述生物标志物为LysoPE 22:5。

10.一种预测库欣综合征的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统或装置，其特征在于，以LysoPE 22:5的水平作为输入变量，输出判别值。

Images